专利名称：次卟啉衍生物、其制备方法及注射用冻干制剂的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及光动力治癌药物次卟啉衍生物。
目前国内外临床使用的光动力治癌药物血卟啉衍生物(HematoporphyrinDerivative,HpD)和光敏素Ⅱ或卟非姆钠(Photofrin Ⅱ or Sodium Pofimer)均为组成不定的混合卟啉制剂，其肿瘤光生物活性成分不明确，并含有大量在体内均匀分布和清除缓慢的强光敏化卟啉，如血卟啉、羟乙基乙烯基次卟啉、原卟啉等。其共同缺点是(1)由于组成不定，无法制定制剂质量的控制标准；(2)因有效成分不明而影响光动力疗效的稳定性；(3)由于制剂中存在大量在体内缓慢清除的强光敏化卟啉而造成机体正常组织的严重光毒反应。上述缺点从制剂质量、疗效、及毒副反应三个方面限制了它们作为创新药物发展的基本前提(许德余肿瘤光动力疗法原理、药物和临床应用导论KesselD和Dougherty TJ:Porphyrin Photosensitization.Plenum Press,NewYork,1983；Spinelli P等Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers.Amsterdam-London-New York-Tokyo,Excerpta Medica,1992)。
本发明的目的在于提供一种肿瘤光生物活性成分明确、制剂质量易于控制、疗效稳定和正常组织光毒副反应相对轻微的光动力治癌药次卟啉衍生物(DpD)。
本发明的目的还在于提供制备这种次卟啉衍生物的方法。
本发明的进一步目的在于提供注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂。
本发明的光动力治癌药物次卟啉衍生物包含组成比例稳定的四种卟啉(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的混合物 (Ⅱ)3-或8-甲氧基乙基-(Ⅲ)3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ8-或3-闳乙基次卟啉Ⅸ (Ⅳ)3-或8-甲氧基乙基-8-或3- (Ⅴ)3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基乙烯基次卟啉Ⅸ次卟啉Ⅸ上述四种卟啉的重量比(W/W)为3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ) 15±2％3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ) 10±2％本发明的次卟啉衍生物制备方法的特征在于(1)以氯化血红素为基始原料，在溴化氢饱和冰醋酸溶液中密闭搅拌反应得到中间体3,8-二溴乙基次卟啉(Ⅰ)，该中间体于室温下与85％甲醇水溶液反应，生成包含血卟啉Ⅸ(Ⅵ)、原卟啉Ⅸ(Ⅶ)、3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)和3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)的次卟啉衍生物粗品； (2)上述次卟啉衍生物粗品经硅胶柱层析分离除去血卟啉及原卟啉，得到如下具有稳定组成的次卟啉衍生物3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％
3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2％3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2％本发明的注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂由上述次卟啉衍生物溶于稀NaOH溶液后冷冻干燥而制成。
以下对本发明作详细描述。
本发明的次卟啉衍生物是由3-或-8(1-甲氧基乙基)-8或3-(1-羟乙基)次卟啉(3-or 8-(1-methoxyethyl)-8-or 3(1-hydroxyethyl)-deuteroporphyrin Ⅰ,55±5％)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉(3,8-dimethoxyethyl-deuteroporphyrin Ⅱ,20±3％)、3-或8-(1-甲氧基乙基)-8-或3-乙烯基次卟啉(3-或8-(1-methoxyethyl)-8-或3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅲ,15±2％)和3-或8-(1-羟乙基)-8-或3-乙烯基次卟啉(3-或8-(1-hydroxyethyl)-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅳ,10±2％)所组成。
