专利名称：用于调节消化道活动性和食物摄取的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及肥胖症治疗和调节食物摄取的领域。具体而言，本发明涉及调节食物摄取的组合物和方法，其中，给予单端孢霉烯及其衍生物和类似物或者嘌呤能(purinergic)化合物，以改变消化道活动性并从而产生饱腹感。本发明还涉及筛检能用于调节食物摄取的单端孢霉烯的衍生物或类似物以及嘌呤能受体的激动剂和拮抗剂的方法。
背景技术：
过度饱食导致肥胖，这是个主要的健康问题。肥胖除了增加躯体所受的身体和机械限制外，还增加患糖尿病、心脏病、癌症和其他慢性疾病的风险。虽然科学上已证明肥胖对健康产生不利的影响，并且公众已广泛认识到这一点，但是还是难以在数以百万计的人群中有效控制个体的食欲和过度饱食。在北美，大约25％的儿童体重超重或肥胖。仅北美洲人在减少体重的治疗中每年就花费400亿美元，而且这个数字还在增加。最近的一个调查保守地估计加拿大每年花费18亿美元治疗肥胖症，占所有疾病的总健康护理支出的2.4％(参见“Cost of Obesity1.8$billion”，Pharmaceutical Manufacturers Association of Canada，1999年3月，第11页)。
目前可得到的抗肥胖症药物，大部分都是以中枢神经系统(CNS)途径为目标，以诱导食欲抑制。但是，这些药物产生许多CNS相关的副作用，如焦虑，而且还可能产生慢性健康问题，如高血压、心血管疾病和糖尿病。目前治疗肥胖症的另一种方法是通过食用代替正常食物的“膨胀性”食品控制食欲。但这些膨胀性食品中的所需营养没达到必需的范围，因此食用它们产生了营养状况改变的问题。而且，食用这些膨胀性食品的个体可能拒绝食用任何食物，即使是所需的营养。
服用抑制食欲的药物属于治疗肥胖症最不理想的方法，因为一旦停止服用这些药物，体重通常又重新增加。此外，患严重的不良的副作用包括如原发性肺动脉高血压的风险也限制了这些药物的应用。例如，食欲抑制剂氟苯丙胺和右旋氟苯丙胺最近被它们的制造者撤出了市场，因为它们可能对肺和心脏产生严重的不利影响。
近来出现的治疗肥胖症的其他方法是使用干扰从小肠吸收脂肪的药物。这些药物可抑制消化脂肪的胰酶。不被消化的脂肪通过肠被排泄。减少脂肪的吸收可产生油性粪便、内衣上的油污、肠气、频繁的肠蠕动以及可溶于脂肪的营养素如维生素A、D和E的吸收减少。
目前还没有既能减少体重又不产生不健康的副作用或不增加患病风险的医学方法。仍需要有效的治疗肥胖症的方法以及控制人和其他动物体重增重而不产生不适当的营养的或医学的副作用的方法。
发明概述本发明提供治疗人和其他动物肥胖症和控制其食物摄取的方法。本发明是以对霉菌毒素单端孢霉烯如何在人和其他脊椎动物中产生食物拒绝的发现为基础，以及以对推动食物通过消化道器官的消化道活动性(“消化道运动行为”)的神经回路调节模型的解释为基础。本文所述的治疗方法涉及给予影响消化道活动性模式(即消化道器官的平滑肌组织的收缩、舒张和静止模式)的化合物。刺激消化道活动性的“进食模式”，产生饱腹感，即吃饱的感觉，这缩短了个体饮食或进食的时间。因此，刺激消化道活动性的进食模式的化合物可用在限制食物摄取以及治疗肥胖症的方法中。刺激“禁食模式”或延长或阻止发生消化道活动性的进食模式的化合物倾向于增加进食的时间，因为身体没有产生饱腹感。这些化合物特别有用于增加动物体重的方法中，如用于作为商业肉源的家畜和家禽。
本发明提供的治疗肥胖症的方法包括给予有效量的刺激消化道活动性的进食模式的单端孢霉烯霉菌毒素或其衍生物。在本发明的一个较佳实施例中，治疗肥胖症的方法包括给予个体单端孢霉烯，此单端孢霉烯选自瓜萎镰毒素、4-脱氧瓜萎镰毒素(“DON”，C15H20O6)、曲古希克龙(trichothecolon)、单端孢菌素、3-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素(“3-乙酸基DON”，C17H22O7)、7-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、3，15-二乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、4-乙酰基瓜萎镰毒素(镰刀菌酮-X)、4，15-二乙酰基瓜萎镰毒素与瓜萎镰毒素结构相关化合物。其他基于DON的衍生物还可用在本发明的较佳方法中，包括DON碳酸酯(即3-羟基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯，C16H18O7)、3-乙酰基-DON碳酸酯(即3-乙酰氧基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯C18H20O8)、3-乙酰基DON亚苄基缩醛(即3-乙酰氧基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C24H26O8)、DON-亚苄基缩醛(即3-羟基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C22H24O7)、异亚丙基DON(即3-羟基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C18H24O6)和异亚丙基-3-乙酰基-DON(即3-乙酰氧基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C20H26O7)。更佳的是，本治疗肥胖症的方法包括给予个体一剂无毒性且不引起呕吐、但刺激该个体消化道活动性的进食模式的单端孢霉烯，如DON或DON基的衍生物。可通过各种途径给予单端孢霉烯或其衍生物，包括经口或肠道外给药。
或者，治疗肥胖症的方法包括给予单端孢霉烯类似物，该类似物像单端孢霉烯一样刺激消化道活动性的进食模式。单端孢霉烯类似物与单端孢霉烯在结构上可能是相关的或者不同的。因此，单端孢霉烯类似物可从单端孢霉烯如DON衍生得到，或者可以是各种化合物，包括无机化合物、有机化合物、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸、糖类、脂质以及它们的组合，这些物质都能刺激消化道活动性的进食模式。
在另一实施例中，本发明提供用于调节个体的消化道活动性和治疗其肥胖症的组合物和方法。本发明的这些方法包括给予个体一种结合并刺激P2X1嘌呤受体的化合物，该受体出现在肠组织的平滑肌上，并直接参与消化道活动性的进食模式的调节。具体而言，P2X1嘌呤受体的激动剂是嘌呤能化合物，它与该受体结合并刺激消化道活动性的进食模式。至于单端孢霉烯，它以嘌呤能化合物刺激消化道活动性的进食模式，产生饱腹感，从而缩短进食时间，减少食物摄取。较佳的是，本发明用于治疗肥胖症的P2X1受体的激动剂是嘌呤受体的“非脱敏”激动剂，即激动剂的分子能与P2X1受体结合，刺激P2X1介导的消化道活动性的进食模式，但最终并没有封阻或灭活该受体。在更好的一个实施例中，P2X1受体的非脱敏激动剂是用在刺激消化道活动性的进食模式中以及用于治疗肥胖症的ATP或2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯基)-ATP(“TNP-ATP”)的结构类似物。
在另一实施例中，本发明提供增加个体体重的组合物和方法。这些方法包括给予个体P2X1受体的脱敏激动剂或拮抗剂，如TNP-ATP。用于本发明这些方法中的脱敏激动剂或拮抗剂化合物与P2X1受体结合并将其封阻，从而抑制或阻止消化道活动性的进食模式和/或延长消化道活动性的禁食模式，后者反过来增加进食时间和食物摄取。这些方法特别适用于饲养商业家畜和家禽。
在本发明的又一实施例中，提供了鉴定刺激或抑制(阻止)消化道活动性的进食模式的化合物的方法，该方法通过直接记录给药期间以及化合物在受试者体内代谢期间该受试者体内的消化道活动性的模式而实现。这些方法可用于检测化合物的调节活性，如已知的或新的单端孢霉烯化合物、单端孢霉烯衍生物化合物、单端孢霉烯类似物化合物、P2X1受体的激动剂或P2X1受体的拮抗剂。可使用体外肠浴(bath)实验、离体肠器官实验或体内实验测定化合物调节(刺激或抑制)消化道活动性模式的能力。根据本发明，通过这些筛检方法被确认为能刺激消化道活动性的进食模式的单端孢霉烯和嘌呤能化合物及其衍生物或类似物可用于治疗肥胖症，而抑制消化道活动性的进食模式的化合物可用于增加食物摄取，以及促进商业家畜和家禽的体重增重。
附图的简短说明
图1是Krantis等人〔Can.j.Physiol.Pharmacol.，74894-903(1996)〕设立的用于记录麻醉的实验动物如大鼠(1)的胃肠活动性的体内装置示意图。在大鼠肠的放大详图(A)中，箔压力传感器(2)沿着肌肉层纵向粘附(例如，用胶水)在所选择的肠器官位点上，例如胃窦的绒膜表面(3)、十二指肠近端(4)或回肠远端(5)。导线连接在IBM计算机的数据采集系统(6)上。
图2是十二指肠和回肠中消化道活动性的神经途径控制的进食和禁食模式示意图。胆碱能(ACh)、一氧化氮能(NO)和嘌呤能(ATP)神经元用不同的受体靶标和/或输入表示mus.(胆碱能蕈毒碱的)、5-HT3(五羟色胺能的)、nic.(胆碱能烟碱的)、P2X(嘌呤能的)。“+”号表示神经元之间的刺激性输入和肠平滑肌的刺激和收缩；“-”号表示抑制性输入。DON是脱氧瓜萎镰毒素，是肠机能亢进(进食模式)和饱腹感的刺激物。NO为一氧化氮，它在十二指肠近端是非肾上腺能的、非胆碱能的(NANC)抑制性递质，它还是十二指肠和回肠中传播性的P2X-嘌呤能和胆碱能(蕈毒碱，mus.)活动性的抑制性递质。一氧化氮能中间神经元(NO)与胆碱能烟碱输入(nic.)(右侧)之间的环路在回肠中不存在。ATP是三磷酸腺苷，嘌呤能受体(如P2X受体)的脱敏激动剂。ACh是乙酰胆碱，结合在蕈毒碱(mus.)受体上以激活运动神经元的胆碱能化学信号。5-HT是5-羟基色胺(五羟色胺)，结合于神经元上的5-HT3(五羟色胺能的)受体，是肠平滑肌的肠中间神经元介导的神经源性的NANC松弛和胆碱能性收缩的刺激的主要递质。nic.是神经元的胆碱能烟碱受体。
图3A和3B是4-脱氧瓜萎镰毒素(DON)及其相关衍生物化合物的化学结构图。图3A是DON(C15H20O6)、3-乙酰基-DON(C17H22O7)、异亚丙基DON(C18H24O6，商品号EN 139491)和异亚丙基-3-乙酰基-DON(C20H26O7，商品号EN 139492)的化学结构图。图3B是DON碳酸酯(C16H18O7，商品号EN 139494)、3-乙酰基-DON碳酸酯(C18H20O8，商品号EN 139495)、3-乙酰基-DON亚苄基缩醛(C24H26O8，商品号EN 139496)和DON-亚苄基缩醛(C22H24O7，商品号EN139497)的化学结构图。“Ph”表示苯基，“OAc”表示乙酰基。
图4记录了具有收缩和松弛反应振荡表现的对照大鼠的胃窦的自发活动性。纵向标记表示开始记录后的第0和第50分钟。以10mg/kg体重的量静脉(i.v.)给予DON(第一个箭头所指为t＝0分钟)，这使得胃窦的活动性突然下降。在40分钟内，对照动物的运动模式恢复，但是，第一次给药后很快再给予DON(第二个箭头)并没有产生影响。
图5记录了大鼠十二指肠对照行为的体内活动性模式。十二指肠对照行为的自发的体内活动性模式(没有DON)由周期性的“组合(grouped)”(G)和“组间(intergroup)”(I)行为组成。纵向的标记表示开始记录后的第0、30、120和150分钟。t＝30分钟后的第一个箭头表示以10mg/kg体重全身给予(i.v.)DON(箭头处)，这诱导了持续的机能亢奋(46±15分钟)。接着活动性恢复到对照水平，再给予DON(t＝150分钟之后的箭头)没产生影响。
图6A-6D显示在大鼠十二指肠(图6A的频率和6B的幅度)和回肠(图6C的频率和6D的幅度)中L-NAME和α，β-亚甲基ATP对DON诱导的松弛的频率(Freq)和幅度(Amp)的影响的定量分析数据。L-NAME和DON存在时的组合活动性(宽的对角线柱)与仅有DON的行为(密的对角线柱)相当。在十二指肠(n＝8)和回肠(n＝4)中，α，β-亚甲基ATP显著地将DON诱导的松弛(填充柱)的频率和幅度减少到对照组间行为(没有DON，空白柱)的水平。
图7A-7D显示在大鼠十二指肠中5-HT3受体拮抗剂——谷尼色创(granisrtron)对自发的和DON诱导的行为的影响的定量分析结果。谷尼色创(i.v.或i.a.，第3个柱)选择性地降低了“组合”松弛(n＝6，图7A为频率，7B为幅度)和“组合”收缩(n＝3，图7C为频率，7D为幅度)的频率(Freq)和幅度(Amp)，但是，它没有改变立体DON诱导的机能亢奋〔比较密的对角线柱(仅有DON)与填充柱(DON+谷尼色创)〕。对照“组合”行为(空白柱)。
图8是α，β-亚甲基ATP对小猪十二指肠的收缩和松弛的DON增强的活动性的影响(以对照的百分比表示)的柱形图。“对照”表示没有接受DON和α，β-亚甲基ATP的一组小猪。“DON”表示仅接受DON(1mg/kg)的一组小猪。“α，β-亚甲基ATP+DON”表示一组在十二指肠中产生DON(1mg/kg)增强的活动性期间动脉内注射α，β-亚甲基ATP(300μg/kg，i.a.)的小猪。将对照组的值设为100％。其他所有的值均是对照值的百分数。空白柱表示松弛的平均幅度(4只小猪)。填充柱表示松弛的平均频率(5只小猪)。敞开的交叉线柱表示收缩的平均幅度(3只小猪)。横线柱表示收缩的平均频率(2只小猪)。“ψ”表示与对照相比p＜0.05。“φ”表示与DON增强的行为相比p＜0.05。
图9是α，β-亚甲基ATP对小猪回肠的DON增强的活动性(收缩和松弛)的影响(以对照的百分数表示)的柱形图。“对照”表示没有接受DON和α，β-亚甲基ATP的一组小猪。“DON”表示仅接受DON(10mg/kg)的一组小猪。“α，β-亚甲基ATP+DON”表示一组在回肠中产生DON(10mg/kg)增强的活动性期间动脉内注射α，β-亚甲基ATP(300μg1kg，i.a.)的小猪。将对照组的值设为100％。其他所有的值是对照值的百分数。空白柱表示松弛的平均幅度(4只小猪)。填充柱表示松弛的平均频率(5只小猪)。敞开的交叉线柱表示收缩的平均幅度(3只小猪)。横线柱表示收缩的平均频率(2只小猪)。“ψ”表示与对照相比p＜0.05。“φ”表示与DON增强的行为相比p＜0.05。
图10排出了胆碱能、一氧化氮能、GABA能、嘌呤能和VIP能神经元在被提议的紧张的和调节性的途径中控制大鼠十二指肠和回肠中自发的活动性的示意图。GABA能和一氧化氮(NO)能中间神经元与胆碱能烟碱输入(nic.)(右端远侧)的环路在回肠中不存在。VIP是作用于血管的肠肽，它是运动神经分配的一氧化氮能预接合抑制作用的激活子。
图11记录了大鼠胃窦(位点S1)和十二指肠近端(位点D1)的对照的白发活动性。给予DON〔10mg/kg体重(“bw”)，静脉给药〕突然降低了窦的活动性，并诱导十二指肠(D1)持续的机能亢奋。在60分钟内，对照运动模式恢复。
图12显示在体内3-乙酰基DON对大鼠胃肠活动性的影响。给予3-乙酰基DON之前显示的是十二指肠(在十二指肠的D2位点记录)和胃窦(S1)中的消化道活动性的典型的禁食模式。注射3-乙酰基DON(10mg/kg，i.v.)后(垂直箭头)，活动性变成典型的进食模式活动性，并持续了大约40分钟。“MMC”是消化道活动性的禁食模式的“组合”行为部分。
图13显示以10mg/kg体重静脉给予3-乙酰基DON对大鼠胃窦(S1)和十二指肠(D2)中的自发的活动性的影响。在60分钟内，对照运动模式恢复(见130分钟后的记录)。“MMC”是消化道活动性的禁食模式的“组合”行为部分。
图14显示典型的大鼠十二指肠(D1)和胃窦(S1)中的活动性的体内记录，阐述了化合物EN 139491(10mg/kg体重，i.v.)对“禁食”活动性的作用。上面部分显示给予化合物前20分钟正常的禁食活动性。在此过程中的记录显示十二指肠具有典型的低频率自发活动性模式以及扩散的“组合”活动性(“MMC”)，胃窦具有典型的规律性活动性。记录的第二部分显示注射EN 139491的时间和在注射后30秒内发展的十二指肠中持续长时间(40-60分钟)的机能亢奋以及胃窦中活动性的同时和平行的下降，这些都是进食模式活动性特征。禁食模式活动性的恢复显示在底部图形中，以“组合”MMC行为和较不活跃的“组间”行为时期为证。
图15显示化合物EN 139491对在D2位点(离D1压力传感器1.5cm)记录的十二指消化道活动性的影响。缩写词与前面的图中的一样。
图16是在记录经氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指肠(D1)和胃窦上自发的体内禁食模式活动性期间，给予EN 139492 DON衍生物化合物(10mg/kb，i.v)对松弛的幅度的影响的柱形图。松弛的幅度以对照“组间”行为的百分数表示。图中显示了给予EN 139491前“组合”活动性的活动性的松弛行为的幅度(对角线柱)、给予EN 139491前对照的“组间”活动性的幅度(空白柱，设为100％)和静脉给予EN 139491后的激活亢奋的幅度。各柱形图是得自5-8只Sprague Dawley大鼠的体内记录的平均值±标准偏差。
