专利名称：用静电吸引层层自组装改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法
技术领域：
本发明涉及改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，具体说是用多元胺胺解并在此基础上静电吸引层层自组装具生物活性的聚电解质，以制备表面具有细胞相容性的聚酯类生物材料的方法。
背景技术：
聚合物生物材料因具有优良的物理和化学性能，在组织工程中的应用越来越广泛。但由于这类材料特殊的应用环境——需要直接与人体的体液、器官、组织等接触，因此制备一种表面具有良好生物相容性的聚合物生物材料成为组织工程发展中非常关键的途径之一。
聚酯类生物材料不仅具有良好的物理机械性能、无毒性、易加工成型性，而且还具有组织工程材料所特有的可生物降解性，因此越来越受到人们的关注。以乳酸或乙醇酸为骨架单元的聚酯类聚合物，由于符合临床使用要求而被许可用作生物组织培养的聚合物，已发展到最为广泛的应用。但未经过改性的聚酯类聚合物由于其本身的疏水性和表面惰性，导致不能提供一个友好的界面以有效促进组织和器官的生长；降解后形成的局部酸性也会导致周围器官和组织产生严重炎症反应。目前虽然存在多种改善其表面性能的表面修饰方法，但均存在操作工艺复杂，修饰表面稳定性差，尤其不适应于多孔的体型复杂的支架材料和制品等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，用静电吸引层层自组装改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法。
本发明的方法包括以下步骤1)在有机溶剂中溶解多元胺制备浓度为0.001～1g/ml的多元胺溶液；2)将聚酯类聚合物材料浸入多元胺溶液中，在0～100℃温度下，反应0.1～10小时；3)将聚酯类聚合物材料取出多元胺溶液，用去离子水或无水乙醇浸泡清洗，真空干燥至恒重；4)用指示剂茚三酮检测聚酯类聚合物材料表面的胺基；
5)将表面带自由胺基的聚合物材料浸入浓度为0.0024～0.12mol/L的酸溶液中，在室温下进行酸化反应1～60分钟，反应结束，取出并用水冲洗干净；6)将步骤5)所得表面带正电的聚酯类聚合物首先浸入浓度为0.001～1000mg/ml的生物活性聚阴离子水溶液中，吸附一层阴离子，表面带上负电荷；用三蒸水洗去游离的阴离子后再浸入浓度为0.001～1000mg/ml的生物活性聚阳离子酸溶液中，吸附一层阳离子后先用酸冲洗，再用三蒸水洗去游离的阳离子，这时表面又带上了正电荷，重复上述步骤，使生物活性阴阳离子交替组装在聚酯类聚合物材料上。
7)反应结束后，取出并用酸或水冲洗干净，室温下真空干燥至恒重。
本发明中，多元胺可以是小分子多元胺和聚多胺，小分子多元胺包括乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、二正辛胺、二正壬胺、二正癸胺的一种或其混合物，聚多胺包括聚乙烯基亚胺、聚烯丙基胺中的一种或其混合物。
本发明中，用于溶解多元胺的有机溶剂包括，但不限于乙醇、乙醇胺、正丙醇、异丙醇、乙二醇二甲醚、二甲基亚砜中的一种或其混合物。
所述的聚合物材料，通常是聚酯类聚合物膜和多孔支架。聚酯类聚合物优选聚己内酯、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、无定型聚(D，L-乳酸)(PDLLA)、聚酯型聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙醇酸、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)中的一种及这些聚合物的共聚物。
所使用的聚酯类聚合物的分子量可以不必考虑，但优选使用分子量范围为10000～1000000的聚酯类聚合物。
多孔支架是指通过致孔剂法、相分离法、编织法、乳液冻结干燥法、径迹刻蚀法、快速成型法或无纺法等方法制备的内部孔洞相互连通的支架。
