专利名称：一种天花粉蛋白突变体及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，具体涉及一种天花粉蛋白突变体(Mutant of Trichosanthin，MTCS)及制备方法。
天花粉是我国传统医学的中药，来源于葫芦科植物栝楼(Trichosanthes Kirilowii M.)的根，有二千余年医学临床应用历史。从中分离纯化的一种分子量为27KD的蛋白质称为天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，它的化学本质为一种单链的核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，能特异切除真核细胞28SrRNA上第4324位腺嘌呤，从而阻断蛋白质的合成。具有“清热解毒”作用。六十年代人们进一步研究发掘了它的“终止妊娠”的能力。60年代后期中国临床上已用于怀孕妇女的中期引产和治疗葡萄胎。1989年美国科学家发现了它能抑制人免疫缺陷病毒(HIV)在急性感染的T淋巴细胞和慢性感染的巨噬细胞中复制(见文献报道，Mcgrath MS，Hwang KM.，Caldwell SE，et al。GLQ223Aninhibitor of human immunodefienfiency virus replication in acutelyand chronically infected cells of lymphocyte and mononuclearphygocyte lineage。Proc Natl Acad Sci USA，1989，862844～2848)，并在临床上试用于艾滋病人的治疗。我们和其他学者还发现天花粉蛋白还具有一定程度抗许多其它病毒、抗白血病和抗其它肿瘤的能力(见文献报道，孔梅，柯一保，周美云等。天花粉蛋白诱发白血病细胞K562凋亡的研究。实验生物学报，1998，31(3)233～243.Zheng YT，Zhang KL，Ben KL，etal。In vitro immunotoxicity and cytotoxicity oftrichosanthin against human nomal immunocytes andleukemia-lymphoma cells。Immunopharmacology andImmunotoxicology，1995，17(1)69～79。吴裕新，项丹妮，章水平等。天花粉蛋白对胃结肠癌细胞的杀伤作用及其机制的研究。中华消化杂志。1993。13(3)263-266。)。但是，在天花粉蛋白作为引产药物应用时，中国科学家就发现了它偶尔会引起通过IgE介导的速发性过敏反应，因而每个引产妇女一生中只能注射一次，极大地限制了它的应用范围。
本发明的目的在于克服上述不足之处，研制一种过敏原性低、能反复使用的新的天花粉蛋白产品。
本发明提供了一种天花粉蛋白突变体产品(MTCS)，它是从天然天花粉蛋白的基因人工突变改造后，利用合适的表达系统得到的。
天然天花粉蛋白(TCS)是由247个氨基酸残基组成，其氨基酸序列的一级结构如下式表示ATG ATC AGAMet Ile ArgTTC TTA GTC CTC TCT TTG CTA ATT CTC ACC CTC TTC CTA ACA ACT CCT GCT GTG GAG GGC ↓Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly1GAT GTT AGC TTC CGT TTA TCA GGT GCA ACA AGC AGT TCC TAT GGA GTT TIC ATT TCA AATAsp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Va1 Phe Ile Ser Asn10 20CTG AGA AAA GCT CTT CCA AAT GAA AGG AAA CTG TAC GAT ATC CCT CTG TTA CGT TCC AGTLeu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser30 40CTT CCA GGT TCT CAA CGC TAC GCA TTG ATC CAT CTC ACA AAT TAC GCC GAT GAA ACC ATTLeu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile50 60TCA GTG GCC ATA GAC GTA ACG AAC GTC TAT ATT ATG GGA TAT CGC GCT GGC GAT ACA TCCSer Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser70 