图17显示如图16所述的柱形图，除了给出的是给予EN 139491对消化道活动性的松弛行为的消化道活动性的频率的影响。
图18显示如图16所述的柱形图，除了给出的是给予EN 139491对消化道活动性的收缩行为的消化道活动性的幅度的影响。
图19显示如图16所述的柱形图，除了给出的是给予EN 139491对消化道活动性的收缩行为的消化道活动性的频率的影响。
图20显示在大鼠十二指肠(十二指肠记录位点D1和D2)和胃窦(窦记录位点S1)中的活动性典型的体内记录，阐述了DON衍生物化合物EN 139492(10mg/kg，i.v.)对消化道活动性的“禁食”模式的作用。给予EN 139492前是明显的典型的禁食运动行为。在此禁食模式期间，十二指肠(D1和D2)具有典型的低频率幅度运动行为的模式与扩散的“组合”运动行为(MMC)，胃窦具有典型的规律性运动行为。在注射给予EN 139492(垂直箭头)的30秒内，在十二指肠中发展了持续长时间(40-60分钟)的机能亢奋，在胃窦中运动行为同时下降，它们都表现为消化道活动性的进食特征，虽然对窦的行为的影响不像对十二指肠那样持久。
图21显示典型的静脉注射经氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠以P2X1嘌呤能受体拮抗剂TNP-ATP(3.5mg/kg)对该大鼠十二指肠内(位点D1)的自发的行为的影响的体内记录。该记录显示，TNP-ATP在注射后(垂直箭头)并没有立即引起任何反应，但是，在注射后1分钟内，扩散的行为(MMC)减少了。“组间”行为并没有显著的改变。20分钟内行为恢复到对照水平的90％。
图22显示典型的静脉注射TNP-ATP(3.5mg/kg)对大鼠十二指肠内(位点D1)的DON诱导的(10mg/kg体重，i.v.，DON上垂直的箭头)进食模式行为的影响的体内记录。注射TNP-ATP(TNP-ATP上的垂直箭头)后1分钟TNP-ATP对DON诱导的进食模式产生抑制性影响。
图23显示静脉给予TNP-ATP(3.5mg/kg)对大鼠胃窦(S1)和十二指肠(D2)中的DON诱导的进食模式诱导活性的影响。在60分钟内，恢复到对照运动模式。记录中的框中部分显示TNP-ATP对各位点的初始作用。
图24是体内记录经氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指肠(D1位点)的消化道行为的松弛行为的幅度柱形图。图中给出了在没有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情况下DON(10mg/kb，i.v)诱导的肠机能亢奋的松弛行为的幅度。图中还给出了“组合”MMC(对角线柱)和对照“组间”活性(填充柱)的松弛行为的幅度。松弛行为的幅度以设为100％的对照“组间”松弛幅度的百分数表示。星号表示与对照“组间”诱导活性相比具有显著差异(p＜0.05)。各柱形图是得自5-8只Sprague Dawley大鼠的体内记录的平均值±标准偏差。各动物以自身为对照。D1表示得自放置在离幽门括约肌10mm远的位置上的压力传感器的记录。
图25是体内记录经氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指肠(D1位点)的消化道行为的松弛行为的频率柱形图。图中给出了在没有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情况下DON(10mg/kb，i.v.)诱导的肠机能亢奋的松弛行为的频率。图中还给出了“组合”MMC(对角线柱)和对照“组间”活性(填充柱)的松弛行为的频率。松弛行为的频率以设为100％的对照“组间”松弛频率的百分数表示。星号、统计和实验的记录条件与图24相同。
图26是体内记录经氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指肠(D1位点)的消化道行为的收缩行为的幅度柱形图。图中给出了在没有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情况下DON(10mg/kb，i.v.)诱导的肠机能亢奋的收缩行为的幅度。图中还给出了“组合”MMC(对角线柱)和对照“组间”活性(填充柱)的收缩行为的幅度。收缩行为的幅度以设为100％的对照“组间”收缩幅度的百分数表示。星号、统计和实验的记录条件与图24相同。
图27是体内记录经氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指肠(D1位点)的消化道行为的收缩行为的频率柱形图。图中给出了在没有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情况下DON(10mg/kb，i.v)诱导的肠机能亢奋的收缩行为的频率。图中还给出了“组合”MMC(对角线柱)和对照“组间”活性(填充柱)的收缩行为的频率。收缩行为的频率以设为100％的对照“组间”收缩频率的百分数表示。星号、统计和实验的记录条件与图24相同。
发明的详细描述本发明提供通过调节人和其他脊椎动物肠器官的行为治疗肥胖症和调节食物摄取的组合物和方法。这些方法是以单端孢霉烯类化合物(如4-脱氧瓜萎镰毒素，DON)刺激通常在摄取食物时出现的肠器官的收缩和松弛的发现为基础。刺激此消化道活动性的“进食模式”，产生饱腹感，即吃饱的感觉，这是个影响个体进食时间的重要因素。单端孢霉烯(如DON)在肠器官的外部位点起作用，并将信号沿着神经途径传至肠器官的平滑肌。我们已发现小肠平滑肌的细胞中存在一种特异性受体——嘌呤能受体P2X1，该受体涉及消化道行为的特异性调节。因此，作为P2X1受体的激动剂或拮抗剂的化合物也可用于调节消化道活动性，并控制饱腹感和进食时间。
为了准确地描述本发明，定义了下述术语本文所用术语“消化道”指由胃、小肠和大肠组成的胃肠道。
本文术语“消化道活动性”或“消化道行为”指人和其他动物的胃肠器官(胃、小肠和大肠)中的平滑肌的运动行为，包括肌肉的周期交替收缩和松弛期以及静止期和相对小的活动期。例如，在正常健康的人和其他动物中，当摄取食物以促进食物进入肠中以使营养被提取和吸收(见下面的消化道的“进食模式“)时，小肠肌肉的收缩和松弛的频率和幅度变高。其他的消化道活动性模式可依赖于消化道器官的不同部分中食物的存在与否而发生。而且，在具体的消化道器官的近端的运动行为可能与其远端的行为不同，如在十二指肠(小肠的起始端)和回肠(小肠的末端)。
本文所用“进食模式”、“进食模式行为”和“分段”意思相同，都指动物(包括人)在摄取食物时正常产生的消化道的小肠的收缩和松弛的持续模式。消化道的进食模式促进所摄取的食物通过消化道，使营养被提取和吸收，未吸收的物质作为废物最后被排出。消化道的进食模式一般在摄取食物后数分钟内开始，并会产生饱腹感即吃饱的感觉。因此，消化道的进食模式的饱腹感通常告诉个体可以结束进食。个体早在大脑具有分析血液中营养含量(在食物被消化数小时后发生的一个分离的过程，这个过程将产生渴望获得维持健康的特殊水平所需的特异营养如蛋白质、糖类、盐类和脂肪的信号)的机会之前就有饱腹感。
对于各器官，进食模式各有特征且不相同，即使在消化道的同一器官，在不同的位点也不相同。在小肠中，进食模式的特征是平滑肌的一系列收缩和松弛，这些行为将肠的内容物混合，促进食物对口地进到肠中，并延迟食物的顺行推进以增加底物的吸收〔Lundgren等人，Dig.Dis.Sci.，34，264-283(1989)〕。当采用Krantis等人〔Can.J.Physiol.Pharmacol.，74894-903(1996)〕的方法进行体内的测量和记录时，十二指肠中的消化道行为的进食模式的特征是强烈的机能亢奋模式，而同时在胃窦中，进食模式的特征是可测量的抑制或所记录的组织行为的下降。此进食模式行为代替了消化道行为的“禁食”模式(见下面)，后者发生在食物已被推过消化道进行营养提取之后。进食模式活动性主要由自主神经末捎经由主要迷走神经输入激活，以及(但程度较小)由中枢神经系统(CNS)控制〔参见，Yoshida等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，256272-278(1991)；Tanaka等人，J.Surg.Res.，53588-595(1996)；Chung等人，Can.J.Physiol.Pharmacol.，701148-1153(1992)〕。自主神经的过度激活加速进食模式的开始以及增加了进食模式的持续时间，同时增加了消化道的扩散的行为的频率和幅度〔Hall等人，Am.J.Physiol.，250G501-510(1986)；Johnson等人，Am.J.Surg.，16780-88(1994)，以及下面的实施例〕。如上面所述，现在可使用适当量的单端孢霉烯霉菌毒素(如DON)以刺激消化道活动性的进食模式。
消化道运动行为的“禁食模式”或“禁食周期运动模式”指在没有摄取食物或在摄取食物前，当被摄取的食物没有被推进到胃和肠中时消化道的运动行为。在十二指肠(小肠的起始端)中，消化道运动行为的禁食模式的特征为自发的、无规则的收缩和松弛的交替周期(“组合”行为)和相对的静止周期(“组间”行为)。具有交替的组合和组间行为的十二指肠的禁食模式的例子显示在图5中的消化道活动性的早期记录部分(在t＝0到t＝30分钟之间)。在回肠(小肠末端)中，禁食模式的特征为随机的收缩和/或松弛运动行为或者通常处于静止状态。食物的摄取打断了消化道活动性的禁食模式并刺激其进食模式的持续行为。
直到最近仍没有准确测量和表征消化道活动性，在实验条件下仅能测量收缩或松弛中的一种行为的方法。但是，最近，Krantis及其合作者发展了一种同时测量胃肠道的各种器官的消化道活动性的收缩和松弛行为的方法，该方法使用能在体内粘附到消化道器官的不同位置上的小型可弯曲的箔压力传感器〔参见，Krantis等人，Can.J.Physiol.Pharmacol.，74894-903(1996)〕。在此方法中，粘附在器官上的传感器的导线与计算机数据分析系统相连(见图1)。Krantis等人的方法可使用体内、离体(器官放在体腔外)和体外(组织从消化道器官中分离出来)方法对消化道进行药理学、神经学和生理学的研究(见下面的实施例)。同时在消化道器官以及在同一器官的不同位点记录收缩和松弛的能力提供了更准确的消化道活动性特征，包括消化道活动性的不同模式，以及食物和各种化学化合物对这种模式的影响。
在禁食状态下，消化道具有周期性的运动行为，即周知的“MMC”、“迁移性运动复合(complex)”或“迁移性肌电复合”。MMC与肠内容物的消化间推进有关，它涉及连续的刺激性和抑制性神经元的次第激活，以扩散源于胃止于回肠的收缩和松弛周期。一个MMC周期由3个不同阶段组成阶段I是静止阶段；阶段II是行为无规律强化(spiking)阶段；阶段III是短期的行为快速强化爆发阶段。MMC提供一种基本的内在运动模式，这种模式以小肠的“主妇(housekeeper)”形式起作用。例如，各MMC周期高度推进的阶段III运动行为扫除了肠腔，清除肠中的残留物以防止细菌过度生长、倒流以及肠分泌物的积聚〔Caenepeel等人，Dig.Dis.Sci.，341180-1184(1989)〕。采用Krantis等人(1996)的方法，现已清楚肠活动性可包括平滑肌的收缩和松弛。没有食物时，肠的消化道活动性禁食模式的“组合”行为表现为与传统地归于MMC阶段III的运动行为的相同类型相符。肠腔中存在食物时，诱导了消化道运动行为由禁食模式转变为进食模式。
Krantis等人(1996)的方法还使人们能够揭示称为单端孢霉烯或单端孢霉烯霉菌毒素的化合物对消化道活动性的作用模式。如实施例1和2所示(下文)，单端孢霉烯4-脱氧瓜萎镰毒素(DON)在消化道的外部位点起作用，刺激消化道活动性的进食模式，它特征性地出现在摄取食物后，产生饱腹感(即吃饱的感觉)。这些发现提供了解释已充分记录的人和其他动物食用被产生DON或其他单端孢霉烯的霉菌种类污染的农作物后的厌食或拒绝进食行为的机制。本发明提供了一种治疗肥胖症的方法，该方法利用单端孢霉烯化合物能诱导消化道活动性的进食模式并产生饱腹感的能力。本文所述的治疗肥胖症的方法包括给予单端孢霉烯或起类似作用的化合物，该化合物刺激消化道活动性的进行模式，从而产生饱腹感。感觉到吃饱，个体就会产生停止进食的信号。当给予的化合物的循环水平下降时，饱腹感也将减少，该个体可能会继续进食。
本发明还提供调节食物摄取的方法，该方法通过给予介导消化道组织的组合松弛的P2X1嘌呤受体的激动剂或拮抗剂而实现。根据本发明，刺激消化道活动性的进食模式的单端孢霉烯(如DON)及其衍生物和类似物实际上在消化道外的位点起作用。信号从远离作用位点的位置沿着神经途径传到消化道中表达P2X1嘌呤受体的平滑肌细胞，该受体涉及到消化道活动性的进食模式的调节(见图2)。因此，结合并影响P2X1嘌呤受体的化合物在神经途径的末端起作用，而DON或其他这样的单端孢霉烯则在上游起作用。根据本发明，用于本文所述的方法中的一组化合物由三磷酸腺苷(ATP)类似物组成，该类似物起到P2X1嘌呤受体的激动剂或拮抗剂的作用。如下面所解释，某些类型的P2X1嘌呤受体激动剂与该受体结合，并刺激消化道活动性的进食模式。P2X1嘌呤受体的这些激动剂可代替单端孢霉烯用来治疗肥胖症。P2X1嘌呤受体的拮抗剂是与受体结合并将其封阻、从而切断或减弱进食模式的化合物。这些P2X1受体拮抗剂抑制或阻止进食模式以及饱腹感的产生，从而可用于延长进食时间和促进体重增重。
用于本发明的单端孢霉烯历史上，单端孢霉烯类化合物曾被认为是由各种能污染农作物的霉菌产生的有毒的次生代谢产物，因此定义为单端孢霉烯霉菌毒素。动物(包括人)摄取这些受污染的农作物可能会产生各种霉菌毒素中毒的病理症状，如呕吐、腹泻、内部器官出血损伤、食物中毒性白细胞缺乏症(ATA)、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、坏死性咽峡炎、粘膜炎症、厌食、惊厥、脓毒症，且在一些情况下导致死亡〔例如可参见Ueno，“单端孢霉烯霉菌毒素霉菌学、化学和毒理学”，Advancesin Nutritional Research 1980，3301-353(1980)〕。
本文所用“单端孢霉烯霉菌毒素”或“单端孢菌霉烯”指以非烯烃的母体或核心化合物单端孢霉烷为基础的倍半萜类家族中的化合物。所有的单端孢霉烯都是修饰的倍半萜，在第9位和第10位碳原子(C-9和C-10)上含有烯烃(双)键(因此称为单端孢霉烯)，并且在12位和13位碳原子(C-12和C-13)上形成环氧环。因此，单端孢霉烯的特征还包括它是12，13-环氧单端孢霉烯化合物。Ueno在结构和霉菌特征的基础上将自然产生的单端孢霉烯霉菌毒素分成4类(例如可参见Ueno，1980，同上)。根据该分类方案，由瓜萎镰毒素代表的单端孢霉烯类是在碳8(C-8)上被酮基(氧代-)取代的非大环状化合物。除了瓜萎镰毒素外，“瓜萎镰毒素相关”的单端孢霉烯类包括那些自然产生的单端孢霉烯霉菌毒素，如4-脱氧瓜萎镰毒素(DON)、曲古希克龙、单端孢菌素、3-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素(3-乙酰基-DON)、7-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、3，15-二乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、4-乙酰基瓜萎镰毒素(镰刀菌酮-X)和4，15-二乙酰基瓜萎镰毒素。本文所用“DON”、“4-DON”、“脱氧瓜萎镰毒素”和“呕吐毒素”都指具有图3所述的化学结构的单端孢霉烯化合物。因此，瓜萎镰毒素与DON不同之处在于前者在C-4上含有羟基，而后者没有(4-脱氧)。
虽然当摄取足够多的量的DON能明显引起严重的和广泛的中毒发生，但是，对于低于致死量的中毒，DON仍然被认为是效力最小的单端孢霉烯之一〔例如可参见Prelusky等人，Arch.Environ.Contam.Toxicol.，2236-40(1992)；Friend等人，Can.J.Anim.Sci.，66765-775(1986)；Ueno，Developments in Food Science IV，Trichothecenes，Chemical，Biological，and toxicological aspects(Elsevier，Amsterdam，1983)，pp.135-146〕。
使用V79中国仓鼠肺细胞〔Rogers和Heroux-Metcalf，Cancer Lett.，2039-35(1983)〕或者皮肤肿瘤发生Sencar小鼠模型(Lambert等人，Food Chem.Toxicol.，33217-222(1995)〕进行肝细胞介导的突变实验，可确定DON还是非致突变的。细胞毒性不是由脱氧核糖核酸(DNA)合成或修复中的改变介导的〔Bradlaw等人，Food Chem.Toxicol.，231063-1067(1985)；Robbana-Bamat等人，Toxicology，48155-166(1988)〕。
