专利名称：以同步化法配合半连续培养法制备高温丁醇菌菌体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种菌体的培养方法。具体地说是以同步化法配合半连续培养法制备高温丁醇菌菌体。该方法所得到的菌体可以高转化率地用于石蜡油转化成乙醇和丁醇。
某种厌气性、嗜热性、形成内生孢子的梭菌属细菌可用于限制性代谢生产酵素，抗生素、毒素蛋白质或用于经丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵法制容剂。详细地说，在含有选择性的防止细胞任意生长的，可缓慢代谢的碳源培养基中，继代培养使该细胞数量和质量上可以同步化。同步化的细胞最少延长到营养细胞的三倍，此时，细胞就成为产溶剂的细菌。同时，如在培养基中添加某一二价阳离子，其浓度不少于0．01M，就可稳定细胞在质量和数量上的同步化。
作为上述理想的梭菌类型是热解糖梭菌(Clostridumthermosachrolgticum)的种类ATCC7956，．NCA3814。其中可利用的种类有C．perfringens ATCC#13124，C．theromocellum ATCC#27405，C．thermohgdrosnlfuricum ATCC#35045，acetobutylicum ATCC#824，C．thermosul-furigenes ATCC#33743，C．thermoacelicum DSM#521，C．thermoautotrophicum DSM#1974，C．beijerinckii ATCC#25752和C．butyricum ATCC#19398。
利用上述菌种，在适当的培养基中进行培养，可制备出产溶剂的细菌，其选择的生长培养基是含有大约0．1-15．0％(W／V)的慢代谢碳源基质的基础培养基。作为这种碳源可包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、丰乳糖、糖原、密二糖、α甲基葡萄糖苷、β甲基葡萄糖苷、棉子糖、水杨苷、淀粉、海澡糖、木聚糖、乙酸钙、丁酸钙、柠檬酸钙、甲酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙。另外，在培养基内添加二价阳离子Ca、Mg、Mn、Fe或、Zn，并为促使大量二价阳离子被利用，可在培养基中加入超过其溶解度的量，这样，随着过量二价化合物的溶解，此二价阳离子源便构成了进行增殖细胞的合并成分。因而更理想的二价阳离子的浓度为0．1M左右。在上述二价阳离子中葡萄糖钙是最理想的二价离子源，因为它不仅提供所需要的钙离子，而且，还可做为极好的碳源。
通过常规的系列稀释，过滤或离心技术，生长的细胞可以达到同步化。随后，在最适生长的温度下培养，培养的时间是梭菌至少达到1×106个／ml所需的时间，大约一个体积的原培体接种于10个体积的木聚糖培养基，后者作为分批培养。直到增加2-3倍的浓度，即大约1．0-1．5代。如此，再进行分批培养。用来维持细胞按照上述代谢途径进行代谢的生长培养基，常用在木聚糖培养基中补充无机或有机二价阳离子来制备。而进一步如所需终产物只是产溶剂细胞，最好利用含蛋白胨-酵母膏的培养基，并补充有机酸的二价盐作为唯一碳源，其最理想的制备方法是以浓度不小于4．3％(w／v，0．1M)葡萄糖酸钙作为唯一的缓慢代谢的碳源补充于含有通常组成成分的液体蛋白胨-酵母膏培养基中。
徐经上述培养过程的代谢产物可按各种常规方法来收回。例如，如果产物是高温下产生的溶剂，在50℃上，可用下述两种真空发酵的方法回收。一种方法是“实验室有机物导论”，一种现代方法“第548-552页(W．B／Saunder．1976)”；另一种是“用真空的快速乙醇发酵及细胞回收”(生物技术和工程19卷1125-1143页，1977)。
但是，在所有试验过的具体方案中，为了使产生溶剂具有较长时期，延长的同步细胞常常需要一种缓慢代谢的碳源，正常的细胞分裂必须经由温度的交替或添加化学生长抑制剂来防止，以及细胞必须与钙结合，即在通常的生长培养基中必须添加葡萄糖酸钙。另外，培养基的碳源通常为木聚糖，其成本也较高。
