专利名称：皮肤外用剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有氢醌-α-D-吡喃葡萄糖甙的皮肤局部制剂，其中所述氢醌-α-D-吡喃葡萄糖甙是通过葡萄糖与氢醌的一个羟基经α结合得到的。
皮肤局部制剂包括基本的皮肤护理品例如乳膏、乳液、香精剂(essence)、面膜(facial mask)、冷霜和和化妆基质，化妆品例如粉底、胭脂(blusher)、眼影、眼线膏和指(趾)甲油，护发产品例如香波和生发油，身体护理产品例如擦面膏(facial scrub)、体皂(bodysoap)、沐浴剂、肥皂和香料。
背景技术：
各种黑素生成抑制剂已经被用于增白皮肤(防止皮肤变黑)，并被用于防止或改善黄褐斑、雀斑和由因过量紫外光照射引起的其它皮肤问题。例如，其代表性例子可能包括氢醌、熊果甙(它是通过葡萄糖与氢醌的苯酚羟基以β结合得到的(β-熊果甙))、维生素C及其衍生物和曲酸。
然而，维生素C、氢醌和曲酸对于热和氧化不稳定，特别是在水中更不稳定，当用于皮肤局部制剂时还存在一些问题例如分解和着色。
维生素C衍生物例如L-抗坏血酸磷酸镁和β-熊果甙对热和氧化更稳定，但它们的效果不太令人满意。
发明目的本发明的目的是提供黑素生成抑制剂的皮肤局部制剂，所述制剂能够完全或部分地解决由常规黑素生成抑制剂所带来的问题。
发明概述为了解决这些问题，本发明寻找在局部制剂中稳定、比常规制剂更安全和更有效的物质，并获得如下发现(1)首先，作为满足上述目的的化合物，存在氢醌-α-D-吡喃葡萄糖甙(下文称α-熊果甙)。
(2)α-熊果甙特异性和高效地抑制人酪氨酸酶。
(3)α-熊果甙比现有的市售增白剂β-熊果甙更稳定并且更安全。
本发明的皮肤局部制剂是基于上述发现，其特征在于所述制剂含有α-熊果甙，其显示良好的抗人酪氨酸酶抑制活性。
通常把氢醌-β-D-吡喃葡萄糖甙称为熊果甙，氢醌-α-D-吡喃葡萄糖甙(如下列结构所示)的结构与上述熊果甙的结构完全不同。然而，在本发明中，为了与上述熊果甙明显区分开来，氢醌-α-D-吡喃葡萄糖甙被称为α-熊果甙，上述熊果甙被称为β-熊果甙。 例如，应用一种从细菌中获得的酶通过将氢醌进行葡萄糖甙化反应获得α-熊果甙。所述酶为α-淀粉酶，可以是第2662667号日本专利中公开的淀粉酶X-23。
酪氨酸酶对于黑素的生成起重要作用，而黑素能够引起色素沉着。许多被设计成预防雀斑和改善褐黄斑的现有增白剂和其它局部用试剂含有酪氨酸酶抑制剂。
酪氨酸酶抑制活性的强度与上述目的被达到的程度密切相关。酪氨酸酶抑制活性越强，增白效果越明显，预防雀斑和改善褐黄斑的能力越强。
通常把蘑菇产生的(Mushroom-derived)酪氨酸酶用于评估酪氨酸酶抑制活性。
按照Biochem.Biotech Biochem.，59，143(1995)记载的数据，在该常规评价系统中，α-熊果酸不显示酪氨酸酶抑制活性。
另外，第5-932号特开平(日本临时专利公开)得出结论认为α-熊果酸促进而不是抑制蘑菇酪氨酸酶活性，并且可以有效地作为晒黑剂。
按照第6-153976号特开平日本临时专利公开，其公开了α-熊果酸能够有效地抑制蘑菇酪氨酸酶。
另一方面，如同钥匙和钥匙孔一样，酶是非常有特异性的，其仅仅对特异的底物起作用。同样对于酶抑制剂也是一样的。例如，Agric.Biol.Chem.，44，1683(1980)记载了能够影响动物α-淀粉酶但不影响植物和微生物α-淀粉酶的α-淀粉酶抑制剂。如这些α-淀粉酶抑制剂所示，抑制特异性酶的物质可能并不能够抑制其它来源的其它酶。
