专利名称：利用转基因盐藻生产口服疫苗和抗菌肽等活性物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及到海洋藻类基因工程领域，即将外源目的基因转入盐藻细胞内，建立盐藻转基因体系，大量快速繁殖，生产目的基因产物，或用于分离提纯，或直接用于口服。
盐藻为一种单细胞真核藻类，属于杜氏藻科杜氏藻属，球形或椭圆形，直径7-18μm。具有2根等长的鞭毛，无细胞壁，仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜包裹，为天然原生质体[参考Borowitzka MA等，Micro-algaebiotechnology，Cambridge Uni Press，27-51(1988)]。细胞核位于细胞前部，约占整个细胞体积的1/5，具有双层核膜，核内具有一典型的核仁。内有一大型的杯状叶绿体，约占整个细胞体积的1/2，叶绿体中部有一大型淀粉核。另外，还具有线粒体、高尔基体、内质网等细胞器，线粒体的形态结构和高等动植物的相似。生长于海水中，能耐受外界盐浓度的剧烈变化，具有很强的耐盐性，可在含0.05-5mol/L NaCl的培养液中生存，在含NaCl 1-2mol/L的培养液中生长最快[参考Fisher M等，Plant Physiol，1061359-1365(1994)]。光合自养，易于培养，成本低廉。富含β-胡萝卜素和甘油，具有重要的商业价值。可进行无性和有性繁殖，无性繁殖时细胞纵裂为二，类似于原核细胞，有性繁殖为同配方式。
目前，藻类基因工程越来越受到重视，特别是海洋藻类的开发和利用。淡水藻类的资源开发已尽尾声，下一个目标不可避免的是海洋藻类。海洋中的藻类资源十分丰富，人们所能认识并利用的并不多，许多未知的藻类需要人们去开发。近年来藻类生物技术发展的主要趋势之一就是海洋藻类基因工程，通过各种转基因手段将外源目的基因转入海洋藻类细胞中，表达出外源基因产物，作为新型的生物反应器，生产紧俏价高的各种产品；同时也可以改良藻类蛋白及其他内源产物的品质，提高它们的含量。
疫苗一直是人类对付人和动物疾病的有力武器，随着各种疫苗的出现，曾经在地球上猖狂一时的流行性疾病已经得到基本控制或消声匿迹了。如在我国，乙肝一直就是一个沉重的负担，不易治愈且易通过饮食传染。不但使患者疾病缠身，甚至到后期发展成肝癌。近几年，乙肝病毒疫苗的出现带来了曙光，使易感人群得到免疫，降低了发病率。但通过传统的方法生产的疫苗价格昂贵且需复杂的医疗设备，限制了疫苗的推广。特别对于比较贫穷的国家，更是没有能力负担如此高昂的开支。因此，生产价格低廉且不需要复杂医疗设备的口服疫苗是必要的。人和动物可直接生食转疫苗基因的植物而达到预防疾病的目的。美国政府已经批准了生产3种口服疫苗，分别为脊椎灰质炎疫苗、伤寒疫苗和轮状病毒疫苗。尚处于实验阶段的有流感病毒疫苗、霍乱病毒疫苗、痢疾疫苗、产肠毒素大肠杆菌疫苗和乙肝病毒疫苗等[参考Tacket CO等，MicrobesInfect，1777-783(1999)；Rennels MB，J Pediatr，131632-638(1997)]，特别是口服乙肝疫苗的研究与开发是个热点[参考Mason HS等，Proc Natl Acad SciUSA，8911745-11749(1992)；Thanavala Y等，Proc Natl Acad Sci USA，923358-3361(1995)；Kapusta J等，FASEB J，131796-1799(1999)；Richter LJ等，NatureBiotech，181167-1171(2000)]。
采用盐藻为受体的转基因体系具有许多的优点，如盐藻没有细胞壁，有利于转化，易于外源目的基因表达产物的提取，干燥的盐藻易被人及动物消化吸收；具有2根鞭毛，可游动，培养时不需要摇床摇动；培养时只需要无机盐，不需要有机物，易于培养，成本低廉，且培养液含有高浓度的NaCl，不需要灭菌，不易污染微生物、其他杂藻和食藻动物；可进行大量、快速地繁殖；饱和盐水中，细胞逐渐变黄，最后形成休眠孢子，具有厚厚的细胞壁，有利于藻种的保存；单细胞，不存在不同组织基因的差别表达而导致的外源基因沉寂现象等。
本发明的目的是采用电激法和基因枪法等多种转基因技术将外源目的基因转入盐藻细胞内，通过抗生素或营养突变筛选，建立稳定的转基因体系，表达来自动物、植物和微生物的有用基因，用于大量快速地、低廉地生产有用的产品，分离提纯或直接用于口服，同时也可以对盐藻自身进行品种改良。
本发明的特点在于一.采用的转基因技术是很成熟的基因转化法(电激法和基因枪法)，易于操作，转化率高；二.转化细胞为天然原生质体，易于转化。三.通过抗生素或营养突变进行筛选。四.转基因盐藻可直接用于口服。
本发明主要包括以下五个方面的技术一.盐藻的培养技术；二.将外源目的基因通过电激法转入盐藻细胞内的技术；三.将外源目的基因通过基因枪法转入盐藻细胞内的技术；