本发明的次卟啉衍生物制备方法包括以下操作步骤(1)以氯化血红素为基始原料，在溴化氢饱和冰醋酸溶液中密闭搅拌反应得到中间体3,8-二溴乙基次卟啉(Ⅰ)，该中间体于室温下与85％甲醇水溶液反应，生成包含血卟啉Ⅸ(Ⅵ)、原卟啉Ⅸ(Ⅶ)、3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)和3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)的次卟啉衍生物粗品； (2)上述次卟啉衍生物粗品经硅胶柱层析分离除去血卟啉及原卟啉，得到如下具有稳定组成的次卟啉衍生物3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％
3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2％3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2％上述步骤(1)中二溴乙基次卟啉(Ⅰ)在冰醋酸溴化氢饱和溶液中的浓度以2.5％为佳，与85％甲醇水溶液反应的体积比为1∶0.5-1∶5，以1∶0.55为佳。
上述步骤(2)中所用硅胶为300目以上的层析硅胶或硅胶H；所用洗脱剂为氯仿/丙酮/甲醇/甲酸(10∶1∶1∶0.1)或氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1)。
．用本发明方法制备的次卟啉衍生物粗品为紫红色固体，不溶于水，溶于氯仿、四氢呋喃、甲醇等有机溶剂。因其组成分均为卟啉化合物，分子中存在可质子化氮原子和游离羧基，故能与酸或碱生成水溶性盐。此外，卟啉化合物具有光敏化作用，对可见光敏感，特别是在有氧条件下，可因自身光动力氧化效应而导致破坏。
本发明的次卟啉衍生物原料药的质量标准(1)性状本品为暗红色、无臭、无味的粉末状固体。无熔点。易溶于四氢呋喃、氯仿、丙酮、甲醇等有机溶剂，不溶于水。能与强酸、强碱水溶液作用生成盐而溶于其中。将本品的强酸或强碱水溶液调节pH至4-5时，因达到其等电点而从溶液中析出沉淀。
(2)鉴别a．薄层色谱(TCL)分析取硅胶H(粒度10-40μm)10g，加羧甲基纤维素(CMC)钠水溶液(0.25％)28±1mL，调成糊状，将其均匀涂布于载玻片上，硅胶厚度为0.25mm，置于水平台面，自然晾干后，105℃活化1小时，置干燥器中备用。
取次卟啉衍生物加甲醇制成浓度为2mg/mL的溶液。用微量注射器或定量毛细管吸取该溶液1-2μL，点于备用的硅胶H薄板上，干燥后置高效薄层色谱水平展开槽中，以氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1V/V/V)为展开剂，自然或低温干燥。薄层板上显示4个暗红色班点，b．紫外吸收光谱分析取本品适量，精密称定，加甲醇配成浓度为2μg/mL的溶液。按照中国药典1995年版二部附录18-19页ⅣA紫外分关光度法测定，在396±1、498±1、532±1569±1621±1nm波长处，应出现特征吸收峰。在396±1波长处有最大吸收峰。
c．荧光光谱分析取鉴别b项下的溶液适量，用甲醇稀释，使成浓度为0.1μg/mL本品的溶液，在荧光分光度计上测定。激发光波长为395nm，发射光波长从500-700nm连续扫描。图谱上除624±1和688±1波长处出现发射荧光峰外，其他波长处不得出现发射荧光峰。
(3)检查a．干燥失重取本品0.5g置于已恒种的称量瓶中，精密称定后，移至盛五氧化二磷的真空干燥器中，常温下避光减压干燥至恒重，减失重量不得超过5％。
b．含量测定避光操作。取干燥本品适量，精密称定，加甲醇溶解，使成2μg/mL的溶液。按紫外/可见分光光度法(中国药典1995年版二部附录18-19页ⅣA)在3961波长处测定其吸收系数(E1cm1％)为2465计算，即得。
(4)贮藏密闭、避光，于-20℃贮存。
本发明的次卟啉衍生物对肿瘤组织具有选择性摄入作用，在395-405nm波长光激发下产生桔红色特征发射荧光；在氩离子染料激光或金蒸汽激光(波长均为630nm)作用下，可敏化产生肿瘤光动力损伤效应而达到治疗的目的。可用于恶性肿瘤的荧光定位诊断及光动力治疗。亦可用于某些体液内癌细胞的检测和鲜红班痣的光动力治疗以及用作肿瘤放射治疗的增敏剂。
本发明的注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂规格为100mg/瓶；200mg/瓶。
本发明的注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂配制方法包括在无菌条件下进行的以下各步操作(1)原料的预处理取干燥的本品200g置于经过消毒的1L耐酸玻璃滤器中，加新鲜注射用水充分研洗后，抽干，反复3-5次。连同滤器一起置于棕色真空干燥器中，减压/P2O5干燥。
(2)次卟啉衍生物的溶解将上述经预处理的200g干燥本品置于圆底三颈烧瓶中，装上电动搅拌机，加入用注射用水配制的0.2N NaOH及生理盐水，搅拌1-2小时使本品成钠盐后完全溶解。然后滴加入由注射用水配制的0.2NHCl调节溶液pH至7.2-7.5，所得即为本品钠盐中性溶液。
