脲酶抑制剂的制作方法

专利名称：脲酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型脲酶抑制剂和抗幽门螺杆菌剂。
也就是说，从胃壁分泌的尿素通过脲酶的水解，生成氨和二氧化碳。该氨有强的粘膜障碍作用，同时引起胃粘膜血流障碍，中和胃酸，可使幽门螺杆菌得以在强酸环境的胃内生存。另一方面，幽门螺杆菌一粘附在胃粘膜上，胃粘膜上皮细胞就产生细胞因子的一种白介素-8(IL-8)，该IL-8作用于嗜中性粒细胞，使其趋化和活化。活化的嗜中性粒细胞进行吞噬和形成胞引细胞的同时，引起活性氧的产生和脱颗粒。产生的活性氧自身就会引起粘膜障碍，同时，与胃内存在的氯通过髓过氧化酶的作用诱导生成次氯酸，另外，由前述氨转变为单氯胺，进一步引起细胞障碍。
另外，上述氨使活性氧消除剂还原谷胱甘肽减少，据认为也使活性氧的产生亢进。
对上述胃粘膜障碍等胃肠疾病的法病的防治乃至治疗，抑制幽门螺杆菌产生的脲酶活性作用的物质，即，脲酶活性抑制剂是有效的。此脲酶活性抑制剂一直被关注。作为例子，例如乙酰羟肟酸(A)、苯酰羟肟酸(B)、烟酰羟肟酸(C)等羟肟酸类；2，2’-二吡啶二硫化物、半胱氨酸、四乙基二硫化秋兰姆等二硫化物；氢醌、对硝基苯酚、对氨基苯酚等酚类。
上述羟肟酸类(A)～(C)，小桥等人在Biochem.Biophys.Acta.，65，380-383(1962)和同上，227，429-441(1971)中报道过。
二硫化物类，Norris等人在Biochem.J.，159，245-257(1976)、Todd等人在J.Biol.Chem.，266，10260-10267(1991)中报道过。
然而，这些化合物对上述的幽门螺杆菌的脲酶活性抑制作用还不十分清楚，在本领域渴望研究和开发替代这些化合物的新型有脲酶抑制作用的物质。
在继续的研究中，本发明人发现新的数种异噻唑衍生物具有优良的抑制脲酶活性的作用和抗幽门螺杆菌活性，以知识为基础，从而完成了本发明。
按照本发明，提供一种用通式(1)表示的含有异噻唑衍生物作为有效成分的脲酶抑制剂。 [式中，R1表示氢原子或氨基，R2表示氢原子、低级烷基或乙酰基，X表示碳原子或氮原子。]另外，根据本发明，提供含有通式(1)表示的异噻唑衍生物作为有效成分的抗幽门螺杆菌剂。
进一步，根据本发明的脲酶抑制剂和抗幽门螺杆菌剂，有效成分是选自异噻唑并[5，4-b]吡啶-3(2H)-酮、5-氨基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮、N-甲基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和N-乙酰-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮的至少一种。
图2表示由试验例2求出的本发明有效成分化合物的脲酶抑制活性图。
图3表示由试验例2求出的本发明有效成分化合物的抗幽门螺杆菌活性图。
发明的
具体实施例方式
本发明的脲酶抑制剂和抗幽门螺杆菌剂(以下，简称本发明药物)中，用上述通式(1)表示的化合物中R1和R2氢原子并且X是碳原子的化合物作为有效成分，即，1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮(BIT)，它是从前就已知具有抗菌活性的化合物，近年来发现，在它的3位上的羰基衍生的衍生物有抗精神病活性(F.Zini，等，Arch.Pharm.，(Weinheim)，331，219-223(1998)；N.J.Hrib，等，J.Med.Chem.，15，2308-2314(1994)；P.J.Collier，等，J.Appl.Bacteriol.，69，567-577(1990)；J.P.Yevich，等，J.Med.Chem.，29，359-369(1986)；R.Fisher，等，ArzermForsch.，14，1301-1306(1964))。作为已知的制法例如McClelland等人从2，2-二硫二苯甲酸经过酰氯而合成的方法(E.W.McClelland，等，J.Chem.Soc.，3311-3315(1926)；L.Katz，等，J.Org.Chem.，19，103-114(1954))。
然而，该环合物有脲酶活性的这一事实以前没有报告的例子，是本发明人新发现得到的知识。
以下，对本发明中包括BIT的作为有效成分的通式(1)表示的化合物及它的制法作详细的说明。
本说明书中，通式(1)中用R2表示的低级烷基，可举例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基等碳原子数为1～6的烷基。
