专利名称：碱性磷酸酶的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种通过光学测定来确定样品中碱性磷酸酶的方法，其特征在于，用450±10nm的主要测定波长与速率空白(rateblank)法结合起来消除血红蛋白的干扰；一种消除游离血红蛋白或血液代用品(所致)干扰的方法；以及主要测定波长与速率空白法结合在消除游离血红蛋白或血液代用品干扰方面的应用。
已知，溶血作用对某些旨在确定分析物的诊断方法具有相当大的干扰。溶血作用是指由于例如机械、渗透、化学或酶作用于红血球细胞膜导致的红血球的任何破坏。溶血作用导致血液色素——血红蛋白(Hb)的释放，致使血红蛋白无法再从样品中去除。血红蛋白的存在是个问题，因为，一方面，血红蛋白的吸收谱在某些情况下相当程度地重叠在待测物和指示剂(色原体)的光谱上，从而造成光度测定中的误差。另一方面，血红蛋白还能与样品成分发生化学反应生成同样会导致虚假测定值的物质。
近来，以血红蛋白为基础制造的血液代用品正越来越频繁地用于治疗目的，例如在大量失血后。血液代用品中的血红蛋白可以是天然的或者是合成的。通常也用Hb-类似化合物。与通常血红蛋白含量最高500mg/dl的溶血作用不同，用血液代用品治疗期间，血清或血浆中Hb含量可能超过2000mg/dl。因此，对含血液代用品样品的干扰要比对溶血样品明显得多，因为其血红蛋白或其合成类似物从一开始便处于游离形式。
游离血红蛋白造成的干扰在碱性磷酸酶的光度测定中尤为严重。碱性磷酸酶的测定是通过在405～415nm(吸收度的增加)测定4-硝基酚的生成来实现的。血红蛋白在415nm也有吸收。血红蛋白的存在对碱性磷酸酶测定的干扰表现在两个方面一方面，Hb谱在碱性介质中随时间而改变(吸收度增加)；另一方面，超过一定Hb含量，测定仪器就达到其光度计极限。
先有技术中公开了各种各样的方法，旨在消除血红蛋白对血清或血浆样品分析的光谱影响和化学影响。
Jay和Provasek在《临床化学》39/9，1804～1810(1993)中描述道血红蛋白对碱性磷酸酶测定的干扰系由Hb光谱随时间改变所致。此种干扰可利用数学校正算法(测定样品中Hb浓度并对碱性磷酸酶测定值做一个等价于Hb被测数量的数值的校正)予以消除。
虽然Jay和Provasek等人提出的数学校正方法能够消除最多至少800mg/dl Hb的Hb影响，然而用起来不十分方便，因为要求额外测定Hb含量，之后又需要进行附加的数学校正步骤。
Jay和Provasek(见上面)还描述了采用所谓速率-空白测定消除干扰的进一步方法。用速率-空白测定校正溶血干扰，也描述在EP-A-0695805中。按该方法，样品进行预反应以确定实际光度测定样品中所含某种成分之前的样品溶血程度。获得的测定值随后再用预先测定的数值——即，将溶血程度与干扰成分对测定误差的贡献大小进行关联所确定的数值——进行校正。
Hb干扰虽可利用速率-空白测定加以消除，但是最高仅限于Hb含量约1200mg/dl，因为Hb含量再增高时，已达到了光度计的极限。该极限对于消除溶血作用的干扰可能足够了，但是对于消除血液代用品引起的干扰则根本不够。
已公开的另一种消除血红蛋白干扰的方法是测定清蛋白(PCT申请WO97/45728)，其中血红蛋白干扰的消除是通过主要与次要波长的特定组合实现的。然而，该文中提到的波长组合无法用于碱性磷酸酶的测定，因为若在这样的波长范围测定，将不再能获得代表4-硝基酚的测定信号。
公开的出版物WO97/45733描述道，血红蛋白的干扰可利用单独紫外试验中546和570的次要波长予以消除。然而，该方法仅能用于主要测定波长等于340nm的酶催紫外测试。尽管单单靠次要波长546或570nm便可完全消除Hb的干扰，但是这对于像主要测定波长位于415nm区间的碱性磷酸酶测定这种酶催色原体检验来说却是不可能的。