80TAT TTT TTC AAC GAG GCT TCT GCA ACA GAA GCT GCA AAA TAT GTA TIC AAA GAC CCT ATGTyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys TyrVal Phe Lys Asp Ala Met90100CGA AAA GTT ACG CTT CCA TAT TCT GGC AAT TAC GAA AGG CTT CAA ACT GCT GCA GGC AAAArg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys110120ATA AGG GAA AAT ATT CCG CTT GGA CTC CCT GCT TTG GAC AGT GCC ATT ACC ACT TTG TTTIle Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe130140TAC TAC AAC GCC AAT TCT GCT GCG TCG GCA CTT ATG GTA CTC ATT CAG TCG ACG TCT GAGTyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu150160GCT GCG AGG TAT AAA TTT ATT GAG CAA CAA ATI GGG AAG CGT GTT GAC AAA ACC TTC CTAAla Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu170180CCA AGT TTA GCA ATT ATA AGT TTG GAA AAT AGT TGG TCT GCT CTC TCC AAG CAA ATT CAGPro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln190200ATA GCG AGT ACT AAT AAT GCA CAG TTT GAA AGT CCT GTT GTG CTT ATA AAT GCT CAA AACIle Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn210220CAA CGA GTC ACG ATA ACC AAT GTT GAT GCT GGA GTT GTA ACC TCC AAC ATC GCG TTG CTGGln Arg Val Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu230240CTG AAT AGA AAC AAT ATG GCA↓GCC ATG GAT GAC GAT GTT CCT ATG ACA CAG AGC ITTLeu Asn Arg Asn Asa Met Ala Ala Met Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe247GGA TGT GGA AGT TAT GCT ATT TAGGly Cys Gly Ser Tyr Ala Ile End上式中的数字表示氨基酸序号MTCS的一级结构组成保留了天然TCS结构的绝大多数氨基酸序列。其特征之一在于天花粉蛋白质的第174位到180位、203位到226位、230位到247位计49个氨基酸残基中的任意1个或1个以上氨基酸残基的被缺失或被改造，包括极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基的互变，酸性与碱性氨基酸残基的互变，或被接上其它化学基团或在上述三段氨基酸顺序中插入一个或一个以上其它氨基酸残基等原因而引起的电荷的改变；特征之二在于羧基末端再加接两个或两个以上的非极性氨基酸或氨基酸残基。上述MTCS结构特征的出现，成为与天然TCS结构有差异的、具有优秀性能的新的天花粉蛋白突变体，它极大地降低了天花粉蛋白的过敏原性，但保留了TCS的一切生物学活性。
该产品一级结构的改变，涉及的极性氨基酸的概念是指丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天门冬氨酸(Asp)、天门冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)等十一种氨基酸。其中，Asp、Asn、Glu、Gln为酸性氨基酸，Lys、Arg、His为碱性氨基酸；非极性氨基酸的概念是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)、甲硫氨酸(Met)等九种氨基酸。
