专利名称：组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，具体说涉及用于引导组织和器官再生的组织相容性三维多孔支架的制备方法。
背景技术：
组织工程是一个涉及到医学、化学、生物学、材料学等多学科、多领域的交叉研究课题，而三维支架的构建是其中的关键之一。只有构建出具有特定微观结构、优良的机械性能、适宜的降解性能以及良好的生物相容性的支架，才能有效地促进细胞的粘附和生长，进而引导组织和器官的再生。
胶原是哺乳动物结缔组织中的主要成分，构成人体约30％的蛋白质，在皮肤中的干重达72％。胶原有19种类型，最常见的是I型、II型和III型。其中I型最丰富，且性能优良，被广泛用于生物材料。胶原材料虽然具有无可比拟的生物相容性，但以纯胶原构建的支架的机械强度较低，降解速率过快，不能满足组织工程支架的要求，因此有必要添加其它组份以改善胶原支架的性能并通过适当的方法交联以获得与细胞外基质相类似的支架结构，并具有与组织再生相匹配的降解速率。
壳聚糖是一种带有多氨基的多糖类物质，其结构和一些性质与细胞外基质的主要成分氨基葡聚糖类似，具有良好的生物相容性和适当的降解性能，无刺激性、无免疫原性、无热源反应，并具有促进创面愈合的功能，而且来源广泛、成本低廉。目前壳聚糖已广泛应用于医用缝合线、创面敷料以及组织工程三维支架中。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法。
本发明是以胶原和壳聚糖为材料，通过冷冻-冻干法制备组织工程用多孔支架，并采用物理和化学的方法对多孔支架进行交联改性。该制备方法包括以下步骤1)分别在酸性条件下配制浓度(按重量)为0.1％～5％，最好为0.3％～3％的胶原溶液和壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，搅拌均匀得胶原/壳聚糖混合溶液，壳聚糖溶液的含量(按重量)为1～80％，最好为5～30％；2)将胶原/壳聚糖共混液注入模具中，采用冷冻—冻干法，在-10℃～-100℃，最好在-10℃～-50℃温度下冷冻0.05～5小时后，于冻干机中冻干，得胶原/壳聚糖三维多孔支架；3)将步骤2)所得胶原/壳聚糖三维多孔支架用真空干热物理方法交联，交联温度为80～130℃，时间为1～48小时，然后在乙酸溶液浸泡1～3小时，再放入醛类化合物或碳化二亚胺类化合物中化学交联1～48小时；4)清洗，再次冷冻、冻干。
本发明中，配制胶原溶液的胶原材料是牛腱胶原、猪皮胶原、鼠尾胶原。配制胶原溶液和壳聚糖溶液所用的酸为乙酸、甲酸、盐酸中的一种或其混合物。所说的胶原/壳聚糖混合液的pH值为2～5。
本发明中，醛类化合物是甲醛或戊二醛。醛类化合物的浓度为0.01％～2.5％，优选浓度为0.05～0.25％。
本发明中，碳化二亚胺类化合物是指1-乙基-3-3二甲基胺丙基-碳化二亚胺(EDAC)。碳化二亚胺类化合物的浓度为0.001～1M的水溶液，优选浓度为0.01～0.3M。
本发明中对所说的壳聚糖材料的分子量没有特别的要求，但优选使用分子量范围为1～200万的壳聚糖。
本发明方法所采用的材料属于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，而且材料来源广泛，成本低廉。采用冷冻-冻干法可以通过调节冷冻温度、共混液浓度或pH值、胶原与壳聚糖的共混比例等因素可控制多孔支架的微结构，制备出具有适宜孔径和孔隙率的三维多孔支架。采用壳聚糖为桥联剂，经过物理或化学的方法交联以调节多孔支架的降解速率。通过本发明制备得多孔支架可以广泛地应用于皮肤、软骨、骨、血管、神经、肌腱、心脏瓣膜等多种组织或器官的重建或再生，以有效促进上述组织或器官的体外构建或体内再生。
图1a壳聚糖浓度为10％时，支架的SEM照片；图1b壳聚糖浓度为50％时，支架的SEM照片；图2a冷冻温度为-50℃条件下制备的支架的SEM照片；图2b冷冻温度为-20℃条件下制备的支架的SEM照片；图3不同浓度的戊二醛交联的壳聚糖浓度为10％的牛腱胶原/壳聚糖支架的降解性能；图4 0.25％戊二醛交联的壳聚糖浓度为10％的牛腱胶原/壳聚糖支架种植3T3细胞7天后的激光共聚焦显微镜照片；图5a 0.25％戊二醛交联的壳聚糖浓度为10％的牛腱胶原/壳聚糖支架植入兔耳背3天的组织切片图；图5b是0.25％戊二醛交联的壳聚糖浓度为10％的牛腱胶原/壳聚糖支架植入兔耳背7天的组织切片图；图5c是0.25％戊二醛交联的壳聚糖浓度为10％的牛腱胶原/壳聚糖支架植入兔耳背14天的组织切片图；图5d是0.25％戊二醛交联的壳聚糖浓度为10％的牛腱胶原/壳聚糖支架植入兔耳背28天的组织切片图；图6是0.25％戊二醛交联的壳聚糖浓度为10％的猪皮胶原/壳聚糖支架种植3T3细胞7天后的激光共聚焦显微镜照片；具体实施方式
