与抗原相结合的肠细菌OmpA蛋白用于产生抗病毒、抗寄生虫、或抗肿瘤的细胞毒性应答的用途的制作方法

专利名称：与抗原相结合的肠细菌OmpA蛋白用于产生抗病毒、抗寄生虫、或抗肿瘤的细胞毒性应答的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠细菌，特别是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)OmpA膜蛋白，与一种抗原或半抗原相结合，用于制备旨在产生或增强针对传染性因子或肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途。本发明包括这些化合物用于预防和治疗感染或癌症，特别是与肿瘤抗原相关的癌症(诸如黑素瘤)的用途，以及包含一些这类化合物的药物组合物。
接种疫苗是预防或治疗病毒或细菌感染的有效方法。接种疫苗运动在这些领域的成功使之有可能将至今在传染病学领域中使用的疫苗概念延伸到癌症和自身免疫疾病领域。单独施用于宿主的疫苗抗原的免疫原性常常不足以诱导免疫应答，因此必需与佐剂相伴或与载体蛋白偶联来诱导(或增强)免疫原性。在这些条件下，只能诱导体液类型的免疫应答。现在，在抗病毒治疗的过程中，产生能够识别并消灭病毒的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是极其重要的(Bachmann等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)242228-2236；P.Borrow，1997，病毒性肝炎杂志(J.Virol.Hepat.)416-24)，正如许多研究证明的，在体内显示针对病毒表位的应答的保护性作用(A.M.Arvin，1992，传染病杂志(J.Inf.Dis.)166S35-S41；Koszinowski等人，1987，免疫学通讯(Immunol.Lett.)16185-192)。
CTL应答的重要性在抗肿瘤应答中同样获得了证明，特别是针对黑素瘤细胞的应答(回顾见Rivoltini等人，1998，免疫学评论性回顾(Crit.Rev.Immunol.)1855-63)。已经定义了数种抗原的CTL表位(与I型分子相互作用并呈递给CD8+T淋巴细胞的肽序列)。然而，困难在于在体内产生CTL，因为这些肽的免疫原性是微弱的(Melief，1992，癌症研究进展(Adv.Cancer Res.)58143-175；Nandaz和Sercaz，1995，细胞(Cell)8213-17)。
因此，研究针对鉴定使之有可能诱导CTL的新的佐剂或抗原递送系统。由于它们在呈递抗原和刺激免疫系统、树突细胞中的有效性，例如已经用于产生抗病毒CTL应答(B.Ludewig等人，1998，病毒学杂志(J.Virol.)723812-3818；P.Brossard等人，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)1583270-3276)或抗癌CTL应答(F.O.Nestle等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4328-332)。这些方法在于，给树突细胞离体装载感兴趣的抗原(肽或溶胞产物)，并将这些细胞重新移植到患者体内。其它方法在于，用编码感兴趣抗原的基因离体转染树突细胞，并重新注射这些经转染细胞(E.Gilboa等人，1998，癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother.)4682-87)。这些方法已经成功的用于小鼠和最近用于人(F.J.Hsu等人，1996，自然医学(Nat.Med.)252-58)，但是由于细胞必需进行离体处理(细胞转化或抗原内化)并移植到宿主生物体内，因而仍然是复杂的。相似的，使用病毒型颗粒(G.T.Layton等人，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)1511097-1107)或不完全弗氏佐剂(IFA)(Valmori等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)241458-1462)使之有可能产生CTL应答。然而，使用对应于CTL表位的肽进行的抗病毒或抗肿瘤免疫当存在这种佐剂时可能导致特异性耐受状态，这可能在某些情况中产生与期望相反的效果，即免疫应答降低(Toes等人，1996，美国国家科学院进展(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)93，7855-7860)。
由此，现在非常需要当与分子(特别是抗原或半抗原)相结合时能够产生针对所述分子的CTL的化合物。这种化合物能够(特别是)用于制备旨在诱导抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、或抗肿瘤的CTL类型的免疫保护的免疫组合物。
令人惊讶的是，已经证明革兰氏阴性细菌外膜蛋白，特别是肠细菌OmpA蛋白，诸如肺炎克雷伯氏菌P40蛋白(WO95/27787和WO96/14415中描述的蛋白质)，具有引发针对与之共价或非共价结合的分子的CTL应答的特性，优选不需加入另一种佐剂。
由此，本发明涉及肠细菌OmpA蛋白或其片段或者编码所述OmpA蛋白的核酸序列或其片段，用于制备旨在在体外或体内(优选体内)产生或增强针对传染性因子或肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途和用于制备旨在产生或增强所述细胞毒性T应答的药物组合物的用途。
在本发明中，术语“蛋白质”旨在表示肽或多肽，术语“OmpA”(“外膜蛋白”)旨在表示A型外膜蛋白。
表述“OmpA蛋白片段”旨在表示(特别是)OmpA蛋白氨基酸序列所含的任何氨基酸序列片段，当其与传染性因子或肿瘤细胞特异的抗原或半抗原相结合时，能够产生或增强针对所述感染性因子或所述肿瘤细胞的细胞毒性T应答，该OmpA蛋白片段包含至少5个氨基酸，优选至少10个氨基酸，或更优选至少15个氨基酸。
表述“传染性因子或肿瘤细胞特异的抗原或半抗原”旨在表示(特别是)传染性因子(诸如病毒、细菌、酵母、真菌、或寄生虫)或肿瘤细胞表达的任何化合物或其结构类似物，其单独或与免疫佐剂相结合时能够诱导对所述传染性因子或所述肿瘤细胞特异的免疫应答。
