专利名称：杀菌/通透性增强蛋白质功能区生物活性肽的制作方法
技术领域：
本发明属于用于治疗人体细菌感染和内毒素血症的活性多肽分子，具体涉及杀菌/通透性增强蛋白质(BPI)功能区生物活性肽--BPI变构肽。
革兰氏阴性(G-)细菌引起的脓毒症是导致临床病人死亡的重要原因之一，其中存在于G-细菌外膜的脂多糖(内毒素，LPS)起着重要的作用。针对G-菌的治疗主要是采用抗生素来杀灭细菌。但是抗生素在杀灭细菌的同时导致内毒素的大量释放，其结果往往是病人死于严重的内毒素血症，这一直是临床亟待解决的难题。
目前已有一些或具有中和内毒素能力或具有杀菌作用的多肽分子，如从鲎血细胞提取的抗内毒素因子(LALF)，从多粘菌中提取的多粘菌素B1。和LALF一样，多粘菌素的类似物由于缺乏脂肪酸基因，虽然可以和LPS结合但无杀菌能力。又如Cecropins和magainins是两种具有杀菌功能的肽类化合物，此类肽的氨基酸长度多在20-40之间，杀菌能力最强的Cecropin是Cecropin A，但它们的中和内毒素作用却不强。为此寻找一种既能杀灭细菌又能中和细菌死亡后释放的内毒素的活性多肽分子，将是一项非常有意义的工作。
人体存在许多抵御外来微生物侵袭的防御机制，其中白细胞是一重要环节，杀菌/通透性增强蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)就是从哺乳类动物白细胞嗜天青颗粒中分离出的蛋白质。人源BPI已由weiss(Weiss J.et al.1987.Blood 69:652)在1987年利用酸抽提及亲合层分析分离成功，其分子量为55KD，其cDNA及氨基酸序列已由Gray(Gray PW.Et al.1989.J.Bio.Chem.264:9505)证实。研究结果表明其具有强大而广谱的杀灭G-细菌及中和内毒素的能力。
BPI特异杀灭G-细菌的机制可能与带正电的BPI与带负电脂多糖相互吸引，细菌表面电位发生变化，从而导致细菌外膜通透性的改变有关。同时，BPI还具有中和LPS毒性的能力，因此BPI可应用于治疗由G-细胞引起的感染性疾病，包括菌血症、内毒素血症、脓毒症等。不仅全序列的BPI具有杀菌和中和内毒素的能力，而且N末端的199个氨基酸(rBPI23)也具有完整BPI的全部生物学功能，不过C末端仅有轻微或无杀菌能力(Ooi CE.et al.1991 J.Exp.Med.174:649)。但是rBPI23在对细菌感染和LPS血症的治疗时，需要绝对的量才能达到杀灭细菌和中和LPS的目的，存在用量较大、成本较高等问题。据文献报道(J5 Study Group.1992J.Infect Dis.165:695,Ziegler EJ.et al.1991 New Eng J.Med.324:429),BPI功能区主要由三大部分组成，①BPI 17-45氨基酸序列，②BPI 65-99氨基酸序列，③BPI 142-169氨基酸序列，也就是说BPI杀菌和中和LPS的生物活性区域分别存在于这三个氨基酸序列的区域内。因此寻找出更小的既能杀灭细菌又能中和内毒素的BPI功能区结构，以及在此基础上寻找新的杀菌和中和LPS活性更强、生产成本更低的多肽分子，并能产业化生产以满足临床治疗的需要，是一个十分重要的研究课题。
本发明是申请人的、申请号为99105075.4的发明的延续，其目的在于利用现今公知的合成方法提供可稳定重复生产的，包括全部或部分BPI生物功能如杀菌、中和内毒素活性的、新的小分子量多肽分子--BPI变构肽。
本发明主要通过在BPI功能区的一个位点置换不同的氨基酸，或在2个以上不同位置置换同一氨基酸或不同氨基酸，以得到具有BPI同样功能的活性短肽--线性的BPI功能区片段变构体。
上述本发明所定义的这种BPI变构肽，具有以下特征(一)SEQ ID NO:5(BPI F)(1)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:5N’--YCA/LQK/RFI/LKM/C--C’或Tyr Cys Ala Leu Gln Lys Arg Phe Ile Leu Lys MetCys(二)SEQ ID NO:6(BPI G)的资料
(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:6N’--KSK/VGF/LQL/LFH/KK--C’或Lys Ser Lys Val Gly Phe Leu Gln Leu Leu Phe His LysLys(三)SEQ ID NO:7(BPI H)的资料(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:7N’--KGK/GV/FLQ/IQL/FHK--C’或Lys Gly Lys Gly Val Phe Leu Gln Ile Gln Leu PheHis Lys(四)SEQ ID NO:8(BPI I)的资料(1)序列特征(A)长度24氨基酸