实施例1壳聚糖含量对牛腱胶原/壳聚糖多孔支架的微结构的影响采用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用乙酸溶液分别配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液与胶原溶液均匀共混获得壳聚糖含量分别为(按重量)10％、20％、30％、50％的胶原/壳聚糖混合溶液。于-20℃冷冻1小时，冻干后可制备出具有不同孔径和形貌的多孔支架，见图1a、图1b。图1a、图1b分别是壳聚糖含量为10％，50％的胶原/壳聚糖支架的扫描电镜(SEM)照片。
实施例2冷冻温度对牛腱胶原/壳聚糖多孔支架的微结构的影响采用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5M的乙酸溶液分别配制浓度为0.5％的胶原溶液和0.5％壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液与胶原溶液均匀共混获得壳聚糖含量为(按重量)10％的胶原/壳聚糖混合溶液。然后分别于-50℃、-20℃冷冻1小时，冻干后可制备出孔径大小不同的多孔支架，见图2a、图2b。图2a、图2b分别为在-50℃，-20℃温度下冷冻制备的多孔支架的SEM照片。
实施例3牛腱胶原/壳聚糖多孔支架的交联采用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5M的乙酸溶液分别配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液与胶原溶液均匀共混获得壳聚糖含量为(按重量)10％的胶原/壳聚糖混合溶液。采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻1小时，然后冻干机中24小时冻干。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时，得到干热交联的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架。经真空干热交联获得的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小时后，于4℃下用0.05％～0.25％的戊二醛溶液交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联度不同的胶原/壳聚糖多孔支架。交联后牛腱胶原/壳聚糖多孔支架的耐降解性能得到显著提高，见图3。
实施例4牛腱胶原/壳聚糖多孔支架体外评价采用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5M的乙酸溶液分别配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液与胶原溶液均匀共混获得壳聚糖含量为(按重量)10％的胶原/壳聚糖混合溶液。采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻1小时，然后冻干机中24小时冻干。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时。真空干热交联的多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小时后，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原/壳聚糖多孔支架。该多孔支架中种植1ml的3T3细胞(500万/ml)，37℃下5％CO2培养箱中培养7天，隔日换液。荧光素二醋酸酯(FDA)染色后激光共聚焦显微镜(CLSM)观察在支架表面下200μm内可见大量3T3细胞，细胞生长状态良好，见图4。
实施例5牛腱胶原/壳聚糖多孔支架体内评价采用酶解与酸抽提相结合的方法从牛腱中提取得到牛腱胶原。用0.5M的乙酸溶液分别配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液与胶原溶液均匀共混获得壳聚糖含量为(按重量)10％的胶原/壳聚糖混合溶液。采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻1小时，然后冻干机中24小时冻干。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时。真空干热交联的多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小时后，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原/壳聚糖多孔支架。支架消毒后埋植于人工切除的兔全厚皮肤创面，分别于埋植后3天，7天，14天，28天后做组织切片观察。埋植3天后有少量炎症细胞存在。7天后可见成纤维细胞长入，支架结构仍然保留，支架中未见明显的炎症细胞，14天后，支架中已经有大量的成纤维细胞生长进入，并且支架已经有一定程度的血管化。埋植28天后已于周围组织融合完好，呈真皮组织样，见图5a、图5b、图5c、图5d。图5a、图5b、图5c、图5d分别为胶原/壳聚糖支架植入体内3天，7天，14天，28天的组织切片图。