在此描述中，表述“抗原或半抗原的类似物”旨在表述(特别是)与所述抗原或半抗原具有结构相似性、能够在预先用所述相似化合物免疫的生物体内诱导针对所述抗原或半抗原的免疫应答的化合物。
本发明的一个主题是本发明中要求保护的用途，其特征在于所述药物组合物还包含与所述肠细菌OmpA蛋白相结合的、对所述传染性因子或所述肿瘤细胞特异的抗原或半抗原。
优选的，本发明包括本发明中要求保护的用途，其特征在于所述传染性因子是病毒颗粒、细菌、酵母、真菌、或寄生虫。
在一个特定实施方案中，本发明包括本发明中要求保护的肠细菌OmpA蛋白或其片段的用途，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述肠细菌的培养物获得。
用于提取细菌膜蛋白的方法对于本领域技术人员是知道的，因而在此描述中将不再详述。例如，可能会提及Haeuw J.H.等人(1998，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)255446-454)描述的提取方法，但是不受其限制。
在另一个优选的实施方案中，本发明还包括本发明中要求保护的肠细菌OmpA蛋白或其片段的用途，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段通过重组途径获得。
用于制备重组蛋白的方法在当今对于本领域技术人员是众所周知的，因而在此描述中将不再详述；然而，可以参照实施例中描述的方法。在可能用于产生这些重组蛋白的细胞中，当然应当提及细菌细胞(P.O.Olins和S.C.Lee，1993，大肠杆菌中异源基因表达的最新进展，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4520-525)、酵母细胞(R.G.Buckholz，1993，用于表达异源基因产物的酵母系统，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4538-542)、动物细胞特别是哺乳动物细胞培养物(C.P.Edwards和A.Aruffo，1993，基于COS细胞的瞬时表达系统的现行应用，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4558-563)、和昆虫细胞，用于昆虫细胞的方法可能采用例如杆状病毒(V.A.Luckow，1993，用于表达人类基因产物的杆状病毒系统，生物技术中的现行观点(Curr.Op.Biotechnology)4564-572)。
完全优选的是，本发明中要求保护的用途的其特征在于所述肠细菌是肺炎克雷伯氏菌。
本发明特别涉及本发明中要求保护的用途，其特征在于所述肺炎克雷伯氏菌OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)优化比对后，与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列，优选90％和95％；或c)如a)中定义的序列的至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列片段，优选10、15、20、和25个氨基酸。
表述“优化比对后，与给定的核酸或氨基酸序列具有至少80％同源性的核酸或氨基酸序列”旨在表示与所述给定序列优化比对后包含与所述给定序列具有至少80％百分率同一性的序列。
为了本发明的目的，术语两种核酸或氨基酸序列之间的“百分率同一性”旨在表示优化比对后获得的所比较的两种序列之间相同核苷酸或氨基酸残基的百分率，该百分率完全是统计学的，两种序列之间的差异随机分布且包含于其全长。两种核酸或氨基酸序列之间的序列比较通常通过将这些序列优化比对后比较来进行，所述比较通过片段或通过“比较窗”来进行，从而鉴定并比较局部区域的序列相似性。除了手工操作，用于比较的序列优化比对可以通过Smith和Waterman(1981，应用数学进展(Ad.APP.Math.)2482)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443)的局部同源性算法、Pearson和LipmaN(1988，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444)的相似性搜索方法、使用这些算法的计算机软件(威斯康星遗传学软件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，或者BLASTN或BLASTP比较软件)产生。
两种核酸或氨基酸序列之间的百分率同一性通过比较经比较窗优化比对的这两种序列来测定，待比较的核酸或氨基酸序列在比较窗中的区域相对于用于这两种序列间优化比对的参考序列可能包含添加或删除。百分率同一性的计算方法是，测定两种序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的同一位置的数目，将此同一位置数目除以比较窗中的总位置数目，并将得数乘以100，从而获得这两种序列之间的百分率同一性。
例如，可以利用BLAST程序“BLAST2 sequences”，可以由站点http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html获得，所用参数为缺省值(特别是“开放缺口罚”参数5和“延伸缺口罚”参数2；所选矩阵是例如由程序提供的“BLOSUM62”矩阵)，待比较的两种序列之间的百分率同一性由程序直接计算。
在所述与参考OmpA序列具有至少80％同源性的序列中，优选能够诱导特异针对与之相结合的抗原或半抗原的CTL活性的肽序列，或其编码序列，例如，CTL活性用途下文实施例中所述标准技术来测量。
本发明还包括本发明中要求保护的用途，其特征在于所述抗原或半抗原选自蛋白质、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂类、或能够特异诱导针对所述传染性因子或所述肿瘤细胞的CTL应答的任何化合物。
本发明的一个主题是本发明中要求保护的用途，其特征在于所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段偶联或混合。
本发明还包括本发明中要求保护的用途，其特征在于所述抗原或半抗原通过共价连接(特别是化学偶联)与所述OmpA蛋白或其片段偶联。
