通过低分子量肝素与血小板聚集抑制剂间协同作用防治各种血栓栓塞疾病的联合治疗方法

专利名称：通过低分子量肝素与血小板聚集抑制剂间协同作用防治各种血栓栓塞疾病的联合治疗方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗、预防和缓解血栓栓塞疾病危险的联合治疗方法，该方法包括施用低分子量肝素(如亭扎肝素)和血小板GPIIb/IIIa拮抗剂(如罗西非班(roxifiban))。
背景技术：
在多数发达国家，血栓栓塞疾病是造成残疾和死亡的主要原因，所述血栓栓塞疾病包括稳定性和不稳定性心绞痛、心肌梗塞、中风和肺栓塞。血小板糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)是纤维蛋白原和其它粘连糖蛋白的主要血小板受体，所述其它粘连糖蛋白包括纤连蛋白、玻连蛋白和von Willebrand因子。与这种受体结合的配体的干扰已经在血栓栓塞疾病的动物模型(Coller，B.S.GpIIb/IIIaAntagonistsPathophysiologic and Therapeutic Insights fromStudies of C7E3 FAB.Thromb.Haemost.781，730-735，1997)和在涉及人这个主题的有限研究(White，H.D.Unmet TherapeuticNeeds in the Management of Acute Ixchemia.Am.J.Cardiol.804A，2B-10B，1997；Tcheng，J.E.Glycoprotein IIb/IIIaReceptor InhibitorsPutting EPIC，IMPACT II，RESTORE，andEPILOG Trials Into Perspective.Am.J.Cardiol.783A，35-40，1996)中被证明是有益的。
整合蛋白GPIIb/IIIa(也被称为血小板纤维蛋白原受体)是调节血小板聚集的膜蛋白。人们已公知活化血小板中的GPIIb/IIIa可结合包含粘连蛋白的四种可溶RGD，即纤维蛋白原、von Willebrand因子、纤连蛋白和玻连蛋白。术语“RGD”是指氨基酸序列Arg-Gly-Asp。纤维蛋白原和von Willebrand因子与GPIIb/IIIa的结合会导致血小板聚集。GPIIb/IIIa拮抗剂代表了一种重要的抗血小板治疗的新方法，该方法可用于治疗血栓栓塞疾病。
血小板激活和凝集牵涉不稳定心绞痛和急性心肌梗塞、牵涉溶栓治疗和血管成形术后再闭塞、牵涉短暂缺血发作以及多种其它血管闭塞疾病。当血管被急性处置如血管成形术或被动脉硬化的病生理过程比较慢性地损伤时，血小板被活化并粘附在破损的表面并且血小板之间也彼此粘附。此活化、粘附和凝集可能导致血管腔中闭塞性血栓形成。由于纤维蛋白原与活化的膜结合糖蛋白复合物(GPIIb/IIIa)的结合是正常凝集的必需的组分，故GPIIb/IIIa是抗血栓药的有价值的靶向。
抗血小板治疗已被用于很多心血管疾病状态中并结合以介入治疗如冠状动脉或外周搭桥、心脏瓣膜更换和经皮冠状动脉成形术(PTCA)。目前用药如阿斯匹林和噻氯匹定(TICLID)，对涉及血管闭塞的症状已显示效果，可能是由于对血小板功能的持续抑制。但是，阿斯匹林和噻氯匹定的抑制作用依赖于激活血小板的激动剂。例如，阿斯匹林在阻断激动剂如依赖于环加氧酶路径的胶原引起的血小板凝集中有效。但是，对可以通过不依赖于环加氧酶路径作用的凝血酶的浓缩物几乎是无效的。同样，抑制ADP引起的血小板凝集的噻氯匹定的抑制作用可以被激动剂的联合形式克服。
利用肝素对血液凝集的作用，在临床上将其作为抗凝剂和抗血栓药。肝素属于多糖类，称为糖胺聚糖(GAGs)，并由交替1-4连接的己糖醛酸和D-葡糖胺组成。己糖醛酸和葡糖胺残基在复合形式中被硫酸化，带来了广泛的结构变化。由于其负电荷密度高，肝素能与多种蛋白质和细胞膜上的碱性氨基酸簇相互作用，如凝集蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、生长因子、脂蛋白和肝脂肪酶、载脂蛋白B和E、粘着基质蛋白、血小板和内皮细胞。
低分子量肝素(LMWHs)，得自标准未分馏肝素(UFH)，与标准未分馏肝素同样有效预防和治疗静脉血栓形成并且副作用极少(SchaferA.I.，用于血栓形成的低分子量肝素，Hospital Practice，1997年1月15日，99-106页)。目前提供的低分子量肝素包括，例如，亭扎肝素、舍托肝素、帕那肝素(parnaparin)、那曲肝素、阿地肝素、依诺肝素、瑞肝素和达肝素(片段化蛋白)。