(3)溶液渗透压的调节上述本品中性水溶液按下式用10％NaCl浓缩注射液调节至溶液中NaCl的浓度为0.9％V1=9V2-58×MeHCl/91
式中V1为调节溶液成等渗所加入的10％NaCl溶液的体积毫升数；V2为溶液调节等渗前的总体积毫升数；MeHCl为调节溶液pH所消耗的0.2N HCl毫克当量数；58为NaCl的分子量。
(4)注射用4％次卟啉钠冻干制剂的配制在上述次卟啉衍生物钠等渗溶液中加入适量甘露醇等冻干制剂支架物质，并用生理盐水稀释，使溶液总体积为5L。然后，经不锈钢滤菌器加压过滤，所得溶液分装于10mL玻璃安瓿，分装量为5mL或2.5mL，经冰冻干燥机减压抽干即得次卟啉衍生物钠注射液冻干制剂。
注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂的质量标准本品为次卟啉衍生物钠无菌注射液冻干制剂，含次卟啉衍生物钠应不低于标示量的90％。
(1)性状本品为玫瑰红色固体，呈圆柱状附着于瓶底。
(2)鉴别取本品加10mL蒸馏水使成溶液。在此溶液中加入1N醋酸调节溶液pH至4-5，析出沉淀，放置过夜，滤集析出的沉淀，用蒸馏水洗3次，吸干，置于棕色真空干燥器中(P2O5)减压干燥后进行下列各项鉴别试验a、薄层色谱所用测定方法、条件均与原料药相同。在硅胶H板上展开后，显示2个暗红色斑点，其比移值(Rf)分别为0.49±0.03和0.39±0.03。
b、紫外吸收光谱测定取上述干燥沉淀适量，加甲醇使之溶解并配成8μg/mL的溶液，于紫外分光光度计上测定，其紫外吸收光谱图上在396±1、498±1、532±1、569±1及621±1nm波长处出现五个吸收峰，其中396±1nm波长处为最大吸收峰。
c、荧光光谱的测定同“b”项操作将本品配成0.1μg/mL的甲醇溶液，于荧光分光度计上测定，其激发荧光的波长为395nm，发射荧光从500-700nm扫描，所得荧光图谱上除在624±1nm和688±1nm波长处出现两个特征发射荧光峰外，不出现其他荧光峰。624±1nm为其最大特征发射荧光峰。
(3)检查a、pH值按中国药典1995版二部附录Ⅵ pH测定，pH值在7.0-7.8之间。
b、无菌试验和嵩词匝榫ψ现泄涔95版二部附录ⅪD和ⅪH的规定。
c、含量测定取次卟啉衍生物钠注射液冻干制剂一支加10mL蒸馏水溶解，用1N醋酸调节pH至4-5，放置过夜，滤集析出的沉淀，并用蒸馏水洗3次，吸干，置真空干燥器中减压干燥(干燥剂为五氧化二磷)24小时。精确称取干燥沉淀10mg，加甲醇使成2μg/mL溶液，后者在紫外分光光度计上于396±1nm波长处测定其吸收度值。本品E1％1cm为2476±36，由E值计算得的本品含量不得低于标示量的90％。
(4)包装 100mg/瓶和200mg/瓶，5瓶/盒。
(5)贮藏 避光低温保存(在半年内使用者在普通冰箱的冷藏室中摄氏5度保存；如拟在半年以后使用者可在普通冰箱冷冻室摄氏-20度保存之。)。
本发明的由四种卟啉组成的次卟啉衍生物钠冻干制剂各成分含量比稳定，作为一种新型肿瘤光动力治疗药物，其实验疗效明显优于目前临床使用的光动力治癌药物血卟啉衍生物(HpD)，毒性则显低于后者。
以下用实施例和实验例对本发明进行举例说明，它们旨在阐述本发明的最佳实施方案。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1关键中间体3,8-二(1-溴乙基)次卟啉Ⅸ的制备将溴化氢气体导入一2L三颈圆底烧瓶，其中装有干燥氯化血红素(含量不低于90％)35g、工业冰醋酸1500mL、对苯二酚3g。通入的干燥溴化氢气泡起到自然的搅拌作用，直至饱和(此时可见，溴化氢气体从反应瓶溢出。)。停止通溴化氢，在室温下用电磁搅拌器继续搅拌24小时。所得即为3,8-二溴乙基次卟啉氢溴酸盐的溴化氢饱和冰醋酸溶液，毋需处理即可直接用于制备次卟啉衍生物。
实施例2次卟啉衍生物粗品的制备将上述3,8-二溴乙基次卟啉氢溴酸盐的溴化氢饱和冰醋酸溶液按2∶1体积比于搅拌下缓缓滴加至85％甲醇水溶液中，控制反应温升不超过20℃，加毕继续搅拌30分钟。然后加10N NaOH中和至pH 13，放置过夜。上述反应液于室温下加稀醋酸中和至pH4-5，并加大量水稀释，放置，待沉淀完全后，滤集析出的沉淀物，用水洗至洗液呈中性，减压(P2O5)干燥，得次卟啉衍生物粗品紫红色固体30-32g(按氯化血红素重量计收率85-91％)。上述次卟啉粗品经色谱分离得到6种不同的卟啉，后者经波谱测定及合成确认品的对照分析证明其化学结构分别为3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉(3-or 8-methoxyethyl-8-or 3-hydroxyethyl-deuteroporphyrin Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉(3,8-dimethoxyethyl-deuteroporphyrin Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-Or 8-methoxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅳ)和3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-or 8-hydroxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅴ)、血卟啉Ⅸ(Hematoporphyrin Ⅸ,Ⅵ)和原卟啉Ⅸ(Protoporphyrin Ⅸ,Ⅶ)。