在特定实施方案中，本发明中要求保护的用途的其特征在于在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中导入一种或多种连接元件，从而有助于化学偶联；所述导入的连接元件优选氨基酸。
如本发明中要求的，可导入一种或多种连接元件，特别是氨基酸，从而有助于OmpA蛋白或其片段与所述抗原或半抗原之间的偶联反应。如本发明中要求的，OmpA蛋白或其片段与所述抗原或半抗原之间的共价偶联可能在OmpA蛋白或其片段的N或C末端进行。能够进行这种偶联的双功能试剂将由选择用来进行偶联的OmpA蛋白或其片段的末端和待偶联的所述抗原或半抗原的本性来确定。
在另一个特定的实施方案中，本发明中要求保护的用途的其特征在于当所述抗原或半抗原的本质是肽时，所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段之间的偶联通过基因重组产生。
由与所述OmpA蛋白或其片段偶联衍生的缀合物可以通过基因重组制备。嵌合或杂合蛋白(缀合物)可以使用重组DNA技术，通过在编码所述OmpA蛋白或其片段的DNA序列中插入或添加编码其本质是肽的所述抗原或半抗原的序列而产生。
用于合成杂合分子的方法包括在基因工程中用于构建编码期望多肽序列的杂合多核苷酸的方法。有利的是，例如可以参考由D.V.Goeddel(1990，基因表达技术，酶学方法(Methods in Enzymology)1853-187)描述的用于获得编码融合蛋白的基因的技术。
另一方面，本发明涉及本发明中要求保护的用途，其特征在于药物组合物包含编码所述杂合蛋白的核酸构建物，或包含含编码所述杂合蛋白的核酸构建物的载体，或包含所述核酸构建物、能够表达所述杂合蛋白的经转化宿主细胞。
本发明还包括本发明中要求保护的用途，用于制备旨在消除传染性因子或抑制肿瘤生长的药物组合物。
优选的是，本发明中要求保护的用途涉及旨在预防或治疗传染病或癌症的药物组合物的制备，优选与肿瘤抗原相关的癌症。
在肿瘤表达相关肿瘤抗原、可以用本发明中要求保护的用途预防或治疗的癌症中，可能特别提及(但是不受其限制)·乳腺癌、肺癌、结肠癌、和胃癌(Kawashima等人，1999，癌症研究(Cancer Res.)59431-435)；·间皮瘤、骨肉瘤、脑癌(Xie等人，1999，国家癌症学会会刊(J.Natl.Cancer.Inst.)91169-175)；·黑素瘤(Zheuten等人，1998，Bratilsl.Lek.Listy 99426-434)；·胰囊腺瘤(Hammel等人，1998，欧洲胃肠病学和肝病学杂志(Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.)10345-348)；·结肠直肠癌(Ogura等人，1998，抗癌研究(Anticancer Res.)183669-3675)；·肾细胞癌(Jantzer等人，1998，癌症研究(Cancer Res.)583078-3086)；和·卵巢和宫颈癌(Sonoda等人，1996，癌症(Cancer)771501-1509)。
本发明的一个主题特别是本发明中要求保护的肠细菌OmpA蛋白或其片段的用途，用于制备旨在预防或治疗传染病(特别是病毒、细菌、真菌、或寄生虫起源)或癌症(优选与肿瘤抗原相关的，特别是黑素瘤)的药物免疫组合物。
本发明还包括本发明中要求保护的用途，其特征在于所述药物组合物的装载形式使之可改进其稳定性和/或其免疫原性，特别是呈脂质体的形式。
优选的是，本发明包括本发明中要求保护的用途，其特征在于所述载体是包含编码所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的核酸构建物的病毒载体，或能够表达所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的经转化宿主细胞。
本发明还包括本发明中要求保护的用途，其特征在于所述核酸构建物、或包含于所述载体或所述经转化细胞中的核酸构建物，所含核酸序列选自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15个连续核苷酸(优选20、25、30、40、和50个连续核苷酸)的片段、或与所述序列之一优化比对后具有至少80％(优选90％和95％)同源性的序列。
另一方面，本发明包括上文中本发明要求保护的用途中定义的药物组合物。
在这些药物组合物中，优选药物组合物的其特征在于，在制药学可接受介质中包含至少一种肠细菌OmpA蛋白或其片段，其通过混合或偶联与至少一种肿瘤细胞相关或特异的抗原或半抗原相结合。
为了本发明的目的，制药学可接受介质是本发明化合物在其中施用的介质，优选能够给人注射的介质。它可由水、水性盐溶液、或基于右旋糖和/或甘油的水溶液组成。
在特定实施方案中，本发明中要求保护的组合物还包含去污剂。
本发明中要求保护的组合物还可以包含去污剂，特别是任何形式的制药学可接受的表面活性剂，诸如例如阴离子、阳离子、非离子、或两性表面活性剂。优选使用去污剂Zwittergent3-12和辛基吡喃葡糖苷，甚至更优选Zwittergent3-14。
优选的是，本发明中要求保护的药物组合物的其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述肠细菌的培养物或者通过重组途径获得。
再次优选的是，本发明中要求保护的药物组合物的其特征在于所述肠细菌是肺炎克雷伯氏菌。
在优选的实施方案中，本发明涉及本发明中要求保护的组合物，其特征在于所述OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)如a)中定义的序列的至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列片段，优选10、15、20、和25个氨基酸。
在作为本发明中要求保护的组合物的一部分的抗原或半抗原之中，优选选自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂类、或能够特异性引发针对肿瘤细胞的CTL应答的任何化合物。
在同等优选的实施方案中，本发明涉及本发明中要求保护的组合物，其特征在于所述抗原或半抗原通过共价连接与所述OmpA蛋白或其片段偶联，特别是通过化学合成产生的偶联，可以在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中适当导入一种或多种连接元件，诸如氨基酸，从而有助于所述化学偶联。
