红景天和酸枣仁复合多糖在制备抗神经退行性疾病保健食品中的应用_2

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[0032]实施例1
[0033]本实施例提供的一种红景天和酸枣仁复合多糖,其通过如下方法制备获得:将红景天和酸枣仁药材按照重量比1:1进行混合,其中红景天是指红景天的药用部位根茎,酸枣仁是指酸枣的药用部位种子,下同,粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加水,在90°C下加热搅拌提取4h。过滤获得的药渣按照料液比为1:5 (g/mL)加水,在90°C下继续提取4h。合并两次提取液,经过减压浓缩和离心获得澄清浓缩液,按照1:4体积比将4倍体积95 % (体积百分含量,下同)乙醇加入浓缩液中,混匀后于4°C下过夜静置沉淀,离心收集沉淀,经过真空冷冻干燥即获得复合多糖。
[0034]或将红景天粉碎后按照料液比1:10(g/mL)加水,在90°C下加热搅拌提取4h。过滤获得的药渣按照料液比为1:5 (g/mL)加水,在90°C下继续提取4h。合并两次提取液,经过减压浓缩和离心获得澄清浓缩液,按照I: 4体积比将4倍体积95 %乙醇加入浓缩液中,混匀后于4°C下过夜静置沉淀,离心收集沉淀,经过真空冷冻干燥即获得红景天多糖,酸枣仁多糖的制备方法同红景天多糖,将酸枣仁多糖与红景天多糖按1:1的质量配比混匀,制备获得红景天和酸枣仁复合多糖。
[0035]采用第一种方法和第二种方法制备的红景天和酸枣仁复合多糖,二者性能等基本相同,无论采用哪一种方法制备红景天和酸枣仁复合多糖均可。
[0036]实施例2
[0037]本实施例提供的一种红景天和酸枣仁复合多糖,其通过如下方法制备获得:将红景天和酸枣仁药材按照重量比2:3进行混合,粉碎后按照料液比1:15 (g/mL)加水,在90°C下加热搅拌提取6h。减压浓缩后离心获得澄清浓缩液,按照1:3体积比将3倍体积95%乙醇加入浓缩液中,混匀后于4°C下过夜静置沉淀,离心收集沉淀,经过真空冷冻干燥即获得复合多糖。
[0038]本实施例也可以同实施例1中一样分别采用红景天或酸枣仁为原料,制备红景天和酸枣仁复合多糖。
[0039]实施例3
[0040]本实施例提供的一种红景天和酸枣仁复合多糖,其通过如下方法制备获得:将红景天和酸枣仁药材按照重量比3:2进行混合,粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加水,在95°C下加热搅拌提取3h。过滤获得的药渣按照上述料液比、温度和时间继续提取一次。合并两次提取液,经过减压浓缩和离心获得澄清浓缩液,按照I: 2体积比将2倍体积95 %乙醇加入浓缩液中,混匀后于4°C下过夜静置沉淀,离心收集沉淀,经过真空冷冻干燥即获得复合多糖。
[0041]本实施例也可以同实施例1中一样分别采用红景天或酸枣仁为原料,制备红景天和酸枣仁复合多糖。
[0042]实施例4
[0043]本实施例提供的一种红景天和酸枣仁复合多糖,其通过如下方法制备获得:将红景天和酸枣仁药材按照重量比4:1进行混合,粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加水,在75°C下加热搅拌提取3h。过滤获得的药渣按照上述料液比、温度和时间继续提取两次。合并三次提取液,经过减压浓缩和离心获得澄清浓缩液,按照I: 9体积比将9倍体积95 %乙醇加入浓缩液中,混匀后于4°C下过夜静置沉淀,离心收集沉淀,经过真空冷冻干燥即获得复合多糖。
[0044]本实施例也可以同实施例1中一样分别采用红景天或酸枣仁为原料,制备红景天和酸枣仁复合多糖。
[0045]实施例5
[0046]本实施例提供的一种红景天和酸枣仁复合多糖,其通过如下方法制备获得:将红景天和酸枣仁药材按照重量比1:2进行混合,粉碎后按照料液比1:15 (g/mL)加水,在50°C下加热搅拌提取lh,提取3次,合并滤液,减压浓缩后离心获得澄清浓缩液,按照2:1体积比将0.5倍体积95 %乙醇加入浓缩液中,混匀后于4°C下过夜静置沉淀,离心收集沉淀,经过真空冷冻干燥即获得复合多糖。
[0047]本实施例也可以同实施例1中一样分别采用红景天或酸枣仁为原料,制备红景天和酸枣仁复合多糖。
[0048]实施例6