四.转基因盐藻的筛选与纯化技术。
五.口服转疫苗基因盐藻表达载体的构建。
实施例1盐藻的培养技术[参考Borowitzka MA等，Micro-algae biotechnology，Cambridge Uni Press，27-51(1988)]盐藻的培养基成份为Johnsons培养液NaCl 3.0-292.2g/L，MgCl2·6H2O1.5g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，KCl 0.2g/L，CaCl20.151g/L，KNO30.5g/L，NaHCO30.043g/L，KH2PO40.035g/L，铁盐溶液10.0ml/L，微量元素溶液10.0ml/L。铁盐溶液Na2EDTA·2H2O 209.0mg/L，FeCl3·6H2O 244.0mg/L。微量元素溶液H3BO361.0mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 38.0mg/L，CuSO4·5H2O 6.0mg/L，CoCl26H2O5.1mg/L，ZnCl24.1mg/L，MnCl2·4H2O 4.1mg/L，用HCl调pH值到7.5。
固体培养Johnsons培养液加1.5％琼脂，划线培养，使盐藻长成单藻落。
液体培养挑取固体培养基中1mm左右的单藻类于20ml液体培养基中，培养温度为20-25℃，光强度为4000Lux左右，光暗比为14hr10hr。
尽管在盐藻高盐度的培养基中绝大多数菌类无法存活，但盐细菌可以生存并大量繁殖，因此，首先要将盐藻在固体培养基上划线培养，连续几次，获得无盐细菌的纯化藻落。
实施例2将外源目的基因通过电激法转入盐藻细胞内的技术取培养第5天的盐藻液体培养液，1500rpm离心8min，去上清液。用含0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇的培养液渗透处理1-2hr。1500rpm离心8min，去上清液，电激缓冲液
调盐藻密度至1×106个/ml，再加入终浓度为10μg/ml的质粒DNA[含CaMV35S或Ubil等启动子，TMVΩ等增强子，外源目的基因，NOS(胭脂碱合成酶)终止子和筛选标记基因]和25μg/ml的鲑精DNA，混合均匀，冰上放置5-10min。取0.4ml混合液放入电激小杯中，置于轰击小室，用Baekon2000型电激仪电激，电压为6.0KV，脉冲持续时间为0.05sec，脉冲次数为210，循环周期为100，电激高度为2mm。电激完，将0.4ml混合液吸入20ml液体培养基中，适宜条件下培养。整个电激过程在无菌下进行。
实施例3将外源目的基因通过基因枪法转入盐藻细胞内的技术受体细胞的准备同实施例2，渗透处理后，1500rpm离心8min，去上清液，用Johnsons培养液调盐藻细胞密度至1×106个/ml。取0.4ml铺于含抗生素的固体培养基的培养皿中央，范围为直径3cm的圆形，超净台下吹干。
微粒子弹的准备称60mg金粉于1ml70％酒精中，充分涡旋，静置15min，1500rpm离心5min。去上清液，加1ml蒸馏水，充分涡旋，1500rpm离心5min，去上清液，重复三次。将金粉转入1ml50％甘油中，制成60mg/ml的金粉悬浮液。取50μl悬浮液，按顺序加入1μg/μl质粒DNA 5μl、2.5mol/L CaCl250μl和0.1mol/L亚精胺20μl，涡旋10min，1500rpm离心5sec，去上清液。250μl100％乙醇洗一次，涡旋，1500rpm离心5min，去上清液，重复一次。最后，金粉悬浮于60μl 100％乙醇中。
取6μl包被DNA的金粉悬浮液，装备基因枪(PDS-1000型，美国Bio-Rod公司制造)，每个培养皿轰击一次，子弹与盐藻细胞之间的距离为6cm。轰击后，将培养皿于适宜条件下培养。整个轰击过程在无菌下进行。
实施例4转基因盐藻的筛选与纯化技术取0.4ml转化过的盐藻，铺于含有60μg/ml氯霉素或0.5g/L KNO3的固体培养基中，适宜培养条件下进行筛选。4周左右，若干藻落(即已转化成功的藻落)出现，挑取藻落于20ml含60μg/ml氯霉素或0.5g/L KNO3的液体培养基中培养，获得转基因盐藻。