DON似乎没有进行大范围的肝代谢，而且易于且主要在尿中被排出。也已在尿中发现衍生物脱氧瓜萎镰毒素葡糖苷酸酯(glucuranide)和脱环氧DON，这明显是接受了DON的动物消化道中的微生物的代谢结果〔例如可参见Worrell等人，Xenobiotica，1925-32(1989)；Lake等人，Food Chem.Toxicol.，25589-592(1987)〕。而且，正如我们所发现的，DON和其他单端孢霉烯通过刺激消化道外的对该消化道的肌肉行为具有明显影响的反应而起作用。即DON并不是直接作用于消化道组织的平滑肌或其他结构，也不以对消化道组织产生不利影响来达到其对消化道活动性的影响。因此，DON和其他瓜萎镰毒素相关的单端孢霉烯化合物特别适用于本文所述的治疗肥胖症的方法。结构上不与DON和其他瓜萎镰毒素相关化合物相关的单端孢霉烯也可以用在治疗肥胖症的方法，条件是它们也能刺激消化道活动性的进食模式，且其剂量不产生任何不想要的或严重的临床霉菌性中毒症状。
可采用生物学方法从霉菌培养基中生产或通过化学合成生产用于本发明的单端孢霉烯及其衍生物。各种已发现的污染并在谷类和其他农作物上生长的土壤真菌产生单端孢霉烯次生代谢物。这些真菌包括镰刀菌属(Fusarium)、单端孢属(Trichothecium)、木霉属(Trichoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、Cyclindrocarpon和葡糖穗霉菌属(Stachybotrys)(见，Ueno，1980)。从镰刀菌属培养基中生产和纯化DON和DON的乙酯(acetyl ester)(如3-乙酰基DON和15-乙酰基DON)的方法已有所描述〔参见Can.J.Microbiol.，291171-1178(1983)；Miller和Blackwell，Can.J.Bot.，641-5(1986)；Greenhalgh等人，Proceedings of the 6th IUP ACInternational Symposium on Mycotoxins and Phycotoxins137-152(P.S.Steyn，编辑)(Elsevier出版社，Amsterdam，1986)；Miller和Arnison(Can.J.Plant Path.，8147-150(1986)〕。因此，可使用标准的培养和生产技术从真菌培养基中生产和抽提出用于本文所述的方法中的各种单端孢霉烯〔例如可参见Ehrlich等人，Biochim.Biophys.Acta，932206-213(1987)；Ueno，1980(同上)以及本文所引用的参考文献〕。如上面所述，DON是玉米和小麦的大量的和自然的污染物。因此，也可从受污染的农作物中分离出DON和其他单端孢霉烯。或者，可从巴西灌木Baccaris magapotomica和cordfolia中分离出这些化合物〔Kupchan等人，J.Org.Chem.，424221-4225(1997)〕。另外，本发明提供新的DON衍生物，该衍生物可如下面的实施例部分所描述的由DON或3-乙酰基-DON合成得到。
另外，还可以用产生单端孢霉烯的霉菌来修饰预先存在的单端孢霉烯。在许多实验室中已使用细菌〔Shima等人，Appl.Environ.Microbiol.，633825-3830(1997)〕或镰刀菌属菌株进行DON及其衍生物的这种生物转化。例如，培养在蛋白胨补充培养基中的F.roseum将3-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素转化成DON〔Yoshizawa等人，Appl.Micrboil.，2954-58(1975)〕。F.nivale能将DON的第3位碳原子乙酰化，得到3-乙酰基-DON。而且，这些菌株能将7，15-二乙酰基-DON去乙酰化，得到7-乙酰基-DON。
已周知单端孢霉烯的化学性质，因此可通过化学或生物化学的方法合成各种单端孢霉烯化合物。单端孢霉烯是化学上通过4环的12，13-环氧基单端孢霉-9-烯〔tricothec-9-ene)骨架相关的倍半萜烯醇或酯〔Williams，Arch.Environ.Contam.Toxicol.，18374-387(1989)〕。已报道由于某些和DON有关的单端孢霉烯由F.tricinctum大量产生并且易于在C-3和C-8位置上被修饰，所以可以以单端孢霉烯T-2毒素(4β，15-二乙酰氧基-3α-羟基-8α-[3-甲基丁酰氧基]-12，13-环氧基单端孢霉-9-烯)为原材料制备这些化合物(Ehrlich等人，Appl.Environ.Microbiol.，50914-919(1985)；Udell等人，Z.Naturfarsch，44660-668(1989)〕。T-2的C-3羟基的去除涉及T-2先转变成3-苯基硫羰碳酸酯，然后用氢化三-n-丁基锡还原此中间物，得到3-脱氧-T-2。这种方法已被别人用来制备3-脱氧蛇形毒素和4-脱氧疣孢毒素〔Schuda等人，J.Nat.Prod.，47514-519(1984)〕。
还已显示，为了产生C-8的氧代官能度(即DON相关的单端孢霉烯)，用二氧化硒氧化T-2和脱氧-T-2〔Bamburg等人，Tetrahedron，243329-3336(1968)〕。通过将C-8酮引入T-2毒素中产生其他的衍生物，如THP-7-DON(四氢吡喃基-7-DON)和DIDON(7-二脱氧瓜萎镰毒素)〔Bamburg等人，1968)。通过首先制备3-THP-T-2三醇和3-脱氧-T-2三醇，然后用二氧化锰(MnO2)将它们氧化可制得上述衍生物〔Warpehoski等人，J.Org.Chem.，472897-2900(1982)〕。不可能通过氧化T-2四醇来制备7-DON，因为竞争性的裂环反应和T-2四醇在反应溶剂二氯甲烷中的低溶解性的缘故。为了由THP-T-2三醇制备THP-2-DON，MnO2氧化是唯一可能的方法，由于用乙酸作为二氧化硒氧化反应的溶剂，四氢吡喃基将被去除。MnO2氧化反应中的副产物是具有15-甲醛官能度的单端孢霉烯。
DON相关化合物的鉴定可采用质谱、NMR(核磁共振)光谱学、红外光谱学、茴香醛染色和TLC(薄层层析)鉴定DON相关的单端孢霉烯化合物，以检测DON或其他单端孢霉烯一种或多种结构特征的存在。
所有DON相关的单端孢霉烯具有显示期待的由C-13a和C13b质子产生的AB偶合模式以及C-10(Cole and Cox)在6.5ppm的质子的NMR光谱，Handbook of ToxicFungal Metabolites(Acedemic出版社，New York，1981)，pp.152-263。
采用茴香醛染色，8-氧基取代的(酮)单端孢霉烯形成柠檬黄的加合物，而在8位缺乏该酮基的化合物形成红色或褐色的加合物。
在红外光谱中，8位上的羰基在1660-1680cm-1吸收。这证明单端孢霉烯保留了α、β不饱和的酮官能度。
DON的乙酰化类似物的质谱数据应显示在进行该方法期间由乙酰基或乙酸的损失所预见的母离子和碎片离子。
使用在本文所述的方法中的各单端孢霉烯较佳是被纯化直到在薄层层析(TLC)上以分离的点迁移。可采用高压液相色谱(HPLC)进一步确定均一性，洗脱出来的特定的单端孢霉烯应是单一的峰。也可使用GC-MS(气相色谱-质谱)分析确定纯度，例如，各类型的纯化的乙酰化单端孢霉烯显示单一的峰(Cole and Cox，1981，同上)。
如下面所讨论，本发明还包括这样的化合物其一种或多种上述的DON或其他单端孢霉烯的结构特征已被修改甚或被除去，以制备也可用于本发明组合物和方法的衍生物化合物。
单端孢霉烯衍生物和类似物DON可以使用在本发明的方法中，如治疗肥胖症，但是使用的剂量必须是刺激消化道活动性的进食模式而不引起其他任何不要的副作用，包括霉菌毒素中毒的临床症状之一——呕吐。虽然可采用标准的方法确定单端孢霉烯(如DON)的药学上可接受的剂量，但理想的是，在单端孢霉烯化学结构中产生一种变体，以得到一种在可能的不适当的副作用方面更温和的结构相关化合物。这种“温和的单端孢霉烯”(如“温和的DON”)是原始单端孢霉烯的衍生物，被期待与该原始的单端孢霉烯在刺激消化道活动性的进行模式中是可比的或更有效。因此，在治疗肥胖症的方法中，较佳的衍生单端孢霉烯(如DON衍生物)具有一种或多种改进的特性，并优于已知的单端孢霉烯(如DON)。
例如，DON的各种结构特征提供了特别具有吸引力的候选化合物的用于修饰的位点，以形成DON衍生物。有利的是，DON是相对小的分子，它具有有限量的可用于改变此化合物的活性的修饰位点。这些位点包括C-9和C-10间的不饱和键、12，13-环氧基环的存在、单端孢霉烯的结构核环上的羟基或其他基团的存在以及C-3、C-4和C15上发生的羟基或其他取代基的取代。另外，空间填充的分子模型揭示了单端孢霉烯核环的几个特征，这提供了哪个位点被修饰能产生有用的DON衍生物的额外信息。A环上的氧取代基(C-8酮和C-7羟基)使分子的这一侧比没有取代基时或存在异戊酰氧基支链(如T-2毒素)时更亲水。在核环的适当位置上存在的羟基改变了化合物的生物活性。例如，4-脱氧瓜萎镰毒素(DON)和瓜萎镰毒素之间的差异在于DON在C-4上存在羟基。
单端孢霉烯结构与单端孢霉烯抑制蛋白质合成的特性之间的关系的研究还揭示了几种可能用于制备本发明方法中使用的DON或其他单端孢霉烯的衍生物的有趣的特征(参见，Erlich等人，Biochim.Biophys.Acta，923206-213(1987)；Rotter等人，Env.Health，481-34(1996)〕。在抑制蛋白质合成方面，最有效的单端孢霉烯在含有8-氧代取代基的A环上缺乏取代基，或者具有酯化的羟基。当存在C-7羟基时，C-8酮上可产生氢(H)键，但这使得该环在空间上更具张力。H键还可出现在C-15和C-7上的羟基间。去除C-7羟基使C-15取代基在单端孢霉烯远离12，13-环氧化物的一侧暴露出来。另外，C-7羟基肯定对单端孢霉烯的效力作出贡献，因为含有C-7羟基的瓜萎镰毒素的效力是不含有C-7羟基的7-DON的效力的一个数量级。因此，可以理解DON和其他单端孢霉烯(尤其是瓜萎镰毒素相关的单端孢霉烯)上可比的或相应的位点可被认为是用于产生用在本发明组合物和方法中的DON或其他单端孢霉烯的衍生物的修饰位点。
用于本发明组合物和方法中的单端孢霉烯DON的衍生物的例子包括本文所指的化合物，包括3-乙酰基-DON(C17H22O7)、异亚丙基DON(3-羟基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮，C18H24O6，EN 139491)、异亚丙基-3-乙酰基-DON(即3-乙酰氧基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C20H26O7，EN139492)、DON碳酸酯(即3-羟基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯，C16H18O7，EN 139494)、3-乙酰基-DON碳酸酯(即3-乙酰氧基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯C18H20O8，EN 139495)、DON-苄基缩醛(即3-羟基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C22H24O7，EN 139497)和3-乙酰基DON亚苄基缩醛(即3-乙酰氧基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C24H26O8，EN 139496)(图3A和3B)。这些化合物还可用作“母体”化合物或原材料，可被进一步修饰得到另外的新的DON衍生物，这些新的衍生物较佳具有一种或多种改进的特性，这些特性将使新的衍生物化合物与其母体化合物或其他已知单端孢霉烯相比更佳用于本文所述的调节消化道活动性的组合物和方法中。
还可理解的是，DON或其他单端孢霉烯的代用品不必是结构相关的衍生物化合物，因为任何以产生最小或不产生不利副作用的剂量调节消化道活动性的化合物都可用在本文所述的方法中。
根据本发明，单端孢霉烯类似物是模拟单端孢霉烯一种或多种特征和所需的生化活性的任何化合物，而不论该化合物是否具有单端孢霉烯的结构特征。如DON，用于本发明方法的单端孢霉烯类似物，通过在消化道的外部、在外周起调节消化道活动性的作用。尤其是，用于本文所述的治疗肥胖症的方法中的单端孢霉烯类似物在消化道以外刺激消化道活动性的进食模式，并从而产生停止进食的饱腹感。这些单端孢霉烯类似物可能与DON或其他单端孢霉烯分子(见上)、无机分子、与单端孢霉烯无关的有机分子、生物分子(如核苷酸、核酸、肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质)或者它们的组合在结构上是相关的或由它们从化学上衍生得到的。可采用本文所述的一种或多种筛检单端孢霉烯活性的方法确定某具体的化合物是否是本发明所述的单端孢霉烯类似物。
P2X1嘌呤受体(消化道神经递质受体)的激动剂和拮抗剂在消化道组织中发现的与嘌呤受体的P2X1亚型结合的化合物还也可用在本文所述的方法中。P2X1嘌呤受体是消化道平滑肌中的神经递质受体，它涉及到消化道活动性的控制(见实施例和图2)。三磷酸腺苷(ATP)是P2X1受体的天然配体。在小肠的十二指肠和回肠中刺激嘌呤能运动神经元能释放出ATP。ATP最初作为P2X1嘌呤受体的激动剂，即ATP分子首先与平滑肌细胞中的P2X1嘌呤受体结合，发出抑制平滑肌的信号，之后平滑肌松弛。如上面所述，这种松弛是消化道活动性的一部分，可以采用Krantis等人(1996)的方法检测和测量。但是，ATP分子看起来持续结合在P2X1嘌呤受体上，从而使该肌肉对由ATP进一步的松弛脱敏，因为其他ATP分子不能与该受体结合以产生进一步的松弛事件信号(Smits等人，Br.J.Pharmacol.，303695-703(1996)〕。因此，消化道运动行为的P2X1受体介导的途径被封阻，导致可观察的所有消化道运动行为的减弱，这种减弱不受额外的ATP的影响(快速减敏)。因此，ATP，一种阻止任何进一步松弛的“脱敏”激动剂，对于消化道活动性的进食模式和禁食模式都起关键作用。ATP能与所有的嘌呤能受体结合。合成的ATP类似物α，β-亚甲基ATP也是一种脱敏激动剂，但是对嘌呤受体的P2X受体有特异性。此外，由于嘌呤受体的P2X1亚型是涉及消化道活动性松弛行为的受体的P2X种类，因此使用α，β-亚甲基ATP进行的研究提供了准确揭示消化道活动性中松弛的特异性神经生理学特征的数据。
与P2X1受体的脱敏激动剂如ATP或α，β-亚甲基ATP相反，P2X1受体的“非脱敏”激动剂具有提供连续的刺激消化道运动行为的松弛所需的受体结合特性。尤其是，P2X1受体的非脱敏激动剂是一种结合但不封阻该受体的化合物。非脱敏激动剂的各分子能结合P2X1受体，引起松弛，然后解离出来，被另外的同类分子所取代，该取代的分子又产生另外的松弛信号等。因此，只要P2X1受体的非脱敏激动剂的分子可以与P2X1受体结合，它就能刺激松弛事件。P2X1受体的非脱敏激动剂刺激消化道活动性的进食模式。因此，P2X1受体的非脱敏激动剂是本文所述的治疗肥胖症的方法中使用的DON、其他单端孢霉烯或单端孢霉烯类似物的代用品。
P2X1受体的脱敏激动剂(见上)或拮抗剂封阻该受体并减弱消化道的活动性。可以使用这些化合物阻止或抑制消化道活动性的进食模式，从而抑制饱腹感。抑制饱腹感将促进更长的进食时间，因为吃饱的感觉没有被激发。根据本发明，对消化道组织中的P2X1起作用受体的拮抗剂(如2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯基)腺苷5′-三磷酸(“TNP-ATP”)或脱敏激动剂(如α，β-亚甲基ATP)可用在延长进食时间和增加体重增重的方法中。这个目标特别有用于肉类和家禽工业，在这些工业中，增加家畜的体重或减少将动物饲养到可销售的重量所需的时间在商业上是需要的并且是有利的。
已知许多ATP的结构类似物和它们的一些药理学特性和受体结合特性〔参见Harden等人的评论，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，35541-579(1995)〕这些化合物可作为进一步筛检其与P2X1亚型嘌呤受体结合以及影响消化道活动性的能力的候选化合物。或者，可进一步修饰这些已知的ATP类似物的化学结构，以制备其他的可筛检其作为用在本文所述的各种方法中的P2X1受体的非脱敏激动剂、脱敏激动剂或拮抗剂的能力的ATP类似物。
