研究体内蛋白质相互作用的方法

专利名称：研究体内蛋白质相互作用的方法
背景对活细胞内蛋白质间相互作用的研究往往对于理解蛋白质功能及其作用机制非常必要。这些相互作用目前采用免疫沉淀、酵母双杂交方法和β-gal互补方法进行研究。
然而，这些方法具有一些缺陷。例如，这些方法带有假阳性。第二，这些方法不可以测定关于相互作用的定量化信息。此外，它们不可能体内实时监测相互作用。
因此，获得另一种没有这些缺点的研究体内蛋白质间相互作用的方法将非常有利。更优选地，本方法可以在多种多样的活细胞内用于广泛的蛋白质。同样优选地，本方法能够用来测定除蛋白质以外的其它分子间的相互作用。
概述根据本发明的一个实施方案，提供一种测定活细胞内第一种蛋白质和第二种蛋白质是否发生相互作用的方法。本方法包括在细胞内提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。当第一种蛋白质靠近第二种蛋白质时供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团。然后复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质在细胞内允许相互靠近。接下去检测任何来自受体荧光团的荧光。由供体萤光素酶发光共振能量传递给受体荧光团导致受体荧光团产生荧光，表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。
在一个优选的实施方案中，提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA以及将基因工程化的DNA转移到活细胞内，这导致细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。在一个特别优选的实施方案中，含有与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞以及含有与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞均为哺乳动物细胞。
在另一个优选的实施方案中，所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。而在另一种优选的实施方案中，所提供的受体荧光团为一种水母(Aequorea)绿色荧光蛋白质。
在一个特别优选的实施方案中，使用分光荧光测定法检测受体荧光团所发出的荧光。
描述本发明包括一种运用发光共振能量传递(LRET)测定活细胞内一种蛋白质和另一种蛋白质是否发生相互作用的方法。发光共振能量传递是由于供体萤光素酶能量的激发态向受体荧光团的传递。为了LRET的发生，在供体萤光素酶的发射光谱和受体荧光团的激发光谱之间必须有重叠。
发光共振能量传递的效率在诸多变量中尤其取决于分隔供体萤光素酶和受体荧光团的距离。一般来说，明显的能量传递仅当供体萤光素酶和受体荧光团彼此之间小于80时才发生。这种短距离大大小于用常规显微镜观察两个实体所需的光学分辨距离。因此，检测到在供体萤光素酶和受体荧光团之间发生发光共振能量传递，表明供体萤光素酶和受体荧光团已经靠近并处于LRET发生所需的距离之内，即彼此之间大约小于80。
本发明运用发光共振能量传递来测定活细胞内一种蛋白质和另一种蛋白质之间是否发生相互作用。它的完成是依靠将第一种蛋白质与供体萤光素酶复合和将第二种蛋白质与受体荧光团复合，并将复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质放入细胞内并处于适合第一种蛋白质与第二种蛋白质发生相互作用的条件下。如果第一种蛋白质与第二种蛋白质相互作用，供体萤光素酶将足够靠近受体荧光团从而发生发光共振能量传递，受体荧光团将发出荧光。由此，检测到来自受体荧光团的荧光将表明第一种蛋白质已经与第二种蛋白质发生了相互作用。有利地是，这种方法也可用于检测即使用例如常规显微镜的光学方法无法检测到的第一种蛋白质与第二种蛋白质之间的相互作用。
根据本发明运用发光共振能量传递检测两种蛋白质之间相互作用的方法具有几个优点。首先，活细胞内蛋白质的特异标记可通过基因工程的方法获得，而将荧光染料导入活细胞非常困难。此外，如果供有底物和氧，酶促反应导致如Renilla的萤光素酶发光相对稳定，而荧光染料则迅速光漂白。
如此处公开所用的方法，“将第一种蛋白质与供体萤光素酶复合”是指将供体萤光素酶和第一种蛋白质以如此方式结合在一起，使得当第一种蛋白质与第二种蛋白质相互作用时供体萤光素酶和第一种蛋白质基本上相互同样靠近。相似地，“将第二种蛋白质与受体荧光团复合”是指将受体荧光团与第二种蛋白质以如此方式结合在一起，使得当第一种蛋白质与第二种蛋白质相互作用时受体荧光团和第二种蛋白质基本上相互同样靠近。例如，可通过基因工程化使细胞生产包含供体萤光素酶和第一种蛋白质的融合蛋白以及包含受体荧光团和第二种蛋白质的融合蛋白来进行这种复合。