在同等优选的实施方案中，本发明涉及本发明中要求保护的组合物，其特征在于当所述抗原或半抗原的本质是肽(杂合蛋白的表达)时，所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段之间的偶联通过基因重组产生。
由此，本发明还涉及本发明中要求保护的组合物，其特征在于药物组合物包含编码所述杂合蛋白的核酸构建物，所述核酸构建物可能包含于载体或能够表达所述杂合蛋白的经转化宿主细胞之中。
在优选的实施方案中，本发明涉及本发明中要求保护的组合物，其特征在于所述核酸构建物所含核酸序列选自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15个连续核苷酸的片段、或与所述序列之一具有至少80％同源性的序列。
在本发明要求保护的组合物之中，还优选其装运形式使之可改进其稳定性和/或其免疫原性的药物组合物，特别是呈脂质体形式的含编码所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的核酸构建物的病毒载体，或能够表达所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的经转化宿主细胞。
在最后一个方面，本发明中要求保护的组合物的其特征在于，除了所述肠细菌OmpA蛋白或其片段或编码所述OmpA蛋白或其片段的核酸构建物，即本发明中要求保护的组合物用于诱导CTL应答的特征性成分，它不包含其它用于诱导CTL应答的佐剂。
下文的图例和实施例旨在例证本发明，绝非限制其范围。
图例

图1A、1B、1C、和1D效应细胞抗MELAN-A和抗TRP-2的CTL活性测量。
在用与3μg rP40混合的50μg hELA(图1A)、与300μg rP40混合的50μghELA(图1B)、与rP40偶联的50μg hELA(图1C)、或与300μgrP40混合的TRP-2肽(图1D)免疫之后，在评估它们杀伤可能经相关肽预脉冲(长方形)或可能未经相关肽预脉冲的(菱形)靶细胞的能力之前，用经照射和用1μM相关肽预脉冲的EL-4 A2/Kb细胞(图1A、1B、或1C)或EL-4细胞(图1D)刺激引流淋巴结细胞。
图1A-1D的X轴点对应于效应T细胞(活性淋巴细胞)与靶细胞(EL-4 A2/Kb或EL-4)混合的比率。
图2A、2B、2C、和2D与由标准免疫方案获得的CTL活性比较，当存在rP40蛋白时效应细胞抗MELAN-A的CTL活性测量。
在单独用50μg hELA(ELA，图2A)、与300μg rP40混合的hELA(ELA+P40，图2B)、与300μg rP40偶联的hELA(ELA/P40，图2C)、或以IFA为佐剂与50μg P30肽混合的hELA(ELA+IFA+TT，图2D)(IFA指不完全弗氏佐剂，TT指破伤风类毒素)免疫之后，在评估它们杀伤可能经hELA肽预脉冲的(长方形)或可能未经hELA肽预脉冲的(菱形)EL-4A2/Kb靶细胞的能力之前，在体外用经照射和用1μM相关肽预脉冲的EL-4A2/Kb细胞刺激引流淋巴结细胞2周。
图3A、3B、3C、和3D用rP40+TRP-2肽免疫的CTL活性和抗肿瘤效果。
图3A用TRP-2肽与rP40混合物的免疫诱导对肽特异的CTL应答。给C57BL/6小鼠皮下注射与300μg rP40混合的50μgTRP-2肽。10天后，分离淋巴结并用可能经TRP-2肽脉冲的(长方形)或可能未经TRP-2肽脉冲的(菱形)经照射EL-4细胞再刺激。
图3B、3C、和3DC57BL/6小鼠接受2×103个B16F10自体黑素瘤细胞，皮下注射至胁腹。同时(图3B和3D)或4天后(图3C)，给这些小鼠中的一些(尾基)皮下免疫与300μgrP40混合的50μg TRP-2肽(○)，给其余小鼠单独免疫P40蛋白(图3B和3C的■)或TRP-2肽(图3D的■)。由移植的第18天开始测量肿瘤体积。
图4A、4B、和4C用与p257-264OVA肽偶联的rP40蛋白免疫后抗OVA的CTL活性测量。
C57BL/6小鼠通过尾基皮下注射接受200μg P40-Ova(■)、Ova偶联珠(○)、增溶Ova(□)、Ova-BS3(▲)(BS3指二(琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)、P40(←)、或DT-Ova(●)(DT指白喉类毒素)。
将用50μg/ml OVA肽(图4B)脉冲(图4B)或未脉冲(图4C)或者用ova基因(E.G7系)转染(图4A)的ELA胸腺瘤靶细胞于37℃与51Cr一起温育，并与效应细胞一起培养。
实施例实施例1编码肺炎克雷伯氏菌P40蛋白的基因的克隆通过PCR扩增由肺炎克雷伯氏菌IPI145(Nguyen等人，1998，基因(Gene))基因组DNA获得编码P40蛋白的基因。将编码该基因的基因片段插入多种表达载体，受多种启动子，特别是Trp操纵子的控制。P40蛋白的核苷酸序列和肽序列分别由下文的序列SEQ ID NO.1和SEQID NO.2表示。用pvaLP40表达载体转化大肠杆菌K12生产菌株。以包涵体的形式生产重组P40蛋白(rP40)，产量相当高(g蛋白质/g干生物量大于10％)。
此实施例仅仅是rP40蛋白表达的例示，此例示有可能延伸至其它细菌菌株和其它表达载体。实施例2用于rP40融合蛋白的发酵的方法在装有250ml含氨苄青霉素(100μg/ml，Sigma)和四环素(8μg/ml，Sigma)的TSB(胰胨豆胨培养基，Difco)培养基的锥形瓶中，接种上述经转化大肠杆菌菌株。于37℃温育过夜后，用200ml此培养物接种发酵罐(Biolaffite，法国)中的2L培养基。在相当传统的方法中，培养物培养基可能包含已知促进高密度细菌细胞生长的添加维生素和/或酵母提取物的化学试剂。
在发酵过程中控制的参数是pH、搅拌、温度、含氧水平、和混合源(甘油或葡萄糖)的供应。一般而言，pH调至7.0，温度固定在37℃。通过恒速(12ml/h)供应甘油(87％)来控制生长，从而将溶氧张力信号维持在30％。当培养物的混浊度(于580nm测量)达到80时(培养大约24小时后)，通过加入吲哚丙烯酸(IAA)至终浓度25mg/L来处理蛋白质生产。诱导大约4小时后，通过离心收获细胞。获得的净生物量为大约200g。实施例3用于提取并纯化rP40蛋白的方法提取rP40将培养物离心(4000rpm(转/分)，10min，4℃)后，将细胞重悬于25mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)。用溶菌酶处理(0.5g/L，1h，室温，温和搅拌)后获得不溶性成分即包涵体。将通过离心(15min，10,000rpm，4℃)获得的包涵体沉淀用含5mM MgCl2的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)吸收，然后离心(15min，10,000rpm)。