本发明的天花粉蛋白突变体产品(MTCS)的免疫学活性及药效测试结果如下一、TCS部分缺失蛋白和突变蛋白的性质为了探索一级结构与生物学活性与免疫学活性的关系，从基因水平将TCS进行改造，获得了多个氨基酸残基被改造和C末端缺失的基因，经大肠杆菌表达、纯化后分别获得了相应的多个氨基酸残基被改造和C末端缺失的蛋白质。由于TCS及其突变体是一种RNAN-醣苷酶，可使核糖体失活，从而阻断蛋白质的合成，因而经检测这些突变体和C末端有明确缺失部位的突变体的系列蛋白的生物学与免疫学活性后，结合TCS的空间结构分析，作活性区域的结构基础判断资料。RIP活性依Pehem &Jackson的方法进行；抗生育活性按我们实验室的常规方法进行，体外免疫反应用Elisa方法检测。实验结果可列表如下所示
注NTCS为天然TCS；LTCS为缺失体TCS；MTCS为突变体TCS。*RIP活性IC50(ng/ml)≤50++，＜50→≥500+，＜500→≥5000±，＞5001-；**抗生育活性％≥80++，＜80→≥30+，＜30→≥5±，＜5-；***体外免疫反应能力％≥++，＜80→≥30+，＜30→≥10±，＜10-。在M31TCS(M226-203，180-174)这个突变体中，有二个突变区域，序列174-180和序列203-226，其中可被突变或缺失的极性氨基酸残基共18个，非极性氨基酸残基共3个。这二个区域分别可有一个或一个以上(174-180)或二个或二个以上(203-226)的极性氨基酸残基被突变改造或缺失，在174-180区域还可有3个非极性氨基酸残基被缺失。
174-180区域可被突变的氨基酸的序列分布列表为原氨基酸残基及其序号 优选改造成的氨基酸残基ARG174、 Glu、Asp、GlyAsp176Lys、GlyLys177Glu、Asp、GlyThr178Gly、AlaVal175缺失Phe179缺失leu180缺失203-226区域可被突变的氨基酸的序列分布列表为原氨基酸残基及其序号 优选改造成的氨基酸残基Se203、Ser211Gly、AlaThr204、Thr224、Thr226Gly、AlaAsn205、Asn206、Asn217、Asn220Lys、GlyGln208、Gln219、Gln221Lys、GlyGlu210Lys、GlyArg222Glu、Asp、Gly230-247区域可被突变的氨基酸的序列分布列表为
优选双突变位点区域 优选双突变位点174-180 Arg174与Asp176或Lys177与Thr178203-226 Ser203与Thr204或Glu210与Thr226从上述基因缺失而获得的缺失体蛋白质(L-TCS)和基因突变获得的突变体蛋白质(M-TCS)的主要性质检测结果表明随着C末端氨基酸残基缺失程度的逐渐加大至缺失10个氨基酸残基，它们的IgG与IgE体外检测免疫活性也如同NTCS一样呈现强阳性；缺失程度加大至14个氨基酸残基后，免疫活性则有所下降，但使核糖体失活和致孕鼠中期引产的两种生物学活性尚未受到影响。直至缺失29个氨基酸残基，它的生物学活性才受到影响。按笔者以往所述，TCS的生物学活性部位在序列110至174区域，但末端氨基酸一定程度的缺失引起的空间结构的松弛变化对活性区域仍有影响，且这种氨基酸残基缺失越接近活性中心区域，失活越大，直至失去全部活性。免疫活性区域较生物学活性区域结构排列在后，比较接近羧基末端，因而较早受到氨基酸缺失的结构影响。至缺失29个氨基酸残基后，它的免疫活性已降至微弱阳性。与IgG和IgE相关的体外免疫反应降低为微弱阳性的产品、并且仍然保留着包括RIP和抗生育两种活性的蛋白质有L29TCS1-218、L46TCS1-201，并且仍然保留两种强生物学活性的有M7TCS(M180-174)和M24TCS(M226-203)两种，两种体外免疫活性为阴性而仍然保留两种强生物学活性的为M31TCS(M226-203，180-174)一种。这是一种性质尤为优秀，极大地降低了天然天花粉蛋白(NTCS)的免疫原性，也几乎无损生物学活性的新的天花粉蛋白突变体。二、M-TCS的性质检测体外失活核糖体能力、怀孕小白鼠中期引产能力、体外与IgG和IgE反应能力和在体外培养下对不同细胞的杀灭情况均为我们实验室的常规应用方法。
1.经改造后的具有优选性能的MTCS产品与天然TCS的免疫与生物学活性相比较.总结见下表NTCS MTCS失活核糖体能力(％) 100 100中期引产能力(％) 100 100肿瘤细胞毒性(K562细胞株) 100 100体外与IgE反应能力(％)100 ＜10体外与IgG反应能力(％)100 ＜10诱发大白鼠体内IgE应答情况++ 一(见3d)诱发豚鼠急性过敏情况 ++ ±(见3c)2.MTCS对不同细胞的杀灭情况总结于下表CELL LINELC50CELL LINELC50CELL LINELC50(ug/ml) (ug/ml) (ug/ml)Jar 7.0B1669.2Wish ＞1000HL60 8.1A431 77.6*HMPLC ＞1000MLT 10.0B7-325 218.8K56211.0SPCA1 257.0U93717.07404 354.8*为人正常外周血淋巴细胞，从临床采集。