本发明中，生物活性聚阴离子可选用苯乙烯磺酸钠(PSS)、硫酸葡聚糖(DS)、硫酸软骨素(CSAS)、海藻酸钠(NaAlg)、聚丙烯酸钠(PAA)、聚甲基丙烯酸、肝素、硫酸肝素中的一种或其混合物；聚阳离子可选用胶原(Collagen)、壳聚糖(Chitosan)、多聚赖氨酸、聚乙烯基亚胺盐酸盐(PEI)、聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)中的一种或其混合物。上述聚阴离子或聚阳离子还可选用具有两性电荷性质的各种蛋白、生长因子和分化诱导因子，这些蛋白、生长因子和分化诱导因子可通过调节pH值来得到不同的带电性质等电点下带正电，等电点上带负电。
本发明方法步骤6)中，生物活性聚阴离子水溶液和生物活性聚阳离子酸溶液的浓度优选0.1～50mg/ml。
本发明采用多元胺胺解聚酯类聚合物表面首先得到表面带自由胺基的聚合物，再以酸酸化使聚合物表面带正电，然后将它交替浸入聚阴离子和聚阳离子的溶液中，通过聚阴离子和聚阳离子的静电引力作用利用静电吸引层层自组装的方法，在其表面交替组装单层或多层具有生物活性的不同聚阴离子和聚阳离子，这些生物活性聚电解质经层层组装后仍然保持其原有的生物活性，得到表面具有细胞相容性的平面膜和三维多孔的支架材料及其制品。这些自由胺基不仅有效提供了进一步与生物活性聚电解质反应的活性位点，而且其降解后的胺基能适度中和聚合物在生物降解过程中产生的局部酸性，有望减轻因局部酸性而引起的器官和组织周围的炎症。静电吸引自组装生物活性聚电解质后，更可进一步提高材料的细胞相容性和其它具有特殊功能的生物活性。本发明工艺简单，反应条件温和，易操作，重现性好，适用范围广，环境友好。适用于多种复杂体型的材料表面、多孔支架材料及其宏观制品的表面修饰。在多种具有复杂体型结构的生物医用装置和多孔组织工程支架材料的表面修饰中具有良好的应用前景。
图1是胺解聚(L-乳酸)膜上PSS/壳聚糖多层自组装后水动态接触角(前进角)随组装层数的变化情况。其中未改性聚(L-乳酸)的前进角为85.3度。
图2是聚(L-乳酸)膜表面改性前后人脐带内皮细胞在其上分别生长12小时和4天后的粘附率、活性和增殖率，其中a为组织培养聚苯乙烯(TCPS)，b为未改性聚(L-乳酸)膜，c为组装一层PSS的聚(L-乳酸)，d为组装一双层PSS/壳聚糖(外层为壳聚糖)的聚(L-乳酸)膜，e为组装三双层PSS/壳聚糖(外层为壳聚糖)的聚(L-乳酸)，f为组装五双层PSS/壳聚糖(外层为壳聚糖)的聚(L-乳酸)膜。
图3是聚(L-乳酸)膜表面组装单层PSS后，人脐带内皮细胞生长4天后的电镜照片，其中图3a放大倍数为1000倍，可清晰看到内皮细胞贴壁生长的形貌；图3b放大倍数为180倍。
图4是聚(L-乳酸)膜表面组装三双层壳聚糖(外层为壳聚糖)后，人脐带内皮细胞生长4天后的电镜照片，其中图4a放大倍数为472倍，可清晰看到内皮细胞贴壁生长及胞间联系的情形；图4b放大倍数为180倍。
图5是聚酯型聚氨酯膜表面组装不同聚阴离子和胶原后，水动态接触角的变化情况。空白聚酯型聚氨酯膜的前进角为80度。
图6是聚酯型聚氨酯膜表面组装不同聚阴离子和胶原(一双层，外层为胶原)后人脐带内皮细胞在其上分别生长12小时的粘附率，图中a为肝素，b为CSAS，c为PAA，d为DS，e为NaAlg，f为PSS。
图7是聚酯型聚氨酯膜表面组装不同聚阴离子和胶原(一双层，外层为胶原)后人脐带内皮细胞在其上分别生长4天后的增殖率，图中a为肝素，b为CSAS，c为PAA，d为DS，e为NaAlg，f为PSS。
图8是聚酯型聚氨酯膜表面组装不同双层PSS/PEI(外层为PEI)后人脐带内皮细胞在其上分别生长12小时的粘附率和生长4天后的增殖率。
具体实施例方式
以下实例进一步说明本发明。
实例1将聚(L-乳酸)溶解于1，4-二氧六环中(聚乳酸重量百分比含量为3％)，并浇铸于成膜模具中流延成膜。将聚(L-乳酸)膜浸入浓度为0.06g/mL的1，6-己二胺/正丙醇溶液中，50℃下反应8分钟，用去离子水浸泡清洗，真空下烘干。取小片膜于浓度为1.0mol/L的茚三酮溶液中，显蓝紫色检测膜表面存在游离的胺基(-NH2)。