因此，应用蘑菇酪氨酸酶评价α-熊果酸对酪氨酸酶的抑制活性已经报道了相反的结果，很明显蘑菇酪氨酸酶评估系统不能用于评估其它动物和植物酪氨酸酶的效果。
本发明者从酶化学观点注意到各个酶的特异性，如上所述，本发明者认为常规蘑菇酪氨酸酶评估系统不适合评估增白剂和其它用于人的制剂。因为增白剂和其它试剂用于到人身上，本发明者得出结论应该应用人酪氨酸酶评估α-熊果酸的抑制活性，并且应用人酪氨酸酶进行研究。
具体地说，纯化人皮肤培养细胞获得的 酪氨酸酶，将其用于评估α-熊果酸对人酪氨酸酶的抑制活性。得到的结果显示α-熊果酸显示特异性，对于人酪氨酸酶有很强的抑制效果。
基于上述发现，本发明者在志愿者中进行了临床试验以确定本发明的含有α-熊果酸的皮肤局部制剂是否显示增白(防止皮肤变黑)效果和改善褐黄斑效果。与常规抑制黑素生成的试剂相比，本发明的含α-熊果酸的皮肤局部制剂显示更好的效果。
氢醌是由常规黑素生成抑制剂β-熊果酸分解后得到的化合物，已经报道其比β-熊果酸的细胞毒性要高约400倍。
已经证实α-熊果甙比β-熊果甙更稳定，并且更不容易生成氢醌。因此，比β-熊果甙更安全。
另一方面，作为制备α-熊果甙的方法，本发明者提出一种方法应用从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(例如保藏的P-13560菌株X-23(Seikoken国立生命科学和人体研究所(National instituteof Bioscience and Human-Technology)产生的α-淀粉酶(例如淀粉酶X-23)作为酶，把α-1，4结合的葡聚糖(例如麦芽低聚糖、直链淀粉、支链淀粉和各种淀粉)用作糖供体(参见日本专利公开No.2662667)。
通过上述公开方法得到的α-熊果酸抑制人酪氨酸酶的活性，并且比常规β-熊果酸的抑制活性要强得多。如后面实施例所示，当用于人时，α-熊果酸还比β-熊果酸更安全，并且α-熊果酸在空气和水中对热和氧化作用非常稳定。当用于皮肤局部制剂时，α-熊果酸不随时间分解，并且不随时间引起色素沉着。
如上所述，α-熊果酸对人酪氨酸酶显示强效抑制活性，其对人安全，在空气和水中对热和氧化作用稳定，在皮肤局部制剂中不随时间的延长而改变。按照下面概述的方法，可以以工业大规模方式生产α-熊果酸，例如应用上述α-淀粉酶和糖供体(可溶性淀粉以便有效地在工业规模上获得α-熊果酸)。
把氢醌溶解于pH4-9、优选pH5-8的溶剂中使其为1-20％重量、优选1-15％重量，同样可溶性淀粉为1-20％重量、优选5-10％重量(其中所述溶剂为含有磷酸和乙酸等物质的水溶液)，在室温至90℃、优选30-70℃加热上述溶液，按照1-100单位、优选5-80单位的量加入上述α-淀粉酶，然后让溶液在上述温度下反应1-48小时、优选5-24小时。
所述产率可以通过下列方式增加，例如首先，加入10-50％上述量的可溶性淀粉，然后逐渐在反应过程中加入余量(例如，每1-5小时指定时间点)，或者首先加入50％上述量的可溶性淀粉，然后在反应过程中加入余量。
本发明涉及含有α-熊果酸的皮肤局部制剂，所述α-熊果酸按照上述方法得到，并具有上述特性，这些制剂包括软膏、乳膏、洗剂等，但不限于这些剂型。
本发明的皮肤局部制剂产生良好的增白效果(防止皮肤变黑)，能够有效地防止雀斑，并改善褐黄斑，其中α-熊果酸的含量为皮肤局部制剂的0.05-10％重量、优选0.05-2％重量，但α-熊果酸的这些含量决不能限定本发明。