作为本发明的有效成分，作为通式(1)表示的化合物优选例如(1)R1是氢原子的物质和(2)X是碳原子的物质。另外，作为其它优选的化合物R1是氨基，R2是氢原子，X是碳原子的物质，以及，R1和R2都是氢原子，X是氮原子的物质。
特别是作为在医药用途上适用的上述化合物，可举出以下的化合物。
·1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮·异噻唑并[5，4-b]吡啶-3(2H)-酮·5-氨基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮·N-甲基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮·N-乙酰基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮作为上述有效成分的化合物，可用例如前述公知的化合物的方法或以它为参照的方法来制备。另外，本发明人发现改良的方法与上述公知的方法比较，副反应产物减少，能以更高的收率得到目的化合物。
以下，对改良的方法中用通式(1)表示的化合物中按基团R2的种类一一进行详述。
通式(1)中，R2是氢原子的化合物如以下所示，可以经过酰基迭氮的方法制备。
以往，酰基迭氮一般用在胺、酰胺、硫酯的合成上，这些反应伴随有库尔提斯重排，选氮基是用作离去基团的(E.Jabri，等，J.Mol.Bilo.，227，934-937(1992))。然而，本发明人确立了在低温条件下，生成硫代水杨酰基迭氮，在不伴随库尔提斯重排的情况下，硫原子攻击迭氮基的氮原子，伴随氮原子的离去环化得到所希望的化合物的方法。
按照该方法，首先，第一，通式(1)中，R1＝R2＝H以及X＝C的化合物，可以按照以下制备。也就是说，以公知的硫代水杨酸为起始原料，例如在三乙胺的存在下，在吡啶中，用二苯基磷酰迭氮(DPPA)作用，得到中间体酰基迭氮，然后，室温下使该酰基迭氮发生环化反应。
这里，替代三乙基胺，可使用通常使用的各种碱。作为例子，可举如三乙胺、三丁胺等三烷基胺、吡啶、甲基吡啶、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬烯-5、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、1，8-二氮杂双环[5.4.0]癸烯-7等有机碱；氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物，碳酸钠、碳酸钾等碱金属碳酸盐，碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属碳酸氢盐等无机碱等。这些碱，以相对于起始原料化合物为1～100倍摩尔，优选1～20倍摩尔量左右的比例适当使用。
另外，替代上述吡啶，也可使用其他适当的其他溶剂。作为例子，可举苯、己烷等烃类溶剂，二乙醚、四氢呋喃等醚溶剂，氯仿、二氯甲烷等卤素类溶剂等。
再者，上述使用的DPPA可用NaN3、H4N2等其他的迭氮化物替代。应予说明，使用NaN3时，作为替代羧酸的原料可以用酰卤化物，通常使用酰氯。另外，使用H4N2时，作为替代羧酸的原料，利用它的酯类反应后，通过与亚硝酸作用，可衍生出希望得到的酰基迭氮。
上述反应中，相对于起始原料化合物DPPA，其他迭氮化物的使用比例通常适当选用为1～10倍摩尔量左右，优选1～2倍摩尔量左右。
上述反应温度一般为-10～10℃左右，优选-5～5℃左右的范围，反应通常为1～3小时左右完成。
继续上述，酰基迭氮的环化反应，通常从上述反应系不用分离、产生酰基迭氮，简单的使反应系的温度返回室温中即可实施。
第二，作为起始原料，使用2-巯基烟酸，与上述同样操作，可制备通式(1)中R1＝R2＝H以及X＝C的化合物。
第三，上述中若以4-巯基间苯二甲酸(以及对应的吡啶衍生物)为起始原料，可制备通式(1)中，R1＝NH2，和R2＝H的希望化合物。以就是说，选择性地只使上述起始原料的2个羧基的一个环化。
按照上述的环化反应后，将所得到的化合物的残留的酰基迭氮在盐酸酸性中加热，进行库尔提斯重排反应，然后，经水解得到所希望的5-氨基体。该库尔提斯重排反应，更详细的说，可以通过下述进行，将得到的酰基迭氮在适当的溶剂如苯、己烷等烃类溶剂、二乙醚、四氢呋喃等醚溶剂、氯仿、二氯甲烷等卤素溶剂中，约40～200℃左右，加热1～24小时左右。
另外，上述之后的水解反应，按照通常的做法，例如可以在盐酸、硫酸等酸性水溶液中，或氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等碱性水溶液中，在约0～100℃左右的温度下，需要1～24小时进行。