将上述表面带游离胺基的聚(L-乳酸)膜浸入到浓度为0.012mol/L的盐酸中酸化15分钟，取出并用三蒸水漂洗后，浸入1.0mg/ml聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液中浸泡20分钟，用三蒸水漂洗干净并用氮气吹干，再浸入1.0mg/ml壳聚糖乙酸溶液中浸泡15分钟，先用1％乙酸溶液冲洗，再用三蒸水漂洗干净并用氮气吹干。重复上述步骤可制备多层组装的聚(L-乳酸)改性膜。聚(L-乳酸)膜经PSS/壳聚糖层层静电自组装后，亲水性明显提高，且呈有规律的交替变化，结果见图1。这同时也证明了层层静电自组装过程的发生。
用I型胶原酶将人体脐带静脉内皮细胞消化分离，并种植于底部平铺有聚合物膜的96孔组织培养级聚苯乙烯(TCPS)培养板中，培养液为PRMI1640和小牛血清，每孔接种200μl，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中，隔天换液，测定细胞粘附率(12小时)和培养4天后的增殖率。聚(L-乳酸)膜经层层静电自组装改性后，对内皮细胞的相容性明显提高，结果见图2，3，4。
实例2将聚酯型聚氨酯溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，使聚合物溶液浓度达到0.13g/mL，将此溶液浇铸于成膜模具中流延成膜。将聚酯型聚氨酯膜浸入浓度为0.06g/ml的1，6-己二胺/正丙醇溶液中，37℃下反应5分钟，用三蒸水浸泡清洗，真空干燥至恒重。取2厘米长和1厘米宽的胺解聚酯型聚氨酯，在浓度为1.0mol/L的茚三酮/无水乙醇溶液中浸泡1分钟取出，在80℃下加热，膜表面呈现出明显的蓝紫色，表明在该膜表面上存在自由的胺基(-NH2)。将上述表面带自由胺基的聚酯型聚氨酯膜浸入到浓度为0.012mol/l的盐酸中酸化15分钟，取出并用三蒸水漂洗后分别在肝素(1.0mg/mL Heparin)，硫酸软骨素(1.0mg/mL CSAS)，聚丙烯酸钠(1.0mg/mL，PAA)，海藻酸钠(1.0mg/mL，NaAlg)，硫酸葡聚糖(1.0mg/mL，DS)，聚苯乙烯磺酸钠(1.0mg/mL，PSS)中浸泡20分钟，用三蒸水漂洗干净并用氮气吹干，再分别浸入浓度为0.1％的胶原乙酸溶液或浓度为1.0mg/ml的PEI乙酸溶液中20分钟。先用1.0％的乙酸漂洗，再用三蒸水漂洗干净并用氮气吹干，放入真空烘箱中烘干。用荧光标记和水动态接触角测试(结果见图5)可证明上述静电吸引自组装过程的发生。
用I型胶原酶将人体脐带静脉内皮细胞消化分离，并种植于底部平铺有聚合物膜的96孔组织培养级聚苯乙烯(TCPS)培养板中，培养液为PRMI1640和小牛血清，每孔接种200μl，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中，隔天换液，测定细胞粘附率(12h)和培养4天后的增殖率。聚酯型聚氨酯膜经层层静电自组装改性后，对内皮细胞的相容性明显提高，结果见图6，7，8。
权利要求
1.用静电吸引层层自组装改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，该方法包括下列步骤1)在有机溶剂中溶解多元胺制备浓度为0.001～1g/mL的多元胺溶液；2)将聚酯类聚合物材料浸入多元胺溶液中，在0～100℃温度下，反应0.1～10小时；3)将聚酯类聚合物材料取出多元胺溶液，用去离子水或无水乙醇浸泡清洗，真空干燥至恒重；4)用指示剂茚三酮检测聚酯类聚合物材料表面的胺基；5)将表面带自由胺基的聚合物材料浸入浓度为0.0024～0.12mol/L的酸溶液中，在室温下进行酸化反应1～60分钟，反应结束，取出并用水冲洗干净；6)将步骤5)所得表面带正电的聚酯类聚合物首先浸入浓度为0.001～1000mg/mL的生物活性聚阴离子水溶液中，吸附一层阴离子，表面带上负电荷；用三蒸水洗去游离的阴离子后再浸入浓度为0.001～1000mg/ml的生物活性聚阳离子酸溶液中，吸附一层阳离子后先用酸冲洗，再用三蒸水洗去游离的阳离子，这时表面又带上了正电荷，重复上述步骤，使生物活性阴阳离子交替组装在聚酯类聚合物材料上。7)反应结束后，取出并用酸或水冲洗干净，室温下真空干燥至恒重。