包括与阿斯匹林或低分子量肝素一起使用的GPIIb/IIIa拮抗剂的联合治疗用于治疗血栓形成疾病，包括动脉粥样硬化动脉疾病、瓣膜性心脏病、脑血管疾病如中风、心房纤维性颤动、冠状动脉疾病如心肌梗塞和不稳定性心绞痛、冠状动脉搭桥移植、外周血管疾病、假体心血管器具如心脏瓣膜和血管移植物的血栓栓塞并发征。还预计当伴随使用血管内支架方法如经皮冠状血管成形术时这些联合治疗用来防止随后的动脉栓塞形成和再闭塞。
当打算联合治疗时，必须考虑一些标准(a)每种试剂在多种血栓形成疾病中显示了显著的临床效果；(b)两种试剂以两种不同的机制和不同的能力发挥作用；(c)以调整剂量给药的这些试剂的联合可以改善效果和/或安全性。就此而言，特别是对UFH和静脉血小板GPIIb/IIIa拮抗剂在急性冠状动脉综合征(ACS)中存在临床优越性。在ACS中血小板GPIIb/IIIa拮抗剂阿昔单抗的潜在的临床益处在关键的“在预防局部缺血并发症中评价c7E3 Fab”(EPIC)和“用阿昔单抗GPIIb/IIIa阻断评价经皮动脉血管成形术对长期结果的改善”(EPILOG)实验中得以证实。在EPIC实验中，当UFH以其全剂量与阿昔单抗一起使用时发生了显著的过量出血，导致了EPILOG实验，其中使用低剂量的UFH。较低的UFH剂量带来了安全性的改善，但不能确保在EPIC中观察到的效果。同样，“在局部缺血综合征处理中血小板受体抑制”(PRISM)和“受不稳定信号和综合征限制的患者中的PRISM”(PRISM-PLUS)实验评价阿斯匹林(PRISM)或UFH加替罗非班(tirofiban)(PRISM-PLUS)的给药是否会改善在处理不稳定心绞痛中的临床结果。在PRISM-PLUS中的对照组只接受静脉内UFH。随机处理后7天内，在降低死亡、心肌梗塞或顽固性局部缺血的发生率方面，替罗非班加UFH较UFH单独使用具有更显著的效果。此发现提示UFH和GPIIb/IIIa拮抗剂联合形式使用后带来了改善的效果。GPIIb/IIIa拮抗剂与调整剂量的UFH的其它实验目前正在研究中。LMWHs与UFH相比优点显著(如下文所述)，因此，当以正确的剂量方案联合时，LMWH与血小板GPIIb/IIIa受体拮抗剂联合具有更大的潜在优点。
发明概要本发明的目的之一在于提供治疗哺乳动物血栓症的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的(i)GPIIb/IIIa拮抗剂和(ii)阿斯匹林的联合形式或者GPIIb/IIIa拮抗剂(i)和(iii)低分子量肝素的联合形式，所述(i)GPIIb/IIIa拮抗剂选自阿昔单抗、依非巴替(eptifibatide)、替罗非班、阿米非班(amifiban)、乐达非班(lefradafiban)、西拉非班(sibrafiban)、奥泊非班(orbofiban)、塞罗非班(xemilofiban)、式(A)化合物 和式(B)化合物(罗西非班) 所述(iii)低分子量肝素选自亭扎肝素、舍托肝素、帕肝素、那屈肝素、阿地肝素、依诺肝素、瑞肝素和达肝素，其中至少一种拮抗剂和阿斯匹林或至少一种拮抗剂和低分子量肝素，其以亚治疗(subtherapeutic)剂量给药。
本发明另一目的在于提供一种治疗哺乳动物血栓症的方法，其中上述(i)和(ii)或(iii)的联合形式以提供协同效果的剂量给药。
本发明另一目的在于提供一种治疗哺乳动物血栓症的方法，该方法包括施用治疗有效量的组织纤溶酶原激活物(“TPA”)和下式GPIIb/IIIa拮抗剂化合物的联合形式， 其中至少上述一种药物以亚治疗剂量给药。
本发明另一目的在于提供一种治疗下述疾病的方法急性冠状缺血综合征、血栓症、血栓栓塞、血栓闭塞和再闭塞、再狭窄、短暂局部缺血发作和首次或复发的栓塞性中风，该方法包括给处于患一种或多种所述病症的危险中的哺乳动物皮下施用与亚治疗剂量的血小板GPIIb/IIIa拮抗剂联合的亚治疗剂量的低分子量肝素。
附图简述

图1、说明了在凝血酶引起的人血小板凝集中罗西非班对亭扎肝素抗血小板效果的影响。
图2、说明了亭扎肝素和罗西非班对凝血酶引起的血小板凝集的协同抗血小板作用。
图3、说明了对于盐水载体、单独的阿斯匹林、单独的GPIIb/IIIa拮抗剂以及阿斯匹林和相同的GPIIb/IIIa拮抗剂的联合形式，颈动脉血流对时间的坐标图。
图4、说明了对于盐水载体、达肝素(片段化蛋白)单独、GPIIb/IIIa拮抗剂单独以及达肝素和相同的GPIIb/IIIa拮抗剂的联合形式，颈动脉血流对时间的坐标图。
图5、概括指出了在凝血弹性描记法中使用的仪器及这些设备的参数。
