四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为荧光探针在检测锌离子方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及到四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为荧光探针分子通过荧光特性高选择性地识别检测锌离子，并且进一步可以用于细胞中锌离子浓度变化的检测。
【背景技术】
[0002]锌是人体必需微量元素之一，也是生物体中继铁之后第二富集的过渡金属。大量的锌离子都集中在神经组织中，如在脑组织中的浓度是0.1-0.5mM。锌离子具有神经调节功能，锌离子能够能够从突触囊中释放出来通过电位调控型离子通道进入细胞，通过金属蛋白(锌指蛋白)来改变染色质的构象或阻断DNA的合成从而影响基因表达。生物体中大部分的锌离子都与蛋白质紧密结合，其在金属蛋白中作为一种辅助因子调控蛋白质或酶的活性。在某些细胞中存在着“游离锌池”，游离锌的浓度在各种哺乳细胞内低至纳摩尔级。锌是人体内200多种酶和蛋白质的重要组成成分，也是许多酶的催化剂，广泛参与生命活动的各个方面。其中最重要的含锌的酶和蛋白质有DNA聚合酶、RNA聚合酶、蛋白转录因子、碱性磷酸酶、味觉蛋白、消化酶等。锌是这些重要生命大分子的活性结构成分。DNA聚合酶是DNA复制的关键物质之一，缺乏锌元素时DNA聚合酶数量减少，活性降低，导致DNA复制速度减慢，结果使细胞的分裂速度降低甚至停滞。锌缺乏还使RNA聚合酶的数量和质量降低，直接影响基因的表达，从而使上述含锌蛋白质和酶的合成受到阻碍。所以说锌直接参与核酸蛋白质的合成、细胞的分化和增殖以及许多代谢，人体内还有一些酶需要锌的激活，而发挥其活性作用。迄今为止，人们已经认识到锌在生命过程中起着许多不同的作用。锌能提高人体的免疫功能，并达到抗衰老的作用；微量锌可强化记忆力，延缓脑的衰老；锌可以加速创伤愈合；锌能保护心肌免遭损害；锌与利尿剂合用能加强降压作用，有利于控制高血压、冠心病的发生。对生长发育中的婴儿、儿童和青少年具有更重要的营养价值。
[0003]对金属离子的分析测定已经存在很多方法，比如原子吸收光谱法，电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学方法等，但是这些方法不能够对生物体内离子进行实时检测，且这些方法测定时样品的预处理比较复杂，使得其应用受到了一定的限制。由于荧光探针法具有灵敏度高、选择性好、反应时间快、能够进行实时区域离子测试而受到普遍的重视。理想的锌离子荧光分子探针应具有化学、光稳定性高，激发波长在可见光区(> 400nm)、对锌离子荧光有选择性和敏感性、快速响应、水溶性、对细胞毒性小等特点。
[0004]卟啉是生物体内的一种具有大共轭环状结构的金属有机化合物。卟啉及其衍生化合物广泛存在于生物体内和量转移相关的重要细胞器内。卟啉在生物体内具有重要的生理功能，如血红素是含铁卟啉的化合物，叶绿素是含镁的卟啉化合物，维生素B12是含钴的卟啉化合物。早期的卟啉是从含有卟啉化合物的天然产物中通过提取、分离、纯化等方法得到的，如血红素、叶绿素等。目前有两种途径得到目标卟啉分子:天然卟啉的结构修饰和卟啉化合物的全合成。天然卟啉的结构修饰虽然能很方便地进行结构的改造，但是受到结构本身的限制，同时外环官能基团的选择上也十分有限，此外，也限制了卟啉化合物的本身生理活性。因此，通常人们需要通过全合成的办法，来获得具有特定生理活性和功能的卟啉分子。通过合成设计，获取不同种类和功能的卟啉化合物推进了卟啉化学的发展，扩宽了其应用前景。卟啉化合物在高分子材料、化学催化、电致发光材料等不同领域的各个方面得到很大应用。本发明充分利用卟啉与金属离子的配合作用，结合锌离子检测对荧光探针的要求，对卟啉衍生物分子的结构进行改良，使其具有良好的水溶性、荧光稳定性，从而成功用于锌离子检测。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题是:
为改进现有锌离子检测方法的不足，提供一种四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为荧光探针分子通过荧光特性高选择性地应用于检测锌离子，对锌离子进行快速简便的检测；解决了现有技术中无法对生物体内离子进行实时检测、测定样品的预处理比较复杂等不足。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