还有，前述第三种方法中，利用的起始原料之一如4-巯基间苯二甲酸可以从例如相应的4-溴化物按以下制备。
也就是说，例如用乙醇等能形成适当的烷基酯的醇类等转变为烷基酯，然后，通过与硫化钠作用，用巯基取代溴。
此反应在适当的溶剂(醇类溶剂、苯、己烷等烃类溶剂、二乙醚、四氢呋喃等醚类溶剂、氯仿、二氯甲烷等卤素溶剂、吡啶等含氮类溶剂)中，使用NaSH、KSH、LiSH、硫化氢气体等量相当于原料化合物的1～100倍摩尔左右、优选1～20倍摩尔左右，在40～200℃左右、优选80～150℃左右加热，1～24小时左右完成。
或者，通过将得到的4-巯基烷基酯水解，可制备所希望的4-巯基间苯二甲酸。该水解反应可在与前述水解反应同样的条件下进行。
进一步，用通式(1)表示的本发明的有效成分的化合物中，R2是氢原子以外的化合物可以上述酰基迭氮的方法等得到的R2是氢原子的化合物的本发明的有效成分化合物作为原料，按以下制备。
例如R2是烷基的化合物可通过将原料化合物与硫酸二烷基酯反应制备。这里，作为硫酸二烷基酯，可举硫酸二甲酯、硫酸二乙酯等相应的硫酸二烷基酯。它们通常使用原料化合物的1～20倍摩尔量左右、优选1～10倍摩尔量左右的范围。反应在碱性水溶液例如10％氢氧化钠溶液、氢氧化钾水溶液、氢氧化锂水溶液等适当的溶剂中，或在无溶剂下，0～100℃左右、优选0～40℃左右的温度下，需要进行1～24小时左右。
另外，R2是乙酰基的化合物可以通过原料化合物与醋酐发生反应可制备。该反应使用醋酐的量通常是原料化合物的1～20倍摩尔量左右、优选1～10倍摩尔量左右的范围，在吡啶等适当的溶剂中，或者在无溶剂中，0～100℃左右、优选0～40℃左右的温度下，需要进行1～24小时左右。
由各反应得到的目的化合物，按照通常的手段，可从反应体系中分离、精制。作为该分离、精制的手段，可举例如吸附色谱法、重结晶法、溶剂萃取法等。
本发明的脲酶抑制剂和抗幽门螺杆菌剂是以上述得到的异噻唑衍生物或它的制剂学允许的酸加成盐为有效成分，使用适当的制剂辅料调制成的医药剂型。
这里，酸加成盐是成盐时使用的适当的酸，例如盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸、乙二酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸等有机酸，可以按常法调制。
作为上述医药剂型，辅料，可举通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂。
作为医药剂型，根据治疗目的的不同选择各种剂型，代表的剂型可举片剂、丸剂、散剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂等。
片剂成型时，作为辅料可使用例如乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等赋形剂、水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂、干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉、昆布多糖(ラミナラン)粉末、碳酸氢钠、碳酸氢钙、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯类、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖等崩解剂、蔗糖、硬脂酸、可可脂、氢化油等崩解抑制剂、季铵盐、十二烷基硫酸钠等吸收促进剂、甘油、淀粉等保湿剂、淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体状硅酸等吸附剂、精制滑石粉、硬脂酸粉末、硼酸盐、聚乙二醇等润滑剂等。
进一步，必要时需要包衣的片剂，可制成例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶衣片、薄膜包衣片或双层片、三层片等。
制成丸剂时，作为辅料，可使用例如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、硬化植物油、高岭土、滑石粉等附形剂、阿拉伯胶粉末、黄蓍胶粉末、明胶、乙醇等粘合剂、昆布多糖、琼脂等崩解剂。
胶囊剂的制法，按照常法，通常混合上述示例的各种辅料和通式(1)的衍生物或它的医药上允许的盐，填充到硬质的明胶胶囊、硬质胶囊中。
本发明的药剂中，进一步，必要时可以使其含有着色剂、防腐剂、香料、风味剂、甜味剂等或其他的医药品。
本发明的医药制剂中应含有的有效成分的量，没有特别的限制，可从宽范围内适当选择。通常，在医药制剂总量的1～70重量％左右为好。