发明详述GPIIb/IIIa拮抗剂与阿斯匹林或低分子量肝素的联合形式用于治疗血栓形成疾病，包括动脉粥样硬化动脉疾病、瓣膜性心脏病、脑血管疾病如中风、心房纤维性颤动、冠状动脉疾病如心肌梗塞和不稳定性心绞痛、冠状动脉搭桥移植、外周血管疾病、假体心血管器具如心脏瓣膜和血管移植物的血栓栓塞并发征。还预计当伴随使用血管内支架方法如经皮冠状血管成形术时这些联合治疗用来防止随后的动脉栓塞形成和再闭塞。也可用于治疗血栓形成的是治疗有效量的组织纤溶酶原激活物和GPIIb/IIIa拮抗剂化合物(B)的联合形式，如本文中所述。
用于本发明的联合形式的阿斯匹林可商购并是本领域熟知的。用于本发明联合形式的低分子量肝素如达肝素(片段化蛋白)也可商购并是本领域熟知的。用于本文中的优选的GPIIb/IIIa拮抗剂化合物及其制备描述于WO95/14683、美国专利5849736中(它们的内容引入本文作为参考)。其中所述优选的化合物及其制剂具有下式化合物(A) 和化合物(B) 还优选这些化合物的其它盐和前药形式。
本发明的一个实施方案描述了制备如下病症的方法急性冠状缺血综合征、血栓症、血栓栓塞、血栓闭塞和再闭塞、再狭窄、短暂局部缺血发作和首次或复发的栓塞性中风，该方法包括给处于患上述一种或多种病症危险中的哺乳动物施用亚治疗量的低分子量肝素和亚治疗量的血小板GPIIb/IIIa拮抗剂。在本发明优选的实施方案中，血小板GPIIb/IIIa拮抗剂是罗西非班。在本发明优选的实施方案中，低分子量肝素是亭扎肝素。在本发明优选的实施方案中，给药是皮下给药。
本发明的另一个实施方案描述了含血小板GPIIb/IIIa拮抗剂和低分子量肝素及药用载体的药物组合物。在本发明优选的实施方案中，血小板GPIIb/IIIa拮抗剂是罗西非班。在本发明的优选实施方案中，低分子量肝素是亭扎肝素。
本发明的另一个实施方案描述了试剂盒，其中包括皮下注射用血小板GPIIb/IIIa拮抗剂和低分子量肝素。
本发明的另一个实施方案描述了治疗哺乳动物血栓形成的方法，包括给上述哺乳动物施用(i)亚治疗剂的GPIIb/IIIa拮抗剂和(ii)阿斯匹林的联合形式或者亚治疗剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂(i)和(iii)低分子量肝素的联合形式，所述(i)GPIIb/IIIa拮抗剂选自阿昔单抗、依非巴替、替罗非班、拉米非班(lamifiban)、乐达非班、西拉非班、奥泊非班、塞罗非班、式(A)化合物 和式(B)化合物 所述(iii)低分子量肝素选自亭扎肝素、舍托肝素、帕肝素、那屈肝素、阿地肝素、依诺肝素、瑞肝素和达肝素。在本发明优选的实施方案中，(i)和(ii)或(iii)的联合形式提供了协同作用。在本发明的优选实施方案中，使用的联合形式是GPIIb/IIIa拮抗剂和低分子量肝素的联合形式。在本发明的优选实施方案中，GPIIb/IIIa拮抗剂以亚治疗剂量给药。在本发明的优选实施方案中，GPIIb/IIIa拮抗剂是化合物A或化合物B。在本发明的优选实施方案中，低分子量肝素是达肝素。在本发明更优选的实施方案中GPIIb/IIIa拮抗剂是化合物A或化合物B而低分子量肝素是达肝素。
本发明的另一个实施方案是如下联合方式制备治疗血栓形成的药物的用途(i)亚治疗剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂和(ii)阿斯匹林的联合形式或者亚治疗剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂(i)和(iii)低分子量肝素的联合形式，所述(i)GPIIb/IIIa拮抗剂选自阿昔单抗、依非巴替、替罗非班、拉米非班、乐达非班、西拉非班、奥泊非班、塞罗非班、式(A)化合物 和式(B)化合物 所述(iii)低分子量肝素选自亭扎肝素、舍托肝素、帕肝素、那屈肝素、阿地肝素、依诺肝素、瑞肝素和达肝素(片段化蛋白)。
本发明的另一个实施方案描述了治疗哺乳动物血栓形成的方法，包括给所述哺乳动物使用(i)组织纤溶酶原激活物和(ii)下式的化合物 其中(i)或(ii)的至少一种以亚治疗剂量使用。
GPIIb/IIIa拮抗剂化合物的特定实例包括罗西非班、阿昔单抗、依非巴替、替罗非班、拉米非班、乐达非班、西拉非班(Ro-48-3657)、奥泊非班和塞罗非班，它们描述于Graul等和Scarborough的文章(Graul A，Martel AM和Castaner J.Xemilifiban；Drugs ofthe Future 22508-517，1997；Scarborough RM；依非巴替。Drugsof the Future 23585-590，1998)中。其中罗西非班、拉米非班、乐达非班、西拉非班、奥泊非班和塞罗非班是优选的。其它对本领域技术人员是显而易见的。