在一个优选的实施方案中，本发明使用Renilla萤光素酶作为供体萤光素酶，使用“人源化的”水母绿色荧光蛋白(人源化GFP)作为受体荧光团。Renilla萤光素酶是一种从Renilla reniformis中纯化出的34kDa的酶。有氧时该酶催化coelentenazine的氧化脱羧作用，产生发射波长最大值为471nm的蓝光。Renilla萤光素酶用作供体萤光素酶是因为它除外源光以外需要外源底物进行激活。这样可有利地除去来自外源光源和自发荧光产生的背景噪音，从而允许容易而准确地定量测定所产生的光。
“人源化”GFP是一种激发最大值在480nm荧光的27kDa的蛋白质荧光团。它与野生型水母绿色荧光蛋白相比有一个氨基酸差异。之所以选择“人源化”GFP作为受体荧光团是因为它的激发光谱与Renilla萤光素酶的发射光谱相重叠。此外，“人源化”GFP发出的光在活细胞内是可见的。并且，“人源化”GFP在用于证明这种方法的“人源化”GFP cDNA转染的哺乳动物细胞中可获得良好的表达。
根据本发明用于测定一种蛋白质与另一种蛋白质是否相互作用的方法显示如下。简而言之，胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)和胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)选作第一种蛋白质和第二种蛋白质。已知IGFBP6是一种对IGF-Ⅱ具有明显结合亲和力的蛋白质。
Renilla萤光素酶的cDNA与IGFBP6的cDNA相融合，“人源化”GFP cDNA与IGF-Ⅱ cDNA相融合。融合的cDNA转染活细胞，且表达融合蛋白。产生并混合细胞提取物。加入融合的Renilla萤光素酶-IGFPB 6蛋白质中的Renilla萤光素酶部分的底物。最终，检测由融合的“人源化”GFP-IGF-Ⅱ蛋白质中“人源化”GFP部分发出的荧光。现在更加详细地描述根据本发明显示的一种方法。A)克隆融合的IGFBP-6 cDNA-Renilla萤光素酶cDNA、融合的IGF-ⅡcDNA-“人源化”GFP cDNA和融合的胰岛素cDNA-“人源化”GFPcDNA首先，生产三种融合的cDNA:1)融合的IGFBP-6 cDNA和Renilla萤光素酶cDNA；2)融合的IGF-Ⅱ cDNA和“人源化”GFP cDNA；和3)融合的胰岛素cDNA和“人源化”GFP cDNA。IGFBP-6 cDNA,SEQ NO:1,Genbank收录号M69054，编码用作第一种蛋白质的SEQNO:2的IGFBP-6。Renilla萤光素酶cDNA,SEQ NO:3,Genbank收录号M63501，编码用作供体萤光素酶的SEQ NO:4的Renilla萤光素酶。IGF-Ⅱ cDNA,SEQ NO:5，编码用作第二种蛋白质的SEQNO:6的IGF-Ⅱ。“人源化”GFP cDNA,SEQ NO:7,Genbank收录号为U50963，编码用作受体荧光团的SEQ NO:8的“人源化”GFP。胰岛素cDNA,SEQ NO:9,Genbank收录号为AH002844，编码SEQNO:10的胰岛素。与“人源化”GFP融合的胰岛素用作蛋白质对照，因为胰岛素与IGF-Ⅱ同源，但不与IGFBP-6结合。SEQ NO:1的IGFBP-6 cDNA、SEQ NO:5的IGF-Ⅱ cDNA和SEQ NO:9的胰岛素cDNA用PCR如下进行修饰。
首先，将由EcoRⅠ片段携带的前原-IGF-Ⅱ cDNA克隆进pBluescript KS(+)Ⅱ载体。插入片段由T7和T3引物进行测序，确定包含已知的前原-IGF-Ⅱ cDNA序列。IGF-Ⅱ前体的5′端与pBluescriptKS(+)Ⅱ载体中的T7启动子相连。设计IGF-Ⅱ 3′引物以产生一个允许可察觉的(Notice of Allowance)限制性位点，从而去除前原-IGF-Ⅱ的D和E结构域，保持“人源化”GFP的允许可察觉的片段处于IGF-Ⅱ开放阅读框架中。
其次，IGF-Ⅱ片段使用T7启动子引物和IGF-Ⅱ 3′引物进行PCR扩增。PCR扩增的IGF-Ⅱ片段由EcoRⅠ和NotⅠ消化，克隆入pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen,Carlsbad,CA，美国)，产生pCDNA-IGF-Ⅱ。然后，“人源化”GFP的允许可察觉的片段插入pCDNA-IGF-Ⅱ的NotⅠ位点，产生pC-IGF-Ⅱ-GFP。
包含B、C和A结构域信号肽的前体胰岛素的cDNA按照以上相应于IGF-Ⅱ片段的方式进行修饰。然后将“人源化”GFP的cDNA连接到修饰的胰岛素cDNA之3′端相连，产生pC-INS-GFP。
最后，利用PCR从一个名为大鼠标记的人IGFBP6质粒中扩增IGFBP6 cDNA。IGFBP6的终止密码子被去除，其开放阅读框架符合来自pCEP4-RVC的Renilla萤光素酶cDNA的框架(Mayerhofer R,Langridge WHR,Cormier MG和Szalay AA。重组Renilla萤光素酶在转基因植物中的表达导致高水平光发射。植物杂志，1995；7；1031～8)。将Renilla萤光素酶cDNA连接到修饰的IGFBP-6 cDNA的3′末端，产生pC-IGFBP6-RUC。