本发明的医药制剂的给药方法没有特别的限制，根据患者的年龄、性别及其他条件、疾病的状态等、或者根据各种剂型等适当决定。通常，口服给药为好。
本发明的医药制剂的人服用量，根据年龄、体重、症状、治疗效果、给药方法、处置时间等适当选择，通常，每日给约0.1～100mg/kg体重，分1次乃至2～数次给药为好。
另外，本发明的医药制剂，单独给药当然可以，也可以与其他的药理有效成分化合物以及含有它们的医药品，例如羟氨苄青霉素、克拉霉素等抗生素；甲硝唑、替硝唑等硝唑类抗虫剂、铋制剂或索法酮、普罗马特(プロゥノト-ル)等抗溃疡剂；奥美拉唑、兰索拉唑等质子泵抑制剂合并使用，若按此合并用药，可以更高效地除去幽门螺杆菌，更容易完全治疗慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等胃肠疾病。
实施例以下，为了对本发明更详细的说明，举本发明化合物的制备例作为参考例，然后给出以该化合物进行的试验例。
参考例11，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮[通式(1)中，R1＝R2＝H，X＝C的化合物，以下称「化合物(3)」]的制备3.1g(20mmol)硫代水杨酸的吡啶溶液40ml，于0℃下，用30分钟滴加到4.5ml(20mmmol)二苯基磷酰迭氮(DPPA)的20ml三乙胺溶液中。
将混合物在室温下搅拌6小时后，用氯仿萃取。萃取物用水洗，在无水硫酸镁上干燥，蒸馏，残渣用硅胶柱色谱法(醋酸乙酯∶己烷＝1∶3，)精制，从氯仿中重结晶，得目标化合物2.45g(收率80％)。
熔点142～144℃1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.44(1H，dt，J＝7.8，0.9Hz)，7.64(1H，dt，J＝7.8，0.9Hz)，7.89(1H，dd，J＝7.8，0.9Hz)，7.99(1H，dd，J＝7.8，0.9Hz)，11.51(1H，b)13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)δ121.8，124.4，125.0，125.1，130.4，147.7，165.1FT-IR(KBr)cm-1606，743，1316，1443，1639，2688，2920，3058FAB-MS(m/z)152(M+H)+元素分析值(以C7H5NOS计)理论值(％)C，55.61；H，3.33；N，9.26实测值(％)C，55.37；H，3.37；N，9.25参考例25-氨基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮[通式(1)中，R1＝NH2，R2＝H，X＝C的化合物，以下称「化合物(10)」]的制备(1)4-巯基间苯二甲酸的制备将10.0g(40.8mmol)4-溴间苯二甲酸溶解于10ml浓硫酸和100ml无水乙醇中。混合物煮沸回流1日，冷却至室温后，用饱和碳酸氢钠中和，氯仿萃取，萃取物用水洗，在无水硫酸镁上干燥，蒸馏。残渣溶于100ml乙醇中，向其中添加70％硫氢化钠10g(0.13mol)。
将反应混合物煮沸回流2小时，用50％盐酸调至酸性，用二乙醚萃取。将萃取物用水洗，在无水硫酸镁上干燥，蒸馏。残渣用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯∶己烷＝1∶20)精制，用己烷重结晶，得4-巯基间苯二甲酸二乙酯6.1g(58.5％)。
然后，将10g(39.3mmol)同上化合物添加至100ml 40％氢氧化钠水溶液中，煮沸回流12小时，冷却后，0℃下加50％盐酸使生成沉淀。将得到的沉淀过滤、水洗。收集沉淀，从甲醇中重结晶，得标题化合物7.61g(收率97.9％)。熔点280℃以上1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ3.17(1H，s)，7.64(1H，d，J＝8.4Hz)，7.86(1H，dd，J＝8.4，1.8Hz)，8.47(1H，d，J＝1.8Hz)13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)δ126.8，127.0，131.8，132.6，146.1，166.9，167.5FT-IR(KBr)cm-1671，761，1256，1305，1412，1598，1683，2545，2641，2830FAB-MS(m/z)199(M+H)+元素分析值(以C8H6O4S计)理论值(％)C，48.48；H，3.05实测值(％)C，48.03；H，3.08(2)5-氨基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮(化合物(10))的制备通过上述(1)得到的2.0g(10mml)化合物的20ml吡啶溶液，于0℃下，用30分钟滴加至4.5ml(20mmmol)二苯基磷酰迭氮(DPPA)的20ml三乙胺溶液中。