亭扎肝素和血小板GPIIb/IIIa拮抗剂罗西非班的联合形式对血凝块和血小板-血小板凝集物形成的作用采用研究血小板-纤维蛋白血凝块动力研究的凝血弹性描记法(TEG)进行研究，并采用研究血小板-血小板相互作用的光透射比凝集检测法(aggregometry)(LTA)进行研究。在IC50亭扎肝素条件下，通过亚治疗浓度罗西非班阻断GPIIb/IIIa的作用显示了明显的、2倍位移的IC50值。也采用LTA来研究该相互作用。与其它GPIIb/IIIa拮抗剂一样，罗西非班具有升降剧烈的量效关系。当罗西非班以亚治疗浓度与不同浓度的亭扎肝素联合时，亭扎肝素的效果显示了显著的提高(附图1)，这表明亭扎肝素给罗西非班的抗血小板效果带来了协同提高，反之亦然(附图2)。将有效的GPIIb/IIIa拮抗剂如阿昔单抗和LMWHs联合，带来了类似的协同作用。组织因子路径抑制剂(TFPI)可以抑制组织因子(TF)、调节整联蛋白、下调促炎性刺激、提供细胞保护、抗血小板作用、调整Xa和白细胞功能。给非人灵长类以等价抗xa单位静脉内施用不同的LMWHs，与其它LMWHs相比在释放游离的TFPI方面显示了不同水平的活性。此外，亭扎肝素抑制TF诱导的血小板P-选择蛋白的表达，该蛋白在调节白细胞-血小板结合和诱导炎性刺激中是重要的。
所述血小板GPIIb/IIIa受体拮抗剂和LMWHs之间的相互作用可以具有巨大的临床意义。LMWHs可以通过抑制凝血酶和Xa来提高GPIIb/IIIa拮抗剂的抗血小板活性。同时，不管激活刺激与否，GPIIb/IIIa拮抗剂通过阻断血纤蛋白原结合和凝集可以加强LMWHs的抗凝集作用；它们也有助于血小板表面原促凝剂活性的下调。减少剂量的LWMH与减少剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂的联合可以带来较高的治疗指数。
在治疗静脉血栓形成以及某种程度的急性局部缺血综合征中，对于院外病人使用来说低分子量肝素(LMWH)具有更便利的转运方法(皮下)，并且与未分馏肝素相比具有改善的效果和安全性。用计算机化的凝血弹性描记法(TEG)检测血小板和纤维蛋白增加血液凝块的剪切弹性模块的能力。此增加在重组人组织因子(TF)加速的血块形成中，在最大血小板激活的条件下测量。LMWHs之间对人血中不同介质诱发的凝集退缩的比较效果用TFG进行检测。这些数据显示不同的LMWHs在抑制不同介质在剪切应力下诱导的凝块形成中的能力。亭扎肝素显示了在抑制TF、脂多糖(LPS)、Xa和凝血酶诱导的在剪切应力下的血块形成中具有较高的效力。该数据说明了与其它抗凝机理相比LMWH的作用更广泛。在这些条件下，血小板将血块强度显著提高了8倍(相对于无血小板纤维蛋白凝块)。阿昔单抗和罗西非班通过影响血小板对纤维蛋白经血小板GPIIb/IIIa受体的收缩力的传递，抑制了凝块强度的升高。亭扎肝素在抑制由TF、Xa或凝血酶介导的血块形成中显示了高效力。亚治疗剂量的亭扎肝素和亚治疗剂量的罗西非班或阿昔单抗的联合，在改进抗血小板和抗凝剂(凝血由TF、Xa或凝血酶介导)效果方面带来了明显的协同作用。这些数据为低剂量亭扎肝素与低剂量GPIIb/IIIa拮抗剂在预防和治疗不同血栓栓塞性疾病中的用途提供了支持。
与未分馏肝素(UFH)相比，LMWHs表现出改善的皮下(SC)生物利用度；较低的蛋白结合；较长的半衰期；抗凝血酶III结合位点的可变数量；不同的糖胺聚糖浓度；不同的抗丝氨酸蛋白酶活性(抗-Xa、抗-IIa和抗-Xa/抗-IIa比)；在释放TPFPI中的不同效力；血管内皮细胞结合动力学的不同水平；及由此产生的不同的血管保护作用。因此，在最近十年中，在预防和治疗静脉血栓栓塞疾病(VTE)中LMWHs代替UFH的趋势增高。随机临床实验表明以最佳的剂量单独使用LMWHs至少与uFH同样有效，且可能比UFH更安全。每天皮下给药一或两次的方案不需要监控，此便利促使LMWHs应用更广泛。众所周知，由于制备方法的不同，不同LMWHs在其理化性质方面有所不同。这些不同导致了其药效和药代动力特性的不同。世界卫生组织(WHO)和美国食品和药品管理委员会(FDA)认可LMWHs作为单独的药物，其不可互换使用。
在本文中，短语“治疗有效量”旨在包括有效治疗哺乳动物血栓形成的所要求保护化合物的联合形式的量。化合物的联合优选协同的联合。“协同”，如Chou和Talalay(Adv.Enzyme Regul.2227-55(1984))所述，是当联合给药时化合物的作用(此处是抗血栓栓塞作用)大于每种化合物作为单一药物单独给药时作用的加和。总之，协同作用在一种或多种合用化合物的亚治疗剂量时显示得最清楚。协同作用可以是与单一组分相比联合形式的抗高血压作用、抗栓塞作用或一些其它非加和的有益作用。