(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:8N’--KSK/VGF/LIQ/LFH/KKL/RGS/LTK/LKG--C’或Lys Ser Lys Val Gly Phe Leu Ile Gln Leu Phe HisLys Lys Leu Arg Gly ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly。
本发明所提供的BPI变构肽，可按Merrifield等(MerrifieldRB.1963 J Am Chem Soc.85:2149)报告的公知的合成方法合成，这是一种众所周知的固相化学合成技术，氨基酸为Fmoc保护的氨基酸，合成用树脂为PEG-PS树脂。合成时按多肽顺序由C端逐个向N端延伸，缩合剂为DCCI，加85％HOBT/DIEA以活化氨基酸的羧基，每轮循环用Piperidine-DMF1∶4除去Fmoc。本发明物是在PE公司的Pioneer多肽自动合成仪上进行合成，根据给定的BPI变构肽氨基酸序列，多肽自动合成仪能自动完成各种反应程序而得到所需的BPI变构肽片段，最后用三氟醋酸法将多肽从树脂上切割并除去所有的保护基团，合成得到的多肽须经过BioCAD系统分离纯化纯化柱 POROS R1 20或POROS R2 20反相柱，4.6mm×100mm流动相A 0.1％三氟醋酸(TFA)流动相B 100％乙晴/0.1％TFA10 to 100％流动相B线性梯度洗脱检测波长220nm
流速5.0ml／min.
主峰面积占整个峰面积的比例为纯度。再经Sephadex G-25脱盐，样品冷冻干燥后经质谱鉴定、N端氨基酸序列分析测定分子量并确认其氨基酸序列。
实施例BPI H的制备采用Pioneer多肽自动合成仪进行合成，具体步骤为 (输入BPI H氨基酸序列)-- (85％HATU/DIEA) (Lys-PEG-PS 5g，柱25x25mm)-- (活化氨基酸1min，氨基酸脱保护(Piperidine-DMF1:4)8 min)-- (20min)-- (15min，每步效率大于98％，时间45min) (TFA∶H2O=95∶5),40min (2.6g，得率96％)上述所得到的粗肽溶液，在以下纯化条件下进行纯化纯化柱POROS R1 20反相柱，4.6mm×100mm流动相A0.1％三氟醋酸(TFA)流动相B100％乙晴/0.1％TFA10 to 100％流动相B线性梯度洗脱检测波长220nm流速5.0ml/min.
收集主峰溶液，再经Sephadex G-25脱盐，溶液冷冻干躁，得到1.9g纯度为86.53％(HPLC百分面积)的BPI H变构肽。经质谱鉴定、N端氨基酸序列分析测定分子量并确认其氨基酸序列；同样，采用与上述合成BPI H变构肽相同的设备、工艺条件及相近的原料，合成得到的BPI F、BPI G及BPI I变构肽，经质谱鉴定、N端氨基酸序列分析测定分子量并确认其氨基酸序列，其结果如表1所示表1 BPI变构肽质谱、N末端氨基酸序列分析结果
这些短肽--BPI变构肽，及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽，或这些肽作为稀释剂、佐剂及载体，都具有杀灭G-、G+及真菌和中和LPS□的多种功效，可用于细菌性感染疾病的治疗，包括对传统抗生素耐药的细菌性感染的治疗，也可应用于治疗内毒素血症。
本发明的BPI变构肽的问世，由于其分子量小，治疗剂量小，成本低，而且可通过化学合成法合成，因而可实现工业化生产。BPI变构肽生物活性检测1．中和内毒素活性
图1是本发明的BPI变构肽中和LPS能力的测试图。多粘菌素B为阳性对照。将各种BPI变构肽与内毒素0111B4混匀，37℃孵育30分钟，间断摇晃，然后加入pH8.0磷酸盐缓冲液(PBS)，使内毒素终浓度为200pg/ml，最后采用基质显色法鲎试剂盒检测内毒素含量。结果见图1，说明BPI变构肽在体外均有中和LPS的作用，其中以BPIF的活性最高。
2．抑制肿瘤坏死因子(TNF)的产生人单核细胞株(THP-1)受内毒素刺激后可释放TNF，且有剂量依赖关系，中和内毒素后，TNF必将减少，TNF的量可采用ELISA法检测(试剂盒由Roch公司提供)。
