为30min，完成后放掉冰盐水；
[0032](3)滚筒内再加入含明矾的冰水，章鱼:冰水:明矾=100: 100: 0.5，滚揉时间为5min，完成后取出章鱼，用低温清水进行冲洗，彻底去除体表粘液和杂物；
[0033](4)将清洗后的章鱼放入盐糖水(5%盐，3%葡萄糖)中腌制30min ；
[0034](5)在蒸煮锅中加水，将水加热至95°C后，放入1.5%盐和3%的葡萄糖，再放入腌制章鱼(章鱼:水=I: 4)漂烫5min ；
[0035](6)用常温水冷却5min，再放入含0.05%醋酸的冰水中冷却30min ;取出冷却后的章鱼控去多余水分，真空包装(抽真空40s，热封4s)；
[0036](7)包装后的章鱼采用高温高压(0.1MPa, 121°C )杀菌20min ；
[0037](8)杀菌后章鱼产品用清水冷却至40°C，擦干包装表面水分，装箱于-18°C冷冻保存。实施例2:低致敏性熟制章鱼的体外模拟胃液消化
[0038](I)熟制章鱼蛋白粗提物制备。取加工后的章鱼肉加入5倍体积(v/w)的冰冷含 0.5mol/L NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液(20mmol/L, pH 8.0)，进行组织捣碎，离心(12000g，10min，4°C )，取上清，即为章鱼蛋白粗提物。
[0039](2)体外模拟胃液消化。参照美国药典体外模拟胃液消化的方法稍作改进。使用猪胃蛋白酶参与模拟胃液消化实验，所用的胃蛋白酶酶活力为109U/mg蛋白。使用ImL模拟胃液(含50mmol/L NaCl，pHl.2)反应体系，胃蛋白酶与章鱼蛋白粗提物的比例为I: 200 (w/w)，反应液中粗提物终浓度为5mg/mL。在37°C水浴锅中振荡进行反应，分别在O、1、2、5、10、15、30、60min时取出100 μ L反应液，立即加入30 μ L终止液(200mmol/L Na2CO3溶液)混合均匀以终止反应，并冰浴以待取用。其中Omin是将终止液先加入含有胃蛋白酶的模拟胃液中中和后，再加入底物。对照反应为不添加蛋白酶的反应，其余条件不变。
[0040](3)消化产物的电泳检测及免疫印迹分析。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电(SDS-PAGE)对消化后的产物进行蛋白质电泳分析。配制12% SDS-PAGE，将SDS化的模拟胃液消化的样品取10 μ L上样进行电泳。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液进行染色，脱色后用凝胶成像仪拍照。采用western blotting进行免疫印迹分析，将经过SDS-PAGE分离的样品通过半干式电转移装置转移至硝酸纤维素膜上，用兔抗章鱼原肌球蛋白多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体作为二抗，以ECL显色液进行显色，使用化学发光成像系统进行显色拍照。结果显示经加工处理的肌肉粗提物明显减少，且比较容易被胃蛋白酶降解。其中主要蛋白是热稳定性比较好的TM。在胃蛋白酶作用下，大部分蛋白在反应Imin时已经看不到明显条带，TM在1min时也几乎被完全降解。通过westernblotting检测TM免疫活性，肌肉中TM更易被胃蛋白酶降解，但是其降解仍然具有免疫活性，直到60min时，才完全被降解，免疫活性消失。
[0041]实施例3:低致敏性熟制章鱼的体外模拟肠液消化
[0042](I)熟制章鱼蛋白粗提物制备。方法同实施例2步骤(I)。
[0043](2)体外模拟肠液消化。参照美国药典体外模拟肠液消化的方法稍作改进。使用猪胰蛋白酶参与模拟肠液消化实验，所用的胰蛋白酶酶活力为360U/mg蛋白。使用ImL模拟肠液液(PH7.5)反应体系，胰蛋白酶与章鱼蛋白粗提物的比例为1: 200(w/w)，反应液中粗提物终浓度为5mg/mL。在37°C水浴锅中振荡进行反应，分别在O、1、5、15、30、60、120、240min时取出100 μ L反应液，立即转入95°C水浴锅灭活5min以终止反应，随后冰浴以待取用。其中Omin是将终止液先加入含有胰蛋白酶的模拟肠液预先在95°C终止反应后，再加入底物。对照反应为不添加蛋白酶的反应，其余条件不变。
[0044](3)消化产物检测及免疫印迹分析。方法同实施例2步骤(3)。结果显示。肌肉经过加工处理后，其粗提物中蛋白主要剩下45kDa蛋白和TM ;在胰蛋白酶作用下，随着时间的延长两种蛋白都很快被降解，在30min时已经几乎被完全降解，在60min后已经完全被降解。通过western blotting检测发现，在胰蛋白酶作用下，TM在5min时已经产生了比较多的降解条带，在120min时几乎看不到条带，几乎完全被降解。
[0045]实施例4:加工过程中章鱼的消化产物致敏性的酶联免疫吸附(ELISA)检测
[0046](I)将章鱼蛋白粗提物用包被液稀释后包被在96孔酶标板上，体积为100 μ L/孔，每孔包被蛋白量为200ng，密封表面后于4°C孵育16h。然后倾去孔内液体，拍干，用TBST清洗300 μ L/孔，反复5次。拍干板内液体后，加入5%脱脂奶封闭，300 μ L/孔，37°C，1.5h。