当用于本文中描述的化合物时，术语“联合给药”、“联合形式”或“联合”指各化合物或组分同时对所治疗的哺乳动物给药。当联合使用时，每种化合物或组分可以同时给药，或以任何次序依次给药或在不同的时间点给药，以提供所需的治疗作用。“亚治疗剂量”指当给哺乳动物单独使用时不能给所治疗疾病所需的治疗作用的各组分的量。
“前药”作为本文中使用的术语，用来包括任何共价键合的载体，当这样的前药给哺乳动物对象使用时，其在体内释放本发明的活性母体药物。因为已知前药提高药物的一些必要的性质(如溶解度、生物利用度、制备等)，本发明的化合物可以以前药形式给药。前药包括本发明的化合物，其中羟基、氨基或巯基与任何基团键合，当本发明的前药给哺乳动物对象使用时，其分别裂解为游离的羟基、游离的氨基或游离的巯基。前药的实例包括但不限于本发明化合物的醇和胺官能基的乙酸、甲酸和苯甲酸衍生物。
剂量和制剂GPIIb/IIIa拮抗剂和阿斯匹林或低分子量肝素的联合形式，以及TPA和GPIIb/IIIa拮抗剂化合物B的联合形式，通过任何手段让该制剂与其作用位点，即哺乳动物体内的GPIIb/IIIa受体接触，以治疗血栓形成。它们通过用于与药物联合使用的任何常规手段给药，或者以单个治疗剂的形式或者以治疗剂的联合形式给药。
适于给药的组合物的剂型每单位含约1mg至约100mg的活性组分。在这些药物组合物中，活性组分一般以占此组合物总重量的约0.5-95％的量存在。此活性组分可以以固体剂型的形式口服，如胶囊、片剂和散剂，或者以液体剂型的形式口服，如酏剂、糖浆和混悬剂。其也可以以灭菌液体剂型的形式非肠道给药。
明胶胶囊含活性组分和粉状载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的稀释剂可以用来制备压缩片。片剂和胶囊都可以制备为缓释产品，以在若干小时的期间内提供药物的连续释放。压缩片可以进行糖包衣或膜包衣以掩盖任何令人不快的味道并保护该片剂不受空气影响，或进行肠溶包衣以在胃肠道选择崩解。口服液体剂型可以含有着色剂或矫味剂以增加患者的接受程度。
一般来说，水、适宜的油、盐水、右旋糖(葡萄糖)水溶液和相关糖溶液以及二元醇如丙二醇或聚乙二醇是非肠道给药溶液剂的适宜载体。非肠道给药用溶液剂优选含有活性组分的水溶性盐、适宜的稳定剂和缓冲物质(如果需要)。抗氧化剂如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，不论单独或联合，都是适宜的稳定剂。也可以使用枸橼酸及其盐，以及EDTA钠。此外，非肠道给药用溶液可以含有防腐剂，如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯以及氯丁醇。适宜的药物载体描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，19版，MackPublishing Company，Easton，PA，1995，该书是本领域的标准参考书，将其内容引入作为参考。
本发明化合物给药用药物剂型可以举例说明如下胶囊大多数单位剂型的胶囊可以制备如下向每个标准两片硬明胶胶囊中添加0.1至100mg的粉状活性组分、150mg的乳糖、50mg纤维素和6mg硬脂酸镁。
软明胶胶囊可以制备活性组分在食用油如豆油、棉籽油或橄榄油中的混合物，并借助容积泵注入明胶中形成软明胶胶囊形式，其中含0.1至100mg的活性组分。然后，应将此胶囊洗涤并干燥。
片剂通过常规方法可以制备大量的片剂，以便使单位剂型是0.1至100mg活性组分、0.2mg胶态二氧化硅、5mg硬脂酸镁、275mg微晶纤维素、11mg淀粉和98.8mg乳糖。可以施用适宜的包衣以增加适口性或延迟吸收。
混悬剂可以制备口服用含水混悬剂，其中每5mL中含0.1至100mg细分散的活性组分、200mg羧甲基纤维素钠、5mg苯甲酸钠、1.0g山梨醇溶液(U.S.P)和0.025mg香兰素。
注射剂适于注射用的非肠道组合物可以制备如下将0.1至100mg的活性组分在10％(体积)丙二醇和水中搅拌。将此溶液通过常用技术灭菌。