ATP类似物TNP-ATP是一种P2X嘌呤受体拮抗剂，已在离体使用它作为P2X亚型选择性拮抗剂(全组织的IC50在μM范围内)，以确定P2X1和P2X31同聚体型和P2X2/3异聚体型嘌呤受体的作用〔参见，Lewis等人，Br.J.Pharmacol.，1241463-1466(1998)；Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)〕。已报道P2X3受体仅在感觉神经元中表达〔Evans等人，Semin.Neurosci.，8217-223(1996)〕。如本文所示，可用TNP-ATP拮抗剂来显示P2X1亚型嘌呤受体在调节体内消化道活动性的进食模式中的直接参与。由于TNP-ATP能阻止由DON、其它单端孢霉烯化合物及其衍生物诱导的消化道活动性的进食模式，因此，此P2X1拮抗剂本身可用在本发明延长饱腹感的产生和增加食物摄取的方法中。这些方法特别有用于生产用于销售的家畜和家禽。此外，可用TNP-ATP作为生产具有提高或改进的影响消化道活动性的特性的衍生物化合物的母体分子。
可作为本发明的P2X1受体的激动剂或拮抗剂的来源的另一类化合物是最初由Bohme等人描述的蒽醌(anthroquinone)-磺酸衍生物〔Chromatogr.，69209-213(1972)〕。这些衍生物可看做是ATP类似物，并包括三嗪基部分，已显示能拮抗豚鼠中的某些ATP介导的作用〔参见，Kerr和Krantis，Proc.Austr.Physiol.Soc.，10156P(1979)〕。所期望的是，这些能结合P2X1受体和调节(即刺激或抑制)消化道活动性的模式的蒽醌-磺酸衍生物可用在本文所述的各种方法中。
另一研制用于治疗肥胖症的P2X1受体的非脱敏激动剂的方法是从磺酰脲中研制化合物，例如，使用已知模拟二磷酸酯或三磷酸酯中的电荷分布但从没与腺苷分子结合过的独特的创新的酸性官能度取代母体化合物(腺苷5′-四氢三磷酸酯)的三磷酸酯部分。重要的是，腺苷-SO2-NH-CO部分可在聚合物基底(base)上用组合化学得到(Chiron Technologies)。结合P2X1受体并刺激消化道活动性的进食模式的化合物可用在本发明治疗肥胖症的方法中。筛检方法可采用许多方法鉴定那些用于本发明方法和组合物的单端孢霉烯、单端孢霉烯类似物、非脱敏P2X1受体激动剂、P2X1受体拮抗剂和其他调节消化道活动性的化合物。
已制备检测DON和15-乙酰基DON的特异性抗体，并在ELISA(酶联免疫检测)中使用〔参见，Sinha等人，J.Agric.Food Chem.，431740-1744(1995)〕。因此，DON和其他单端孢霉烯的抗体可使用在各种免疫学方法中(如ELISA)，以快速检测出也可用在本文所述的方法中的衍生物或相关的单端孢霉烯。
已使用Vero(Green Monkey的肾)细胞、鼠红白血病(MEI)细胞和大鼠脾淋巴细胞的离体细胞培养物测定大量的12，13-环氧基单端孢霉烯的结构-功能关系。例如，使用这些细胞培养物系统检测各种12，13-环氧基单端孢霉烯抑制肽基转移酶并因此抑制蛋白质的合成的活性的能力〔参见，例如。Erlich和Daigle，Biochim.Biophys.Acta，923206-213(1987)；Rotter等人，J.Toxicol.Env.Health，481-34(1996)〕。具体是单端孢霉烯结合到真核核糖体的60S亚基上，并因此干扰肽基转移酶。单端孢霉烯倍半萜上的结构取代的程度影响结合到肽基转移酶的性能，并因此影响抑制此酶的程度(Erlich等人，1987；Rotter等人，1996)。
可使用上述细胞培养物来检测或筛检可能用在本文所述的治疗组合物和方法中的未知活性的化合物。这些以细胞为基础的检测和筛检方法特别有用于检测和表征各种具有未知活性的单端孢霉烯或衍生物化合物，如新近合成的或发现的具有已知单端孢霉烯(如DON或其他瓜萎镰毒素相关的单端孢霉烯)的结构特征的化合物。也可使用这些细胞培养物筛检其他的在结构上与已知的单端孢霉烯不相关的化合物。
在以细胞为基础的筛检方法中，可将各试验化合物与一种或多种已知单端孢霉烯(如DON)的标准制品比较，该标准制品一般配制在原液(10μg/ml)在二甲亚砜中的溶液中。调整二甲亚砜的浓度，以使其在与细胞培育期间总是1％(v/v)以下。单端孢霉烯室温(27℃)下一般能保持稳定达到一年。
较佳的是，还可采用Krantis等人(1996)的方法筛检和表征候选化合物，该方法使用小型箔压力传感器和计算机数据分析系统准确和同时记录消化道中平滑肌的松弛和收缩。这是通过对消化道运动性的作用直接筛选化合物的一种方法。如上面所述，Krantis等人(1996)的方法能提供化合物对体内、离体或体外消化道活动性的进食和禁食模式的影响的真实记录(见实施例1和2)。这些筛检或鉴定用于本发明组合物和方法的新化合物的方法还可包括比较候选化合物对消化道运动的影响与已知单端孢霉烯(如DON)对消化道运动的影响。
用于P2X1激动剂或拮抗剂的结合实验和筛检还可检测或筛检候选化合物(也称为“引导”或“试验”化合物)结合或封阻嘌呤受体的P2X1亚型的能力，该受体是表达在平滑肌上的嘌呤能受体，且明显地涉及到小肠消化道活动性的松弛行为的控制〔例如可参见Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)；Humphrey等人，Naunyn Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.，352585-596(1995)；Bo等人，Br.J.Pharmacol.，1121151-1159(1994)和G.Bumstock的评论，Ciba Dound Symp.，1981-28(1996)(P2受体类)和A.Surprenant，的评论，Ciba Dound Symp.，198208-219(1996)(天然的或克隆的P2X受体的功能特性)〕。还可将化合物结合P2X1受体的能力与已知受体配体(如ATP或ATP类似物，如α，β-亚甲基ATP或TNP-ATP)结合P2X1受体的能力进行比较。
用于胞外刺激的细胞表面受体的成功的放射性标记依赖于是否能得到具有高亲和力、稳定性和蛋白质结合的特异性的配体。直到最近，还没有P2嘌呤受体的特殊亚型的选择性拮抗剂，而显示能竞争性抑制P2嘌呤受体的几种化合物(例如，苏拉明，活性蓝2)仅以微摩尔的亲和力起作用，并且因为它们与许多其他的蛋白质相互作用，所以缺乏特异性。同样的问题是结合实验是在如用膜的条件下进行，而这些条件与那些可测量受体的生物学反应的条件非常不同。因此，难于确定结合常数和受体活性常数之间的直接关系。由于P2嘌呤受体的激动剂的结合亲和力仅比它们对其他ATP结合蛋白质的亲和力稍大一些，所以这种激动剂也存在一些问题，而且它们易受核苷酸水解酶的水解。
在制备膀胱和脉管(vas deferens)平滑肌中已使用[3H]-标记的α，β-亚甲基ATP作为P2X嘌呤受体的放射性配体。通常，激动剂结合亲和力与那些在完整组织中观察到的一致。例如，α，β-亚甲基ATP和2-甲基-S-ATP竞争结合脉管结合位点的表观结合亲和力的差异仅约为30倍，而许多推测其不是P2X激动剂的核苷酸也完全抑制放射性配体结合。[3H]标记的α，β-亚甲基ATP的结合位点的密度远远超出用其他所有神经递质受体所观察到的。
可分离出表达P2X1受体的肠平滑肌，并将该分离出来的平滑肌细胞培养在基本培养基中。可将这些培养基用于能作为P2X1受体的激动剂或拮抗剂的引导或候选化合物的结合实验中。或者，可使用表达P2X1受体的胚胎肾293细胞〔Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)〕。这种受体亚型还在血小板和原巨核细胞系〔Vial等人，Thromb.Haemost.，781500-1504(1997)〕以及在HL60细胞〔Buell等人，Blood，872659-2664(1996)〕中表达。因此，在培养基中表达P2X1受体的任何细胞(包括重组修饰的细胞)可用于筛检P2X1受体的激动剂和拮抗剂。
已纯化(Valera等人，Nature，371516-519(1994)〕和克隆〔Sun等人，J.Biol.Chem.，27311544-11547(1998)〕P2X1嘌呤受体。已描述重组P2X1受体的结合特性〔Michel等人，Br.J.Pharmacol.，1181806-1812(1996)〕。纯化的P2X1受体可通过多种连接剂中的任何一种连接到固体基质上，如微滴定板的孔的表面、树脂颗粒的表面或检测芯片的表面上。这种安排可以检测非常少量的化合物结合该受体的能力。此外，可利用的筛检微滴定板和检测芯片中的样品的自动操纵技术使得熟练的专业人员在数小时内能准确和连续地筛检成百或成千的化合物。
可采用体外实验、离体消化道器官实验和/或体内消化道活动性实验〔例如，采用Krantis等人的方法(1996)〕进一步评估在一种上述筛检方法中确定具有活性的引导或候选化合物(见实施例1)。在离体消化道器官浴实验中，从动物体内割下消化道器官部分(例如小肠的十二指肠、空肠和回肠片段)，将其放在生理性维持培养基中，如在生理体温的Krebs溶液中。通常将单个消化道片段固定，以记录循环的肌肉活性，较佳在两个连接点记录。可将化合物注射、混合或涂覆到切割下来的消化道器官片段，测量该化合物对该器官活动性的影响。在离体消化道器官中，暴露出被麻醉的动物的消化道器官，但维持其完整和处于生理条件。然后可将试验或引导化合物方便地直接涂(局部)在该器官上，监测该化合物对该器官的影响。在体内试验中，可将化合物注射到动物体内，或使动物摄取该化合物，然后直接测量该化合物对消化道活动性的影响。
检测或筛检用于本文所述组合物和方法中的化合物的来源包括(没有限制)小分子集合，组合库，从真菌、细菌和各种胚胎细胞培养基或发酵液中得到的生长介质或细胞抽提物，和从人和其他动物得到的生物体液、组织和血清样品。
治疗方法、药学组合物、给药模式本发明提供用于治疗肥胖症的方法中的药学组合物。本发明其他的组合物用于促进动物的体重增重，这对于饲养销售用的商业家畜和家禽特别有用。人和其他脊椎动物具有相同的控制消化道活动性方面的基本消化道神经生理学。因此，可采用本文所述的方法治疗的动物毫无限制地包括人和其他灵长动物、猪、牛、绵羊、鸟(家禽和其他鸟类)、马、猫、狗和啮齿动物(包括仓鼠、豚鼠、大鼠和小鼠)。本文所述的所有给予其他动物的药学组合物和组合物含有有效量的所述化合物，以达到所需的对消化道活动性的影响而没有产生显著的或不需的副作用。
根据本发明，通过给予人或其他动物有效量的DON或其他单端孢霉烯、单端孢霉烯衍生物、单端孢霉烯类似物或P2X1嘌呤受体的非脱敏激动剂以刺激或激活消化道活动性的进食模式并从而产生饱腹感而治疗肥胖症。相反，可以给予人或其他动物以P2X1嘌呤受体拮抗剂(如TNP-ATP)或脱敏激动剂(如α，β-亚甲基ATP)，以阻止或抑制消化道活动性的进食模式，并从而延长进食时间，促进体重增重。
可以多种形式中的任何一种特别是适合于预期的给药模式的形式(包括固体、半固体或液体剂型)给予这些组合物，例如，片剂、锭剂、丸剂、胶囊、粉末、栓剂、液剂、散剂、水性或油性悬浮液、糖浆、酏剂和水性溶液。较佳的是，该药学组合物是适合于准确剂量的单一给药的单位剂型，该剂型可以是一剂量的一部分或若干倍，以产生所需的对消化道活动性的影响。如上面所述，这些组合物将包括有效量的所选择的化合物与药学上可接受的载体和/或缓冲液的混合，另外，可包括其他无毒的、惰性的和药学上可接受的医学制剂或药学制剂、载体、稀释剂、填充剂和配制佐剂或它们的组合。在液体混合物或制品中，可使用药学上可接受的缓冲液，如磷酸缓冲盐溶液。“药学上可接受的”指一种不是生物、化学的物质，或者不论如何，与躯体化学性质和代谢不相容的、存在于药学组合物中也不对其他任何组分产生不利影响的物质。
对于固体组合物，常规的无毒的固体载体包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。药学上可接受的液体组合物可通过如在赋形剂(如水、盐水、水性右旋糖、甘油、乙醇等)中溶解和分散调节本文所述的消化道活动性的活性化合物和优选的药学佐剂，从而形成溶液或悬浮液而制得。如果需要，给药的药学组合物还可含有少量的无毒辅佐物质(如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等)，例如，醋酸钠、油酸三乙胺。
对于本领域熟练的技术人员，制备剂型的标准方法是已知的或将是明显的〔例如可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin编辑，Mack PublishingCo.，Easton，PA，最后一版〕。对于DON和其他单端孢霉烯，剂量为不产生呕吐的量。如在动物研究中已证明的那样，这些低于呕吐(sub-emetic)的剂量是易于确定的(见实施例1和2)。
本发明组合物的主要活性成分是影响(调节)消化道活动性的单端孢霉烯、单端孢霉烯类似物、P2X1受体的激动剂或P2X1受体的拮抗剂。当摄入单端孢霉烯(如DON)时，它们明显地能发挥它们对消化道活动性的活性。因此，本发明优选的组合物是被配制成口服给药。还可肠道外给予这些化合物，例如，通过静脉内、肌肉内或腹膜内注射给药。
对于优选的口服给药，本发明组合物可被配制成含有影响消化道活动性的化合物以及还含有稀释剂、分散剂和/或表面活性剂的细微粉末或颗粒。口服组合物还可以水或糖浆中的溶液或悬浮液的形式存在，存在于丸剂、片剂、胶囊或干燥状态的小袋中，或者存在于可能包括悬浮剂的非水性溶液或悬浮液中。在口服组合物中还可使用结合剂和润滑剂。在想要或需要时，可包括增香剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂或乳化剂。片剂和粒剂是优选的口服剂型，这些剂型可被包衣。
如果使用，肠道外给药通常是注射。可注射的制品可以制成常规的形式，包括液体溶液或悬浮液、适合于注射前配制成溶液或悬浮液的固体，或者制成乳化液。对于大多数目的，可静脉内注射在药学上可接受的缓冲液中的用于调节消化道活动性的化合物。但是，将这种化合物制成可能含有逐渐从注射位点上释放出来的媒染剂的大丸剂也在本发明的范围内。肠道外给药的方法涉及缓释或持续释放系统的使用，这样剂量的稳定水平得以维持(例如可参见美国专利3710795号)。
用在本文所述的组合物和方法中用来调节消化道活动性的化合物的确切和有效的量对不同的对象将根据年龄、体重和该对象的总的条件、治疗的肥胖程度、具体使用的化合物、给药的方式等而改变。因此，不能指定可应用于所有个体的理想的剂量的确切的量。但是，所期望的是，单端孢霉烯(如DON)通常使用或检测的量为0.01-100mg/kg体重。此外，选择用于具体个体的有用的剂量将是低于呕吐的，即没有引起该个体呕吐的剂量。对于市售用的药学组合物，可以理解在用于人时，可由健康维护医生根据美国食物和药品管理(或类似的机构)的标准确定药学有效和合适量的单端孢霉烯、单端孢霉烯衍生物、单端孢霉烯类似物、P2X1受体激动剂或P2X1受体拮抗剂。用于动物时，将根据商业家畜食物或兽医药品的标准和实际确定和配制恰当的组合物。
从下述的非限制性实施例将能明白本发明其他的实施方式和特征。
实施例实施例1下述实施例显示DON在消化道外的位点起作用，并干扰胃和小肠的特异性内在神经途径，产生运动行为的改变的模式。这些发现显示DON诱导食欲的消失(如动物中的进食拒绝所证明的)并支持诱导食欲的这种消失的方法。
正常的胃肠道活动性依赖于消化道壁的内在的(肠的)神经网络，以及外周和中枢神经系统(CNS)的调节性输入。内在的回路使反射作用(如蠕动反射)或复合模式的诱导行为〔如发生在禁食模式和分段推进的进食模式间的消化间的移动性肌电复合(MMC)〕相协调。
检测了DON对控制大鼠胃和肠消化间自发的运动行为的途径的影响。即使大鼠没有呕吐反射，但它们却具有与呕吐相关的恶心和不舒适〔Andrews，Br.J.Anaesth.，692s-19s(1992)，W.A.Rapley和M.Hirst，Lab.Anim.Sci.的摘要，38504(1988)〕。检测了低阈值水平的DON对体内消化间运动模式的影响。从获得辅助药学信息的离体消化道浴实验中得到额外的信息。
在体重为250-350克的雄性Sprague-Dawley大鼠上进行实验。所有的实验计划都根据渥太华大学的动物护养委员会的指南进行。
单只大鼠，禁食24小时，但可自由饮水，之后用氟烷(4％)在氧中的混合物将其麻醉。将大鼠放在加热的净化桌上的2％氟烷麻醉剂下，以保持其体温在37℃。暴露出右颈动脉，将PE 50管插入，经由连接到IBM数据采集系统上的压力传感器(P23ID，Gould Statham，OH)监测血压。用PE 50管插入颈静脉以进行静脉内(i.v.)注射。但是，由于各种药物的半衰期短，以及为了回避肝的第一轮代谢，动脉内给药常常是必需的。对于通过闭合(close)动脉内(i.a.)注射导入药物的动物，从股动脉插入套管(PE 10管)，反向插入以将针头放在上面的肠系膜动脉水平处。