将包涵体在含7M尿素(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(还原二硫键)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中于37℃溶解2小时。离心(15min，10,000rpm)使之可消除不溶性颗粒。
然后重悬于13倍体积的含NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％，w/v)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中。将溶液于室温接触空气温和搅拌过夜(从而通过稀释和二硫键的再氧化促进蛋白质复性)。纯化rP40蛋白-阴离子交换层析步骤再次离心后，将溶液用含0.1％Zwittergent3-14(100倍缓冲液体积)的25mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)于4℃透析过夜。
将透析液上样至用上述缓冲液以线性流速15cm/h平衡的含强阴离子交换剂类载体(Biorad Macro Prop High Q凝胶)的层析柱。于280nm检测蛋白质。用含0.2M NaCl和0.1％Zwittergent3-14的25mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)以线性流速60cm/h洗脱rP40蛋白。-阳离子交换层析步骤合并含rP40蛋白的收集液，并通过超滤浓缩。对于大约100ml体积，借助带搅拌的Amicon小室系统使用YM10型Diaflo膜(截留阈值10kDa)浓缩；对于较大体积，借助Millipore Minitan切向流过滤系统，使用截留阈值10kDa的膜板浓缩。将由此浓缩的收集液用含0.1％Zwittergent3-14的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)于4℃透析过夜。
将透析液上样至用含0.1％Zwittergent3-14的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)平衡的含强阳离子交换剂类载体(Biorad Macro Prop HighS凝胶)的层析柱。用0.7M NaCl浓度以线性流速61cm/h洗脱rP40蛋白。电泳图显示大约95％的纯度。通过SDS-PAGE监测蛋白质状态。由肺炎克雷伯氏菌膜提取的P40蛋白根据其是否变性或呈天然形式而具有特征性电泳(泳动)行为。事实上，天然形式(β-折叠结构)的分子量小于由变性剂(诸如尿素或盐酸胍)作用或存在SDS时于100℃加热产生的变性形式(α-螺旋结构)。不管进行后者时是否存在0.1％(w/v)Zwittergent3-14，rP40蛋白在复性结束时不正确复性。另一方面，用含0.1％(w/v)Zwittergent3-14的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)透析后获得完全复性。然而，应当注意的是，只有在室温的稀释步骤和处理在Zwittergent3-14(不含去污剂阴性结果)中进行时获得这种复性。实施例4CTL的产生为几种抗原定义了针对黑素瘤细胞的抗肿瘤CTL应答。这些抗原包括于下列三类之一a)黑素瘤特异性排异抗原，诸如MAGE家族(由van der Bruggen等人综述，科学(Science)2541643)；b)来自正常蛋白质突变的抗原。这一组包括MUM-1(Coulie等人，1995，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)927976-7980)；CDK4(Wolfel等人，1995，科学(Science)2961281-1284)；和HLA-A2(Brandel等人，1996，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1832501-2508)；c)黑素瘤和黑素细胞表达的分化抗原。这一组包括酪氨酸酶(Wolfel等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)4759和Brichard等人，1996，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)26224)；gp100(Kang等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)1551343；Cox等人，1994，科学(Science)264716；和Kawakami等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)1553961)；gp75(Wang等人，1996，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1831131)；和Mart-1/MelanA(参阅美国专利5,620,886)。
在所有这些抗原中，Mart-1/MelanA似乎是用于免疫治疗的最佳候选者，这有几个原因。首先，该抗原是根据CTL应答鉴定的，所述CTL应答是体内浸润黑素瘤的淋巴细胞，不是体外外周血细胞，这说明了该抗原在天然应答中的较大相关性，所述天然应答在体内是针对黑素瘤的(Kawakami等人，1994，实验医学杂志(J.Exp.Med.)180347)。此外，Mart-1/MelanA在所有检查的黑素瘤上表达，使之成为免疫治疗干预的优选靶。最后，由Mart-1/MelanA衍生的肽能够在患有黑素瘤(表达HLA-A2组织相容性抗原)的患者体内诱导特异性CTL应答(Rivoltini等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)1542257；Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)1601750)。