本发明的联合用化合物可以如此配制，虽然活性组分在单位剂型中混合，但是这些活性组分之间的物理接触被降低至最小。为了将接触降低至最小，例如，其中产品是口服给药的，对一种活性组分可以进行肠溶包衣。通过将活性组分进行肠溶包衣，不仅可能将混合的活性组分之间的接触降至最小，还可能控制这些组分之一在胃肠道中的释放，以便这些组分之一不在胃中释放，而是在肠中释放。本发明的另一个实施方案，其中混合的化合物需要口服给药，活性组分之一是用持续释放物质包衣，其在整个胃肠道都起持续释放作用，且也能将混合的活性组分之间的物理接触降至最小。此外，缓释组分也可以再进行肠溶包衣，以便此组分的释放只在肠道中发生。另一项研究将包括联合的化合物的制剂，其中一种化合物用持续释放和/或肠溶释放聚合物包衣，而另一种化合物也用聚合物，如低粘度羟丙甲基纤维素或本领域已知的其它适当的物质进行包衣，以便进一步分隔活性组分。聚合物包衣用来形成防止与其它组分相互作用的附加的屏障。
其中一种活性组分是肠溶包衣的本发明的联合产品的剂型，可以是片剂形式，即肠溶包衣化合物和其它活性组分一起混合并再压制为片剂，或将肠溶包衣组分压制为片剂的一层，而另一种活性组分压制为另一层。任选地为了进一步分隔这两层，可以存在一层或多层安慰剂层，以便安慰剂层在活性组分层之间。此外，本发明的剂型可以是胶囊形式，其中一种活性组分压制为片剂，或者是多个微片、颗粒、微粒或糖芯，其再进行肠溶包衣。再将这些肠溶包衣的微片、颗粒、微粒或糖芯置于胶囊中或与其它活性组分颗粒一起压制为胶囊。
这些以及其它将联合给药的化合物之间接触降低至最小的方式，不论以单一剂型给药或通过相同的途径以分离的形式同时或并行给药，基于本说明书，对本领域技术人员来说是显而易见的。
联合治疗本发明的各治疗化合物可以独立地在任何如上所述的剂型中，并还可以以如上所述的各种方式给药。例如，这些化合物可以以联合产品的形式一起配制为单一剂量单位(即结合在一起为胶囊、片剂、散剂或液体等)。或者，当不一起配制为单一剂量单位时，单一GPIIb/IIIa拮抗剂可以在使用阿斯匹林、低分子量肝素或TPA的同时，或者按照任何顺序依次给药。当不同时给药时，优选这些化合物分开给药的时间间隔小于约1小时。
优选本文中的治疗联合形式的给药途径是通过皮下注射。虽然一般优选化合物通过相同的途径给药，但是不必为此而勉强。例如，当GPIIb/IIIa拮抗剂和阿斯匹林以治疗联合形式给药时，可以优选该拮抗剂静脉内给药而阿斯匹林口服给药。
正如本领域医师所知，本发明的联合治疗的剂量可以根据不同因素变化，如特定试剂的药代动力学特性及其给药方式和途径，接受治疗者的年龄、健康状况和体重，症状的性质和程度，同时治疗的种类，治疗的频率及所需的作用，如上所述。
GPIIb/IIIa拮抗剂和阿斯匹林联合形式、GPIIb/IIIa拮抗剂和低分子量肝素的联合形式或TPA化合物B的联合形式的适当剂量，由本领域熟练的医师根据本发明公开的内容可容易地确定。作为一般原则，典型的每日剂量可以是每种组分约0.01mg至约1g。作为一般原则，当这些化合物联合给药时，就联合形式的协同作用而言，为了治疗血栓形成，相对于该组分以单一制剂的形式单独给药时的常用剂量来说，各组分的剂量可以降低约70-80％。
显然，根据上述教导，本发明的多种改进和变化是可能的。因此，可以理解在后面的权利要求书的范围内，本发明可以以不同于本文中特别描述的方式实施。
实施例通过下列实施例可以进一步理解本发明。在下列旨在举例而非限制性的描述和实施方案中，本发明的其它特征对本领域技术人员来说会变得显而易见。在所有的实施例中，生理盐水(0.9％(重量)氯化钠)是载体。
实施例1阿斯匹林和GPIIb/IIIa拮抗剂的联合形式用氯胺酮(50mg/kg，肌肉内)和赛拉嗪(10mg/kg，肌肉内)麻醉兔子，然后手术进行动脉和静脉插管。将电磁流探针置于剥离的颈动脉的片段上，以监测血流。用外部不锈钢双极电极以4mA电流对颈动脉进行3分钟电刺激，诱发血栓形成。在90分钟内连续检测颈动脉血流以监测血栓闭塞。在对颈动脉进行电刺激前1小时静脉内输注被测试剂，并连续输液90分钟。
如附图3所示，电刺激后，诱发了血栓形成，而在生理盐水载体处理的动物中颈动脉血流逐渐减小。在刺激约40分钟后，此动脉完全闭塞而血流为零。以0.1mg/kg/小时静脉内施用的阿斯匹林(在生理盐水中的浓度是0.167mg/ml)或以0.03mg/kg/小时静脉内施用的化合物(A)(GPIIb/IIIa拮抗剂)(在生理盐水中浓度为0.005mg/ml)不能防止此动脉的闭塞；并且在大约与载体处理动物相同的时间，这些动物的血流降低为0。令人惊奇的是，以0.03mg/kg/小时静脉内施用化合物(A)与以1mg/kg/小时静脉内施用阿斯匹林联合，防止了该动脉的闭塞并将血流维持在对照水平的60-70％，时间超过90分钟。这些结果表明化合物(A)和阿斯匹林以其亚治疗剂量的联合形式在动脉血栓形成的兔模型中意外地产生了显著的抗血栓形成作用。