本发明的目的是提供一种以同步化法制备高温丁醇菌菌体的方法。该方法中培养可使用更廉价的碳源代替木聚糖，并且也可以不补充二价阳离子，即生长培养基中不用添加葡萄糖酸钙，不但能进一步降低制备菌体的成本，并可结合半连续的菌体培养法，使制备高温丁醇菌菌体适于在工业生产中应用。
为实现上述目的，本发明对以同步化法制备高温丁醇菌菌体的方法进行改进而提出一种更简便易于工业化生产的菌体培养方法。具体地说，本发明的以同步化法制备高温丁醇菌菌体的方法包括原菌种培养和分批培养，其特征在于分批培养的同步化过程在不含二价阳离子的生长培养基中进行，并且每当培养基中的细胞浓度达到1-6×109个／ml时就进行稀释，稀释用与分批培养相同的生长培养基，把培养体以1／2以上的稀释比例进行稀释，最终得到用于石蜡油转化为乙醇和丁醇的，细胞浓度为1-3×109个／ml的同步的高温丁醇菌种。
在上述本发明的方法中，其分批培养的不含二价阳离子的生长培养基含有0．1-15．0％(W／V)的慢代谢碳源，所谓慢代谢碳源可选择修饰玉米淀粉。或糯玉米淀粉。
其中更可取的是玉米淀粉。
另外，上述本发明的方法中当培养体中的细胞浓度最好达到1-3×109个／ml时就进行稀释，并且把培养体以1／15以下的稀释比例进行稀释。在分步培养中，虽然培养体的稀释可以按任何比例进行，但是当稀释比例小于1／2时，稀释进行的频率过快不利工业化生产，同时培养体的生产效率低，而当稀释比例大于1／15时，每步培养进行的时间过长，也难于提高生产效率。因此，合适的稀释比例为1／2-1／15，最理想的稀释比例为1／8-1／11。
按照上述本发明的以同步化法制备高温丁醇菌种的方法中，由于分批培养是用同样的生长培养基进行，因此，可在同一发酵罐中，通过加入生长培养基的方法进行培养体的稀释。这样可实现半连续的进行菌种的培养，使该法易于在工业生产中应用。另外，培养体的稀释也可在不同发酵罐中进行，即先在一发酵罐中进行分批培养达到一定量的培养体之后，再分别于不同发酵罐中进行接近用于发酵石蜡油量的分批培养，提高设备的使用效率，同时可实现半连续式的发酵过程。因此，本发明的方法是以分步化配合半连续培养法来制备高温丁醇菌种。
在上述的本发明的方法中，菌种采用嗜高温厌气菌梭芽孢杆菌(clostridium thermosaccharolgticum)ATCC7956。可利用的种类如前所述有C．perfringens ATCC#13124，C．theromocellum ATCC#27405，C．thermohgdrosulfuricum ATCC#35045，C．acetobutylicum ATCC#824，C．thermosul-furigenes ATCC#33743，C．thermoacelicum DSM#521，C．thermoautotrophicum DSM#1974，C．beijerinckii ATCC#25752和C．butyricum ATCC#19398。使得生长着的细胞在数量和质量上的同步化过程，并改变了野生型梭芽孢杆菌ATCC#7956在纯培养中的细胞分化。有关菌种原种培养及培养的制备都可参照常规的技术进行。
下面通过实施例对本发明的技术给予进一步的说明。
实施例1梭芽孢杆菌的培养1．菌种梭芽孢杆菌ATCC#7956；2．原种培养基豌豆肉汤培养基六颗干燥的阿拉斯加种豌豆加入10ml 2％蛋白胨溶液中，灭菌15分钟，立即用2ml灭菌石蜡油覆盖。
3．原种培养将处于对数生长的梭芽孢杆菌的培养体接种于豌豆肉汤培养基中，随后在56℃下培养8小时。
4．分批培养将1ml上述原种培养所得的培养体接种于10ml新鲜的基础培养基中作为分批培养。
基础培养基0．2％蛋白胨，0．5酵母膏，0．1％(NH4)2SO4，0．01％CaCl2·2H2O，0．01％MgSO4，0．01％MnSO4·H2O，0．0005％ZnSO4·7H2O，0．0005％CuSO4·5H2O，0．0001％(NH4)6Mo7O24·4H2O，0．000002％对氨基苯甲酸，0．0001％盐酸硫胺，0．0000001％生物素。
溶于1L水中盐酸硫胺和生物素经过过滤除菌，再加入灭菌后的培养基中，加入0．55％(W／V)玉米淀粉于培养基作为碳源。培养基用1M NaOH调至pH7后灭菌。接种前培养基在56℃预温。