实施例5口服转乙肝疫苗基因盐藻表达载体的构建1.通过氯霉素筛选的HBsAg(乙肝表面抗原)表达载体的构建。(1)根据HBsAg基因设计一对引物，从乙肝病毒DNA中扩增出HBsAg基因，两端分别具有限制性内切酶SmaI和SacI酶切位点，用这两种酶进行酶切，得到约681bp的片段。用SmaI和SacI双酶切质粒pUΩGUS[含Ubil启动子，TMVΩ增强子，GUS(β-葡糖苷酸酶)基因，NOS终止子和Ampr基因，Ubil启动子上游为限制性内切酶HindIII酶切位点，TMVΩ增强子和GUS基因之间为SmaI酶切位点，GUS基因和NOS终止子之间为SacI酶切位点，NOS终止子下游为限制性内切酶EcoRI酶切位点]，去掉GUS基因片段，回收约5.0kb的片段。将681bp的片段和5.0kb的片段连接起来，构建成质粒pUΩ-HBsAg。(2)先用EcoRI酶切质粒pUΩ-HBsAg，T4DNA聚合酶将粘性末端补成平端，再用HindIII酶切，回收约2.981kb的片段(为HBsAg基因的表达框)。先用限制性内切酶SphI酶切质粒p35S-CAT[含CaMV35S启动子，CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因，NOS终止子和Ampr基因，CaMV35S启动子上游为HindIII和SphI酶切位点]，S1核酸酶将粘性末端切成平端，再用HindIII酶切，切出一个切口。将2.981kb的片段插入质粒p35S-CAT中，连接酶连接，构建成通过氯霉素筛选的HBsAg表达载体pUΩ-HBsAg-CAT。转入野生型盐藻细胞内进行氯霉素筛选培养。
2.通过营养突变筛选的HBsAg表达载体的构建。用EcoRI和HindIII双酶切质粒pUΩ-HBsAg，回收约2.981kb的片段。用SphI和HindIII双酶切质粒p35S-NAR[含CaMV35S启动子，NAR(硝酸还原酶)基因，NOS终止子和Ampr基因，CaMV35S启动子上游为HindIII和SphI酶切位点]，切出一个切口。将2.981kb的片段插入质粒p35S-NAR中，连接酶连接，构建成通过营养突变筛选的HBsAg表达载体pUΩ-HBsAg-NAR。转入硝酸还原酶缺失突变的盐藻细胞内进行KNO3筛选培养。
本发明不受所述实施例5的限制，任何相类似的启动子(如NOS、Patatin、Actin和pEmu等启动子)在本发明之内，任何相类似的增强子(如TL等增强子)在本发明之内，任何相类似的筛选标记基因(如NPTII基因和Bar基因等)在本发明之内，任何疫苗基因(如CTB和LTB基因等)在本发明之内，任何来自动物、植物和微生物的外源目的基因(如防御素基因和蜘蛛丝蛋白基因等)在本发明之内。
权利要求
1.一种盐藻转基因体系，含有外源目的基因和筛选标记基因，能产生外源基因的产物。其特征在于将外源目的基因通过电激法和基因枪法等转基因方法转入盐藻细胞内，通过抗生素或营养突变等筛选出含有外源目的基因的盐藻品系，大量快速繁殖，生产目的基因产物。对转基因盐藻内的外源目的产物进行分离提纯或直接将转基因盐藻进行口服，免疫人及动物，达到预防疾病的目的。
2.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于用电激法将外源目的基因转入盐藻细胞内，并得到表达。
3.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于用基因枪法将外源目的基因转入盐藻细胞内，并得到表达。
4.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于用PEG介导法等其他常用技术将外源目的基因转入盐藻细胞内，并得到表达。
5.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于将来自人及动物的基因，如防御素基因和抗菌肽基因等转入盐藻细胞内，并得到表达。
6.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于将来自植物的基因，如种子贮藏蛋白基因等转入盐藻细胞内，并得到表达。
7.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于将来自微生物的基因，如乙肝疫苗基因等转入盐藻细胞内，并得到表达。
8.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于转入外源目的基因后，以氯霉素乙酰转移酶基因作为转基因盐藻的筛选标记，通过氯霉素筛选出转基因盐藻。
9.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于将外源目的基因转入硝酸还原酶缺失突变的盐藻细胞内，通过KNO3为氮源的培养基筛选出转基因盐藻。
10.根据权利要求1所述的转基因体系，其特征在于直接将转疫苗基因的盐藻用于口服，如口服乙肝疫苗，以达到预防疾病的目的。
全文摘要
采用电激法和基因枪法等转基因方法将外源目的基因转入盐藻细胞内,通过抗生素或营养突变等筛选,建立稳定的转基因盐藻体系,表达来自动物、植物和微生物的有用基因,用于大量快速地生产口服疫苗和抗菌肽等活性物质,同时也可以对盐藻自身进行品种改良。
文档编号A61K39/29GK1329169SQ0110999
公开日2002年1月2日 申请日期2001年3月29日 优先权日2001年3月29日
发明者孙勇如, 耿德贵, 李文彬, 王义琴, 张利明 申请人:中国科学院遗传研究所