实施例2达肝素(片段化蛋白)和GPIIb/IIIa拮抗剂的联合形式在此研究中使用与实施例1所述相同的实验方案。如附图4所示，在电刺激后，诱发了血栓形成，而在生理盐水载体处理的动物中颈动脉血流逐渐降低。在刺激后约40分钟，此动脉完全闭塞而血流是零。以60U/kg/小时静脉内施用达肝素(在生理盐水中的浓度为10U/ml)对增加血流不是非常有效。以0.03mg/kg/小时静脉内施用化合物(A)(在生理盐水中的浓度为0.005mg/ml)无效并且在这些动物中在大约与生理盐水载体处理动物相同的时间内血流降低为0。令人惊奇的是，以0.03mg/kg/小时静脉内使用的化合物(A)与以60U/kg/小时静脉内施用达肝素(片段化蛋白)联合，防止了该动脉的闭塞并将血流维持在对照水平的60-70％，时间超过90分钟。这些结果表明化合物(A)和达肝素(片段化蛋白)以其亚治疗剂量的联合形式在动脉血栓形成的兔模型中意外地产生了显著的抗血栓形成作用。
实施例3
组织纤溶酶原激活物和GPIIb/IIIa拮抗剂的联合形式在用氯胺酮(110mg/kg肌肉内)和赛拉嗪(10mg/kg肌肉内)麻醉的大鼠中进行实验。方案类似于上述实施例1所述的兔方案，不同的是式(B)化合物的游离酸
或者西拉非班的游离酸和/或TPA在血块形成后5分钟给药。检测的参数为再灌注时间、开放时间和再闭塞的几率。所用TPA、西拉非班和化合物的剂量分别为1、0.3和0.3mg/kg静脉内给药。在此研究中使用的西拉非班和化合物B的剂量在预防此大鼠模型中的血栓形成方面是等效的。
如下表1所示，化合物B和TPA的联合形式比西拉非班和TPA的联合形式产生了意外好的溶栓作用。此结果表明化合物B是一种有前途的可利用的辅剂，其加速TPA或其它溶栓试剂诱发的血栓溶解。此外，此结果还表明，较西拉非班而言，化合物B对亚治疗剂量的TPA诱发的溶栓作用产生了更好的提高。
*p＜0.05，与TPA比较**p＜0.05，与西拉非班+TPA相比表1实施例4计算机化的凝血弹性描记法(附图5)
在37℃，在振荡的塑料圆柱体比色杯(“杯”)和同轴向悬浮的静止活塞(“栓”)中监控血块形成，其表面之间具有1mm的清除率，监控使用计算机化凝血弹性描记法(CTEG Model 3000，Haemoscope，Skokie，IL)。每4.5秒将此杯在两个方向振荡4°45′(1/12弧度)，其具有1秒的中间循环静止期；结果是频率为0.1Hz和最大剪切率为0.1每秒。由作为扭力传感器的扭转线悬浮该栓。血块形成时，纤维蛋白小纤维机械连接此杯和栓，而此杯的旋转(传送给此活栓)用IBM-兼容个人电脑和规定的软件(Haemoscope Corp.，Skokie，IL)联机显示。作为时间的函数绘制活栓的扭力(相对于杯的振荡)曲线。TEG描记法上的振幅是此血块硬度的尺度；血块达到的峰强度或剪切弹性模块G是血块硬度的函数，并可以由TEG描记法的最大振幅(MA)计算。
由TEG描记法(附图5)检测下列参数·R，反应时间(胶凝时间)表示三维纤维蛋白凝胶网(振幅＝2mm的可检测硬度)建立前的潜伏期。
·最大振幅(MA，单位mm)是该血块表现出的峰硬度。
·剪切弹性模块或血块强度(G，达因/平方厘米)定义如下对于计算机化的TEG，G＝(5000*MA)/(96-MA)。采血按照经William Beaumont医院的人类调查委员会批准的方案，从同意的自愿者中采血。用两种-注射器方法，通过21号蝶形针采血并弃去开始的3ml血。将全血(WB)收集到硅化处理的Vacutainer管(Becton Dickinson，Rutherford，NJ)中，其中含3.8％枸橼酸三钠，维持枸橼酸盐与全血的比例为1∶9(v/v)。在采血的3小时内进行TEG。
实施例5血小板对凝块强度的贡献为了评价TF改变对峰值的作用，在加入或不加入TF的WB和PRP的成对样品中检测血块强度(G)。为了报告活化的血小板对纤维蛋白血块的弹性模块的贡献，通过用PPP系列稀释PRP来检测血小板数量的影响。在进行TEG前检测每个稀释度的血小板计数。以渐增的浓度(0、0.625、1.25、2.5、5和10μM)进行组织因子激发的TEG，其中DMSO加入到TEG杯中，以便在每个TEG样本中最终DMSO的浓度为0.3％(v/v)。GPIIb/IIIa对血块强度的阻断作用通过将渐增浓度的c7E3 Fab(Abciximab，Centocor，Malvern，PA)、环肽、拟肽和非肽GPIIb/IIIa拮抗剂(DuPont，Wilmington，DE)和不同的LMWH加入到TEG杯中，同时加入的有二氯化钙和TF。通过从低血小板血浆(PPP)样本MA(PPP)中减去MA来计算血栓弹性描记法最大振幅(MA)的血小板MA(PLT)，MA(PPP)在一个凝血弹性描记法孔中确定，在第二个凝血弹性描记法孔中同时进行全血MA(WB)测定。