所有构建体中插入DNA片段的序列通过DNA测试分析所证实。Qiagen Maxi质粒试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)用于纯化质粒DNA。B)用磷酸钙沉淀方法将pC-IGF-Ⅱ-GFP、pC-INS-GFP和pC-IGFBP6-RUC瞬时转染哺乳动物细胞紧接着，用克隆的融合DNA转染哺乳动物细胞。首先，COS-7细胞(非洲绿猴肾细胞，美国典型培养物保藏中心CRL 1651)在含有L-谷氨酰胺、10％胎牛血清和包含终浓度为青霉素100u/ml、链霉素100mg/ml和两性霉素B 250ng/ml(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO，美国)的抗霉菌抗生素溶液的Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM)中37℃于5％CO2条件下生长。转染前一天将每组1×106细胞铺板，转染时约有50％～60％的汇集。
每一质粒融合DNA 40mg沉淀后用Dulbecco′s磷酸缓冲盐溶液重悬，然后用标准的磷酸钙沉淀法将质粒融合DNA导入哺乳动物细胞。24小时后用荧光显微镜估计转染效率。在pC-IGF-Ⅱ-GFP DNA转染细胞的平板、pC-INS-GFP DNA转染细胞的平板以及用作阳性对照的只包含GFP的质粒DNA转染的平板中每个平板的绿色荧光细胞数目相类似。C)融合蛋白表达的证实用DNA磷酸钙沉淀方法转染DNA 24小时以后，用荧光显微镜通过检测GFP荧光可观察到质粒DNA转染的单个COS-7细胞。pC-IGF-Ⅱ-GFP和pC-INS-GFP转染的细胞显示出相类似的荧光模式，即典型的分泌蛋白质从ER向高尔基体转移。pC-IGFBP6-RUC转染的细胞不发荧光。然而，加入Coelenterazine后用低光成像系统显示pC-IGFBP 6-RUC转染的细胞发光。
进一步，预期分子量分别约为36kDa和56kDa的融合蛋白IGF-Ⅱ-GFP和IGFBP6-RUC可用免疫印迹分析法检测。这样可以确证瞬时转染细胞中两种融合蛋白的存在。D)通过分光荧光测定法检测蛋白质相互作用已经确证了预期融合蛋白IGF-Ⅱ-GFP和IGFBP 6-RUC的存在，以及供体萤光素酶和受体荧光团的功能后，这些瞬时转染细胞的细胞提取物可用于进行基于融合蛋白Renilla萤光素酶部分和“人源化”GFP部分之间能量传递的蛋白质结合实验。钙转染48小时之后，COS细胞用PBS洗2次，然后用细胞刮刀将细胞收获于包含0.5M NaCl、1mM EDTA和0.1M磷酸钾(pH7.5)的萤光素酶分析缓冲液中。收获的细胞用Fisher 550型超声破碎仪(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA，美国)以10秒间隔进行3次10秒超声，以产生细胞提取物。
接着，混合包含IGF-Ⅱ-GFP和IGFBP 6-RUC的细胞提取物，立即加入0.1μg coelenterazine。使用SPEX Fluoro Max(仪器S.A.,Inc.,Edison,NJ)进行分光荧光测定。光谱表明在471nm处有单一发射峰，其相应于已知的Renilla萤光素酶发射谱。
在第一次分光荧光测定之后，混合物室温保存30分钟，并加入新鲜的Coelenterazine重复示踪光谱。30分钟后示踪显示在471nm和503nm处有2个最大发射峰值。细胞提取物的分光荧光测定进行更长的时间，但光谱模式不随时间发生改变。
作为对照的pC-INS-GFP和pC-IGFBP 6-RUC转染细胞的提取物混合物按类似方法制备并进行光谱示踪。示踪显示仅在471nm处有一个峰，其相应于Renilla萤光素酶的发射峰。光谱模式不随时间改变。
因此，这些数据表明IGFBP-6和IGF-Ⅱ相互作用而胰岛素与IGFBP 6不发生相互作用。
除了以上公开的实施例，蛋白质-蛋白质相互作用也可以使用相应的方法在共转化的大肠杆菌和哺乳动物细胞中通过检测LRET进行检测。
尽管本发明已经相当详尽地讨论了有关的优选实施方案，其它实施方案同样可行。例如，除蛋白质以外的分子间相互作用可用相应的方法进行研究。其它分子可以靠扩散、输入和掺入或其它方式提供给活细胞。此外，基因工程化活细胞生产的融合蛋白可在研究相互作用之前进行翻译后修饰，如添加糖部分。同样，使用这些方法通过分光荧光测定法低光成像分析在细胞、集落和组织中观察活细胞。此外，可使用本发明方法结合微滴孔或多阵列检测的细胞分选术和低光成像分析，可完成高通量的集落筛选。因此，附加的权利要求的精髓和范围不应局限于这里包含的优选实施方案的描述。
序列表<110>Szalay,Aladar A.
