专利名称：齿梗孢霉醇提取物的制法及在抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种菌生真菌醇提取物的制备方法，具体地说涉及齿梗孢霉醇提取物的制备方法。
本发明还涉及上述醇提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
从动植物组织中可以提取获得结构独特而作用机理新颖的抗肿瘤化合物，但受资源限制很大，且易破坏自然植被，破坏生态环境。真菌具有生长速度快，不受季节限制，可以工业化生产的优点，同时，真菌培养条件容易实现人工化，这为保持生产的重现性和大规模生产提供了可能。利用发酵法从真菌中获得原料药，还具有大规模发酵生产和容易控制质量等特点。过去从真菌发酵产物中开发的抗肿瘤药多是一些多糖类化合物，它们通过提高人体免疫力来达到抗肿瘤的目的。而目前市场上其它的抗肿瘤药物在抗肿瘤的同时，大多具很大负作用或严重毒性。自然界存在的真菌种类繁多，从这些真菌的发酵产物中寻找到作用机理新颖、高效而低毒的抗肿瘤成分，是开发抗肿瘤新药的基础工作。
本发明的又一目的在于提供上述醇提取物在抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的制备方法是采用齿梗孢属齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)发酵培养，再制备醇提取物。本发明采用的真菌由野生灵芝(Ganoderma lucidum)子实体中分离得到，经培养鉴定为齿梗孢属齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)，于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为0686。
其发酵培养工艺为(1)培养基的配制采用液体发酵培养方法，培养基葡萄糖1-3％；KH2PO40.1％-0.5％；K2HPO40.08％-0.3％；MgSO40.08％-0.3％；天然物麦麸1％-5％(煮汁)或土豆10-25％(煮汁)。
(2)培养条件培养基pH4-7；三角瓶摇床培养瓶装量20-60％；转速100-120转/分钟；温度18-25℃；培养6-10天收获，以7天收获为佳。发酵罐培养接种量5-10％，其余参数同上。
醇提取物的获得(1)将上述发酵所得发酵产物，用双层尼龙布过滤得到菌丝体和发酵液两部分。
(2)菌丝体部分用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，常温下凉干或在80℃以下干燥。用甲醇、95％乙醇或丙酮等溶剂热提取，也可用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇、甲醇等溶剂超声、渗滤或浸泡提取，其中以甲醇或95％乙醇两种热提取方法最为经济有效，减压浓缩，水浴回收溶剂，得到菌丝体醇提取物。
(3)发酵液部分常压热浓缩或减压浓缩至较小体积后，加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使得溶液中含有70％-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置分层，倒出上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇如前操作，反复3-5次，收集上清液，减压浓缩，水浴挥掉溶剂，得到发酵液醇提取物。
本发明提到的比例均为重量百分比。
用上述方法获得的醇提取物的体外抑制癌细胞活性IC50分别为人BEL-7402肝癌细胞1.0μg/ml，HCT-8结肠癌细胞1.7μg/ml，SPC-A-1肺腺癌细胞4.7μg/ml，EC-109食管癌细胞5.6μg/ml，GLC-82肺腺癌细胞8.7μg/ml，均小于20μg/ml。
用上述方法获得的醇提取物的体内抑瘤活性腹腔注射50mg/kg醇提取物可显著抑制小鼠S180实体肉瘤的生长，抑瘤率为46.8％，P＜0.001，该菌菌丝体乙醇或甲醇提取物无明显毒性；该菌发酵液的乙醇提物也有相同的作用。
1、发酵培养工艺(1)培养基的配制采用液体发酵培养方法，培养基葡萄糖1-3％；KH2PO40.1％-0.5％；K2HPO40.08％-0.3％；MgSO40.08％-0.3％；天然物麦麸1％-5％(煮汁)或土豆10-25％(煮汁)。
(2)培养条件培养基pH4-7；三角瓶摇床培养瓶装量20-60％；转速100-120转/分钟；温度18-25℃；培养6-10天收获，以7天收获为佳。发酵罐培养接种量5-10％，其余参数同上。
醇提取物的获得(1)发酵所得发酵产物用双层尼龙布过滤得到菌丝体和发酵液两部分。
(2)菌丝体部分用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，常温下凉干或在80℃以下干燥后，称取干重。用甲醇、95％乙醇、丙酮等溶剂热提取，也可用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇、甲醇等溶剂超声、渗滤或浸泡提取，其中以甲醇或95％乙醇两种热提取方法最为经济有效。提取物减压浓缩后，置于搪瓷盘中，水浴挥掉溶剂，得到所需浸膏，称取浸膏重量，为菌丝体醇提取物。