实施例6血小板凝集激动剂诱发的血小板凝集以PRP(血小板计数2×105/μL)的透光性的变化百分率检测。为了研究LMWH & GPIIb/IIIa拮抗剂对血小板凝集的作用，在加入0.5IU/ml凝血酶5分钟后，向PRP中加入渐增的浓度。凝集反应检测为凝血酶诱发的透光性增加的最大反应，用PPP确立100％透光性。
实施例7在人全血中用凝血弹性描记法检测不同的LMWHs在抑制不同的刺激物诱发的血块形成中的对比效果血块凝缩的介体平均值(IC50[μg/mL])±SEM
数据表示平均值+SEM n＝3.4；--＝无活性；ND＝无数据*p＜0.01，与依诺肝素或夫拉肝素(fraxiparin)比较表2在人全血中用凝血弹性描记法检测不同的LMWHs在抑制不同的刺激物诱发的血块形成中的对比效果GPIIb/IIIa拮抗剂的协同作用
表3用凝血弹性描记法检测LMWH和GPIIb/IIIa拮抗剂罗西非班对凝血酶引起的人血血块凝缩的协同作用
表权利要求
1.治疗选自如下病症的方法急性冠状缺血综合征、血栓症、血栓栓塞、血栓闭塞和再闭塞、再狭窄、短暂局部缺血发作和首次或复发的栓塞性中风，该方法包括给需要此治疗的哺乳动物施用亚治疗剂量的低分子量肝素和亚治疗剂量的血小板GPIIb/IIIa拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中血小板GPIIb/IIIa拮抗剂是罗西非班。
3.权利要求1的方法，其中低分子量肝素是亭扎肝素。
4.权利要求1的方法，其中给药是皮下给药。
5.药物组合物，其中含有血小板GPIIb/IIIa拮抗剂和低分子量肝素以及药用载体。
6.权利要求5的药物组合物，其中血小板GPIIb/IIIa拮抗剂是罗西非班。
7.权利要求5的药物组合物，其中低分子量肝素是亭扎肝素。
8.试剂盒，其中包括皮下注射用血小板GPIIb/IIIa拮抗剂和低分子量肝素。
9.治疗哺乳动物血栓症的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用(i)亚治疗剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂和(ii)阿斯匹林的联合形式或者亚治疗剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂(i)和(iii)低分子量肝素的联合形式，所述(i)GPIIb/IIIa拮抗剂选自阿昔单抗、依非巴替、替罗非班、阿米非班、乐达非班、西拉非班、奥泊非班、塞罗非班、式(A)化合物 和式(B)化合物 所述(iii)低分子量肝素选自亭扎肝素、舍托肝素、帕肝素、那屈肝素、阿地肝素、依诺肝素、瑞肝素、瑞肝素和达肝素。
10.权利要求9的方法，其中(i)和(ii)或(iii)的联合形式提供协同作用。
11.权利要求9的方法，其中给药的联合形式是GPIIb/IIIa拮抗剂和低分子量肝素的联合形式。
12.权利要求11的方法，其中GPIIb/IIIa拮抗剂以亚治疗剂量使用。
13.权利要求11的方法，其中GPIIb/IIIa拮抗剂是化合物A或化合物B。
14.权利要求11的方法，其中低分子量肝素是达肝素(片段化蛋白)。
15.权利要求11的方法，其中GPIIb/IIIa拮抗剂是化合物A或化合物B，而低分子量肝素是达肝素(片段化蛋白)。
16.如下联合方式制备治疗血栓形成的药物的用途(i)亚治疗剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂和(ii)阿斯匹林的联合形式或者亚治疗剂量的GPIIb/IIIa拮抗剂(i)和(iii)低分子量肝素的联合形式，所述(i)GPIIb/IIIa拮抗剂选自阿昔单抗、依非巴替、替罗非班、拉米非班、乐达非班、西拉非班、奥泊非班、塞罗非班、式(A)化合物 和式(B)化合物 所述(iii)低分子量肝素选自亭扎肝素、舍托肝素、帕肝素、那屈肝素、阿地肝素、依诺肝素、瑞肝素和达肝素。
17.治疗哺乳动物血栓形成的方法，包括给所述哺乳动物施用(i)组织纤溶酶原激活物和(ii)下式的化合物
全文摘要
本发明涉及用于治疗、预防和缓解血栓栓塞疾病危险的组合治疗方法,该方法包括施用低分子量肝素(如亭扎肝素)和血小板GPIIb/IIIa拮抗剂(如罗西非班)。
文档编号A61K31/616GK1378472SQ00807319
公开日2002年11月6日 申请日期2000年3月10日 优先权日1999年3月11日
发明者P·C·王, S·A·穆萨 申请人:杜邦药品公司