进行中央剖腹术，暴露出感兴趣的胃肠片段。接着用Vet Bond胶将箔压力传感器(Showa N11型，Durham Instruments，Pickering，ON)依次连接到胃窦上(离幽门括约肌2cm)、连接到十二指肠的非肠系膜边界(离胃肠连接处1-2cm)、以及侧向连接到回肠的非肠系膜边界(回盲肠连接处)。所有箔压力传感器的取向都与肌肉层的纵向平行，这样使记录圆周的运动行为的环境最灵敏。接出箔压力传感器上的导线并通过3信道口盒将其连接到IBM PC数据采集系统上。Krantis等人(1996)已描述了使用箔压力传感器与基于计算机的数据采集系统记录和分析体内活动性的详细方法。图1是此方法记录消化道活动性的示意图。手术结束后，使大鼠俯卧，剩下的实验中麻醉剂浓度维持为1％。
采用上述相同的外科方法制备离体器官制品，除了使大鼠仰卧以维持箔传感器连接位点暴露出来外。这使得可直接将药物局部给到消化道的绒膜表面上。定时用温暖的盐水淋洒暴露的消化道片段，以使其潮湿。
根据Mckay和Krantis(Can.J.Physiol.Pharmacol.，69199-204(1991)〕的方法制备用于离体消化道器官浴的消化道器官。无痛处死大鼠，迅速取出十二指肠、空肠和回肠近端的片段，小心地清除其中的内容物，去除任何肠系膜粘附物，然后将其放在含有下述组成(mM)的Krebs溶液的器官浴中Na+(151.0)、K+(4.6)、Mg2+(0.6)、Ca2+(2.8)、Cl-(134.9)、HCO3-(24.9)、H2PO4-(1.3)、SO42-(0.6)和葡萄糖(7.7)。维持此溶液的温度为37℃，并用95％O25％CO2连续供气，以使pH为7.4。
然后水平放置单条消化道片段，以记录离肠系膜边界25mm远的两个连接点的环状肌肉活性，各点与将该片段连接到器官浴的底部的蛙心夹(frog heart clip)相对，各点通过聚酯绳连接到Grass等容压力传感器(isometric force transducer)上。使用MacLab Macintosh数据采集系统(Apple Corp.，Toronto，Ontario)直接监测由该传感器检测到的机械活性。
各连接点的静止张力为1克，在用药物处理前先将片段平衡60分钟。每15分钟以及用药物刺激期间用更新的Krebs浴溶液洗涤器官浴制品。接着的药物刺激仅在至少5分钟的平衡后或者直到基本状况恢复到静止张力的90％后检测。
由IBM数据采集系统获得、数字化和保存体内和离体记录的运动行为，然后计算运动反应的幅度和频率(除了其他可变的以外)(Krantis等人，1996)。根据其满足一组六个数值参数(分别为收缩和松弛)的能力标记合格的反应，该参数是以使用者定义的必须满足有限时间段的阈值为基础。在2分钟的时间段内连续监测这些参数，并视需要将其调整为具有95-100％精度的有效标记运动反应。然后将数据输出，组织成表格形式，以用于统计分析。
使用Statgraphics Plus5.0软件(Statistical Graphics Corp.)，用具有Tukey多分析实验的单向ANOVA比较平均值。认为小于0.05的概率(p＜0.05)是显著的。所有的值都以实验的平均值±标准偏差表示。
将在体内和离体实验中使用到的所有药物(包括DON)都溶解在生理盐水中(0.9％)。注射浓度是(注射速率为0.5ml/分钟)α，β-亚甲基三磷酸腺苷(α，β-亚甲基ATP，300mg/kg)、N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10mg/kg)、BRL 43694(格兰塞群，80mg/kg)、血安定(5×10-5M)和六甲双铵(18mg/kg，s.c.)。α，β-亚甲基ATP从RBI(Natick，MA)购得；DON由Mr.Dave Miller(Agriculture Canada，Ottawa，ON)提供，它是根据Miller等人所述的方法〔Can.J.Microbiol.，291171-1178(1983)；Miller和Blackwell，Can.J.Bot.，641-5(1986)；Miller和Arnison，Can.J.Plant Path.，8147-150(1986)〕生物合成生产和纯化的；其余所有的药物从Sigma ChemicalCompany(Toronto，ON)购得。“mg/kg”指毫克每千克个体对象/动物体重。
用于器官浴制品(体外)或局部用于离体实验中的药物的浓度是卡巴胆碱(0.5mM)、罂粟碱(10mM)、ATP(0.5mM)、DMPP(50mM)、3-APS(0.5mM)(SigmaChemical Company，Toronto，ON)和DON(20mM)。药物体积从不超过浴体积的1％。
在对照条件下，麻醉大鼠的胃和小肠具有局部自发的运动行为。在胃窦中，这种行为由振动收缩和松弛运动反应组成。在十二指肠近端，自发的运动行为是阶段性的强烈的“组合”行为(持续1-5分钟)模式，主要包括低振幅、低频率松弛和收缩。与“组间”行为相反，“组合”行为以3.4±0.6cm/分钟的速率在对口方向扩散。回肠远侧对照的自发行为主要包括随机产生的相对高振幅和频率的收缩和/或松弛。
以1或2mg/kg的大丸剂全身给予DON并没有影响对照的运动行为。但是，在10mg/kg时，DON如下面所述中断了自发的运动模式。用20mg/kg的DON处理并没有产生显著更大的影响。
胃窦静脉注射后2分钟内，DON(10mg/kg，i.v.，n＝7)抑制窦的运动行为(图4)，减弱(p＜0.05)自发的收缩(相对对照，减弱20±6％)和松弛(相对对照，减弱27±11％)。这种影响是短暂的，因为运动行为在18±3分钟内恢复到对照的90％。最短时间内重新给予DON一般没有产生影响。
近端十二指肠全身注射DON(10mg/kg，n＝12)后2分钟内，自发的十二指肠运动行为从对照模式的交替“组合”和“组间”行为转变成一段持续的“组合”样行为(46±15分钟)(图5)。这种机能亢奋并不与对照“组合”行为的振幅或频率有显著差异。在给予DON后的60分钟内，对照模式的交替“组合”和“组间”行为恢复。接着注射DON(n＝6)并没有显著改变原来的运动模式，这表明产生了快速减敏。快速减敏对DON的作用时间是相对短的，30分钟后再给予DON(n＝5)，又引起机能亢奋(p＜0.05)；但是，相对最初的DON诱导的机能亢奋，此次行为的持续时间(24±14分钟)大大减少。
回肠末端全身注射DON(10mg/kg，n＝9)，2分钟内引起回肠的机能亢奋。收缩和松弛运动反应的频率和振幅显著(p＜0.05)增加。因此，回肠在DON的存在下所具有的消化道活动性的模式类似于当食物被摄取并需要被推过消化道时产生的消化道活动性的特征进食模式。这种效果持续63±22分钟。之后，运动行为慢慢恢复到对照水平。与十二指肠类似，在回肠中也产生了对再给予DON(n＝6)的快速减敏作用。此快速减敏持续达90分钟，之后可通过再给予DON(n＝6)诱导机能亢奋。
局部给予DON的效果离体制品的运动行为模式与体内制品相似。在胃窦(n＝3)、十二指肠近端(n＝3)或回肠远端(n＝3)的绒膜中直接(局部)使用20mM的DON(浓度远远大于体内实验使用的剂量)，并没有引起任何可与体内实验所见到的运动反应相比的反应。通过观察所检测的消化道区域的活力证明了预测的对药理学刺激的反应(即已知的对平滑肌直接起作用)，这些刺激如使平滑肌松弛的罂粟碱(10mM)和诱导胆碱能蕈毒碱受体介导的收缩的卡巴胆碱(0.5mM)。局部使用DON并没有干扰这些药物的作用。
使用了卡巴胆碱(0.5mM)或罂粟碱(10mM)的十二指肠、空肠和回肠的分离的消化道浴制品(n＝5)分别产生收缩和松弛。另外，利用GABAA受体激动剂3-APS(0.5mM)或一氧化氮能受体激动剂DMPP(50mM)，消化道片段对假定的非肾上腺素能、非胆碱能(NANC)的抑制性递质ATP(0.5mM)和神经刺激具有松弛反应。但是，在同样的制品中，DON(20mM)不起作用。此外，DON不干扰这些消化道片段对受试药理学制剂的响应性。
DON诱导的机能亢奋的药理学L-NAME在麻醉的具有自发的运动行为的大鼠中，一氧化氮(NO)合成酶抑制剂L-NAME减弱了十二指肠的一氧化氮介导的“组间”松弛并提高了“组合”行为(观察结果未公开)。因此，测量了L-NAME对DON行为的影响。全身给予L-NAME(10mg/kg，n＝5)并未减轻十二指肠中DON诱导的机能亢奋的松弛的频率和振幅(p＞0.05)(见图6A、频率和6B、振幅)。在回肠中，L-NAME总是将自发的运动活性的松弛的频率和振幅提高到与单独存在DON时的水平(见图6C、频率和6D、振幅)。
嘌呤受体快速减敏自发的十二指肠“组合”松弛通过P2X受体相关的嘌呤能传导特异性地介导(观察结果未公开)。这通过P2X嘌呤体长时间暴露在特异性的激动剂α，β-亚甲基ATP中产生脱敏作用而被证实。最初注射α，β-亚甲基ATP(300mg/kg，i.a.，n＝3)诱导显著的松弛。恢复到基本的状况后，再用α，β-亚甲基ATP刺激没有产生影响，这表明产生了快速减敏。在这些条件下，自发的十二指肠“组合”松弛和回肠的松弛被特异性地封阻。另外，在十二指肠(n＝8)和回肠(n＝4)中α，β-亚甲基ATP诱导的快速减敏过程中，DON诱导的机能亢奋也被消除。
烟碱受体胆碱能的烟碱机制基本上涉及到肠活动性的控制〔参见，Furness和Costa，Neurosci.，51-20(1980)；Gershon，Ann.Rev.Neurosci.，4227-272(1981)〕。在体内，用神经节烟碱拮抗剂血安定(50mM，局部使用，n＝2)或六甲双铵(18mg/kg，s.c.，n＝2，数据未给)治疗，显著地减少了十二指肠和回肠中DON诱导的机能亢奋的频率和振幅。
谷尼色创在十二指肠中，全身给予5-HT3受体拮抗剂谷尼色创(80mg/kg，n＝8)，减弱了(p＜0.05)“组合”行为的自发的收缩和松弛的频率和振幅(在图7A-7D中比较宽对角线的柱(仅谷尼色创)和对照组合行为的空白柱〕。谷尼色创的影响持续达30分钟。但是，由于十二指肠对此药物的作用不具有脱敏作用，重复给予谷尼色创以维持“组合”行为的封阻。在这些条件下，DON(10mg/kg，n＝5)总是诱导机能亢奋(p＜0.05)〔比较图7A-7D中的窄对角线柱(仅DON)和填充柱(谷尼色创+DON)〕。
类似地，在回肠中，谷尼色创减弱了消化道活动性(p＜0.05)，分别将自发的收缩和松弛运动反应减到对照水平的40±18％(n＝4)和27±10％(n＝3)；但是，它没有对抗DON诱导的机能亢奋(数据未给)。
这些实验描述了暴露在霉菌毒素DON中的麻醉大鼠的胃和肠水平的运动模式的特征。全身注射DON破坏了胃窦振动运动行为，代之以静止的模式；在十二指肠中，DON诱导了代替自发的环状扩散模式和非扩散运动行为的机能亢奋。DON还引起回肠中存在的运动模式的过度兴奋。DON诱导的模拟行为是典型的“进食模式”运动行为的回忆。使用低水平的DON，即没有引起呕吐或呕吐行为的水平。10mg/kg的DON起最大作用；这个剂量与使用啮齿动物进行的其他研究中使用的剂量是可比的，在那些研究中，使用DON以诱导进食的改变的剂量达到40mg/kg(i.v.)〔Rapely等人，Lab.Anim.Sci.，385041(1988)〕。
在所检查的大鼠中找到了对DON的渐进性的耐受力的证据。小肠中DON诱导的机能亢奋持续达60分钟，然后完全恢复到对照运动模式。接下来维持着对常规使用的药理学刺激的响应性；除了紧接的连续给药后不起作用的DON外，产生了对DON的快速减敏的特征。但是，这种快速减敏没有持续，可能是因为大鼠中高速率的DON解毒的缘故〔Prelusky等人，Fund.Appl.Toxicol.，10276-286(1988)〕。
许多药物(具体是催吐剂)在消化道水平上改变肠的活动性，它们激活伸向自主神经节和/或神经中枢(CNS)的呕吐中心的迷走神经传入神经，这又反射刺激消化道，从而实现上述改变〔Castex等人，Brain Res.，688149-160(1995)；Cubeddu等人，Sem.Oncol.，192-13(1992)〕。但是，从本文得到的离体和体外实验结果表明，虽然分离的消化道片段对各种药理学刺激表现敏感，但直接给予DON不产生影响。因此，DON肯定是从消化道外的位点间接发挥其影响。这个发现与文献中的胃内与静脉内注射(分别为30分钟和15分钟)后DON诱导的影响的延迟的发生的某些报道一致〔Coppock等人，Am.J.Vet.Res.，46169-174(1985)，Foresyth等人，Appl.Environ.Microbiol.，34547-552(1997)；Prelusky等人，Natural.Toxins，1296-302(1993)〕。
在正常的环境中，进食中断所有水平上的消化道的禁食环形运动模式，代之以连续的、不规则的低水平行为(分段的进食模式)。如上面所述，分段以插入小肠松弛间的窄环状收缩为特征，并减少了胃窦中的活动性。进食模式起到混合肠内容物和延迟顺行推进以提高基质吸收的作用〔Lundgren等人，Dig.Dis.Sci.，34264-283(1989)〕。进食模式活动性被外周主神经节经由基本迷走输入激活和控制，受CNS激活和控制的程度较小〔Chung等人，Can.J.Physiol.Pharmacol.，701148-1153(1992)；Tanaka等人，J.Surg.Res.，53588-595(1996)；Yoshida等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，256272-278(1991)〕。自主神经的过度激活加速了进食模式的产生并增加其持续时间，同时增加扩散性运动行为的频率和振幅〔Hall等人，Am.J，Physio.，250G501-G510(1986)；Johnson等人，Am.J.Surg.，16780-88(1994)〕。这种运动行为与上面所观察到的小肠中DON诱导的机能亢奋类似。另外，DON诱导的窦诱导行为的抑制性和胃排空的延迟(Fioramonti等人，J.Pharmaciol.Therap.，2661255-1260(1993)〕也是该进食模式的特征(Hall等人，1986)。总之，这些结果表明，DON从外部位点经由外周自主神经节或迷走传出神经刺激介导进食模式的途径。
通过抑制性神经的影响的抑制作用可部分激活进食模式活动性(Lundgren等人，1989)。因此，在消化道以外起作用的DON能通过消除控制消化道活动性的肠神经回路的强抑制作用而刺激机能亢奋。NO(一氧化氮)被提议为调节胃肠活动性的强释放的抑制性介质〔Daniel等人，Am.J.Physiol.，266G31-G39(1994)，Gustafeeon等人，J.Aut.Nerv.Sys.，44179-187(1993)；Hryhorenko等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，271918-926(1994)〕。在体内实验中，用NO合成抑制剂L-NAME(10mg/kg，i.v.)进行的处理通过加强十二指肠和回肠的特异性运动行为在一定程度上模拟了DON的效果。但是，L-NAME处理不影响消化道中DON的作用。
这些实验提供了对消化道中介导DON影响的途径的有价值的理解。当NO合成酶抑制剂L-NAME选择性封阻自发的“组间”十二指肠松弛以及强化组合运动行为时，它并未影响到DON诱导的机能亢奋。相反，选择性减弱“组合”松弛的α，β-亚甲基ATP诱导的快速减敏也阻止十二指肠中的DON诱导的机能亢奋。存在着提示ATP和NO是大鼠十二指肠中NANC抑制性神经递质的强有力证据〔katsuragi等人，J.Pharmacol..Exp.Therap.，259513-518(1991)；Manzini等人，Eur.J.Pharmacol.，123229-236(1986)；Postorino等人，J.Auton.Pharmacol.，1565-71(1995)；Windschief等人，Br.J.Pharmacol.，1151509-1517(1995)〕。这种由DON引起的嘌呤能松弛的靶向在回肠中也是明显的，在那里DON诱导的机能亢奋被α，β-亚甲基ATP快速减敏所封阻。迄今仍未测定大鼠中介导体内自发的回肠松弛的递质的身份。但是，有大量的离体功能性证据证明ATP和NO都介导了大鼠回肠中的NANC松弛〔Belai等人，Cell.Tiss.Res.，278197-200(1994)；Fargeas等人，Gastroenterol.，102157-162(1992)；Mahmod和Huddart，Comp.Biochem.Physiol.，106C79-85(1993)；Simits等人，Br.J.Pharmacol.，118695-703(1996)〕。
烟碱受体阻断消除了小肠中自发的和DON诱导的运动行为，这解释了从先前的研究中得到的结果。已知烟碱神经节传导介导兴奋性和抑制性器官内神经元的胆碱能刺激，该神经元调节和处理肠神经信号〔Bomstein等人，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，21441-452(1994)；Gershon，Ann.Rev.Neurosci.，4227-272(1981)〕。实际上，胆碱能神经元介导胃肠道所有的活动模式，包括蠕动反射和MMC。因此，用烟碱拮抗剂进行的处理可有效地封阻绝大多数(如果不是全部)肠神经回路。