Wang,YubaoWang-Pruski,GefuLoma Linda University<120>用于研究蛋白质体内相互作用的方法<130>11785-3PCT<140>在此提交<141>1999-09-02<150>60/135,835<151>1999-05-24<150>60/099,068<151>1998-09-03<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>918<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(3)..(719)<400>1tg tgc ccc cac agg ctg ctg cca ccg ctg ctg ctg ctg cta gct ctg 47Cys Pro His Arg Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu1 5 10 15ctg ctc gct gcc agc cca gga ggc gcc ttg gcg cgg tgc cca ggc tgc95Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Ala Leu Ala Arg Cys Pro Gly Cys20 25 30ggg caa ggg gtg cag gcg ggt tgt cca ggg ggc tgc gtg gag gag gag 143Gly Gln Gly Val Gln Ala Gly Cys Pro Gly Gly Cys Val Glu Glu Glu35 40 45gat ggg ggg tcg cca gcc gag ggc tgc gcg gaa gct gag ggc tgt ctc 191Asp Gly Gly Ser Pro Ala Glu Gly Cys Ala Glu Ala Glu Gly Cys Leu
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权利要求
1．一种测定活细胞内第一种蛋白质和第二种蛋白质是否相互作用的方法，方法包括a)在细胞内提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质；b)在细胞内放置复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质使之相互靠近；和c)检测来自受体荧光团的任何荧光；当第一种蛋白质靠近第二种蛋白质时，供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团；以及供体萤光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出荧光，则表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。
2．权利要求1的方法，其中提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA以及将基因工程化的DNA转入活细胞，这引起细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。
3．权利要求1的方法，其中提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
4．权利要求1的方法，其中提供了与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
5．权利要求1的方法，其中所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。
6．权利要求1的方法，其中所提供的受体荧光团为绿色荧光蛋白质。
7．权利要求1的方法，其中所提供的受体荧光团为水母绿色荧光蛋白质。
8．权利要求1的方法，其中采用分光荧光测定法检测来自供体萤光素酶的任何荧光。
9．一种测定活细胞内第一种分子和第二种分子是否相互作用的方法，方法包括a)在细胞内提供与供体萤光素酶复合的第一种分子和与受体荧光团复合的第二种分子；b)在细胞内放置复合的第一种分子和复合的第二种分子使之相互靠近；和c)检测来自受体荧光团的任何荧光；当第一种分子靠近第二种分子时，供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团；以及供体萤光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出荧光，则表明第一种分子与第二种分子已经发生了相互作用。
10．权利要求9的方法，其中第一种分子为第一种蛋白质，而第二种分子为第二种蛋白质；并且其中提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA和将基因工程化的DNA转入活细胞，这引起细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。