提供一种四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为荧光探针在检测锌离子方面的应用，其中，四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为检测锌离子的荧光探针激发光的有效光波长为405、430、515、550、580nm。上述激发光的作用下，可以得到发射光谱峰在640nm的近红外光，该发射光谱峰不随激发光的改变而改变。
[0007]此外，四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为检测锌离子的荧光探针对锌离子的最低检测限为0.8μΜ，且可以通过共聚焦荧光显微镜测得的荧光强度对细胞中的锌离子浓度变化进行检测。
[0008]本发明的有益效果是:与现有技术相比，本发明的优点如下:四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物作为检测锌离子的荧光探针与锌离子的结合络合能力高，络合后荧光明显增强。细胞毒性实验结果表明该探针对细胞几乎没有毒性，生物相容性和细胞渗透性好，可以通过细胞荧光共聚焦成像对细胞内锌离子的浓度变化进行检测。本发明的方法应用简便易行、快速，直观，毒性低、灵敏度高、方法简单，为金属离子的检测提供了高效可行的方法。
【附图说明】
[0009]图1为四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物的分子结构示意图。
[0010]图2为四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物本身的激发光谱(图2Α)和发射光谱(图2Β)。图2Α横坐标是激发波长，纵坐标是激发光谱的荧光强度，从激发光谱中看到激发峰有五个分别在405，430，515，550，580nm。图2B横坐标是发射波长，纵坐标是发射光谱的荧光强度，曲线a，b，c，d，e分别是使用405，430，515，550，580nm激发光激发所得到的对应发射光谱。
[0011 ]图3是本发明的四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物荧光探针分子与各种金属离子作用后的荧光光谱图(激发波长515nm)，曲线a是卟啉衍生物分子本身的荧光光谱，曲线b是加入锌离子后的荧光光谱，钠、钾、钙金属离子加入后荧光光谱没有任何变化与曲线a几乎重合，曲线c是加入镁离子后的荧光光谱，曲线d，e是分别加入铜、铁离子后的光谱。光谱结果明显表明，只有锌离子明显增强卟啉衍生物荧光表现出良好的选择性识别。干扰金属离子钠、钾、钙、镁、铜和铁对检测没有影响。
[0012]图4是本发明的四-对-磺酸基-苯基卟啉衍生物荧光探针分子的荧光强度和锌离子浓度的关系。横坐标为波长(纳米)，纵坐标为荧光强度。箭头表示锌离子的浓度变化从低到高依次为 0、0.8,2.5,7.5、15、40、80、93、123、135μΜ。
[0013]图5是本发明的卟啉衍生物荧光探针分子对细胞的毒性。横坐标是加入的卟啉的浓度，纵坐标是细胞存活率。
[0014]图6是本发明的卟啉衍生物荧光探针分子用于细胞内锌离子检测。图6a是明场下的Hela细胞；图6b是在加入荧光探针分子和锌离子后的细胞内荧光成像图，细胞呈现出很强的红色荧光。
【具体实施方式】
[0015]下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
[0016]实施例1:四-对-磺酸基-苯基卟啉荧光探针分子本身的荧光特性
首先，考察卟啉衍生物荧光探针四-对-磺酸基-苯基卟啉本身的荧光特性。将固体四-对-磺酸基-苯基卟啉化合物溶于超纯水或者磷酸缓冲溶液(pH 7.2，0.02mM)配制成浓度为1.0mM的母液。取一定量的母液用相应的溶剂如超纯水或者磷酸缓冲溶液稀释到实验所用的浓度6.25μΜο稀释后的四-对-磺酸基-苯基卟啉化合物溶液加到干净的4mL石英比色皿中，使用岛津型号为RF-5301 PC的荧光仪进行测定，实验结果如图2A激发光谱图所示，激发光波长具有五个激发峰，分别在405，430，515，550，580nm处。用得到的五个激发峰波长分别去激发得到如图2B所示发射光谱图，当激发光波长分别为405，430，515，550，580nm，探测样品发射出的荧光波长发现，五个激发光所得到的发射光波