迷走神经传入上的5-HT3位点不大可能涉及与DON作用相关的消化道运动行为，因为当直接对整只动物的暴露的消化道使用DON时，DON不起作用。5-HT3受体还位于肠肌层神经元中，后者涉及调节中间消化运动模式的肠回路〔Hoyer，Neuropsypharmacol.，3371-383(1990)；Yoshida等人，1991〕，并且这些神经元可能在被DON锁定的肠回路中发生。使用有效的和特异的5-HT3受体拮抗剂谷尼色创，以足以消除十二指肠中自发的“组合”行为以及回肠中的运动行为的剂量进行处理，并不能影响DON诱导的机能亢奋。因此，DON和5-HT以小肠中共同的肠元素为目标通过不同的途径起作用。但是，DON激活的途径和5-HT3受体依赖性途径都集中于同一类群的抑制性嘌呤能运动神经元。
这些发现为DON诱导的进食拒绝提供了解释。DON的“低”阈值水平对消化道活动性的中断作用的影响是明显的；窦运动行为变小，小肠的运动行为得到强化。这些运动模式一起说明了“进食状态”，一种通常与饱食有关的状态。爱这些条件下，人或其他动物停止进食。这种DON诱导的进食模式是短暂的，中间消化的环状模式很快恢复，大概是因为DON血浆水平降至低于阈值的缘故。
与此研究的特征一致的是由DON锁定的P2X嘌呤受体介导了抑制性肠运动的神经分布。这种神经分布也涉及烟碱受体，但是，如上面所述，肠神经回路中到处分布和涉及的烟碱位点排除了以抵消DON的作用为目的的烟碱拮抗剂的使用。但是，更有希望的是DON在激活P2X嘌呤受体相关活性中的特异性。P2X嘌呤能位点代表肠途径的一种高度限制的组分，因此，以这些位点为目标可代表一种抵消消化道中DON影响的简单方法。
实施例2DON对猪胃肠道体内自发的运动行为的影响肠的P2X嘌呤受体的涉及。
本实施例证明单端孢霉烯DON通过在外周神经系统的位点上起作用而影响消化道活动性，并且，可通过以高亲和力与消化道组织上的P2X1嘌呤受体结合的P2X1嘌呤受体脱敏激动剂α，β-亚甲基ATP抵消DON的这种影响。这种嘌呤能ATP类似物的强烈结合不仅使源自DON的消化道活动性的P2X1嘌呤受体调节脱敏化，而且还能作为P2X1嘌呤受体拮抗剂有效地中断消化道活动性的调节途径。
将断奶1周的雄性Yorkshire猪(10-15kg活重)禁食12小时过夜，可饮水。在进行外科手术的当天早晨，肌肉内注射Ketamine(氯胺酮)8mg/kg，使其镇静。Ketamine是一种分离性的麻醉剂，它使血压和骨骼紧张性增加，气管僵硬。全身处于镇静状态使动物缺乏对环境的意识。但是，唾液分泌物增加，因此，导气管阻塞是危险的；但不能使用阿托品。通过面罩使用氟烷-氧气混合物产生麻醉。用1-2剂利多卡因气溶胶(10mg/剂，Xylocain，Sigma)进行局部的咽部麻醉。然后将管子插入动物体中，通过关闭的非重呼吸回路用氟烷(3-4％)在氧气(200ml/分钟)中的混合物实现外科水平的麻醉。将导管插入耳表层小静脉以进行电解质替换(0.9％盐水)以及静脉内药物的注射。同样也在股动脉插入导管，用于动脉内药物注射。将PE 205管逆向插入，这样将管的针头放在上部肠系膜动脉的水平上。使用与在线IBM数据采集系统连接的压力传感器(P23ID，Durham，Statham，OH，USA)通过此动脉导管监测血压。然后对该动物进行剖腹术。如实施例1所述，使用VetBond胶将箔压力传感器(Showa型N11，Durham Intrusments，Pickering，ON)粘附在胃肠道的绒膜上。将一个压力传感器放在胃窦上(离幽门5-10cm)，将另一个传感器放在近端十二指肠的反肠系膜边界上(离盲肠2-10cm)，将最后一个传感器连接到回肠末端的绒膜上(离盲肠2-10cm)。3个箔压力传感器的取向与纵向肌肉的轴平行。从压力传感器延伸出来的导线经由接口盒连接到IBM数据采集系统上。外科手术结束后，将猪翻身，使用1-2％氟烷维持轻水平的麻醉，以进行剩余的实验。
同时使用数据采集软件(AD1000模拟数字转化卡，Real Time Devices Inc.，Dr.Frank Johnson，Institute of Medical Engineering，University of Ottawa)和IBM兼容机连续记录从所有的箔压力传感器上得到的运动行为。根据其满足两组(收缩和松弛)六个数值参数的能力选择合格的反应。这些数值定义了在使用者对记录的可视的检查的基础上有效地标记运动行为的阈值持续时间和最大参数。使用者能在2分钟的时间段内连续监测这些参数，并视需要将其调整为具有95-100％精度的有效标记运动反应。数据采集软件输出频率、振幅、面积、达到峰值的时间以及收缩与松弛运动行为的持续时间。
使用Statgraphics Plus5.0软件(Statistical Graphics Corp.)，用具有Tukey多分析实验的单向ANOVA比较平均值。认为小于0.05的概率(p＜0.05)是显著的。所有的值都以实验的平均值±标准偏差表示。
将在体内和离体实验中使用到的所有药物(包括DON)都溶解在生理盐水中(0.9％)。注射浓度是(注射速率为0.5ml/分钟)α，β-亚甲基三磷酸腺苷(α，β-亚甲基ATP，300mg/kg)、N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10mg/kg)、谷尼色创(80mg/kg)、血安定(5×10-5M)和六甲双铵(18mg/kg，s.c.)。α，β-亚甲基ATP从RBI(Natick，MA)购得；DON由Mr.Dave Miller(Agriculture Canada，Ottawa，ON)提供，它是根据Miller等人所述的方法〔Can.J.Microbiol.，291171-1178(1983)；Miller和Blackwell，Can.J.Bot.，641-5(1986)；Miller和Arnison，Can.J.Plant Path.，8147-150(1986)〕生物合成并纯化的；其余所有的药物从Sigma ChemicalCompany(Toronto，ON)购得。
胃肠道自发的运动行为胃胃窦中的运动行为一般由振动性收缩和松弛组成。这些行为以对照记录的完整期间呈现，或者随机发生。在胃记录中与MMC类似的运动模式不明显。表1中列出了自发的运动行为的总结。
十二指肠自发的运动行为由不规则的收缩和/或松弛运动行为组成(表1)。有时，由阶段III扩散类型行为(“组合”行为)和静止阶段组成的MMC的行为回忆是明显的。“组合”行为的持续时间大约是5分钟，但不能准确测定循环长度，因为在我们的实验中仅持续2小时的控制期间中的“组合”行为出现的次数不超过2或3次。已知在禁食猪中的MMC的循环长度为70-115分钟。在我们的猪中，“组合”行为由相对高的振幅、高频率的松弛和收缩组成收缩的频率为11.9±0.5事件/分钟，收缩的振幅为0.08±0.01g；松弛的频率为12.9±0.8事件/分钟，松弛的振幅为0.07±0.01g。
回肠回肠通常具有随机的收缩和/或松弛运动行为(表1)。很少观察到MMC样的行为。在1/3的猪中，回肠的运动行为是静止状态，但是在这些实验中，回肠被证明是对DON处理作出响应。
表1.麻醉猪中的自发的消化间运动行为的特征
数值表示得自12头猪的数据的平均值±标准偏差。
以0.1mg/kg(n＝3)、0.7mg/kg(n＝2)和1.0mg/kg(n＝10)的量经由静脉内(i.v.)或动脉内(i.a.)给予DON。注射后5分钟内，DON(n＝6)降低了自发的收缩和松弛运动行为的频率和振幅(p＜0.05)。此DON诱导的抑制作用的持续时间从10分钟到不定的时间。相反，在3头猪中，DON增加了(p＜0.05)自发的运动行为的频率和振幅，分别为182±40％和206±38％；在恢复到对照模式前这种影响持续达30分钟。DON这种不同的作用并不与注射的剂量或给予的途径明显有关。此外，注射剂量与给药途径都没有导致平均动脉血压的任何改变，该值在对照的持续期和DON处理期都维持为稳定的水平。
DON的影响在十二指肠中更为一致(n＝21)，在那它总是强化自发的运动行为(p＜0.05)。全身性给予大于或等于1mg/kg的DON一致地引起显著的强化作用；该剂量还代表增加十二指肠运动行为的频率以及振幅的剂量。在整个实验过程中，DON诱导的机能亢奋的频率通常持续升高，而运动反应的振幅逐渐恢复到对照的水平。
用0.1mg/kg(n＝3)、1.0mg/kg(n＝12)和10mg/kg(n＝3)的剂量检测DON对收缩和松弛运动行为的频率和振幅参数的剂量影响。仅运动行为的振幅的剂量反应影响是明显的。另外，由于DON为10mg/kg而提高的运动行为与1mg/kg的DON的影响没有显著差别。
全身性给予DON引起回肠运动行为中的剂量依赖性的增加。以0.1mg/kg(n＝3)、0.7mg/kg(n＝3)、1.0mg/kg(n＝12)和10mg/kg(n＝4)的剂量给予DON。在回肠中，剂量反应影响在运动行为的频率和振幅参数中都是明显的。但是，DON的最大影响出现在等于或大于1mg/kg的剂量，在此剂量，自发的运动行为的收缩和松弛的频率以及振幅都显著地增加(p＜0.05)。DON提高行为30-60分钟后，当前的运动行为的频率和振幅开始下降，但是，在最初注射DON后的2个小时，运动行为仍显著高于对照。
α，β-亚甲基ATP对DON诱导的机能亢奋的影响总是在DON诱导的机能亢奋期间给予α，β-亚甲基ATP。这给DON作用提供了内在的对照。以300μg/kg的剂量动脉内给予α，β-亚甲基ATP，仅仅引起平均动脉血压的短暂增加(少于1分钟)。
给予α，β-亚甲基ATP(300μg/kg，i.a.)总是引起胃中原始的松弛反应，但是，它没有抵消DON对胃运动行为的影响。
注射后，α，β-亚甲基ATP(175μg/kg，i.a.)通常引起十二指肠小的时相性的松弛。但是，DON诱导的机能亢奋并没有出现被影响的迹象。较高剂量的α，β-亚甲基ATP(300μg/kg，i.a.)更一致地引起原始的时相性松弛(0.5±0.1g，n＝10)，接着在DON诱导的机能亢奋中出现短暂的降低(3-10分钟)。α，β-亚甲基ATP显著地减低了DON诱导的松弛和收缩的振幅而不是频率(见图8)。当在最初注射后10-20分钟内再给予α，β-亚甲基ATP(300μg/kg，i.a.)时，十二指肠又松弛。但是，这时没有表现出对DON诱导的机能亢奋的进一步影响。
在回肠中观察到类似的结果，在那里在注射后α，β-亚甲基ATP(300μg/kg，i.a)引起大的时相性松弛(1.2±0.2g，n＝6)，并减少了DON诱导的机能亢奋。α，β-亚甲基ATP诱导的回肠中DON诱导的松弛和收缩的振幅以及频率的效力由图9表示。在这三个试验中，在最初给药后的10分钟内再给予α，β-亚甲基ATP(300μg/kg)，以测试快速减敏的产生。α，β-亚甲基ATP诱导的松弛的振幅与最初给予该制剂相比减少了68±18％。
实施例3大鼠小肠中体内消化间运动行为的非肾上腺素能的、非胆碱能的(NANC)控制。
本实施例提供体内控制大鼠小肠的不同区域的消化间运动行为的神经途径的研究。本实施例中的数据以及上述实施例1和2中的数据都表明消化道活动性的调节是由图2和10示意图中所示的神经回路所控制。
迁移性运动复合(MMC)与肠内容物的消化间推进(如蠕动)有关，还涉及兴奋性和抑制性途径的连续的激活作用。蠕动下的神经回路由支配胃肠平滑肌的兴奋性(主要为胆碱能的)和抑制性非肾上腺素能的、非胆碱能的(NANC)运动神经元以及兴奋性和抑制性中间神经元组成〔Costa和Brookes，Am.Gastroenterol.，89S129-S137(1994)〕。但是，先前对关于控制消化间活动性的器官壁内的神经元知道很少，主要是因为在离体很难测定MMC。而且，体内MMC分析的绝大多数注意力仅放在收缩行为上。体内活动性研究(如本文所述)揭示了扩散性肠运动行为(这是MMC的特征)由收缩以及松弛的组成。
我们确定了在十二指肠和回肠的自发运动行为中胆碱能和5-HT涉及的程度，以及ATP、VIP和NO的作用。
在可饮水的情况下，将雄性Sprague-Dawley大鼠(250-350g)禁食24小时。为了进行外科手术，用2％氟烷在500ml/分钟的氧气中将大鼠麻醉，使用温度调节控制加热桌和热毯子维持大鼠的体温恒在37℃。暴露右颈动脉，插入导管，经由压力传感器(P23ID，Gould Statham，OH)监测血压。将导管插入右颈静脉，以进行静脉内药物注射。由于许多药物半衰期短以及为了避免肝的第一轮代谢，常常采用动脉内(i.a.)途径给药。为此，从右股动脉插入套管，并以逆向插入，以使针头放在上层肠系膜动脉的水平上。
如上面所述准备进行体内活动性评估的动物。使用Vet Bond胶顺序将箔压力传感器粘贴在十二指肠的非肠系膜边界上，离胃肠连接处1-2cm，位于回肠的非肠系膜边界旁，正好接近回盲肠连接处。在6只大鼠中，有2或3个箔压力传感器粘贴在离近端十二指肠2cm的地方。我们从这些实验中外推出“组合”行为扩散的速率。所有粘贴了箔压力传感器的肠的取向与肌肉层的纵向平行，因为这样提供了记录圆周运动行为最敏感的环境。允许大鼠从手术状态恢复1小时，然后在给予任何药物前再记录1小时的对照运动行为。根据渥太华大学动物护养委员会制订的加拿大动物护养理事会的指南(Canadian Council on Animal Care)进行所有的手术和实验方案。
如上面所述进行数据采集和统计分析。
所有药物都溶解在0.5ml的生理盐水(0.9％)中。其剂量是(在1分钟内注射完)α，β-亚甲基ATP(300mg/kg)、甲基-S ATP(360mg/kg)、N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10mg/kg)、血管活性肠肽(VIP，4-10mg/kg)、BRL 43694(谷尼色创，80mg/kg)、阿托品(4-6mg/kg)和六甲双铵(18mg/kg，s.c.)。α，β-亚甲基ATP和甲基-S ATP从RBI购得，谷尼色创是从Dr.R.K.Harding得到的礼物，除此之外的药物都从Sigma购得。
可容易地表示大鼠小肠中的自发运动行为的区域特异模式的特征。在十二指肠中(n＝8)，该模式由扩散性“组合”和非扩散性“组间”运动行为的再发生循环组成，其循环长度为5.4±0.4分钟。“组合”行为以收缩和/或松弛运动行为的强烈阶段(大约2-4分钟)为代表，该行为在尾部以MMC回忆的方式以3.4±0.6cm/分钟的速率扩散。“组间”行为由随机发生的低振幅、低频率松弛和/或收缩组成。
回肠的自发运动行为仅由松弛(占所有受试动物的50％)或收缩(占所有受试动物的30％)组成；在剩下的实验中，收缩和松弛运动行为一起发生。一类运动反应占优(收缩或松弛)指示平滑肌的内在的紧张状态，处于高紧张状态的组织主要是松弛行为，而处于低紧张状态的组织易于显示收缩。通常，自发的回肠松弛和收缩以相对低的频率发生，具有相对高的振幅。在10％的实验中，回肠具有可与阶段III的MMC行为相比较的高频率运动反应的周期性爆发。
ATP的取代衍生物α，β-亚甲基ATP和甲基-S ATP对P2X和P2Y嘌呤受体分别具有不同的亲和力〔Bumstock和Kennedy，Gen.Pharmacol.，16433-440(1985)〕。延长组织暴露在这些制剂中的时间之后，组织产生了快速减敏，因此以这种方式可能可以区别P2X和P2Y受体介导的反应。注射后，α，β-亚甲基ATP(300μg/kg，i.a.)引起十二指肠中的时相性松弛(1.0±0.1g，n＝5)；接着它选择性地减弱了“组合”松弛的频率和振幅(p＜0.05)，分别减弱了73±7％和48±5％。α，β-亚甲基ATP对自发的十二指肠收缩的影响是可变化的且不能被分析。
在回肠中，α，β-亚甲基ATP(300μg/kg，i.a.)引起最初的时相性松弛。用α，β-亚甲基ATP在最短时间内再刺激并没有引起别的反应，这表明产生了快速减敏。在此期间，自发的回肠松弛减弱时间达30分钟(p＜0.05，n＝8)。自发的收缩并未受到α，β-亚甲基ATP处理的影响。甲基-S ATP(360μg/kg，i.a.，n＝4)也减弱了回肠的松弛(p＜0.05)，但是，甲基-S ATP并未引起最初的时相性松弛。
L-NAME(10mg/kg，i.v.，n＝8)选择性地减弱了十二指肠的自发的“组间”松弛的频率和振幅，分别减弱了44±8％和66±1％。在回肠中，L-NAME强化了收缩(n＝6)和松弛(n＝8)运动行为。这种影响常常持续了实验的整个过程。由L-NAME强化的松弛被α，β-亚甲基ATP处理(59±12％)或甲基-S-ATP处理(70±3％)减弱(p＜0.05，n＝4-6)。
“组合”和“组间”运动行为以及回肠的运动行为的自发的收缩和松弛都被烟碱受体拮抗剂六甲双铵减弱，时间达到20分钟(p＜0.05，n＝4)。L-NAME提高的行为也被六甲双铵减弱(p＜0.05，n＝6)。阿托品(4-6mg/kg，i.a.，n＝4)分别将自发的回肠收缩减弱了87±3％和89±7％。十二指肠收缩也受到类似影响。