从上表中可见，MTCS对K562、HL60、MLT、U937等白血病细胞和Jar人绒癌细胞的半杀灭剂量LC50＜30ug/ml，我们称LC50≤30ug/ml的细胞为最敏感的细胞群；MTCS对B16、A431、B7-325、SPCA1、7404等癌细胞的LC50＞30ug/ml以上，称它们为一般敏感型细胞群；MTCS对人外周血淋巴细胞和人羊膜细胞等正常体细胞的LC50＞1000ug/ml以上，称为非敏感型细胞群。这就清楚地明确在一定的剂量条件下，MTCS对白血病等癌细胞有强烈的杀灭作用；而对正常体细胞不敏感。这与以往对TCS的研究相一致。
3、抗人体癌症动物模型的性质。
a)药效学研究将人白血病红白细胞癌的K562细胞接种至八周令裸小鼠(nodemice)皮下，接种细胞数量为1×107数量级。接种10天后，可见肿瘤在接种部位生成，接种成功率为50％。选择肿瘤生成鼠随机分为四组，给予不同剂量的MTCS注射治疗。并以生理盐水注射鼠作为对照。在每鼠治疗剂量≤引产剂量(15nm/Kg、45nm/Kg、75nm/Kg)条件下，每四天注射一次，以四次治疗为限，均可见不同程度的抑瘤效应。各治疗组的抑瘤率分别为(40±3)％、(71±2)％和(92±4)％。选用另一种免疫双缺陷动物Scid小鼠人体动物模型，继续研究MTCS的对红白细胞癌(K562)的杀灭效应。选用九周令Scid小鼠给予K562细胞接种，接种细胞数量同裸小鼠，接种成功率为100％。在接种后第五天，随机将小鼠分为四组，其中三组为MTCS治疗组，另一组为生理盐水对照组。治疗组按高、中、低不同剂量进行注射治疗。分为150nm/kg一次注射组、75nm/kg二次治疗注射组(每周注射一次)和37nm/kg注射组(每四天注射一次)，总剂量均为150nm/kg。高、中、低三组抑瘤率分别为(43±6)％、(64±8)％、和(94±3)％、二种人体动物模型的实验结论是在引产剂量条件下，便可见明显的抑瘤效应；一半引产剂量四次注射便可见90％以上的抑瘤效果，即小剂量多次注射效果尤佳。
上述为人红白细胞白血病细胞癌的癌细胞接种至两种动物机体形成实体瘤后，MTCS的治疗效果均佳。在此两种动物模型的基础上，继续用Scid小鼠建立了一种与临床表现更为接近的人白血病的动物模型，即一种能从小白鼠血液生化指标、白血球数量的变化反映人源白血病的小鼠。实验从小鼠尾静脉注射3.75nm/kg、7.5nm/kg、和15nm/kg剂量的MTCS，用以治疗患人红白细胞癌的小鼠，经三次注射后，上述三组白血球总数恢复至正常值的小鼠分别为(25±6)％、(75±8)％和(94±3)％。即MTCS治疗液体瘤的剂量可小于实体瘤，而治疗液体瘤的效果却优于实体瘤。
b)小白鼠急性毒性的研究。
选用八周龄ICR/JCL-F1小鼠按常规急性毒性研究法，一次注射MTCS和NTCS，比较MTCS和NTCS的LD50，结果表明在同一剂量条件下，动物死亡率天然组大于突变体组，且动物死亡时间天然组早于突变体组。以七天为观察时间，它们的半致死剂量分别为LD50(NTCS)＝18.4mg/kg和LD50(MTCS)＝27.5mg/kg，因而MTCS的急性毒性明显低于NTCS，约下降了50％。
c)豚鼠体内急性过敏毒性试验。
将NTCS和MTCS分别作豚鼠体内急性过敏毒性试验。致敏用量为一次皮内注射致孕妇临床剂量的4.5倍剂量，14天后进行攻击，攻击剂量为一次耳静脉注射致孕妇流产剂量的10倍。观查动物在30分钟内的反应和死亡情况。结果NTCS组死亡动物数与试验动物总数之比为12/14；占86％，MTCS组为3/15，占20％，两者相较差异显著。即MTCS引起的豚鼠体内急性过敏程度比NTCS显著降低。
d)大鼠被动皮肤过敏试验。
按0vary，Z.S.的方法，作大鼠被动皮肤过敏(PassiveCutaneous anaphylaxis，PCA)试验。将N-TCS和M-TCS分别致敏小白鼠，14天后，分别得NTCS和MTCS的抗血清。再将两种抗血清分别注入麻醉了的大白鼠剃去毛的背部皮内，并分别用含NTCS和MTCS的伊文思蓝注射入大白鼠的尾静脉进行攻击，半小时后，拉尾致死，观查大白鼠背部皮肤蓝斑形成情况，以蓝斑直径大于0.5cm者为阳性。结果显示经N-TCS抗血清注射的大鼠背部斑块均显阳性(+)，而M-TCS抗血清注射的大鼠背部斑块均显阴性(-)。表明MTCS诱发大白鼠体内IgE应答锐减，原NTCS的阳性反应已全部消失。三、MTCS抗肿瘤机理的研究1.MTCS诱导了敏感的肿瘤细胞的凋亡。