附图简要说明
图1显示关于本发明α-熊果酸和β-熊果酸在小鼠皮肤上稳定性方面的对比试验结果。
图2显示关于本发明α-熊果酸和β-熊果酸在小鼠皮肤上稳定性方面的另一组对比试验结果。
实施例[α-熊果酸的制备]把氢醌(10％重量)和麦芽戊糖(maltpentose)(20％重量)溶解于20mM乙酸水溶液(pH5.5)中，将10mL(在下文中，“毫升”简写为“mL”，“升”简写为“L”)含有60单位α-淀粉酶(淀粉酶X-23)的酶溶液加入到10mL所得溶液中。
把得到的混合物在40℃下维持16小时，加入3倍体积量的乙酸乙酯。将混合物剧烈搅拌，室温下放置30分钟，然后收集水相部分。将上述步骤重复3次，完全除去未反应的氢醌后，减压干燥水相部分。
把获得的材料溶解于纯化的水中，让糖甙吸附于被纯化水平衡的活性碳柱上。
首先用20％的甲醇处理该柱，洗脱吸附于柱上的不反应糖。然后用100％甲醇处理柱以洗脱糖甙。
把100％的甲醇级分减压干燥，再次在纯化水中溶解，然后冷冻干燥。
通过这些步骤得到约200mg氢醌甙。
在上述情况下，糖转移率为约27％。
在反应开始6小时后，把麦芽戊糖以5％重量加入到上述的乙酸水溶液中，糖转移率增加到约40％。
制剂实施例1为了制备表1所示的组合物，把上述实施例中制备的α-熊果甙(在下文中，术语“α-熊果甙”应该一直表示该α-熊果甙)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丁酯加入到纯化水和丙二醇的混合物中，将上述混合物加热至80℃溶解。
把表1所示其它成分的混合物通过加热至80℃均匀溶解，将其逐渐加入到上述溶液中，应用均化-混合器高速乳化得到的混合物。
经乳化后，在搅拌下逐渐把混合物冷却至30℃制备软膏。
表1重量比％α-熊果甙 2.0凡士林 4.0硬脂醇 5.0液体石蜡 17.0POE(20)十六烷基醚 4.0甘油单硬脂酸酯 2.0对羟基苯甲酸甲酯 0.1对羟基苯甲酸丁酯 0.1丙二醇 5.0纯化水 平衡制剂实施例2为了制备表2所示的组合物制剂，把α-熊果甙加入到纯化水中，在70℃温度下溶解。在此温度下维持得到的溶液。
另一方面，把表2中的其它成分混合，维持70℃的温度。把上述70℃温度下的α-熊果甙和纯化水的混合物加入到维持在70℃的其它成分的混合物中，在搅拌下把所得混合物冷却制备乳膏。
表2重量比％α-熊果甙 1.0聚乙二醇异硬脂酸酯7.5十六烷醇 1.0液体石蜡 7.5肉豆蔻酸异丙酯7.5二乙二醇单乙基醚 10.5对羟基苯甲酸酯0.5丙二醇5.0纯化水平衡制剂实施例3为了制备表3中组合物，把α-熊果甙加入到纯化水中，将其在70℃温度下溶解，在该温度下维持该溶液。
另一方面，把表3中除槐树豆胶以外的其它成分混合，维持在70℃。
把上述维持在70℃的α-熊果甙和纯化水的混合物加入到维持在70℃的其它成分的混合物中。充分搅拌得到的混合物，冷却至50℃，均化，继续冷却至30℃。
把槐树豆胶加入到上述混合物中，冷却至30℃，搅拌得到的混合物，冷却后制备乳剂。
表3重量百分比α-熊果甙 0.05聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯 5.0脱水山梨糖醇单硬脂酸酯 3.0甘油单硬脂酸酯 2.0十六烷醇2.5肉豆蔻酸异丙酯 8.0对羟基苯甲酸酯 0.5丙二醇 2.0槐树豆胶2.0纯化水 平衡[皮肤局部制剂的评价实施例]评价实施例1应用人酪氨酸酶评价α-熊果甙对酪氨酸酶的抑制活性按照Funayama等记载的方法[Biosci.Biotech.Biochem.，57(10)1666-1669(1993)]，应用人酪氨酸酶代替蘑菇酪氨酸酶，评价抑制活性。应用β-熊果甙(由Nisshin Flour Milling Co.制备)作为对照。