次卟啉衍生物的制备反应及各组成分的生成过程如下 上述次卟啉衍生物粗品为紫红色固体，不溶于水，溶于氯仿、四氢呋喃、甲醇等有机溶剂。因其组成分均为卟啉化合物，分子中存在可质子化氮原子和游离羧基，故能与酸或碱生成水溶性盐。此外，卟啉化合物具有光敏化作用，对可见光敏感，特别是在有氧条件下，可因自身光动力氧化效应而导致破坏。
实施例3次卟啉衍生物的分离上述次卟啉衍生物粗品8g与300目层析硅胶24g充分研匀后，置于装有200g层析硅胶的60×500mm玻璃柱内硅胶的上层，用氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1V/V)混合液作洗脱剂，洗脱液用薄层色谱检测，收集由3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉(3-or 8-methoxyethyl-8-or 3-hydroxyethyl-deuteroporphyrin Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉(3,8-dimethoxyethyl-deuteroporphyrin Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-Or 8-methoxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅳ)和3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉(3-or 8-hydroxyethyl-8-or 3-vinyl-deuteroporphyrin Ⅴ)组成的次卟啉衍生物。上述Ⅱ-Ⅴ四种卟啉在次卟啉衍生物中所占的比例分别为50±5％(Ⅱ)；20±3％(Ⅲ)；15±2％(Ⅳ)和15±2％(Ⅴ)。
实施例4 次卟啉衍生物各组成分的鉴定1g次卟啉衍生物固体用10g 300目硅胶H研匀制成色谱分离样品，将其置于装有200g硅胶H的玻璃柱的顶层，用氯仿-甲醇-甲酸(10∶1∶0.1V/V/V)作洗脱剂，分别收集相当于HPLC分析保留时间为7.08(A)、8.37(B)、9.99(C)和12.13分钟(D)的4组流分，减压蒸除溶剂，并在真空干燥器中用五氧化二磷减压干燥至恒重。所得4种暗红色固体A、B、C、D的HPLC分析相对峰面积均≥95％。以下为4种组分的波谱测定结果组分A核磁共振氢谱(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.96(s,2H,2×NH),2.16(t,3H,CH(OH)CH3)2.28(t,3H,CH(OCH3)CH3),3.20(m,4H,2×CH2CH2COOH),3.55(s,3H,OCH3),3.59-3.73(alls,12H,4×Ar-CH3),44.36(m,4H,2×CH2CH2COOH),6.17(m,2H,-OH,CH(OCH3)CH3),6.54(m,1H,CH(OH)CH3),10.25-10.76(4H,meso-H),12.31(bs,2H,2×COOH)。
快原子轰击质谱(FABMS m/z):613(M+1),612(M+),581(M-OCH3)。
红外吸收光谱(IR KBr,υcm-1):3315,2980,2930,2820,1710,1440,1410,1102,1080。
紫外可见吸收光谱(UV/Visλmax(CH3OH)nm):397(Soret),498,531,569,622。
上述波谱测定结果表明，次卟啉衍生物这一组成分的化学结构为3-或8-(1-羟乙基)-8-或3-(1-甲氧基乙基)次卟啉Ⅸ。
组分B核磁共振氢谱(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.94(s,2H,2×NH),2.16(d,3H,CH(OH)CH3),3.20(m,4H,2×CH2CH2COOH),3.60-3.74(all s,12H,4×Ar-CH3),4.36(t,4H,2×CH2H2COOH),6.19(m,1H,Cis=C-H),6.42(m,1H,Trans=C-H),6.57(m,1H,CH(OH)CH3),8.50(q,1H,=CH-),10.24-10.70(4H,4×meso-H),12.27(bs,2H,2×COOH).