如上面第二条第1和第2点所述，MTCS对体外培养中的白血病细胞有极强的杀灭作用，而对正常细胞影响极微。我们以MTCS对K562细胞的杀灭作用为例，经多种研究手段通过电子显微镜观察可见加药后K562细胞发生了典型的凋亡形态学改变，细胞变小，胞浆浓缩，内质网扩张，核仁消失，染色质凝聚浓缩为一个或数个团块，有时可形成新月状，许多细胞内出现空泡，最后形成有外膜包绕典型的凋亡小体。生化上抽提加药组细胞DNA，用琼脂醣凝胶电泳观察到“阶梯状”条带的出现，这是凋亡的生化指标。以及利用流式细胞仪(FACS)检测到的凋亡细胞出现的二倍体峰(即凋亡峰)，所有结果均表明TCS诱导了K562细胞的凋亡。
2.敏感细胞的细胞膜上存在着能与MTCS专一结合的蛋白组分。
用生物分子相互作用分析系统(Biomolecular InteractionAnalysis，BIA)研究，当敏感细胞的细胞膜抽提液流经生物传感片，能与固相化的MTCS结合，导致感应片上的共振变化。该变化转换为SPR信号并以RU(Resonance unite)来衡量。敏感细胞均有100至300不等的RU变化，表明MTCS与膜蛋白的大分子结合甚强。而同样处理正常细胞如人子宫羊膜细胞，则无此变化。
3.通过激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)研究，观察到MTCS可以通过受体介导形式被内吞到K562细胞胞浆内；4.通过[35S]GTPγS的结合实验，说明MTCS能激活敏感细胞膜上的G蛋白，而不敏感细胞则无此激活现象。表明在敏感细胞中引起了信号的产生和转导；5.通过激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)研究，进一步观察到外源MTCS刺激敏感细胞后，能引起细胞内钙库中游离钙离子的释放和浓度变化。
根据以上研究得出的结论为敏感细胞的细胞膜上存在着MTCS的受体，能介导MTCS进入细胞内，发挥致核糖体失活(RIP)作用；同时，MTCS还干扰了细胞的信号转导。上述双重作用导致了细胞的凋亡。这些敏感细胞极大多数是肿瘤细胞，因而MTCS治疗癌症与通常抗肿瘤药物对肿瘤细胞和正常细胞两败俱伤的杀伤机理完全不同。为MTCS作为新要代抗肿瘤药物的临床应用提供了坚实的理论基础。
本发明的另一目的是提供了上述天花粉蛋白突变体产品的制备方法，该方法包括下列步骤(1)对原TCS基因的改造天然天花粉蛋白的基因是从ATG(起始密码子)到TAG(中止密码子)共计870 bp(碱基对)，可从基因库或cDNA库筛取，或利用PCR方法吊取，也可以利用化学方法人工全合成，该基因编码了一个由289个氨基酸残基组成的前体蛋白，即它除了编码成熟的TCS(247氨基酸残基)外，在其5’端前还编码了一个由23肽组成的前导肽或信号肽、和在其3’端后还编码了一个延伸肽或尾肽(19肽)。
利用分子生物学领域工作者均已知的DNA的定点突变方法，包括单链模板法和双链模板法(即PCR法)对原始的天然TCS基因进行突变改造a.在编码成熟TCS的DNA序列的5’端前引进限制性内切酶NcoI位点(CCATGG)，也便引进了起始密码子ATG，由此同时将编码的原成熟TCS的N端前加了一个甲硫氨酸；或引进限制性内切酶NdeI位点(CATATG)，由此同时使编码的原成熟TCS的第一个氨基酸残基从天门冬氨酸改为甲硫氨酸。
在编码成熟TCS的DNA序列的3’端后引进限制性内切酶Bam HI位点(GGATCC)，由此同时引进了终止密码子。
b.对编码恰当部位氨基酸残基(174-180、203-226、230-247)的DNA序列进行改造，以及对编码247位氨基酸密码子后的延伸，以获得本发明的天花粉蛋白突变体的基因。(3)MTCS的表达将具有优秀性能的天花粉蛋白突变体的基因用NcoI(或NdeI)和Bam HI双酶切后克隆进质粒载体pET-2d(或pET-3a)，常规方法转化受体菌大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。转化子在37℃用LB培养液(含Ap，Chl)中培养过夜后，用M9ZB培养液(含Ap，Chl)在同样温度放大发酵培养至570mu的光吸收为0.8左右，加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养3小时后离心收集菌体。菌体经超声破碎后，离心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱层析分离纯化，其主峰即为MTCS产品。
本发明的产品能用于医学临床。
除包括了原天然天花粉蛋白的一切适应症外，还扩大至抗肿瘤领域，即可应用于1)抗白血病和广谱性的抗其它实体肿瘤。它的优点是能选择性地进入靶细胞，因而用量微，使用次数少。在一定的剂量范围内，对肿瘤细胞有强烈杀伤作用，而几乎不损伤正常细胞，故不良反应极微。