分批培养步骤所有的步骤均采用Hungate方法在无菌条件下进行。原种培养活化后，转接于预温的含有0．55％玉米淀粉做为碳源的基础培养基中，接着在56℃下培养六小时，此时细胞的浓度大约为5×106，1ml的这种液体培养体无菌地转接于10ml预温的新鲜玉米淀粉基础培养基，再让它做为分批培养在56℃下生长。
10小时后，培养体中的细胞浓度大约为1-2×109／ml。
重复转移到玉米淀粉培养基生长在六小时内而同步化的培养体，进一步在玉米淀粉培养基中生长45小时，证明了细胞在数量和质量上均有高度的同步化。按常规方法由差别计数表明了细胞质量上的同步化可达69．3％。数量上的上述同步化可达76．7％。90％以上的同步化的产溶媒的细胞至少延长四倍，并且显示一种修饰过的细胞分裂保持在至少4倍于营养细胞长度的特定长度上。折光性的孢子几乎可以忽略不计。
实施例2高温丁醇菌菌体的制备A将实施例1制备的培养液隔夜培养8小时，得活化的细胞，稀释10倍接种至120ml的相同玉米淀粉为碳源的培养基中，经培养1．5世代浓度达1-2×109个／ml后。转移至1．5L发酵罐含玉米淀粉为碳源的产孢培养基中，稀释10倍，培养温度维持56℃，控制搅拌速率及通气量，在发酵罐中进行同步培养，制备同步的产溶剂细胞，当浓度达到2-3×109个／ml，迅速降温至30℃，停止细胞继续分裂，即可得到可用于石蜡油发酵转换为乙醇和丁醇的本发明的高温丁醇菌体A。第一次将活化培养体稀释10倍接种到120ml的培养过程约8小时。第二次接种至1．5L发酵罐的培养过程约10小时。由培养液内菌种的浓度决定进行稀释的操作。
实施例3高温丁醇菌菌体的制备B除下列步骤外，其他步骤同实施例2。第二次接种至1．5L发酵罐中后以含玉米淀粉为碳源的产孢培养基稀释2倍，当浓度达到1-2×109个／ml时，再用同样培养基稀释5倍，在发酵罐进行第三次同步培养，制备高温丁醇菌体B。实施例3制备高温丁醇菌种B需要20小时。
实施例4高温丁醇菌菌体的制备C除下列步骤外，其他步骤同实施例2。在第一次于120ml培养基中经培养1．5世代浓度达1-2×109个／ml后再以同样培养基稀释100倍接种到1．5L发酵罐中，制备高温丁醇菌体C，该制备过程需要28小时。
实施例5 高温丁醇菌菌体用于石蜡油转换成乙醇和丁醇1在上述实施例2进行后，用1ml孔径通气针头由发酵罐度部通气。通氮气过程共须10分钟，每分钟沿圆周移动一次，氮气流速约400ml／ml。
通氮气9分钟后，缓缓将150ml矿物油沿边缘加入，覆盖于培养基上。通氮气10分钟后，缓缓取出通气针头，并将氮气充满发酵罐上部空间，之后在保持30℃下进行210小时发酵。
上述1．5公升的发酵槽中，搅拌和通气均为自动化的控制系统，将发酵罐中原有的搅拌器底部加装不锈钢丝，改装成发酵槽的刮削器，用以均匀搅拌并防止细胞间产生凝聚现象。而通气系统则是以定时器及通气控制阀定时控制氮气通入的量及通气时间。通常将刮削器转速控制为160rpm，通气的时间大约控制为每两小时通氮气3-15分钟，氮气的流速则为150-250ml／min，氮气纯度为99．99％(vo／vol)，发酵温度则控制为30℃。
在1．5公升发酵罐中进行210小时之后，将发酵液取出，离心之后，以气相层析仪分析发酵产物，经积分计算其结果，测得乙醇最终浓度为3．95％(vo／vol)，异丙醇最终浓度为4．15％(vo／vol)，丁醇最终浓度为8．7％(vo／vol)，合计得有机溶剂16．8％(vo／vol)。
上述发酵产物分析是于实验过程中取出发酵液1ml，在12，000xg转速下离心10分钟；取上层澄清部分，再离心5分钟，重复两次，最后将此处理过程的样品冷藏于4℃，待分析。
发酵产物的测定，包括乙醇、丁醇、异丙醇或丙酮等，皆由气相层析仪分析。每次取处理过的样品0．2ml注入气相层析仪(Hewlett-Packardmodel HP 5890A gas chromatograph)等中分析；使用长30m，内径0．32mm，填充物Rtx-225(Retek Co．，USA)的毛细管柱；oven的初温设定为60℃，维持5分钟，之后以4℃／分加热，末温设定为180℃；注射口设定温度200℃，火焰离子侦测器设定温度220℃；载气体为氮气，气体液速为1ml／分。