快原子轰击质谱(FAB MS,m/z):581(M+1),580(M+),563(M-OH)。
红外吸收光谱(IR,KBr,υcm-1):3315,2930,2880,1710,1450,983,902。
紫外可见吸收光谱(UV/Visλmax(CH3OH)nm):399(Soret)502,537,573,625。
上述波谱分析结果证明，组分B为3-或8-(1-羟乙基)-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ。
组分C核磁共振氢谱(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.93(s,2H,2×NH),2.19(6H,2×CH(OCH3)CH3),3.22(4H,2×CH2CH2COOH),3.56(s,6H,2×OCH3),3.63-3.72(a11 s,12H,Ar-CH3),4.36(m,4H,2×CH2CH2COOH),6.17(m,2H,2×CH(OCH3)CH3),10.25-10.60(4H,4×meso-H),12.30(bs,2×COOH).
快原子轰击质谱(FAB MS m/z):627(M+1),626(M+),595(M-CH3O)。
红外吸收光谱(IR,KBr,υcm-1):3330,2940,2870,1710,1435,1110,1090。
紫外可见吸收光谱(UV/Visλmax(CH3OH)nm):397.5(Soret),498,532,569,522。
上述波谱分析结果表明，组分C为3,8-二(1-甲氧乙基)-次卟啉。
组分D核磁共振氢谱(1H-NMR δ[ppm,(CD3)2SO]:-3.95(bs,2H,2×NH),2.23(d,3H,CH(OCH3)CH3),3.17(4H,2×CH2CH2COOH),3.54-3.72(all s,15H,OCH3,4×Ar-CH3),4.25(m,4H,2×CH2CH2COOH),6.18(q,1H,Cis=C-H),6.41(q,1H,Trans=C-H),8.47(q,1H,=CH),10.23-10.60(4H,4×meso-H),12.20(bs,2H,2×COOH)。
快原子轰击质谱(FAB MS m/z):595(M+1),594(M+),563(M-OCH3)。
红外吸收光谱(IR,KBr,υcm-1):3320,2925,1718,1445,1105,980,902。
紫外可见吸收光谱(UV/Visλmax(CH3OH)nm):399(Soret),502,536,572,625。
上述波谱分析结果表明组分D为3-或8-(1-甲氧基乙基)-8-或3-乙烯基-次卟啉Ⅸ。
实施例5次卟啉钠注射剂冻干制剂的制备以下各步均在无菌条件下进行操作。
(1)原料的预处理取干燥的本品200g置于经过消毒的1L耐酸玻璃滤器中，加新鲜注射用水充分研洗后，抽干，反复3-5次。连同滤器一起置于棕色真空干燥器中，减压/P2O5干燥。
(2)次卟啉衍生物的溶解将上述经预处理的200g干燥本品置于圆底三颈烧瓶中，装上电动搅拌机，加入用注射用水配制的0.2N NaOH及生理盐水，搅拌1-2小时使本品成钠盐后完全溶解。然后滴加入由注射用水配制的0.2NHCl调节溶液pH至7.2-7.5，所得即为本品钠盐中性溶液。
(3)溶液渗透压的调节上述本品中性水溶液按下式用10％NaCl浓缩注射液调节至溶液中NaCl的浓度为0.9％V1=9V2-58×MeHCl/91式中V1为调节溶液成等渗所加入的10％NaCl溶液的体积毫升数；V2为溶液调节等渗前的总体积毫升数；MeHCl为调节溶液pH所消耗的0.2N HCl毫克当量数；58为NaCl的分子量。
(4)4％次卟啉钠注射液冻干制剂的配制在上述次卟啉衍生物钠等渗溶液中加入适量甘露醇等冻干制剂支架物质，并用生理盐水稀释，使溶液总体积为5L。然后，经不锈钢滤菌器加压过滤，所得溶液分装于10mL玻璃安瓿，分装量为5mL或2.5mL，经冰冻干燥机减压抽干即得次卟啉衍生物钠注射液冻干制剂。