2)抗病毒、抗HIV，可用于艾滋病人的治疗，较天然TCS副反应少，病人可多次使用。
3)妊娠妇女的中期引产、宫外孕，可多次使用。
实施例1TCS基因的定点突变和克隆。
为方便基因操作，设计的引物有1.5’GTGCAGGCC ATG GAT GTT AGG 3’2.5’AAC AAT ATG GCA TAG GAT CCC ATG GAT GAC 3’引物1的特点是含NcoI位点(CCATGG)，同时引进起始密码子(ATG).结果在编码原成熟TCS的N端前加了一个Met；引物2的特点是含BamHI位点(GGATCC)，结果在编码成熟的TCS后引进终止密码子(TAG)。
选用Bio-Rad公司提供的Muta-Gene Phagemid in vitromutagenesis药盒，按药盒中所附的详细说明和步骤进行突变操作，最后通过DNA序列分析验证所获基因符合试验设计。该方法要求先将待突变的原始基因前体克隆进phagemid(噬菌粒)系列。我们挑选了pTZ-19U。
将上述用引物1突变好的pTZ-19U-TCS经NcoI和Bam HI在37℃水解2小时，通过低熔点琼脂醣凝胶在TAE缓冲液中电泳分离和回收长度约750bp的TCS基因片段，利用T4DNA连接酶在4℃与事先同样经NcoI和BamHI双酶解的表达型质粒pET-2d连接过夜，得到pET-2d-TCS。
实施例2pET-2d-TCS转化受体菌及其表达pET-2d-TCS用常规的方法转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。转化子在370℃用LB培养液(含Ap，Chl)中培养过夜后，再用M9ZB培养液(含Ap，Chl)在同样温度放大发酵培养至600mu的光吸收为0.8左右，加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养3小时后离心收集菌体。菌体经超声破碎后，离心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱层析。利用含50mM Tris-Hcl缓冲液的(0.1-0.4)M浓度梯度的Nacl分离纯化，其主峰即为表达的产品。
实施例3MTCS的基因克隆除根据需要，设计的引物不同外，其余操作均与上面实施例1相同。最后得到含MTCS基因的质粒pET2d-MTCS。
以MTCS(M177、203、204)为例，设计的突变引物为3.5’AAG CGT GTT GAC GAA ACC TTC CTA CCA 3’4.5’ATT CAG ATA GCG GGA GGT AAT AAT GGA CAG 3’引物3的特点是将原177位的Lys的密码子改变成Glu的密码子。由于密码子的兼并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Glu的碱基GAG替代。引物4的特点是将原203和204位的Ser和Thr的密码子改变成Gly和Gly的密码子。由于密码子的兼并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Gly的碱基如GGG GGG、GGA GGA、GGC GGC、GGT GGT等共有16种替代方式。
实施例4MTCS基因的转化和表达。
含MTCS基因的质粒pET2d-MTCS用常规的方法转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。MTCS基因的转化、表达和纯化所用的方法与上述实施例2相同。最后得到所需的突变体TCS，在本例的情况下，为MTCS(M177、203、204)。
实施例5MTCS(M177、203、204)生物学活性和免疫活性的检测。
RIP活性按文献[8]报道方法进行，兔网织红细胞裂解液为Promega产品，[3H]亮氨酸为New England Nuclear产品。抗生育活性用我们实验室常规方法进行[9]，以中期怀孕11天的ICR小鼠为模型，背部注射MTCS(M177、203、204)75n mole/kg药物剂量，48小时后断颈处死小鼠。解剖记录总胎鼠数及死亡胎鼠数(包括胎儿吸收点)，计算肽鼠死亡率。体外免疫活性用Elisa方法检测，IgG抗体和单克隆抗体IgE为我们实验室自行制备和纯化[10]。纯化方法用亲和层析柱，其中TCS-Sepharose 4B按溴化氰活化方法制备。SDS-聚丙烯胺凝胶电泳按Laemmli方法进行，电泳后用0.25％考马氏亮兰R250染色。以上各项实验结果除阴性对照外，均用NTCS为阳性对照。实验结果小结为产品 氨基酸改动点RIP活性 抗生育活性 体外免疫反体外免疫反(％) (％) 应能力IgG 应能力IgENTCS0 100 100 100 100MTCS 177，203，204100 100 ＜10 ＜10实施例6MTCS(M177、203、204)对K562细胞的杀灭效应用实验室常规的MTT方法测定MTCS(M177、203、204)对K562细胞的杀灭效应。