由实验结果计算，基质中含玉米淀粉、石蜡油及水，还有通入细胞液中的氧分子，而培养基中占比例最高的水也是可能的基质。细胞利用上述的基质可用来增加细胞质量，或释放出二氧化碳，并将之转换为乙醇、异丙醇、正丁醇等发酵产物。
在1．5L发酵罐中，计算得0．55％(vo／vol)玉米淀粉72．5g，覆盖于培养基上的石蜡油最后被消耗掉150ml，而石蜡油的平均密度为0．86，因此当作基质部分的石蜡油为129g。根据细胞浓度(1010个／nl)，发酵液体积(1500ml)，及细胞干重(8×1013g／细胞)，可计算得细胞质量为12．0g。生长时所释放出的CO2则可根据理论计算，得知其摩尔数为0．4mol；此外，发酵产物为乙醇、异丙醇和丁醇，最终浓度分别为3．95％，4．15％，8．7％(vo／vol)，由于三者的密度分别为0．79，0．78，0．81g／cm3，计算得其重量分别为46．8，48．8，105．6g。由各基质及产物的质量或摩尔数，可计算其碳、氢、氧的摩尔数，并计算碳、氢、氧的回收率。经计算结果，碳的回收率高达97．9％，这足以证明消耗掉的150ml石蜡油，完全被转换为产物。事实上，培养基中的碳源，大部分用来做菌体及CO2，石蜡油的碳则完全转换为乙醇丁醇及异丙醇的碳骨架。由计算可知，本发明制备出的高温丁醇菌体的确有分解饱和碳氢化合物(如石蜡油)的能力。
实施例6高温丁醇菌菌体用于石蜡油转换成乙醇和丁醇2除下述步骤外，按实施例5所述的方法分别在实施例3和4进行后充入300ml石蜡油，通氮气的流速为500ml／分，在120小时内分别向实施例3和4的发酵罐中充入纯度99．9％的氮气370ml和260ml。发酵期间结束后对实施例3和4发酵罐中乙醇和丁醇会计浓度分别为3．22％和2．92％。
实施例7除用含1．1％(W／V)糖密作碳源的培养基代替0．55％(W／V)玉米淀粉作碳源的培养基外，按实施例3的方法和实施例6的方法制备高温丁醇菌和用于石蜡转换成乙醇和丁醇发酵，发酵其结束后乙醇和丁醇合计浓度为2．98％。
比较例梭芽孢杆菌的制备及用于石蜡油转换除下述步骤外，按实施例3制备出适用于石蜡油转换成乙醇和丁醇的培养体。其中第一次培养基中碳源合0．5％(W／V)木聚糖，第二次发酵罐中采用含0．5％(W／V)木聚糖和4．3％葡萄糖酸钙的培养基。
制备出培养体后再按实施例6的步骤与实施例3相同的方法进行石蜡油的发酵。发酵期结束后乙醇和丁醇合计浓度为3．15％。
由上述实施例和比较例的结果可以看到，本发明只利用廉价的玉米淀粉作为碳源所配制的培养基就可制备出适于石蜡转换成乙醇和丁醇的高温丁醇菌，并得到与用木聚糖和葡萄糖酸钙为碳源的培养基相近的由石蜡油制乙醇和丁醇的产率。但是本发明的方法在操作中比目前的方法更简单，发酵条件易控制，可实现半连续化的工业生产，同时作为以玉米淀粉碳源的成本也比采用木聚糖和葡萄糖酸钙要降低25-40％。
权利要求
1．一种以细胞分化同步化法法制备高温丁醇菌菌体的方法，包括原菌种培养和分批培养，其特征在于，分批培养的同步化过程在不含二价阳离子的生长培养基中进行，并且每当培养基中的细胞浓度达到1-6×109个／ml时就进行稀释，稀释用与分批培养相同的生长培养基，把培养体以1／2以上的稀释比例进行稀释，最终得到细胞浓度为1×109-5×1010／ml的同步的高温丁醇菌体。
2．按照权利要求1所述的方法，其特征在于，其分批培养的不含二价阳离子的生长培养基含有0．1-15．0％(W／V)的慢代谢碳源，所谓慢代谢碳源可选择修饰玉米淀粉或糯玉米淀粉。
3．按照权利要求1所述的方法，其特征在于，把培养体以1／2-1／15的比例进行稀释。
4．按照权利要求3所述的方法，其特征在于，把培养体以1／8-1／11的比例进行稀释。
5．按照权利要求1所述的方法，其特征在于，每当培养其中的细胞浓度达到1-2×109个／ml时就进行稀释，最终得到细胞浓度为2-3×109个／ml的同步的高温丁醇菌体。
全文摘要
一种以细胞分化同步化法制备高温丁醇菌菌体的方法,包括原菌种培养和分批培养,分批培养的同步化过程在不含二价阳离子的生长培养基中进行,并且每当培养基中的细胞浓度达到1－6×10
文档编号C12P7/16GK1282790SQ99111180
公开日2001年2月7日 申请日期1999年7月29日 优先权日1999年7月29日
发明者毛桂震, 许骏发 申请人:毛桂震, 许骏发