实验例1次卟啉衍生物钠在重水中对NADPH光氧化作用的敏化效应分别取1mL含2×10-7mol/L NADPH的磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L)5份，依次加入不同量的待测样品，使成浓度分别为8.80、13.20、19.79、29.69和44.54×10-6mol/L。混合后置于光径1cm的比色杯中，以氦氖激光水平辐照10分钟，光剂量为0.679J/cm2。照毕后分别于340nm处测定辐照后溶液中NADPH的残存量。用不含NADPH而含等体积同浓度试样的磷酸盐缓冲液作空白，以未照光的NADPH缓冲液(不含样品而含与试样等量的水)做对照，根据测定结果计算不同浓度样品的NADPH残余百分数，取3次测定平均值。结果见下表。
表1次卟啉衍生物(DpD)的光敏化效应
表1结果表明，次卟啉衍生物(DpD)具有比目前临床应用的光动力治癌药物血卟啉衍生物(HpD)更强的光敏化效应。
实验例2次卟啉衍生物对体外培养人癌细胞的光灭活作用人宫颈癌细胞Hela株用RPMI 1640完全培养液(含15％小牛血清)在37℃、5％CO2的孵箱内传代培养，获得生长良好的单层上皮样细胞。用胰酶-EDTA混合液消化制备单细胞悬液，然后接种于40#(6×8mm)平底塑料测定板孔内，每孔200μL，含5×104个细胞。
培养24-36小时后，弃去旧培养液。避光下加入用不含血清培养液配制的试样100μL，置孵箱内继续培养1小时后，弃去药液，并用Hank’s液清洗两遍，再加含血清的培养液200μL。上述培养板用氩激光辐照3分钟，平均光剂量为4.28±0.15J/cm2。测定后的培养板在孵箱中培养24小时。最后将测定板浸入2.5％结晶紫溶液中染色10分钟，取出，经流水冲洗后于37℃干燥。比色前每孔加33％醋酸100μL脱色，然后用酶联检测仪于577nm处测定其光密度。试样及对照药物分别设7组不同浓度，每组4孔。实验设空白、单照光和单给药三个对照组。取3次实验平均值，求出50％光灭活浓度(IC50)、95％置信限(95％CL)及回归方程，结果如表2。
表2 DpD对体外培养人宫颈癌Hela细胞的光灭活作用
表2所列数据表明，次卟啉衍生物对体外培养人癌细胞的光灭活作用明显较血卟啉衍生物为强。
实验例3次卟啉衍生物对动物移植瘤的光动力治疗效果无菌条件下于昆明株小鼠前胸皮下新鲜分离的S-180肉瘤小块，待肿瘤生长至直径4-6mm时，选取生长良好的实验鼠按文献方法进行激光光动力治疗。结果见表3。
表3次卟啉衍生物对小鼠S-180肉瘤的光动力治疗效果
*治愈动物数/试验动物数表3所列数据表明，DpD对小鼠S-180肉瘤的光动力治疗效果至少不低于国外的第二代产品光敏素Ⅱ或卟非姆钠(Photofrin Ⅱ,Sodium Pofimer)。
实验例4次卟啉衍生物的急性毒性试验4周龄昆明株小鼠雌雄各半，体重18.9±0.07g(X±SD)，按常规测定静脉注射DpD的半数致死剂量(LD50)。以Finney计算，并以HpD作平行对照。结果见表4。
表4次卟啉衍生物急性毒性小鼠半数致死剂量
表4数据表明，DpD的急性毒性明显低于目前临床应用的HpD。
实验例5 犬近似致死剂量(ALD)和最小致死剂量(MLD)的测定杂种犬18条，体重12.5±0.9kg(X±SD)，先按Deichmann LeBlanc法用6条犬测定DpD的ALD及MLD。然后用12条犬分4组分别给予1.0、0.5及0.25ALD(分别为120、60及30mg/kg)，对照组i.v.生理盐水，于避光条件下观察14天。
DpD的ALD为114mg/kg，实验犬未死亡；MLD为171mg/kg，实验犬于30h后死于呼吸衰竭。
权利要求
1．次卟啉衍生物，包含组成比例稳定的四种卟啉(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的混合物(Ⅱ)3-或8-甲氧基乙基- (Ⅲ)3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ8-或3-羟乙基次卟啉Ⅸ (Ⅳ)3-或8-甲氧基乙基-8-或3- (Ⅴ)3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基乙烯基次卟啉Ⅸ 次卟啉Ⅸ上述四种卟啉的重量比(W/W)为3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3％3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ) 15±2％3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ) 10±2％