[0047](2)于另一块未包被的酶标板上加入30 μ L/孔过敏患者血清(1: 2，用1%脱脂奶稀释)，并与等量的抑制剂一一过敏原的消化产物(消化酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶分别消化lh，4h，4h后的产物)以及未消化的过敏原蛋白混合，在37°C孵育2.5h，过敏原蛋白消化产物作为抑制剂用1%脱脂奶按1: 10稀释。
[0048](3)将步骤⑴中的孵育后的酶标板中脱脂奶倾去，用TBST清洗5遍，然后加入
(2)中反应过后的混合液50 μ L/孔，置于37°C继续孵育1.5h。而后再倾去并洗涤，加入HRP标记的羊抗人IgE 二抗(I: 2000) 100 μ L/孔，37°C孵育1.5h。倾去液体洗净之后，加入TMB显色液100 μ L/孔，37°C孵育20min，用2mol/L硫酸终止反应，在450nm波长下用酶标仪进行吸光值测定。抑制率计算:抑制率) = (X-Y) + (X-Z) X 100，其中X是过敏患者血清没有加抑制剂的吸光值，Y和Z分别是阳性血清和阴性血清与不同稀释梯度的抑制剂竞争孵育后的吸光值。抑制性ELISA分析结果显示，章鱼经过加工处理后，与未处理组相比，其IgE结合活性经过初步美拉德反应后略有降低，之后经过高温高压处理，其致敏性有了显著下降。
【主权项】
1.一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将章鱼原料预处理后，在目与目之间切口至牙的位置，放入滚筒内，再加入冰盐水，滚揉后放掉冰盐水； 2)在滚筒内加入冰明矾水，继续滚揉，取出章鱼，清洗； 3)将清洗后的章鱼放入盐糖水中腌制； 4)将锅中的水加热，再放入盐和还原糖，然后放入步骤3)腌制后的章鱼，漂烫； 5)将步骤4)漂烫后的章鱼冷却，再放入含醋酸的冰水中冷却，取出后沥干，真空包装，杀菌后冷却，擦干包装表面水分，装箱保存。2.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤I)中，所述章鱼原料采用新鲜或冰鲜章鱼原料。3.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤I)中，所述预处理是将章鱼原料去除有臭味的章鱼，将章鱼内脏去除，并清洗表面和腕足部位污物泥沙。4.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤I)中，按质量比，所述章鱼原料:冰水:盐为100: 100: (5?10)。5.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤I)中，所述滚揉的时间为20?40min。6.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤2)中，按质量比，章鱼原料:冰水:明矾=100: 100: (0.3?0.8);所述继续滚揉时间可为3?1min ;所述清洗可用低温清水进行冲洗，去除章鱼体表粘液和杂物。7.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤3)中，所述盐糖水按质量百分比的组成为盐5 %，还原糖I %?5 %，余量为水；所述还原糖可选自葡萄糖或核糖；所述腌制的时间可为20?40min，腌制的温度可低于10°C。8.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤4)中，所述加热的温度为90?100°C;所述盐和还原糖的加入量按质量百分比可为1.5%盐和I %?3%还原糖；所述还原糖可选自葡萄糖或核糖；按质量比，腌制后的章鱼:水可为1: 3?5 ;所述漂烫的时间可为3?lOmin。9.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤5)中，所述漂烫后的章鱼冷却采用常温水冷却5?15min ;所述放入含醋酸的冰水中冷却可放入按质量百分比含0.02%?0.08%醋酸的冰水冷却30?60min。10.如权利要求1所述一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，其特征在于在步骤5)中，所述真空包装的条件是抽真空30?50s，热封2?4s ;所述杀菌的条件可采用121°C、0.1MPa下的高温高压杀菌10?30min ;所述杀菌后冷却可采用清水冷却至35?40°C;所述装箱保存的温度可为-18°C。
【专利摘要】一种低致敏性熟制章鱼的加工方法，涉及食品加工。将章鱼原料预处理后，在目与目之间切口至牙的位置，放入滚筒内，再加入冰盐水，滚揉后放掉冰盐水；在滚筒内加入冰明矾水，继续滚揉，取出章鱼，清洗；将清洗后的章鱼放入盐糖水中腌制；将锅中的水加热，再放入盐和还原糖，然后放入腌制后的章鱼，漂烫；将漂烫后的章鱼冷却，再放入含醋酸的冰水中冷却，取出后沥干，真空包装，杀菌后冷却。解决了传统章鱼加工过程中难以降低章鱼致敏性的难题。采用盐糖水对章鱼进行短时的腌制处理，利用还原糖与过敏原蛋白质在漂烫及高温高压杀菌过程中发生的美拉德反应来降低章鱼的致敏性，同时保持章鱼原有的口感和风味。操作简便、成本低、易实现规模化生产。
【IPC分类】A22C29/00, A23L1/333
【公开号】CN104939156
【申请号】CN201510371519
【发明人】刘光明, 陈仲玮, 张凌晶, 杨阳, 曹敏杰, 蔡秋凤
【申请人】集美大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月30日