HLA-A2是在高加索人中表达的最常见的等位基因。已经为该等位基因定义了Mart-1/MelanA的CTL表位。由大多数人类CTL系识别的抗原肽包括第27-35位氨基酸AAGIGILTV(Kawakami等人，1994，实验医学杂志(J.Exp.Med.)180347)。此外，关于与HLA-A*0201的结合亲和力和CTL克隆的识别的研究已经证明，用于这两种功能的最佳肽是第26-35位十肽EAAGIGILTV(Romero等人，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)1592366)。然而，这些肽在体外(Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)1601750)和在体内(Jaeger等人，1996，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)66162)似乎免疫原性微弱。
当将Mart-1/MelanA的T表位氨基酸序列与A*0201的肽基序(Rammensee等人，1995，免疫遗传学(Immunogenetics)41178)进行比较时，第26-35位和第27-35位肽似乎在第2位具有非优势锚定残基，由此微弱结合HLA-A*0201分子(Kawakami等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol.)154，3961)，这可以解释其微弱的免疫原性。以编号WO98/58951公开的国际专利申请描述了第26-35位肽的类似物，其中第2位丙氨酸用亮氨酸替代(序列将命名为ELA的序列SEQ IDNO.3)。
用于下文实验的hELA肽是专利申请WO98/58951的主题，该专利属于路德维希癌症研究学会(Institut Ludwig de Recherche sur leCancer)。hELA是在黑素细胞和黑素瘤上表达的蛋白质Melan-A/Mart-1第26-35位十肽(EAAGIGILTV)的类似物。虽然Melan-A/Mart-1第26-35位十肽能够结合HLA-A0201分子(Romero等人，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)1592366-2374)，但是它在体外和体内是微弱的免疫原(Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)1601750-1758)。hELA类似物通过用亮氨酸替代Melan-A/Mart-1第26-35位十肽的第2位氨基酸(丙氨酸)来产生。根据关于将肽锚定至HLA-A0201分子所需残基的分析，所述替代在体外导致黑素瘤患者CTL的更有效识别和更好的免疫原性(Valmori等人，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)1601750-1758)。将C57B1/6×BDA/s品系的HLA-A*0201/Kb(A2/Kb)转基因小鼠(Vitiello等人，1991，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1731007-1015)用于该研究以测试ELA。在这些小鼠中表达的I型MHC分子是由人类HLA-A0201分子(发现的最常见的同种异型)的α1和α2结构域和鼠Kb分子的α3结构域构成的嵌合分子。
TRP-2肽的序列SEQ ID NO.4是对应于酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)第181-188位氨基酸(VYDFFVWL)的八肽。TRP-2在黑素细胞和黑素瘤中表达。已经证明该抗原在C57BL/6(H-2Kb)小鼠中诱导针对黑素瘤提供保护的CTL应答(Bloom等人，1997，实验医学杂志(J.Exp.Med.)185453-459)。A用与肽(Melan-A或TRP-2类似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A和抗TRP-2的CTL的产生实验方案A2/Kb小鼠通过尾基皮下注射接受-与3或300μg rP40混合的50μg ELA；-与300μg rP40共价偶联的50μg ELA。
C57BL/6小鼠通过尾基皮下注射接受-与300μg rP40混合的50μg TRP-2肽(第181-188位)。细胞毒性效应细胞的产生免疫后10天，处死小鼠并由引流淋巴结回收淋巴细胞，以在体外用相关肽进行刺激。
将这些淋巴细胞(4-5×106)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μM β-2-巯基乙醇的DMEM中，与2-5×105个经照射(10kRad)和经脉冲(用1μM相关肽于37℃ 1h)的EL-4 A2/Kb细胞或ELA细胞一起培养。每周一次刺激2次后，测定细胞的细胞毒性活性。细胞毒性活性的测量将EL-4 A2/Kb细胞或ELA细胞与51Cr在存在或不存在相关肽的条件下温育1小时，清洗，然后以多种比率与效应细胞一起在96孔板中体积200μl于37℃温育4-6小时。然后将细胞离心，并在100μl上清液中测量51Cr释放。如下计算比裂解百分率％比裂解＝(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)×100。结果如图1A-1D所示，用在与hELA(图1B)或TRP-2(图1D)的混合物中的最佳剂量的rP40(300μg)免疫小鼠，诱导强烈的特异性CTL应答。在用与hELA偶联的rP40(图1C)免疫后也观察到这种应答。另一方面，单独用肽或单独用rP40(结果未显示)或者用在与亚最佳剂量rP40(3μg)的混合物中的hELA肽免疫不诱导任何CTL活性(图1A)。这些结果证明与免疫原性肽混合或偶联的rP40分子使之有可能在不加入佐剂的情况下在体内诱导特异性CTL应答。B用与肽(Melan-A类似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A的CTL的产生，与标准免疫方案比较实验方案A2/Kb小鼠接受-50μl IFA(不完全弗氏佐剂)，通过尾基皮下注射；3周后，50μg hELA，同时存在50μg由破伤风类毒素(TT)衍生的辅助T p30肽(Panina-Bordignon等人，1989，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)192237)，以IFA为佐剂。此方案被描述用于产生抗肽CTL(Valmori等人，1994，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)241458)并作为阳性对照使用。-50μg hELA或与50μg hELA混合或偶联的300μg rP40。细胞毒性效应细胞的产生最终免疫后10天，处死小鼠并由引流淋巴结回收淋巴细胞，以在体外用相关肽刺激。