将混合物于室温下搅拌12小时后，缓缓加入30％盐酸50ml中。混合物煮沸回流6小时，冷却至室温后，用饱和碳酸氢钠中和，蒸馏粗产物，溶于甲醇。使得到的液体吸附于色谱用酸性活性氧化铝上，首先，用甲醇将杂质溶解分离除去，然后用20％浓氨水-甲醇(1∶4)混合液洗脱，得到纯粹的目的化合物，从甲醇中使其结晶化(收量1.24g，收率75％)。熔点230～233℃1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ5.36(1H，s)，6.96(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，6.98(1H，d，J＝1.9Hz)，7.55(1H，d，J＝8.5Hz)，10.94(1H，br)13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)δ164.5，146.4，125.36，121.1，119.4，105.9FT-IR(KBr)cm-1611，759，1270，1315，1477，1618，2678，2924，2924，3330，3432FAB-MS(m/z)16753(M+H)+元素分析值(以C7H6N2OS计)理论值(％)C，50.59；H，3.64；N，16.86实测值(％)C，50.80；H，3.73；N，16.79参考例3
异噻唑并[5，4-b]吡啶-3(2H)-酮[通式(1)中，R1＝R2＝H，X＝的化合物，以下称「化合物(11)」]的制备将3.1g(20mmol)2-巯基烟酸的40ml吡啶溶液，于0℃下，用30分钟滴于4.5ml(20mmmol)二苯基磷酰迭氮(DPPA)的20ml三乙胺溶液中。
将混合物于室温下搅拌4小时后，蒸馏反应混合物，使其吸附于色谱用碱性活性氧化铝上，首先，用甲醇将杂质溶解分离除去，然后，用10％醋酸-甲醇洗脱，得到纯粹的目的化合物，从甲醇中使其结晶化(收量2.64g，收率87％)。熔点235～237℃1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.51(1H，d，J＝4.8Hz)，7.53(1H，d，J＝5.1Hz)，8.33(1H，dd，J＝5.1，1.5Hz)，8.83(1H，dd，J＝4.8，1.5Hz)，11.93(1H，b)13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)δ118.9，120.8，133.5，153.0，163.4FT-IR(KBr)cm-1606，753，1387，1461，1674，2696，2911，3032FAB-MS(m/z)153(M+H)+元素分析值(以C6H4N2OS计)理论值(％)C，47.36；H，2.65；N，18.41实测值(％)C，47.26；H，2.68；N，18.11参考例4N-甲基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮[通式(1)中，R1＝H，R2＝CH3，X＝S的化合物，以下称化合物(12)]的制备将1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮0.5g(3.3mol)的10％氢氧化钠水溶液20ml滴入硫酸二甲酯2ml(21mmol)。将混合物煮沸回流过夜，用氯仿萃取。萃取物用10％盐酸洗净，在无水硫酸镁上干燥、蒸馏。残渣用乙酸乙酯重结晶，得到目的化合物0.47g(收率86％)。熔点43～46℃1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ3.45(3H，s)，7.41(1H，dt，J＝8.2，1.4Hz)，7.52-7.64(2H，m)，8.04(1H，dt，J＝8.0，0.5Hz)13C-NMR(75MHz，CDCl3)δ30.4，120.3，124.5，125.5，126.7，131.8，140.0，165.6FT-IR(KBr)cm-1670，745，1341，1447，1638，3449FAB-MS(m/z)166(M+H)+元素分析值(以C8H7NOS计)理论值(％)C，58.16；H，4.27；N，8.48实测值(％)C，57.48；H，4.26；N，8.38参考例5N-乙酰基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮[通式(1)中，R1＝H，R2＝CH3CO，X＝S的化合物，以下称「化合物(13)」]的制备将1g(6.6mol)1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮的20ml吡啶溶液滴入2ml(21mmol)醋酐中。