美国专利5,766,872提到，577nm的次要波长可减少淀粉酶测定中溶血作用的干扰。但是，所援引的测定数据却表明，当达到500mg/dl的Hb含量时，就已经出现最高达8％的测定值显著偏差。这对于消除溶血干扰来说可能是足够了，但是在更高的Hb浓度下(例如，采用血液代用品治疗期间所出现的浓度)，该测定值偏差将由于约415nm主要测定波长的使用以及那时Hb干扰的消除将不再充分，而变得更大。
目前，先有技术中尚没有一种碱性磷酸酶的测定方法，在诸如含血液代用品样品中出现的那样高Hb浓度存在下也能不受干扰地实施。
因此，本发明目的是研发一种基本克服了先有技术缺点的测定样品中碱性磷酸酶的改良方法。具体地说，目的是提供一种简单和使用方便的方法，来消除碱性磷酸酶测定期间由血红蛋白和基于血红蛋白的血液代用品造成的干扰。
该目的是通过权利要求书中更详细描述的利用光学测定确定样品中碱性磷酸酶的方法实现的。该方法的特征在于，以450±10nm作为主要测定波长并结合实施速率空白程序。
令人惊奇地发现，Hb对碱性磷酸酶测定的干扰只需改变主要波长并采用速率空白程序便可有效地消除。要满意地消除Hb的干扰，仅改变主要波长或者仅采用速率空白程序都是不够的。
鉴于4-硝基酚的吸收谱(的位置)，不仅可以在415nm，也可以在450±10nm处测定碱性磷酸酶。尽管这样一来主要测定波长将不再位于检验反应通常的吸收峰，而是位于其一侧，但所获得的测定信号仍然足够满足精确测定碱性磷酸酶的需要。
虽然，新的主要测定波长450±10nm的选择已经导致血红蛋白干扰略有减少，但是令人惊奇的是，干扰的完全消除只有在将主波长450±10nm与速率空白程序结合使用时才能实现。
本发明方法首次实现了在最高Hb含量为至少3000mg/dl的范围内以简单的方式消除血红蛋白和血红蛋白类似化合物对碱性磷酸酶测定的干扰。该Hb干扰消除的上限是光度计操作所决定的极限。因此，本发明方法预计在最高6500mg/dl血红蛋白含量范围内可做到很好地消除干扰。
按本发明的速率空白程序，在实际光度测定样品所含某一成分之前，样品先进行预反应以确定样品的溶血程度。获得的待测组分测定值随后再用预先测定的数值——即，将溶血程度与干扰成分对测定误差的贡献大小进行关联所确定的数值——进行校正。速率空白程序本身在校正溶血干扰方面的应用，例如描述在EP-A-0695805以及Jay和Provasek在《临床化学》卷39/9，1804～1810(1993)中。
速率空白程序所采用的次要测定波长对本发明来说并不重要。还有，预反应和主反应测定的时间范围长度也不起决定作用。而测定预反应和主反应在1～4min期间的吸收度变化已证明是适宜的。
本发明方法适合测定任何含游离血红蛋白的样品。术语游离血红蛋白，就本发明意义而言，旨在用来将它与完好的红血球中存在的血红蛋白区别开来。含游离血红蛋白的样品的例子是溶血的血清或血浆样品或者含血液代用品的样品。属于术语游离血红蛋白范畴的血液代用品的例子，就本发明意义而言是衍生的、聚合的、改性的或交联的血红蛋白衍生物，特别是人体血红蛋白或牛血红蛋白，例如DCL血红蛋白(双阿司匹林-交联的血红蛋白)或重组生成的血红蛋白。
本发明还涉及在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离血红蛋白所致干扰的方法。该方法的特征在于，主要测定波长450±10nm与速率空白程序的结合运用。
本发明另一个主题是，主要测定波长450±10nm与速率空白程序的结合，在消除碱性磷酸酶测定方法中游离血红蛋白或用血红蛋白制造的血液代用品所致干扰上的应用。
本发明将通过下列实施例加以阐明。
实例a)含血红蛋白样品的制备将含Hb的溶液加入到一份取自某一血清源的血清中，达到至少3000 mg/dl的Hb含量。来自同一血清源的另一份相同体积血清与等当量氯化钠溶液(154mmol/l)彼此混合。随后，这两份彼此以不同比例混合，从而获得11个样品组成的Hb浓度系列，其中最低的样品中不含Hb，而最高的样品中有至少3000mg/dl Hb。