11．权利要求10的方法，其中提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
12．权利要求10的方法，其中提供了与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
13．权利要求9的方法，其中所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。
14．权利要求9的方法，其中所提供的受体荧光团为绿色荧光蛋白质。
15．权利要求9的方法，其中所提供的受体荧光团为水母绿色荧光蛋白质。
16．权利要求9的方法，其中用分光荧光测定法检测来自供体萤光素酶的任何荧光。
17．一种测定第一种蛋白质和第二种蛋白质是否相互作用的方法，方法包括a)提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质；b)将复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质相互靠近；和c)检测来自受体荧光团的任何荧光；当第一种蛋白质靠近第二种蛋白质时，供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团；以及供体萤光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出荧光，则表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。
18．权利要求17的方法，其中提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA以及将基因工程化的DNA导入活细胞，这引起细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质以及与受体荧光团复合的第二种蛋白质。
19．权利要求18的方法，其中提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
20．权利要求18的方法，其中提供了与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
21．权利要求17的方法，其中所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。
22．权利要求17的方法，其中所提供的受体荧光团为绿色荧光蛋白质。
23．权利要求17的方法，其中所提供的受体荧光团为水母绿色荧光蛋白质。
24．权利要求17的方法，其中使用分光荧光测定法检测来自供体萤光素酶的任何荧光。
25．一种测定第一种分子和第二种分子是否相互作用的方法，方法包括a)提供与供体萤光素酶复合的第一种分子和与受体荧光团复合的第二种分子；b)将复合的第一种分子和第二种分子相互靠近；和c)检测来自受体荧光团的任何荧光；当第一种分子与第二种分子靠近时，供体萤光素酶能够将发光共振能量传递给受体荧光团；和供体萤光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出荧光，则表明第一种分子和第二种分子已经发生了相互作用。
26．权利要求25的方法，其中第一种分子为第一种蛋白质而第二种分子为第二种蛋白质；以及其中提供与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质，包括基因工程化DNA和将基因工程化的DNA转入活细胞，这引起细胞产生与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。
27．权利要求26的方法，其中提供了与供体萤光素酶复合的第一种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
28．权利要求26的方法，其中提供了与受体荧光团复合的第二种蛋白质的细胞为哺乳动物细胞。
29．权利要求25的方法，其中所提供的供体萤光素酶为Renilla萤光素酶。
30．权利要求25的方法，其中所提供的受体荧光团为绿色荧光蛋白质。
31．权利要求25的方法，其中所提供的受体荧光团为水母绿色荧光蛋白质。
32．权利要求25的方法，其中采用分光荧光测定法检测来自供体萤光素酶的荧光。
全文摘要
一种用来测定活细胞内第一种蛋白质和另一种蛋白质是否相互作用的方法。该方法包含在细胞内提供与供体荧光素酶复合的第一种蛋白质和与受体荧光团复合的第二种蛋白质。允许复合的第一种蛋白质和复合的第二种蛋白质在细胞内彼此相互靠近。然后检测由供体荧光素酶发光共振能量传递导致受体荧光团发出的任何荧光,这里来自受体荧光团的荧光表明第一种蛋白质与第二种蛋白质已经发生了相互作用。
文档编号C12Q1/66GK1323353SQ99811958
公开日2001年11月21日 申请日期1999年9月2日 优先权日1998年9月3日
发明者A·A·加雷, 王玉葆, G·王－普鲁斯基 申请人:洛马林达大学