图2是本发明的BPI变构肽抑制肿瘤坏死因子能力的测试图。将THP-1培养于RPMI1640中，细胞悬液离心后用新鲜RPMI1640配成1×105/ml，接种于96孔培养板，加入大肠杆菌0111B4内毒素5ng/ml,37℃培养6小时，每孔中分别加入BPI变构肽0.1ug/ml至100ug/ml，离心，取上清，测TNF含量，结果表明BPI在浓度为0.1ug/ml即产生明显的抑制TNF产生的作用。
3．杀菌活性检测图3是本发明的BPI变构肽杀菌活性的测试图。检测细菌为大肠杆菌J5,0111B4，先将细菌复苏于普通琼脂平板，挑取单个菌落接种于5ml M-H肉汤，37℃,3-4h至细菌生长于对数期。1000rpm/min离心5分钟，弃上清，沉淀用5mlPBS冲洗，离心后用M-H肉汤稀释至2×106cfu/ml加入BPI变构肽，按200μg/ml倍比稀释至每管，37℃振荡孵育20小时，于590nm处读取吸光度。另取50ul菌液于血晾脂平板上，过夜培养计数，结果说明几种BPI变构肽在体外有杀菌作用，BPI F效果最好。
4．对小鼠内毒素血症的治疗作用小鼠尾静脉注射大肠杆菌0111B4内毒素，LD90为20mg/kg。然后迅速同途径注射不同剂量BPI变构肽(剂量为1mg/kg或5mg/kg体重)，用地塞米松为阳性对照，生理盐水为空白对照，观察7天后动物死亡率。结果见表2。
表2 BPI变构肽对小鼠内毒素血症模型的保护作用
结论BPI变构肽对LPS(20mg/kg体重)攻击的小鼠有明显的保护作用。
5．对小鼠腹膜炎的保护作用小鼠腹腔注入活大肠杆菌0111B4,1×107cfu/ml 0.5ml，随即注入1ml BPI变构肽(剂量为1或5mg/kg体重)，以多粘菌素B为阳性对照，生理盐水为空白对照，观察动物7天后的死亡率，结果见表3。
表3 BPI变构肽对小鼠腹膜炎的保护作用
结论BPI变构肽对产生腹膜炎的小鼠有较强的保护作用。
权利要求
1．一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-F)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:5F.N’--YCA/LQK/RFI/LKM/C--C’。
2．一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-G)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:6G.N’-KSK/VGF/LQL/LFH/KK--C’。
3．一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-H)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:7H.N’-KGK/GV/FLQ/IQL/FHK--C’。
4．一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-I)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度24氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO:8I.N’--KSK/VGF/LIQ/LFH/KKL/RGS/LTK/LKG--C’。
5．如权利要求1,2,3或4所述的BPI变构肽及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽，其特征在于用于治疗G-细菌感染或内毒素血症。
6．如权利要求1,2,3或4所述的BPI变构肽及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽作为稀释剂、佐剂及载体，其特征在于用于治疗G-细菌感染或内毒素血症。
全文摘要
一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的、其氨基酸序列为:F.N’——YCA/LQK/RFI/LKM/C－－C’,G.N’——KSK/VGF/LQL/LFH/KK－－C’,H.N’－－KGK/GV/FLQ/IQL/FHK－－C’,I.N’－－KSK/VGF/LIQ/LFH/KKL/RGS/LTK/LKG－－C’的活性多肽分子及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽,或其作为稀释剂、佐剂及载体,用于治疗G－细菌感染或内毒素血症,治疗剂量小,成本低,而且可通过化学合成法合成,因而可实现工业化生产。
文档编号A61P31/00GK1306965SQ0010174
公开日2001年8月8日 申请日期2000年1月21日 优先权日2000年1月21日
发明者姚志勇, 曾少贵, 沈福泉 申请人:深圳市翰宇生物工程有限公司