所得结果如表4所示。
表4IC50(nM)α-熊果甙 1.0mMβ-能果甙 9.0mMIC50(nM)抑制酪氨酸酶活性50％时的测试物质浓度从表4可以清楚看出，本发明的α-熊果甙对人酪氨酸酶显示非常强的抑制活性，其IC50值为β-熊果甙的1/9。
评价实施例2按照实施例2中记载的相同方法，但应用0.5％重量含量的α-熊果甙制备本发明的乳膏，应用所述乳膏进行临床试验。所用的对照乳膏为同样的组合物，只是应用1.0％重量的β-熊果甙代替α-熊果甙。
把20例健康志愿者(6例男性和6例女性，12人的年龄均在25-55之间)分成两组。将其中的一半志愿者(3例男性和3例女性，共6例)在右臂内侧用药本发明乳膏，而另一半志愿者在同样部位用药含有β-熊果甙的对照乳膏。
每天用药3次(8小时一次)，共连续用药7天。从用药第一天开始，应用UVB光源每天一次使用药部位露置于1MED(最少红斑剂量)。
完成上述试验30天后，将试验者交叉，在右臂内侧另一个部位重复相同试验，以确保两组的均匀性。
将试验设计成双盲研究。
用肉眼比较在开始照射紫外线第14天的皮肤颜色和紫外照射前的皮肤颜色，评价皮肤变黑抑制效果。应用下列5个级别非常有效、有效、略微有效、无效和恶化。
表5显示所得结果。
表5
从表5可以清楚看出，把含有0.5％重量α-熊果甙的本发明乳膏与含有1.0％重量β-熊果甙的对照乳膏相比，前者能够更有效地防止皮肤变黑。
另外，本发明的皮肤局部制剂无副作用，表明其为良好的预防皮肤变黑的试剂。
评价实施例3应用制剂实施例1中获得的软膏进行临床试验，对照软膏为同样的组合物，但用2.0％重量的β-熊果甙代替α-熊果甙。
把患有褐黄斑的女性志愿者(26个40-65岁的女性)均匀分成两组。把本发明的软膏用药至其中一组，而把含有β-熊果甙的对照软膏用药于另一组，均用药3个月，比较这两类乳膏的抗褐黄斑效果。
经3个月连续用药后，用肉眼评价改善褐黄斑的效果，分成下列5个级别显著改善、改善、略微改善、无效和恶化。
其结果如表6所示。
表6
从表6可以清楚看出，把含有2.0％重量α-熊果甙的本发明乳膏与含有2.0％重量β-熊果甙的对照乳膏相比，前者的效果更好。
另外，本发明的软膏无副作用，表明它可以作为良好的褐黄斑改善剂。评价实施例4在酸性和碱性环境中，评价α-熊果甙相对于氢醌的稳定性。
测定酸性(pH5.5)、中性(pH6.5)和碱性(pH7.5)水溶液中的分解速率(α-熊果甙和氢醌的浓度均为0.045M，温度为37℃)。
结果如表7所示表7
*69小时后测定从表7可以清楚看出，在碱性和酸性环境中，α-熊果甙的半衰期比氢醌的半衰期要长，氢醌的半衰期仅为0.6-10.8小时，表明α-熊果甙非常稳定。
因此，可以得出结论本发明的α-熊果甙在皮肤局部制剂中应该非常稳定。
评价实施例5在下面将比较α-熊果甙和β-熊果甙在小鼠皮肤上的保持程度。
把24周龄的小鼠以颈脱位方式处死后，脱毛后剥离背部皮肤。称量0.5g和2.0g的皮肤样品，加入到含有0.037Mα-熊果甙或β-熊果甙(2.0mL，pH7.0)的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液中，在37℃温度下保温。