2.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是所说的多元胺是小分子多元胺和聚多胺，小分子多元胺包括乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、二正辛胺、二正壬胺、二正癸胺的一种或其混合物，聚多胺包括聚乙烯基亚胺、聚烯丙基胺中的一种或其混合物。
3.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是用于溶解多元胺的有机溶剂是乙醇、乙醇胺、正丙醇、异丙醇、乙二醇二甲醚、二甲基亚砜中的一种或其混合物。
4.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是所说的聚酯类聚合物材料是聚酯类聚合物膜和多孔支架。
5.根据权利要求1或4所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是所说的聚酯类聚合物为聚己内酯、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、无定型聚(D，L-乳酸)、聚酯型聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙醇酸、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)中的一种或这些聚合物的共聚物。
6.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是所说的聚阴离子为聚苯乙烯磺酸钠、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、海藻酸钠、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸、肝素、硫酸肝素中的一种或其混合物。
7.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是所说的聚阳离子有胶原、壳聚糖、多聚赖氨酸、聚乙烯基亚胺盐酸盐、聚烯丙基胺盐酸盐中的一种或其混合物。
8.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是所说的聚阴离子和聚阳离子是具有两性电荷性质的蛋白、生长因子和分化诱导因子。
9.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是所说的生物活性聚阴离子水溶液或聚阳离子酸溶液的浓度分别为0.1～50mg/mL。
10.根据权利要求1所述的改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法，其特征是步骤5)中所说的酸溶液为盐酸、硫酸、乙酸溶液中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种用静电吸引层层自组装改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法。该方法用多元胺胺解聚酯类聚合物表面首先得到表面带自由胺基的聚合物，再以酸酸化使聚合物表面带正电，然后利用静电吸引层层自组装的方法，在其表面交替组装单层或多层具有生物活性的不同聚阴离子和聚阳离子，这些生物活性聚电解质经层层自组装后仍然保持其原有的生物活性，得到表面具有细胞相容性的平面膜和三维多孔的支架材料及其制品。本发明方法操作工艺简单，重复性好。在多种具有复杂体型结构的生物医用装置和多孔组织工程支架材料的表面修饰中具有良好的应用前景。
文档编号A61L27/58GK1394901SQ02112499
公开日2003年2月5日 申请日期2002年7月10日 优先权日2002年7月10日
发明者高长有, 竺亚斌, 沈家骢 申请人:浙江大学