(3)发酵液部分常压热浓缩或减压浓缩至较小体积后，加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使得溶液中含有70％-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置过夜，倒出上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇如前操作，反复3-5次，收集上清液后减压浓缩，浓缩物置于搪瓷盘中，水浴挥掉溶剂，得到所需浸膏，称取浸膏重量，为发酵液醇提取物。
菌丝体醇提取物的体内抑瘤活性小鼠的右腋皮下常规接种S180肉瘤细胞悬液。接种24h后，给药组小鼠腹腔注射醇提取物溶液50mg/kg，该醇提取物溶液的配制为每1mg醇提取物溶于1ml生理盐水中，对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水，连续给药8天。末次给药24h后，颈椎脱臼处死小鼠，剥离出瘤块称重，统计学处理计算抑瘤率。结果显示，腹腔注射50mg/kg醇提取物可显著抑制S180实体肉瘤的生长，抑瘤率为46.8％，P＜0.001。给药组的平均体重在实验前后无明显改变，说明该菌菌丝体醇提取物无明显毒性，参见表1。
该菌发酵液醇提取物也有相同的作用。显示出该菌菌丝体醇提取物和发酵液醇提取物在抗癌新药开发方面有较大价值，有望成为一种新的抗癌药。
表1 醇提取物对S180实体肉瘤的生长抑制作用组别 剂量 动物数 平均体重(g)平均瘤重 抑瘤率始 末始 末 (g) (％)对照组— 10 1019.6 20.12.63±0.8322 —给药组 50mg/kg 10 1019.5 19.61.40±0.4570*46.8*与空白对照组比较*P＜0.00权利要求
1.齿梗孢霉醇提取物的制备方法，采用齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)发酵培养，再制备醇提取物，其发酵培养工艺为(所述的比例均为重量百分比)(1)培养基的配制采用液体发酵培养方法，培养基葡萄糖1-3％；KH2PO40.1％-0.5％；K2HPO40.08％-0.3％；MgSO40.08％-0.3％；天然物麦麸1％-5％(煮汁)或土豆10-25％(煮汁)；(2)培养条件培养基pH4-7；三角瓶摇床培养瓶装量20-60％；转速100-120转/分钟；温度18-25℃；培养时间6-10天，发酵罐培养接种量5-10％，其余参数同上；醇提取物的获得(1)将上述步骤所得发酵产物，用双层尼龙布过滤得到菌丝体和发酵液两部分；(2)菌丝体部分用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，晾干，用甲醇、95％乙醇或丙酮等溶剂热提取，或用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、氯仿、氯仿-甲醇或甲醇等溶剂超声、渗滤或浸泡提取，上述溶剂的加入量为菌丝体的3-6倍，减压浓缩提取物，水浴挥掉溶剂后，得到菌丝体醇提取物；(3)发酵液部分常压热浓缩或减压浓缩后，加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使得溶液中含有70％-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置分层，收集上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇如前操作，反复3-5次，收集上清液，减压浓缩，水浴挥掉溶剂，得到发酵液醇提取物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养时间为7天。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述晾干为常温下晾干或在80℃以下干燥。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述热提取的溶剂为甲醇或95％乙醇。
5.齿梗孢属真菌醇提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
齿梗孢霉醇提取物的制法及在抗肿瘤药物中的应用，采用齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)发酵培养，制备醇提取物，该菌生长速度快、发酵工艺简单、成本低周期短、可大规模工业化生产、该醇提取物获得容易，有显著抑制肿瘤生长的效果且无明显毒性，显示出该菌菌丝体醇提取物和发酵液醇提取物在抗癌新药开发方面有较大价值，有望成为一种新的抗癌药。
文档编号A61P35/00GK1433780SQ0210077
公开日2003年8月6日 申请日期2002年1月25日 优先权日2002年1月25日
发明者郭顺星, 于能江, 逯海燕, 林晨, 王春兰, 肖培根 申请人:中国医学科学院药用植物研究所