经19和40小时后离心样品，用HPLC测定上清液中的α-熊果酸和β-熊果酸量，以计算其残余率。
在所有4组中，每个样品一式三份进行测试(n＝3)，计算出平均残余率。
在下列条件下进行HPLC柱ODS(4.6×250mm)溶剂甲醇-水(20∶80，v/v，用磷酸调节至pH2.5)检测波长280nm流速0.5mL/分钟温度40℃图1中显示获得的结果。
从图1中可以明显看出，α-熊果甙和β-熊果甙在开始保温19小时期间基本上保持不变，但注意到所有组在开始保温40小时分解。在α-熊果甙加入到0.5g皮肤样品的试验组中，残余率为87.5％；在β-熊果甙加入到同样皮肤样品的试验组中，残余率为0％，这表明β-熊果甙完全分解。
在加入2.0g皮肤样品的试验组中，经保温40小时后，α-熊果甙显示的残余率为β-熊果甙的10倍，表明α-熊果甙远远不像β-熊果甙那样容易分解。
评价实施例6应用与评价实施例5同样的皮肤样品，评价α-熊果甙和β-熊果甙的维持性。
称重评价实施例5中获得的皮肤样品，取2.6g加入到柠檬酸钠-磷酸缓冲液溶液(5.2ml，pH7.0)中，均化。应用获得的均化物作为皮肤提取液。
把皮肤提取液与含有比例为1∶1(v/v)的0.1Mα-熊果甙或β-熊果甙(5.2ml，pH7.0)柠檬酸-磷酸钠缓冲液混合，在37℃温度下保温。
经4小时和20小时后将上述混合物离心，用HPLC测定在上清液中α-熊果甙和β-熊果甙的含量以计算出它们的残余率。
在两组中按照一式三份测试各个样品(n＝3)，计算出平均残余率。
在评价实施例5所用的条件下进行HPLC。
图2显示所获结果。
从图2可以明显看出，在开始保温4小时后，α-熊果甙和β-熊果甙均基本上保持不变。在开始保温20小时后，α-熊果甙组的残余率比β-熊果甙组的残余率高2倍以上，这些结果表明α-熊果甙比β-熊果甙更稳定。
工业实用性因此，应用含有本发明α-熊果甙的本发明皮肤局部制剂获得下列结果(1)、当应用人酪氨酸酶评价时，本发明的α-熊果甙对酪氨酸酶显示远远超过常规β-熊果甙的抑制活性，而酪氨酸酶与黑素形成密切相关，其黑化皮肤，并导致色素沉着，这表明其能够用作人皮肤的增白剂。
(2)、在健康志愿者的临床试验中，与含有常规β-熊果甙的皮肤局部制剂相比，含有本发明α-熊果甙的皮肤局部制剂显示的更好的增白效果(防止皮肤变黑)，并且显示更好的褐黄斑改善效果。没有观察到副作用，这表明安全性方面不存在问题。因此，作为皮肤增白剂和褐黄斑改善试剂，含有本发明α-熊果甙的皮肤局部制剂是有效的。
(3)、由于本发明α-熊果甙在水中稳定，其能够有效地用于局部制剂例如软膏、乳剂和乳膏。
(4)、由于本发明α-熊果甙在小鼠皮肤上的维持时间长，其能够有效地用于人的皮肤局部制剂。
权利要求
1.皮肤局部制剂，含有对人酪氨酸酶有优良抑制活性的氢醌-α-D-吡喃葡萄糖甙。
全文摘要
含有黑素生成抑制剂的外用皮肤制剂，与常规黑素生成抑制剂不同之处在于其对热和氧化高度稳定，并且不会随时间进行分解或引起色素沉着。所述制剂中含有作为黑素生成抑制剂并且对人酪氨酸酶有优良的抑制活性的氢醌－α－吡喃葡萄糖苷。
文档编号A61K8/60GK1419435SQ01807107
公开日2003年5月21日 申请日期2001年2月19日 优先权日2000年2月21日
发明者中山宏基, 冈田茂孝, 米谷俊, 西村隆久 申请人:彭特法姆股份公司, 江崎格力高株式会社