将混合物室温搅拌过夜，用氯仿萃取。萃取物用饱和碳酸氢钠洗净，在无水硫酸镁上干燥、蒸馏。残渣用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶10)精制，用乙酸乙酯重结晶，得到目的化合物1.2g(收率94％)。熔点135～137℃1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ2.79(3H，s)，7.41(1H，ddd，J＝8.0，7.1，0.8Hz)，7.53(1H，dt，J＝8.0，0.8Hz)，7.71(1H，ddd，J＝8.0，7.1，1.4Hz)，8.03(1H，ddd，J＝8.0，1.4，0.8Hz)13C-NMR(75MHz，CDCl3)δ24.9，120.6，125.4，125.9，127.9，134.5，141.0，163.4，170.1FT-IR(KBr)cm-1604，737，1368，1451，1687，2931，3009，3064EI-MS(m/z)(rel.int.％)193(M+，16)，151(100)，123(5)，96(4)元素分析值(以C9H7NO2S计)理论值(％)C，55.95；H，3.65；N，7.25实测值(％)C，55.92；H，3.66；N，7.20试验例1脲酶活性抑制试验将本发明的有效成分化合物作为供试化合物(脲酶抑制剂样品)，进行以下的脲酶活性抑制试验。
也就是，使用13C-尿素作为底物，通过脲酶的酶反应按下述的13C-NMR随时测定消失的尿素量，以没有脲酶抑制剂存在下的13C-尿素的消失速度(M/sec)作为基准，算出样品存在下的同样的消失速度达到1/2时的值作为该样品的IC50。[13C-NMR装置和测定条件]装置Varian公司制GEMINI300(75MHz)采样时间1.0秒脉冲 衰减时间0.5秒扫描数8～30次探头温度20℃谱幅18102.9Hz数据点36192脉冲角度27°(供试样品的调整)直径5mm的NMR管中加入用400μl的0.1M硫酸缓冲液(pH7)500μl和DMSO100μl的混合溶剂(pH7.0)溶解的幽门螺杆菌脲酶(大塚制药株式会社，1.6U)，加入100μl乙醇溶解的各个供试化合物(脲酶抑制剂样品)后，于20℃，放置30分钟，然后在冰浴上放置10分钟。
然后，在上述NMR管中另外加入冷却到0℃的100μl的同混合溶剂溶解的13C-尿素(マストレ一ス公司制(99atom％13C)，1mg)，立即振摇混合，将反应溶剂的量调制为600μl的样品。另外，以不含供试化合物的样品作为对照品。[测定方法]将上述各样品插入探头内，于20℃的反应温度(探头的温度)，进行酶反应，从反应开始后的1分钟到4分钟每20秒、4分钟后的每1分钟用13C-NMR装置进行测定，求出底物13C-尿素的信号(165ppm)的消失速度。[结果]作为供试化合物，使用参考例1调制的化合物(BIT)得到的上述试验的结果，该BIT的IC50为5.5×10-5M。
替代幽门螺杆菌脲酶，使用市售的刀豆脲酶作为代用品，进行同一试验，结果，BIT的IC50为13.2×10-5M。
这些值与以往已知的代表性的脲酶抑制剂羟肟酸类(K.Kyoichi，等，Biochem.Biophys.Acta，65，380-383(1962)；K.Kyoichi，等，ibid，227，429-441(1971)；S.Odake，et，al.，Biol.Pharm.Bull.，17，1329-1332(1994))的值相当。从中可判断BIT有强的脲酶抑制活性。
另外，作为供试化合物使用由参考例2～5得来的各化合物，重复同一试验(使用刀豆脲酶)，求得各供试化合物的IC50值，通过它们，算出以上述BIT同值为基准的相对脲酶抑制活性。结果如

图1所示。
图1中，纵轴表示以参考例1得到的化合物(BIT)的脲酶抑制活性为1时的各供试化合物的相对脲酶抑制活性，横轴表示各供试化合物。
进一步，将反应体系的pH调整至6(使用1.04g NaH2PO4·2H2O溶解于50ml蒸馏水中调制的溶液350μl+2.39g Na2HPO4·2H2O溶解于50ml蒸馏水中调制的溶液150μl+1.04g NaHPO4·2H2O和100μl H3PO4溶解于50ml蒸馏水中调制的溶液100μl+DMSO100μl的混合溶液调制的缓冲液(pH6))，重复同一试验，结果如图2所示(是针对参考例2和3得到的化合物)。