人红白细胞型白血病K562与采自临床分离的正常人淋巴细胞，分别在含有10％灭活小牛血清的RPMI-1640培养液内、于37℃、5％CO2条件下，以2×105/ml接种细胞，并分别加入1、5、10、20、50、100ug/ml的MTCS。培养48小时后每孔加入25ulMTT(购自Sigma)(5mg/ml)，2小时后每孔加入Lysing Buffer终止反应，37℃放置过夜，用酶标仪测定各孔A570值。最后结果显示MTCS对K562的LC50为11.0ug/ml，而对正常人外周血淋巴细胞不敏感，在上述实验剂量MTCS的浓度高达1000ug/ml条件下，测不出LC50值。
权利要求
1.一种天花粉蛋白突变体产品，其特征在于该产品改变了天花粉蛋白质序列的第174位到180位、203位到226位、230位到247位计49个氨基酸残基中的任意一个或一个以上氨基酸残基的被缺失或被改造，包括极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基的互变，酸性与碱性氨基酸残基的互变，或被接上其它化学基团或在上述三段氨基酸顺序中插入一个或一个以上其它氨基酸残基等原因而引起的电荷的改变；改变之二是在羧基末端再加接两个或两个以上的非极性氨基酸或氨基酸残基，成为与天然TCS结构有差异的、具有优秀性能的新的天花粉蛋白突变体。
2.根据权利要求1所述的一种天花粉蛋白突变体，其特征在于其中所述的一级结构的改变，涉及的极性氨基酸是指丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天门冬氨酸(Asp)、天门冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)或组氨酸(His)。其中，Asp、Asn、Glu、Gln为酸性氨基酸，Lys、Arg、His为碱性氨基酸；非极性氨基酸是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(I1e)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)或甲硫氨酸(Met)。
3.一种如权利要求1所述的天花粉蛋白突变体产品的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)对原TCS基因的改造利用分子生物学领域工作者均已知的DNA的定点突变方法，包括单链模板法和双链模板法(即PCR法)对原始的天然TCS基因进行突变改造a.在编码成熟TCS的DNA序列的5’端前引进限制性内切酶NcoI位点(CCATGG)，由此引进起始密码子，同时将编码的原成熟TCS的N端前加了一个甲硫氨酸；或引进限制性内切酶NdeI位点(CATATG)，由此同时使编码的原成熟TCS的第一个氨基酸残基从天门冬氨酸改为甲硫氨酸；在编码成熟TCS的DNA序列的3’端后引进限制性内切酶Bam HI位点(GGATCC)，由此同时引进了终止密码子；b.对编码恰当部位氨基酸残基(174-180、203-226、230-247)的DNA序列进行改造，以及对编码247位氨基酸密码子后的延伸，以获得本发明的天花粉蛋白突变体的基因；(2)MTCS的表达将具有优秀性能的天花粉蛋白突变体的基因用NcoI(或Nde I)和Bam HI双酶切后克隆进质粒载体pET-2d(或pET-3a)，常规方法转化受体菌大肠杆菌BL 21(DE3，plysS)，转化子在37℃用LB培养液(含Ap，Chl)中培养过夜后，用M9ZB培养液(含Ap，Chl)在同样温度放大发酵培养至570mu的光吸收为0.8左右，加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养3小时后离心收集菌体，菌体经超声破碎后，离心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱层析分离纯化，其主峰即为MTCS产品。
全文摘要
本发明涉及基因工程,具体涉及一种天花粉蛋白突变体产品及制备方法。本发明的产品是从天然天花粉蛋白基因经突变改造后,通过合适的表达系统制备得到的。本发明产品极大降低了天花粉蛋白的过敏原性,生物活性好,能选择性进入靶细胞,对肿瘤细胞有强烈杀伤作用,并能抗病毒、抗HIV,也可用于妊娠妇女中期引产、宫外孕,能多次使用。
文档编号A61P15/04GK1336381SQ0110310
公开日2002年2月20日 申请日期2001年1月18日 优先权日2000年8月2日
发明者柯一保, 聂慧玲 申请人:中国科学院上海细胞生物学研究所