[0049]转基因秀丽线虫CL2355是在体内神经元中表达A β 42蛋白,其聚集能够产生显著的神经毒性,从而导致秀丽线虫的趋化行为能力下降,因此可以利用该模型研宄复合多糖对毒性蛋白胁迫的缓解作用。将实施例1制得的复合多糖和单一多糖,以2mg/mL浓度分别加入LI期CL2355幼虫中,对照组加入等体积的S Medium。在16°C下培养36h后,转移至23°C中再次培养36h。取9cm培养皿,用lmol/L甘油在中间划条直线,在左半圆形区域加Λ 1.5 μ L0.5%苯甲醛的乙醇溶液和1.5 μ Llmol/L叠氮化钠溶液,标记为A区。在右半圆区域的相同位置加入1.5 yL乙醇和1.5 yL lmol/L叠氮化钠溶液,标记为B区。将CL2355秀丽线虫转到培养皿中央后于23°C下孵育lh,然后分别统计A区和B区的线虫数量,趋化率=(A区数目-B区数目)/线虫总数。数据以mean土SD表示,采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0050]结果如图1A所示,与对照相比,采用复合多糖处理的CL2355线虫在苯甲醛区域的数目更多。图1B统计结果显示,未处理CL2355线虫的趋化率仅为34.8%,而复合多糖、红景天多糖和酸枣仁多糖在2mg/mL浓度时能够将趋化率分别显著提高至55%、47.3%和44.1%
[0051](P ( 0.05)。相比于单一多糖,复合多糖改善毒性蛋白Αβ诱导的行为缺陷的活性更好,表明其具有缓解神经退行性病症的作用。
[0052]实施例7
[0053]秀丽线虫转基因模型ΗΑ759是利用渗透压相关基因osm_10促使polyQ40片段在其头部ASH神经元中表达,由于polyQ40的聚集能产生显著毒性,ASH神经元将发生进行性衰亡(表现为荧光消失),因此可通过观察ASH神经元存活率研宄复合多糖对毒性蛋白胁迫的缓解作用。将实施例2制得的复合多糖和单一多糖,以2mg/mL浓度分别加入LI期的HA759幼虫中,对照组加入等体积的S Medium。在15°C下培养3天后收集线虫,加入叠氮化钠溶液使线虫麻痹,混匀后滴加在琼脂糖垫上,在荧光显微镜下观察每条秀丽线虫ASH神经元的GFP荧光点。每个处理组随机统计?50条线虫,ASH神经元存活百分率=ASH神经元存活的线虫数目/(ASH神经元存活的线虫数目+ASH神经元死亡的线虫数目)X100%。存活率以mean土 SEM表不,使用one-way ANOVA分析和Tukey post-hoc test比较多糖组和对照组的差异性。
[0054]结果如图2A所示,未经多糖处理的HA759秀丽线虫的ASH神经元因polyQ聚集而衰亡(荧光消失),加入复合多糖后ASH神经元依然存活(荧光存在)。图2B显示,未处理HA759秀丽线虫的ASH神经元在3天后的存活率为36.4%,采用2mg/mL复合多糖和红景天多糖处理后,ASH神经元存活率分别显著提高至49.2%和45.1% (p彡0.05),酸枣仁多糖(41.3% )在2mg/mL浓度下不能显著提高ASH神经元存活率。该结果表明复合多糖能够抑制易聚蛋白PolyQ的毒性胁迫反应,具有缓解神经退行性病症的作用。
[0055]由于ASH神经元具有高渗回避功能,因此在同时受到引诱和高渗溶液阻拦时,ASH神经元未衰亡的秀丽线虫能够保留回避高渗溶液的行为特征,而ASH神经元死亡的秀丽线虫将丧失对高渗溶液的回避能力。因此利用HA759秀丽线虫模型可以检测复合多糖对毒性蛋白诱导行为缺陷的缓解作用。将实施例2制得的复合多糖和单一多糖,以2mg/mL浓度分别加入LI期的HA759幼虫中,对照组加入等体积的S Medium。在15°C下培养3天后收集线虫。以SM甘油(高渗试剂)、双乙酰(引诱试剂)、叠氮化钠(麻醉剂)制备趋化回避平板,将处理后的秀丽线虫置于平板上,在20°C中培养1.5h后取出统计秀丽线虫的分布数目。回避率计算公式如下:回避率=(回避区内线虫数目/线虫总数)X100%,回避率以mean土SD表示,使用one-way ANOVA分析和Tukey post-hoc test比较多糖组和对照组的差异性。
[0056]结果如图2C所示,对照组有42.3%的秀丽线虫在高渗溶液甘油附近表现出回避行为,采用2mg/mL复合多糖和红景天多糖处理后,HA759秀丽线虫的回避率分别显著提高至61%和52.3% (P彡0.05),而酸枣仁多糖(47.2%)在2mg/mL浓度下不能显著提
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