b)按SFBC法测定碱性磷酸酶根据Ann.Biol.Clin，卷35，271(1977)所载SociétéFrancaisede Biologie Clinique(法国临床生物学学会)建议的方法测定碱性磷酸酶的测定是在Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析仪上进行的。
采用下列试剂试剂1930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，pH10.5；
1.03mmol/l天冬氨酸镁；试剂2930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，pH10.5；1.03mmol/l天冬氨酸镁；98mmol/l磷酸4-硝基苯酯试验程序如下250μl试剂1加入到11μl样品中，5min后，加入50μl试剂2。作为对比测定，又经过50秒后测定分析物，期间测定随后4min内的吸收度变化。下面的主要测定波长(λ1)和次要测定波长(λ2)结合起来用于测定λ1/λ2＝415/660nm(以往的仪器设定值)、415/570nm和450/660nm(对比)。又按照Jay和Provasek提出的速率空白测定法测定了另一些碱性磷酸酶作为进一步的比较(称作415/660nm RB)。
采用测定波长组合λ1/λ2＝450/660nm测定本发明分析物。对于速率空白测定，试剂1加入到样品中以后3.0～4.9min内测定预反应的吸收度变化；试剂1加入到样品中以后7.9～9.8min内测定主反应的吸收度变化。这在Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析仪上对应于测定点[10]-[16]和[25]-[31]。结果载于标记为“450/660nm RB”的一栏中。
按本发明的测定结果以及对比测定结果载于下表1中。可以看出，采取450nm的新主要波长与速率空白程序这样的创造性组合，与其他测定波长组合或者与在415nm的主要波长处的速率空白测定相比，可大大减少含Hb血液代用品的干扰。表137℃下测定的碱性磷酸酶含量，U/l
*此时采用交联的血红蛋白。
权利要求
1.一种通过光学测定来确定样品中碱性磷酸酶的方法，其中采用450±10nm的主要测定波长与速率空白程序的组合。
2.权利要求1的方法，其中测定是在血清或血浆样品中进行的。
3.以上权利要求中任何一项的方法，其中所测定的样品含有游离血红蛋白或以血红蛋白为基础制造的血液代用品。
4.以上权利要求中任何一项的方法，其中血液代用品含有衍生的、改性的或交联的人体血红蛋白、牛血红蛋白或重组生成的血红蛋白。
5.以上权利要求中任何一项的方法，其中样品的血红蛋白含量最高6500mg/dl。
6.一种在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离血红蛋白或血液代用品引起的干扰的方法，其中采用450±10nm的主要测定波长与速率空白程序的组合。
7.一种450±10nm的主要测定波长与速率空白程序相结合在消除碱性磷酸酶测定方法中游离血红蛋白或血液代用品干扰方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种通过光学测定确定样品中碱性磷酸酶的方法,其特征在于,用450±10nm的主要测定波长与速率空白技术结合起来消除血红蛋白的干扰。本发明还涉及一种消除游离血红蛋白或血液代用品(所致)干扰的方法,以及主波长与速率空白技术结合在消除碱性磷酸酶测定期间游离血红蛋白或血液代用品造成的干扰方面的应用。
文档编号C12Q1/42GK1322255SQ99811934
公开日2001年11月14日 申请日期1999年10月5日 优先权日1998年10月8日
发明者R·维谢特, W·特雷贝尔 申请人:罗赫诊断器材股份有限公司