VIP(4-10μg/kg，i.a)引起十二指肠中的时相性松弛(n＝8)。接着，VIP短暂抑制(p＜0.05)了十二指肠“组间”运动行为，强化(p＜0.05)了“组合”行为。在回肠中，VIP一致地仅引起缓慢的收缩，该收缩在6分钟内恢复到对照水平。伴随着这种收缩，自发的(n＝4)松弛和L-NAME提高的(n＝6)松弛被减弱(p＜0.05)，时间达到8分钟。自发松弛的频率和振幅分别被减到对照的33±8％和21±5％。L-NAME诱导的松弛的频率和振幅分别被减到对照的32±12％和14±3％。
谷尼色创(80μg/kg，i.v.或i.a.)在5分钟内，减弱了(p＜0.05)自发的十二指肠“组合”松弛(n＝9)和收缩(n＝4)，但并未影响“组间”运动行为。“组合”运动行为被减弱的时间达40分钟，接着，消化间活动性的对照模式逐渐恢复。谷尼色创处理还减弱了(p＜0.05，n＝4)自发的回肠收缩和松弛。在约60分钟内回肠的消化间运动模式逐渐恢复到对照水平。在谷尼色创的存在下，L-NAME提高的回肠运动行为的振幅也被减弱了76±8％(p＜0.05，n＝6)。
组合松弛对α，β-亚甲基ATP处理敏感，而在NO合成酶抑制剂L-NAME的存在下“组间”松弛被抑制。相反，我们的结果显示NO不是自发的回肠松弛的介体。其他人的结果显示，在分离的大鼠回肠制品中，ATP引起了松弛，ATP脱敏作用减少了这些松弛〔Smits等人，Br.J.Pharmacol.，118695-703(1996)〕。在本研究中，全身性注射P2X嘌呤受体激动剂α，β-亚甲基ATP引起回肠的原始松弛。在最短的时间间隔内再给予α，β-亚甲基ATP并未引起反应，这表明产生了快速减敏。伴随着诱导产生的快速减敏，自发的回肠松弛被抑制。因此，经由P2X位点起作用的ATP是介导大鼠回肠中自发的NANC松弛的递质。
ATP具有多种肠神经功能，因为除了介导十二指肠和回肠中的P2X嘌呤受体依赖性松弛外，ATP通过P2Y嘌呤受体能刺激十二指肠中NO介导的非扩散性“组间”松弛〔Glasgow等人，Am.J.Physiol.，276(Gastrointest.Liver Physiol.，38)G889-G896(1998)〕。在本实施例中，P2Y嘌呤受体激动剂甲基-S-ATP抑制自发的回肠松弛。但是，与α，β-亚甲基ATP不同，甲基-S-ATP在注射后不引起回肠松弛。这表明P2Y嘌呤受体在平滑肌中不存在，或者在回肠的抑制性运动神经分布中没被激活。数据支持这样的观点在大鼠回肠中，P2Y嘌呤受体涉及介导嘌呤能NANC运动神经元的强抑制作用的途径的激活，该神经元以P2X嘌呤受体为靶标。P2Y嘌呤受体可存在于促进强抑制作用的一氧化氮能中间神经元上，或者存在于在此预连接输入内的其他中间神经元上。一氧化氮能和嘌呤能中间神经元还可代表相同的类群，因为ATP和NO合成酶共同位于大鼠回肠的肠肌层中〔Belai和Burnstock，Cell Tiss.Res.，278197-200(1994)〕。
在许多消化道区域中VIP是NANC抑制性递质〔Bojo等人，Eur.J.Pharmacol.，236443-448(1993)；Mule等人，J.Auton.Pharmacol.，1281-88(1992)〕。在这些实验中，VIP在大鼠十二指肠中引起短暂的松弛。接着产生的对VIP的快速减敏抑制了收缩的和松弛的“组间”行为，提高了“组合”运动行为。数据表明最初的VIP引起的松弛依赖于NO，并对VIP脱敏作用敏感。因此，VIP能中间神经元肯定是以“组间”行为的直接的运动神经分布(一氧化氮能和胆碱能运动神经元)以及“组合”行为的一氧化氮能预连接调节输入为靶标。
在这些实验中，VIP处理抑制回肠的自发的松弛。由于VIP在注射后没有引起松弛，VIP能神经元介导对回肠平滑肌的直接抑制性输入是不大可能的〔Smits等人，Br.J.Pharmacol.，118695-703(1996)〕。犬回肠的体内实验表明，VIP通过抑制性神经作用在环状肌肉运动行为的强抑制作用中起主要作用(Fox-Threlkeld等人，Peptides，121039-1045(1991)〕。数据支持VIP以十二指肠和回肠中嘌呤能抑制性运动神经分布的NO依赖性预连接调节为靶标。这些嘌呤能运动途径特异性地产生小肠的扩散运动行为。此外，VIP特异性地 抑制MMC的阶段III行为，而VIP拮抗剂启动阶段III行为(Hellstron和Ljung，Neurogastroenterol.Motil，8299-306(1996)〕。结论是VIP同时刺激大鼠回肠中嘌呤能运动神经元的兴奋性运动输入和抑制性一氧化氮能预连接输入。
所有的消化间运动复合组分依赖于迷走交感神经的完整性〔Chung等人，Am.J.Physio.，267G800-G809(1994)；Galligan等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，2381114-1125(1986)〕。控制胃肠活动性的胆碱能中间神经元通过烟碱性突触起作用，而ACh(乙酰胆碱)通过蕈毒碱性受体对平滑肌起作用。阿托品抑制小肠所有自发的收缩。从本研究中得到的结果表明，所有的十二指肠和回肠的自发的消化间运动行为被强烈地驱动着，并对烟碱性受体封阻敏感。
离体研究显示神经元驱动的5-HT刺激嘌呤能NANC松弛〔Briejer等人，Naunyn-Schmiedebergs Arch.Pharnacol.，351126-135(1995)；Briejer等人，Pharmacol.Exp.Therap.，274641-648(1995)〕和胆碱能松弛〔Briejer等人，Eur.J.Pharmacol.，308173-180(1996)〕。本研究得到的体内结果显示，5-HT3受体涉及介导十二指肠和回肠中自发的胆碱能收缩和嘌呤能松弛的运动途径。
图10是在所提议的控制大鼠十二指肠和回肠中自发运动行为的强力的和调节的途径内胆碱能、一氧化氮能、GABA能、嘌呤能和VIP能神经元素的安排的示意性简化接线图，该图还显示在该途径中P2X和P2Y受体的关键位置。当通过“肠神经程序”确定驱动回路激活兴奋性和抑制性运动途径时，立体的运动模式被引发。但是，源自抑制性中间神经元的连续驱动维持着静态的肌源性行为。这种协同的抑制作用和反抑制作用由抑制性一氧化氮能输入介导，并且它正好是这些预连接神经途径以及非常活跃的运动途径的对照，它在运动行为已存在的基线上产生了环状的(消化间)活动性模式。回肠中不存在GABA能/一氧化氮能组合途径回路。
实施例4DON和DON基的衍生物对自发的胃肠运动行为的影响。
本实施例证明DON基的衍生物以类似DON的方式引起消化道活动性的进食模式的能力。
采用在先前测试DON和记录其对消化道活动性的影响的实施例中所述的方法选择用于与DON进行可比研究的DON衍生物。DON衍生物的一个代表是3-乙酰基DON(C17H22O7)。用于研究的其他新的DON基的衍生物还包括异亚丙基DON(即3-羟基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C18H24O6，EN139491)、异亚丙基-3-乙酰基-DON(即3-乙酰氧基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C20H26O7，EN 139492)、DON碳酸酯(即3-羟基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯，C16H18O7、EN 139494)、3-乙酰基-DON碳酸酯(即3-乙酰氧基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯C18H20O8，EN 139495)、3-乙酰基DON亚苄基缩醛(即3-乙酰氧基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C24H26O8，EN 139496)和DON-苄基缩醛(即3-羟基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢菌素-8-酮，C22H24O7，EN 139497)。图3A和3B中显示了DON和这些代表性DON衍生物的化学结构。新颖的DON衍生物的合成异亚丙基DON(EN 139491)在50mg(0.168mmol)脱氧瓜萎镰毒素(DON)和70mg 2，2-二甲氧基丙烷在2.0ml、0℃的无水丙酮中的溶液中加入大约1mg的p-甲苯磺酸。搅拌反应混合液，并将其温度升至室温。用薄层层析(PLC)监测反应的进展，反应5小时后认为反应完成。蒸发掉溶剂，用2ml水和5ml乙酸乙酯分配粗产品。用2ml饱和NaHCO3洗涤有机层，接着用2ml饱和盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。蒸发溶剂，在硅胶上用6∶4的乙酸乙酯己烷混合物为洗脱液进行色谱法纯化残留物。得到38mg(67％)的白色固体。
1H NMR分析(CDCl3，300MHz)δ 6.81(m，1H)，4.45(s，1H)，4.40(m，1H，3.85(bs，2H)，3.61(d，J＝8.0Hz，1H)，2.91(d，J＝8.0Hz，1H)，1.91-2.10(m，2H)，1.99(s，3H)，1.49(s，3H)，1.26(s，3H)，0.99(s，3H)。在此光谱中不能判明OH基的峰。
质谱数据证明异亚丙基DON(EN 139491)的结构如图3A所示。
异亚丙基-3-乙酰基-DON(EN 139492)由70mg的3-乙酰基-DON和87mg的2，2-二甲氧基丙烷制备此化合物，得率为62％。在使用1∶5的乙酸乙酯∶己烷混合物作为洗脱液进行硅胶色谱法，得到白色固体。
1H NMR分析(丙酮-d6，200MHz)δ 6.67(d，J＝8.0Hz，1H)，5.09(m，1H)，4.81(m，2H)，3.85(d，J＝8.0Hz，1H)，3.51(bs，2H)，3.12(m，2H)，2.61(dd，J＝8.0Hz、16.0Hz，1H)，2.01(s，3H)，1.99(dd，J＝8.0Hz、16.0Hz)、1.82(s，3H)、1.25(s，6H)，1.15(s，3H)。
质谱数据证实异亚丙基-3-乙酰基-DON(EN 139492)的结构如图3A所示。
DON-7，15-碳酸酯(EN 139494)将三光气(5mg，0.016mmol)在1ml CH2Cl2中的溶液滴加到-78℃的10mg(0.033mmol)的DON和0.015ml吡啶在1ml无水二氯甲烷中的溶液中。将反应混合液温度升至室温，再搅拌6小时。蒸发溶剂和残留的挥发性试剂，用乙酸乙酯为洗脱液进行硅胶柱色谱法纯化残留物。得到10mg(99％)白色固体DON-7，15-碳酸。
1H NMR分析(丙酮-d6，200MHz)δ 6.71(d，J＝8.0Hz，1H)，5.49(s，1H)，4.81(d，J＝8.0，1H)，4.51(m，3H)，4.31(d，J＝16.0Hz，1H)，3.51(d，J＝4.0Hz，1H)，3.21(m，2H)，1.90-2.21(m，2H)，1.86(s，3H)。1.01(s，3H)。
质谱数据证实DON-7，15-碳酸酯(EN 139494)的结构如图3B所示。
3-乙酰基-DON-7，15-碳酸酯(EN 139495)由20mg的3-乙酰基-DON、0.023ml吡啶和10mg三光气制备此化合物。使用7∶3的乙酸乙酯∶己烷混合物作为洗脱液进行硅胶色谱法，得到白色产品。
1H NMR分析(CDCl3，300MHz)δ 6.61(d，J＝8.0Hz，1H)，5.36(m，1H)，5.29(s，1H)，4.49(d，J＝8.0Hz，1H)，4.41(d，J-16.0Hz，1H)，4.19(d，J＝16.0Hz，1H)，3.95(d，J＝4.0Hz，1H)，3.20(m，2H)，2.39(s，1H)，2.12(s，3H)，1.92(m，1H)，1.12(s，3H)。
质谱数据证实3-乙酰基-DON-7，15-碳酸酯(EN 139495)的结构如图3B所示。
7，15-亚苄基-3-乙酰基DON缩醛(EN 139496)由20mg的3-乙酰基-DON和13mg的苯甲醛二甲缩醛制备此化合物，得率为95％。用4∶6的乙酸乙酯∶己烷作为洗脱液进行硅胶色谱法纯化，得到白色固体。
1H NMR分析(CDCl3，300MHz)δ 7.45(m，5H)，6.81(d，J＝8.0Hz，1H)，5.39(s，1H)，5.10(m，1H)，4.90(s，1H)，4.35(d，J＝8.0Hz，1H)，4.31(d，J＝16.0Hz，1H)，3.81(d，J＝16.0Hz)，3.81(d，J＝16Hz，1H)，3.21(m，2H)，2.20-2.45(m，2H)，2.01(s，3H)，1.91(s，3H)，1.31(s，3H)。
质谱数据证实异亚苄基-3-乙酰基-DON(EN 139496)的结构如图3B所示。
7，15-亚苄基-DON缩醛(EN 139497)将约1mg的p-甲苯磺酸加到25mg(0.084mmol)DON和20mg(0.126mmol)苯甲醛二甲缩醛在2ml无水乙腈中的溶液中。室温搅拌混合液2小时，然后蒸发掉溶剂。将粗的残留物溶解于乙酸乙酯(5ml)中，然后用饱和的重碳酸钠溶液(2ml)洗涤，接着用水(5ml)洗涤。分离出有机层，用无水硫酸镁干燥，浓缩得到粗产品，柱色谱法(7∶3的乙酸乙酯∶己烷)纯化，得到27mg(87％)的白色固体标题化合物。
1H NMR分析(丙酮-d6，200MHz)δ 7.5(m，5H)，6.75(d，J＝8.0Hz，1H)，5.35(s，1H)，4.95(s，1H)，4.51(d，J＝8.0Hz，1H)，4.49(m，1H)，4.25(d，J＝16.0Hz，1H)，3.85(d，J＝16.0Hz，1H)，3.45(d，J＝5.0Hz，1H)，3.11(m，2H)，2.10(m，2H)，1.85(s，3H)，1.25(s，3H)。在此光谱中不能判明OH基的峰。
质谱数据证实异亚苄基-3-乙酰基-DON(EN 139497)的结构如图3B所示。
全身给予DON(10mg/kg，i.v.)，引起大鼠胃肠中消化道运动行为的典型的进食模式(见图11)。DON突然减弱了胃窦(位点S1)运动行为，并引起十二指肠(近端十二指肠位点D1)中持续的机能亢奋。在60分钟内，对照运动模式恢复。有时，单端孢霉烯诱导的机能亢奋以原始的高频率运动行为为特征，在该运动行为中虽然振幅比“组间”反应大但是它小于MMC运动行为的振幅。这种情况在图11中显示，图中这种原始时期持续3-10分钟，之后振幅增加到MMC的水平。
3-乙酰基-DON(10mg/kg体重，i.v.)引起大鼠胃肠(n＝4)中典型的进食模式运动行为。图12显示起作用的时间(1分钟)和影响持续的时间(40+4分钟)与DON的类似。图13显示静脉内给予3-乙酰基DON对大鼠胃窦(S1)和近端十二指肠(D2)中自发的运动行为的影响。在60分钟内，对照运动模式恢复。
静脉内注射EN 139491(10mg/kg体重)后的30秒钟内，在十二指肠中产生了持续的长时间(40±1.75分钟，n＝6)的机能亢奋，并且在胃窦中产生了同时且平行减弱的运动行为，这是用DON进行的实验中所观察到的典型的影响。图14显示大鼠十二指肠(D1)和胃窦(S1)中的运动行为的典型的体内记录，阐明了化合物EN139491对消化道运动行为的禁食模式的作用。记录的上面部分显示没有任何药物处理的20分钟的正常的禁食模式运动行为。在此期间，十二指肠具有典型的低频率自发活动性模式以及扩散性运动行为(MMC)模式。胃窦具有典型的规律性运动行为。记录的第二部分显示注射EN 139491时的行为。在注射后30秒内，在十二指肠中发展了持续长时间(40-60分钟)的机能亢奋，在胃窦中发展了同时且平行减弱的运动行为。该EN 139491诱导的运动行为是典型的进食模式运动行为。禁食模式运动行为的恢复显示在图14的底部记录中。图15显示化合物EN 139491对在D2位点(离D1压力传感器1.5cm)记录的十二指消化道运动行为的影响。图15中显示的在D2由EN 139491引起的进食模式的诱导和持续时间的记录与图14中显示的在位点D1记录的结果类似。
还精细(closer)分析了由EN 139491诱导的消化道运动行为的进食模式的单个的松弛和收缩行为的特征。在此分析中，在十二指肠D1位点由EN 139491诱导的MMC和进食模式的松弛或收缩行为的振幅和频率以在禁食模式的正常的“组间”行为中观察到的松弛或收缩行为各自的频率和振幅的百分数表示，将其作为各动物的内部对照。分析的结果表明由EN 139491诱导的进食模式的松弛行为的振幅(图16)和频率(图17)与那些在消化道自发的“组合”MMC行为中观察到的是可比的。同样，由EN 139491诱导的进食模式的收缩行为的振幅(图18)和频率(图19)与那些在消化道自发的“组合”MMC行为中观察到的是可比的。这些结果表明，由EN 139491诱导的进食模式的特征与由DON诱导的进食模式的特征相同。