将这些淋巴细胞(4-5×106)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μM β-2-巯基乙醇的DMEM中，与2-5×105个经照射(10kRad)和经脉冲(用1μM相关肽于37℃1h)的EL-4 A2/Kb细胞(经HLA-A*0201/Kb基因转染的鼠细胞)一起培养。
每周一次刺激1次、2次、或3次后，测定细胞的细胞毒性活性。
根据上述方法测量细胞毒性活性。结果用与hELA偶联的无佐剂的rP40免疫后，测量到与用hELA+P30/IFA免疫后观察到的相当的抗hELA的CTL活性(参照图2C和2D)。相似的，rP40+hELA肽混合物(其自身也无佐剂的)产生CTL，其方式与用于产生CTL的传统方案获得的相似(参照图2B和2D)。
单独用肽(参照图2A)或单独用rP40蛋白(未显示)免疫后，无论在哪天刺激效应细胞，没有检测到CTL活性。实施例5用rP40与小鼠黑素瘤表达的肽的混合物免疫的抗肿瘤效果为了评价rP40产生抗肿瘤CTL应答的能力，测试rP40蛋白诱导针对肽序列SEQ ID NO.4(VYDFFVWL)的CTL应答的能力。肽序列SEQID NO.4(VYDFFVWL)衍生自酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)，该蛋白质由C57BL/6小鼠衍生的B16F10黑素瘤表达。这种肽在这种品系中具有免疫原性。然后测试移植到经或未经rP40与TRP-2肽混合物免疫的C57BL/6小鼠中的B16F10细胞的生长。实验方案为了产生抗TRP-2肽的CTL应答，使用与实施例4中所述相同的方案，除了在这种情况下使用C57BL/6小鼠。
对于保护实验，C57BL/6小鼠通过皮下(s.c.)注射至胁腹接受2×103个B16F10自体黑素瘤细胞。同时或4天后，这些小鼠中的一些于尾基皮下免疫与300μg rP40混合的50μg TRP-2肽。然后以规则间隔测量肿瘤的生长。结果如图3A所示，使用TRP-2与rP40蛋白混合物的免疫能够产生针对这种肽的特异性CTL应答，这确认了实施例4中所述用hELA蛋白获得的结果。此外，这种CTL应答与抑制B16F10黑素瘤的生长有关(图3B、3C、和3D)。值得注意的是，这种保护作用不仅在移植肿瘤的同时进行TRP-2肽+rP40免疫时(图3B和3D)是显著的，而且在移植4天后进行免疫时(图3C)同样显著。
这些结果清楚的显示使用与抗原性肿瘤肽相结合的肠细菌OmpA蛋白(诸如肺炎克雷伯氏菌OmpA蛋白)用于诱导有效预防或治疗癌症(诸如黑素瘤)的特异性CTL型应答的治疗效果。实施例6用与p257-264 Ova肽偶联的rP40免疫后抗OVA的CTL的产生Ova肽p257-264是对应于卵清蛋白序列第257-265位氨基酸序列(包括末端)的卵清蛋白保守序列片段的八肽。卵清蛋白作为针对表达卵清蛋白的肿瘤细胞提供保护的肽使用。实验方案C57BL/6小鼠通过尾基皮下注射接受200μg P40-Ova(●)、Ova偶联珠(○)、增溶Ova(□)、Ova-BS3(▲)(BS3指二(琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)、P40(←)、或DT-Ova(●)(DT指白喉类毒素)。细胞毒性效应细胞的产生免疫后7天，处死小鼠并回收脾。将脾细胞(4×107)在烧瓶中在含1.5×106个经照射(4kRad)E.G7细胞的DMEM中进行培养。细胞毒性活性的测量将经或未经OVA肽脉冲或者经ova基因(E.G7系)转染的EL-4胸腺瘤细胞或EL4细胞于37℃与51Cr一起温育并与上文获得的效应细胞一起培养。
如实施例4A所述计算比裂解百分率。结果如图4A-4C所示，用与OVA肽偶联或混合的rP40蛋白免疫小鼠诱导强烈的特异性CTL应答。这种应答与用阳性对照即卵清蛋白偶联珠(见图4A和4B)免疫后观察到的相似。另一方面，用可溶性卵清蛋白、ova-BS3、和DT-Ova免疫没有效果。这些结果证明与免疫原性肽偶联的rP40模块使之可在不加入佐剂的情况下在体内诱导特异性CTL应答。
权利要求
1.肠细菌OmpA蛋白或其片段用于制备旨在产生或增强针对传染性因子或肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途。
2.权利要求1的用途，其特征在于所述药物组合物还包含与所述肠细菌OmpA蛋白相结合的、对所述传染性因子或所述肿瘤细胞特异的抗原或半抗原。
3.权利要求1或2的用途，其特征在于所述传染性因子是病毒颗粒、细菌、或寄生虫。
4.权利要求1-3之一的用途，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述肠细菌培养物获得。
5.权利要求1-3之一的用途，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段通过重组途径获得。
6.权利要求1-5之一的用途，其特征在于所述肠细菌是肺炎克雷伯氏菌。
7.权利要求6的用途，其特征在于所述OpmA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)如a)中定义的序列的至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列。
8.权利要求2-7之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原选自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂类、或能够特异性引发针对所述传染性因子或所述肿瘤细胞的CTL应答的任何化合物。
9.权利要求2-8之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段偶联或混合。