2．权利要求1所述次卟啉衍生物的制备方法，其特征在于(1)以氯化血红素为基始原料，在溴化氢饱和冰醋酸溶液中密闭搅拌反应得到中间体3,8-二溴乙基次卟啉(Ⅰ)，该中间体于室温下与85％甲醇水溶液反应，生成包含血卟啉Ⅸ(Ⅵ)、原卟啉Ⅸ(Ⅶ)、3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)、3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)、3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)和3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)的次卟啉衍生物粗品； (2)上述次卟啉衍生物粗品经硅胶柱层析分离除去血卟啉及原卟啉，得到如下具有稳定组成的次卟啉衍生物3-或-8甲氧基乙基-8或3-羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ )55±5％3,8-二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ) 20±3％3-或8-甲氧基乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2％3-或8-羟乙基-8-或3-乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2％
3．如权利要求2所述的方法，其中步骤(1)中二溴乙基次卟啉(Ⅰ)在冰醋酸溴化氢饱和溶液中的浓度为2.5％，与85％甲醇水溶液反应的体积比为1∶0.5-1∶5。
4．如权利要求3所述的方法，其中2.5％二溴乙基次卟啉(Ⅰ)与85％甲醇水溶液反应的体积比为1∶0.55。
5．如权利要求2所述的方法，其中步骤(2)中所用硅胶为300目以上层析硅胶或硅胶H；所用洗脱剂为氯仿/丙酮/甲醇/甲酸(10∶1∶1∶0.1)或氯仿/甲醇/甲酸(10∶1∶0.1)。
6．注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂，由权利要求5所述次卟啉衍生物溶于稀NaOH溶液后冷冻干燥而制成。
7．注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂的制备方法，其特征在于将次卟啉衍生物经注射用水反复搅洗、减压干燥后，按静脉注射用无菌制剂配制要求用过量稀NaOH使之完全溶解，在溶液中加入稀盐酸调节溶液pH至7-7.5，所得次卟啉中性溶液加生理盐水及支架物质配制成4％溶液，滤菌后定量分装于玻璃瓶，在冰冻干燥机上减压抽干。
8．如权利要求7所述方法，其中次卟啉固体与过量氢氧化钠反应的条件是使溶液pH保持在12以上，并在搅拌1小时后放置过夜。
9．如权利要求7所述方法，其中支架物质为甘露醇，NaOH和稀盐酸浓度为0.1N。
10．光动力治癌药物，包括有效量的权利要求6所述的注射用次卟啉衍生物钠冻干制剂。
全文摘要
将氯化血红素经溴化氢加成得到中间体3,8－二溴乙基次卟啉Ⅸ(Ⅰ),(Ⅰ)在控制条件下与甲醇/水混合物反应,所得产物经硅胶色谱分离得到如下次卟啉衍生物,其组成(W/W)为:3－或8－甲氧基乙基－8或3－羟乙基次卟啉Ⅸ(Ⅱ)55±5%3,8－二甲氧基乙基次卟啉Ⅸ(Ⅲ)20±3%;3－或8－甲氧基乙基－8－或3－7烯基次卟啉Ⅸ(Ⅳ)15±2%;3－或8－羟乙基－8－或3－乙烯基次卟啉Ⅸ(Ⅴ)10±2%;所述四种卟啉组成的次卟啉衍生物钠冻干制剂各成分含量比稳定,作为一种新型肿瘤光动力治疗药物,其实验疗效明显优于目前临床使用的光动力治癌药物血卟啉衍生物(HpD),毒性明显低于后者。
文档编号A61K9/19GK1311186SQ0011173
公开日2001年9月5日 申请日期2000年2月28日 优先权日2000年2月28日
发明者许德余 申请人:上海复旦张江生物医药有限公司