与EN 139491的情况相同，静脉内注射DON衍生物EN 139492(10mg/kg体重)后的30秒钟内，在十二指肠位点D1和D2产生了持续长时间(48.5±2分钟，n＝6)的机能亢奋，在胃窦位点S1产生了同时且平行减弱的运动行为。图20显示了这些对体内消化道运动行为的影响的一个例子。图20显示在大鼠十二指肠D1和D2位点以及胃窦S1位点上的运动行为的典型的体内记录，阐述了EN 139492对消化道运动行为的禁食模式的作用。记录的顶部显示不存在DON或DON衍生物的情况下超过40分钟的正常禁食模式运动行为。在此期间，十二指肠具有低频率自发运动“组间”行为和扩散性“组合”运动行为(即“MMC”)的典型模式。胃窦具有典型的有节奏的运动行为。在注射后30秒钟内，在十二指肠中引发了持续长时间的机能亢奋，在胃窦中产生了同时和平行减弱的运动行为。
对由EN 139492诱导的消化道诱导行为的进食模式进行的精细分析，揭示松弛和收缩行为的频率和振幅与消化道的MMC行为的松弛和收缩行为的频率和振幅至少是可比的((数据未给)。因此，与EN 139491相同，DON衍生物EN 139492能诱导消化道运动行为的进食模式，该进食模式与DON(EN 139491和EN 139492的结构性母体)诱导的模式是可比的。
也采用与上述研究EN 139491和EN 139492的方法相同的方法测试DON衍生物DON碳酸酯(EN 139494)和3-乙酰基DON碳酸酯(EN 139495)(见图3B)，结果显示它们能以至少与那些由结构性母体DON诱导的水平诱导消化道运动行为的进食模式是可比的。静脉内注射单端孢霉烯基衍生物EN 139495(10mg/kg)引起从被氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠(n＝4)的近端十二指肠(D1)和胃窦(S1)记录得到的消化道内典型的体内进食模式运动行为。EN 139495的影响在注射后40秒内是明显的，且作用持续40-60分钟。在S1，收缩振幅和频率分别减少到对照运动行为的59±8.7％和64.25±12.0％标准偏差。胃窦松弛振幅和频率分别减到28.4±3.4％和48.0±10.5％标准偏差。在肠中(D1)，机能亢奋更强收缩振幅和频率分别增加到对照运动行为的119.0±12.0％和1598.8±421.9％标准偏差。松弛振幅和频率也分别增加到331.0±39.8％和724.4±180.75％标准偏差。
在约20％的实验中，3-乙酰基-DON和EN 139491诱导的机能亢奋并未显示快速的大振幅行为。图15显示了这种情况的一个例子。虽然存在原始高频率的运动行为，但是大振幅的运动行为还是被延迟，代之以比“组间”反应大但小于MMC运动行为的反应。当这种振幅中的“延迟”发生时，它通常持续3-10分钟。此后，诱导产生的机能亢奋的振幅增加到如图16-19所示的MMC水平。这些DON衍生物化合物最初的不同的作用并未影响到诱导产生的消化道运动行为的进食模式的持续时间。
在第一次注射后90分钟内以最短时间再使用DON或其衍生物通常不产生影响。120分钟后，DON和其衍生物又是有效的，并且能诱导消化道运动行为的进食模式。
前面所述的结果证明了DON和DON的类似衍生物3-乙酰基化的DON(据报道此化合物在所有的单端孢霉烯中毒性最低)诱导消化道运动行为的进食模式的有效性。另外，合成了两种新的DON基的衍生物(EN 139491和EN 139492)，它们能以至少与DON可比的方式诱导消化道运动行为的进食模式。所有的衍生物(以10mg/kg的剂量作为单独的1ml大丸剂静脉内测试)具有与静脉内注射单独大丸剂的DON相类似的性质在麻醉的Sprague Dawley大鼠中进行静脉内注射后的1分钟内，胃肠的自发的禁食模式变为典型的进食模式运动行为。在胃窦中，振动的运动行为被静止的模式取代；在十二指肠中，DON诱导的持续的机能亢奋代替了环状的“组合”MMC模式。这种影响持续40-60分钟，然后该自发的运动行为恢复到运动行为的禁食模式。DON及其衍生物都没有引起任何对血压、心跳速率或呼吸速率可辨别的影响。
实施例5选择性P2X1-2X3嘌呤受体拮抗剂2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯)基腺苷三磷酸(TNP-ATP)的影响。
本实施例证明存在于消化道组织的平滑肌上的P2X1嘌呤受体直接参与了调节消化道的运动行为，以及P2X1-2X3嘌呤受体拮抗剂TNP-ATP封阻P2X1嘌呤受体从而抑制由DON或DON基的衍生物诱导的消化道运动行为的进食模式的能力。
先前的实施例使用一氧化氮(NO)合成抑制剂和嘌呤受体(如一般的P2受体拮抗剂苏拉明、一般的P2X激动剂α，β-亚甲基ATP和P2Y激动剂甲基-硫醇-ATP)介导的反应的抑制剂表示了大鼠和猪胃肠的固有的运动抑制性神经分布的药理学特征。在最短的时间间隔内用这些嘌呤受体激动剂再刺激表明产生了明显的组织快速减敏，可使用这种减敏来封阻各嘌呤受体。其结果显示大鼠近端十二指肠模拟的自发运动行为中的松弛有差别地依赖于NO或ATP十二指肠“组合”MMC松弛对α，β-亚甲基ATP处理敏感，而“组间”松弛被NO合成抑制剂L-NAME抑制。另外，数据显示NO不是自发的回肠松弛的介体。这些回肠松弛依赖于ATP通过P2X嘌呤受体以类似于MMC有关的松弛的形式起作用。
先前的实施例还显示，任一运动行为的干涉都有效地阻止了DON诱导的运动行为的进食模式。在本实施例中，我们进一步研究了DON诱导的肠进食模式运动行为中产生的松弛是被P2X1嘌呤受体亚型介导的假设。这个研究使用一种新的嘌呤受体拮抗剂TNP-ATP〔Lewis等人，Br.J.Pharmacol.，1241463-1466(1998)〕，此拮抗剂已被用作离体测定P2X1和P2X3同聚体型的和P2X2/3异聚体型的嘌呤受体的作用的亚型选择性拮抗剂(全组织的IC50在μM范围内)〔Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)〕。据报道P2X3受体仅在感觉神经元上表达〔Evans和Suprenant，Semin.Neurosci.，8217-223(1996)〕。这个研究代表P2X1选择性拮抗剂TNP-ATP首次在体内使用。目标是确定P2X1受体在控制模拟胃肠的运动行为中的作用以及直接测试P2X1嘌呤受体亚型介导DON诱导的消化道机能亢奋的假设。
如上面所述在大鼠模型中体内测试4剂TNP-ATP。连续监测Sprague Dawley大鼠的血压、呼吸速率、苍白和总体的健康状况。在整个实验中TNP-ATP没有对这些参数产生明显的影响，这种结果常常持续达6小时。
TNP-ATP没有影响自发的胃运动行为(未给数据)。相反，静脉内注射单一大丸剂的TNP-ATP显著地和特异性地影响了自发的十二指肠松弛。2.5mg/kg的TNP-ATP，其作用几乎观察不到。相反，4.5和5mg/kg的量则表现为超大的剂量，其效力也不一致。有时这些较高的剂量还对消化道运动行为有一些非特异性的作用。
发现3.5mg/kg的TNP-ATP对于其作用是可再现地有效和特异的。在接下来的模型中的评估中选择此剂量进行。静脉内注射TNP-ATP(3.5mg/kg)对大鼠十二指肠(十二指肠位点D1)中自发的运动行为的影响的典型的体内记录显示在图21中。TNP-ATP在注射时没有产生任何反应。但是，在注射后1分钟内，MMC有关的松弛减少了。“组间”运动行为并未被显著地影响。TNP-ATP注射后的30分钟内MMC有关的松弛运动行为恢复到对照水平的90％以内。
静脉内注射TNP-ATP(3.5mg/kg)对DON诱导的大鼠胃和十二指肠中的进食模式运动行为的影响的体内记录显示在图22(记录十二指肠位点D1)和图23(记录十二指肠位点D2和胃窦位点S1)中。与其它所有的实验一致，TNP-ATP在注射时并未引起任何反应。但是，在注射后1分钟内，DON(10mg/kg，i.v.)的影响被显著地减少。TNP-ATP的这种抑制作用由持续约5分钟的最初显著的影响(达到80％的抑制)、接着长时间的较浅的影响(达到40％的抑制)，但是DON作用的显著拮抗作用组成。
TNP-ATP抗DON作用的能力表示在图24-27的图表中。图24-27的柱形图显示静脉内用TNP-ATP进行处理对DON诱导的近端十二指肠(D1)的松弛和收缩的影响。将TNP-ATP对DON诱导的松弛的振幅(图24)和频率(图25)的影响与设为100％的“组合”MMC和对照“组间”运动行为的松弛行为的振幅和频率相比。同样，将TNP-ATP对DON诱导的收缩的振幅(图26)和频率(图27)与“组合”MMC和对照“组间”运动行为的收缩行为的振幅和频率比较。TNP-ATP作用的一致特征是DON诱导的十二指肠机能亢奋的振幅而非频率的特异性减弱(比较图24-27中的空白柱和方格柱)。TNP-ATP对DON诱导的十二指肠中机能亢奋的松弛行为的频率的影响在给予TNP-ATP后的20秒内是明显的，松弛行为的频率的最大减弱在2分钟内发生。DON引起的机能亢奋在给予TNP-ATP的35分钟内恢复，并恢复到给予TNP-ATP前的水平的90％。
评估了选择性P2X1嘌呤受体拮抗剂TNP-ATP的效力。静脉内注射单一大丸剂的这种拮抗剂快速且特异地减弱MMC有关的松弛，这表明P2X1嘌呤受体涉及了消化道运动行为。静脉内注射单一大丸剂的TNP-ATP以剂量依赖性的方式(暂时地)减少了DON诱导的进食模式。这些结果证实使用一般的P2X受体拮抗剂得到的数据的趋势。P2X嘌呤能位点代表肠途径的高度受限的组份。该结果清除地显示，P2X1受体亚型介导了十二指肠固有的嘌呤能抑制性神经分布，封阻这些受体可代表一种抵消消化道中DON的影响的简单方法。此外，数据支持这些受体位点是发展修改进食行为的制剂的潜在靶标。
本文纳入所引用的所有的出版物作为参考。
权利要求
1.一种治疗脊椎动物肥胖症的方法，它包括给予所述动物无毒的、消化道活动调节量的单端孢霉烯或其衍生物。
2.如权利要求1所述的治疗肥胖症的方法，其特征在于，所述单端孢霉烯或其衍生物选自DON、瓜萎镰毒素、曲古希克龙、单端孢菌素、3-乙酰基DON、7-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、3，15-二乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、4-乙酰基瓜萎镰毒素(镰刀菌酮-X)、4，15-二乙酰基瓜萎镰毒素、异亚丙基DON、异亚丙基-3-乙酰基-DON、DON碳酸酯、3-乙酰基-DON碳酸酯、3-乙酰基-DON亚苄基缩醛和DON亚苄基缩醛。
3.如权利要求2所述的治疗肥胖症的方法，其特征在于，所述单端孢霉烯是DON。
4.如权利要求1所述的治疗肥胖症的方法，其特征在于，经口、肠道外、静脉内、肌肉内、动脉内给予所述单端孢霉烯。
5.如权利要求4所述的治疗肥胖症的方法，其特征在于，经口给予所述单端孢霉烯。
6.如权利要求1所述的治疗肥胖症的方法，其特征在于，所述脊椎动物选自灵长类动物、猪、牛、羊、鸟、马、猫、狗和啮齿动物。
7.如权利要求1所述的治疗肥胖症的方法，其特征在于，所述脊椎动物是人。
8.一种刺激脊椎动物消化道活动的进食模式的方法，所述方法包括给予所述动物以无毒的、消化道活动调节量的单端孢霉烯或其衍生物、单端孢霉烯类似物、或者P2X1受体的非脱敏激动剂。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单端孢霉烯或其衍生物选自DON、瓜萎镰毒素、曲古希克龙、单端孢菌素、3-乙酰基DON、7-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、3，15-二乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、4-乙酰基瓜萎镰毒素(镰刀菌酮-X)、4，15-二乙酰基瓜萎镰毒素、异亚丙基DON、异亚丙基-3-乙酰基-DON、DON碳酸酯、3-乙酰基-DON碳酸酯、3-乙酰基-DON亚苄基缩醛和DON亚苄基缩醛。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单端孢霉烯是DON。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，经口、肠道外、静脉内、肌肉内、动脉内给予所述单端孢霉烯。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，经口给予所述单端孢霉烯。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脊椎动物选自灵长类动物、猪、牛、羊、鸟、马、猫、狗和啮齿动物。
14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脊椎动物是人。
15.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述P2X1受体的非脱敏激动剂是ATP的类似物。
16.一种增加脊椎动物体重的方法，该方法包括给予所述动物以足够量的ATP类似物，抑制进食模式的消化道运动行为。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述ATP类似物是P2X1嘌呤受体的脱敏激动剂或拮抗剂。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述ATP类似物选自α，β-亚甲基ATP和2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯基)-ATP。
19.一种阻止脊椎动物进食模式的消化道运动行为的方法，该方法包括给予ATP类似物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述ATP类似物是P2X1受体的脱敏激动剂或拮抗剂。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述ATP类似物选自α，β-亚甲基ATP和TNP-ATP。
22.一种鉴定用于治疗肥胖症的化合物的方法，该方法包括确定该化合物是否能诱发进食模式的消化道运动行为。
23.如权利要求22所述的鉴定用于治疗肥胖症的化合物的方法，其特征在于，使用体外消化道器官浴试验、离体消化道器官试验或体内消化道器官运动活性试验检测所述化合物诱发进食模式的消化道运动活性的能力。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，将由所述化合物诱发的进食模式的消化道运动行为与由DON诱发的进食模式的消化道运动行为进行比较。
25.一种诱发进食模式的消化道运动行为的药学组合物，该组合物包括(a)选自瓜萎镰毒素、4-脱氧瓜萎镰毒素、曲古希克龙、单端孢菌素、3-乙酰基瓜萎镰毒素、7-乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、3，15-二乙酰基脱氧瓜萎镰毒素、4-乙酰基瓜萎镰毒素(镰刀菌酮-X)、4，15-二乙酰基瓜萎镰毒素、3-羟基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮-7，15-碳酸酯、3-乙酰氧基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮-7，15-碳酸酯、3-乙酰氧基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮、3-羟基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮、3-羟基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮、3-乙酰氧基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮的化合物及其组合；和(b)药学上可接受的载体。
26.化合物3-羟基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮。
27.化合物3-乙酰氧基-7，15-异亚丙基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮。
28.化合物3-羟基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮-7，15碳酸酯。
29.化合物3-乙酰氧基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮-7，15-碳酸酯。
30.化合物3-乙酰氧基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮。
31.化合物3-羟基-7，15-亚苄基-12，13-环氧基-9-单端孢霉-8-酮。
全文摘要
本发明描述了调节消化道活动性和食物摄取的方法和组合物。可用这些组合物和方法治疗肥胖症或刺激体重增重。控制食物摄取的优选化合物是DON(4－乙酰基瓜萎镰毒素)及其衍生物。本发明还公开了新颖的DON衍生物。
文档编号A61P3/00GK1370066SQ00811624
公开日2002年9月18日 申请日期2000年7月6日 优先权日1999年7月6日
发明者A·克兰蒂斯, T·德斯特 申请人:En法玛有限公司