10.权利要求9的用途，其特征在于所述抗原或半抗原通过共价连接与所述OmpA蛋白或其片段偶联。
11.权利要求10的用途，其特征在于通过共价连接的偶联是通过化学合成产生的偶联。
12.权利要求11的用途，其特征在于在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中导入一种或多种连接元件，从而有助于化学偶联。
13.权利要求12的用途，其特征在于所述导入的连接元件是氨基酸。
14.权利要求10的用途，其特征在于当所述抗原或半抗原的本质是肽时，所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段之间的偶联通过遗传重组产生。
15.权利要求14的用途，其特征在于药物组合物包含编码所述杂合蛋白的核酸构建物。
16.权利要求15的用途，其特征在于所述核酸构建物包含于载体或能够表达所述杂合蛋白的经转化宿主细胞中。
17.权利要求1-16之一的用途，用于制备旨在消除传染性因子或抑制肿瘤生长的药物组合物。
18.权利要求1-17之一的用途，用于制备旨在预防或治疗包括病毒、细菌、真菌、和寄生虫感染的传染性疾病之药物组合物。
19.权利要求1-17之一的用途，用于制备旨在预防或治疗癌症的药物组合物。
20.权利要求19的用途，用于制备旨在预防或治疗与肿瘤抗原相关的癌症的药物组合物。
21.权利要求19和20的用途，用于制备旨在预防黑素瘤的药物组合物。
22.权利要求1-21之一的用途，其特征在于所述药物组合物以使之可改进其稳定性和/或其免疫原性的形式运载。
23.权利要求22的用途，其特征在于所述载体是脂质体，包含编码所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的核酸构建物的病毒载体，或能够表达所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的经转化宿主细胞。
24.权利要求15、16、和23的用途，其特征在于所述核酸构建物或包含于所述载体或所述经转化宿主细胞中的核酸构建物包含这样的核酸序列，其选自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15个连续核苷酸的片段、或与所述序列之一具有至少80％同源性的序列。
25.一种药物组合物，其特征在于它在制药学可接受介质中包含至少一种肠细菌OmpA蛋白或其片段，其通过混合或偶联与至少一种肿瘤细胞相关或特异的抗原或半抗原相结合。
26.权利要求25的组合物，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段使用提取方法由所述肠细菌培养物获得。
27.权利要求25的组合物，其特征在于所述肠细菌OmpA蛋白或其片段通过重组途径获得。
28.权利要求25-27之一的组合物，其特征在于所述肠细菌是肺炎克雷伯氏菌。
29.权利要求28的组合物，其特征在于OmpA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)与序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)如a)中定义的序列的至少5个氨基酸的片段的氨基酸序列。
30.权利要求25-29之一的组合物，其特征在于所述抗原或半抗原选自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂类、或能够特异性引发针对肿瘤细胞的CTL应答之任何化合物。
31.权利要求25-30之一的组合物，其特征在于所述抗原或半抗原通过共价连接与所述OmpA蛋白或其片段偶联。
32.权利要求31的组合物，其特征在于通过共价连接的偶联是通过化学合成产生的偶联。
33.权利要求32的组合物，其特征在于在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中导入一种或多种连接元件，从而有助于化学偶联。
34.权利要求33的组合物，其特征在于所述导入的连接元件是氨基酸。
35.权利要求31的组合物，其特征在于当所述抗原或半抗原的本质是肽时，所述抗原或半抗原与所述OmpA蛋白或其片段之间的偶联通过遗传重组产生。
36.权利要求35的组合物，其特征在于药物组合物包含编码由所述偶联后获得的杂合蛋白的核酸构建物。
37.权利要求36的组合物，其特征在于所述核酸构建物包含于载体或能够表达所述杂合蛋白的经转化宿主细胞中。
38.权利要求36和37的组合物，其特征在于所述核酸构建物包含这样的核酸序列，其选自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15个连续核苷酸的片段、或与序列SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的序列。
39.权利要求25-38之一的组合物，其特征在于所述药物组合物以使之可改进其稳定性和/或其免疫原性的形式运载。
40.权利要求39的组合物，其特征在于所述载体是脂质体，包含编码所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的核酸构建物的病毒载体，或能够表达所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述杂合蛋白的经转化宿主细胞。
41.权利要求25-40之一的组合物，其特征在于所述制药学可接受介质由水、水性盐溶液、或基于右旋糖和/或甘油的水性溶液组成。
42.权利要求25-41之一的组合物，其特征在于所述组合物还包含去污剂。
43.权利要求25-42之一的组合物，不含任何其它用于诱导CTL应答的佐剂。
全文摘要
本发明涉及肠细菌膜蛋白OmpA,特别是肺炎克雷伯氏菌,与一种抗原或半抗原相结合用于制备产生或增强针对感染或肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途。本发明还涉及该化合物用于预防和治疗感染或癌症的用途,特别是与肿瘤抗原相关的癌症,诸如黑素瘤,和包含一些该化合物的药物组合物。
文档编号A61P37/04GK1344166SQ0080509
公开日2002年4月10日 申请日期2000年2月17日 优先权日1999年2月17日
发明者T·伦诺, J－Y·邦尼费 申请人:皮埃尔法博赫药品公司