由图1和图2可知，用参考例2～5所制备的本发明有效成分的化合物，其中的任意一种与用参考例1制备的同一有效成分的化合物相同均有优良的脲酶抑制活性。
药理试验例2抗幽门螺杆菌活性试验本发明的有效成分化合物的抗幽门螺杆菌试验通过以下的稀释法进行。
(1)菌液的调制将幽门螺杆菌ATCC43504菌株接种在培养皿中的培养基(Brucella琼脂(BECTON DIKINSON)，含有7％FBS)中，在二氧化碳气-氮气混合气体(10％-CO2，5％-O2，85％-N2，37℃)中培养2日。回收菌体后，在用Brucella肉汤(BECTON DIKINSON)的液体培养基中同样培养1日，用培养基稀释，调整至OD660nm＝0.1的菌量。
(2)供试化合物稀释系列的调制将供试化合物溶解在50％的乙醇/生理盐水中调制成1mg/ml的溶液，用相同培养基将该溶液稀释为×1～×2048的12级，制成梯度稀释系列溶液。
(3)试验方法在细胞培养板的(20μl/皿)各孔中，加入供试化合物的各阶段稀释液20μl，然后，加入Brucella培养基(含有7％FBS)160μl，最后加入菌液20μl。于37℃下，在二氧化碳气-氮气混合气体(10％-CO2，5％-O2，85％-N2)中平板培养3日，测定各皿的浊度(OD660nm)，以试验开始时的相同值为基准，算出菌抑制率(除菌率，％)。
(4)结果使用由参考例1调制的本发明的有效成分化合物所得到的结果如图3所示。图中，纵轴是除菌率(％)，横轴是供试化合物的浓度(ug/ml)，图中(1)表示使用本发明化合物的结果，接下来(2)表示使用对照化合物的结果。
对照化合物使用以往已知作为幽门螺杆菌的除菌剂甲硝唑(MN)另外，上述结果用平均±SD表示，当用本发明的有效成分化合物时，n为12，用对照化合物时n为6。
由图3可知，本发明的有效成分化合物(参考例1得到的化合物)在低浓度时比MN有更高的螺杆菌抑制率，从这点来看，也有比MN更强的抗幽门螺杆菌活性。
以上可知，本发明的有效成分化合物的任意一种都同时具有脲酶抑制活性和抗幽门螺杆菌活性。
按照本发明，提供一种对幽门螺杆菌的脲酶有良好抑制活性的化合物和以该化合物作为有效成分的脲酶抑制剂和抗幽门螺杆菌剂。本发明的药剂可有效预防和治疗由于幽门螺杆菌的脲酶引起的慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等胃肠疾病。
权利要求
1.一种脲酶抑制剂，其中，含有通式(1)表示的异噻唑衍生物作为有效成分， 式中，R1表示氢原子或氨基，R2表示氢原子、低级烷基或乙酰基，X表示碳原子或氮原子。
2.权利要求1所述的脲酶抑制剂，其中，有效成分是选自1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮、异噻唑并[5，4-b]吡啶-3-(2H)-酮、5-氨基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮、N-甲基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和N-乙酰基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮的至少一种。
3.一种抗幽门螺杆菌剂，其中，含有通式(1)表示的异噻唑衍生物作为有效成分， 式中，R1表示氢原子或氨基，R2表示氢原子、低级烷基或乙酰基，X表示碳原子或氮原子。
4.权利要求1所述的脲酶抑制剂，其中，有效成分是选自1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮、异噻唑并[5，4-b]吡啶-3-(2H)-酮、5-氨基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮、N-甲基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和N-乙酰基-1，2-苯并异噻唑-3(2H)-酮的至少一种。
全文摘要
一种脲酶阻断剂和抗幽门缠绕杆菌剂，有效成分含有一般式(1)表示的异噻唑衍生物。本药剂可有效预防和治疗由于幽门缠绕杆菌的脲酶引起的慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等的胃肠疾病。[式中，R
文档编号A61K31/437GK1422155SQ01806208
公开日2003年6月4日 申请日期2001年3月2日 优先权日2000年3月7日
发明者梶原正宏 申请人:大塚制药株式会社