实施例6猪皮胶原/壳聚糖多孔支架构建与体外评价采用酶解与酸抽提相结合的方法从新鲜猪皮中提取得到猪皮胶原。用0.5M的乙酸溶液分别配制浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液与胶原溶液均匀共混获得壳聚糖含量为(按重量)10％的胶原/壳聚糖混合溶液。采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻1小时，然后冻干机中24小时冻干。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时，真空干热交联的多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小时后，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原/壳聚糖多孔支架。该多孔支架中种植1ml的3T3细胞(500万/ml)，37℃下5％CO2培养箱中培养7天，隔日换液。FDA染色后CLSM观察可见在支架中的孔壁上贴附有大量3T3细胞，细胞呈圆颗粒状，细胞间可见已有细胞间质存在，见图6。
权利要求
1.组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于它包括以下步骤1)分别在酸性条件下配制浓度(按重量)为0.1％～5％的胶原溶液和壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，搅拌均匀得胶原/壳聚糖混合溶液，壳聚糖溶液的含量(按重量)为1～80％；2)将胶原/壳聚糖共混液注入模具中，采用冷冻—冻干法，在-10℃～-100℃温度下冷冻0.05～5小时后，于冻干机中冻干，得胶原/壳聚糖三维多孔支架；3)将步骤2)所得胶原/壳聚糖三维多孔支架用真空干热物理方法交联，交联温度为80～130℃，时间为1～48小时，然后在乙酸溶液浸泡1～3小时，再放入醛类化合物或碳化二亚胺类化合物中化学交联1～48小时；4)清洗，再次冷冻、冻干。
2.按权利要求1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于配制胶原溶液的胶原材料是牛腱胶原、猪皮胶原、鼠尾胶原。
3.按权利要求1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于配制胶原溶液和壳聚糖溶液所用的酸为乙酸、甲酸、盐酸中的一种或其混合物。
4.按权利要求1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所说的胶原/壳聚糖混合液，其壳聚糖溶液的含量(按重量)为5～30％。
5.按权利要求书1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所说的胶原/壳聚糖混合液的pH值为2～5。
6.按权利要求1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所说的醛类化合物是甲醛或戊二醛。
7.按权利要求1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征是碳化二亚胺类化合物是指1-乙基-3-3二甲基胺丙基-碳化二亚胺。
8.按权利要求1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于步骤2)的冷冻温度为-10℃～-50℃。
9.按权利要求1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所说的醛类化合物的浓度为0.01％～2.5％，优选浓度为0.05～0.25％。
10.按权利要求书1所述的组织工程用胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于碳化二亚胺类化合物的浓度为0.001～1M的水溶液，优选浓度为0.01～0.3M。
全文摘要
本发明公开了一种采用天然生物材料胶原和壳聚糖为原料，通过冷冻－冻干，再进一步通过真空干热法、醛类化合物或碳化二亚胺类化合物交联，制备具有微结构可控、适宜降解速率和良好生物相容性的多孔支架。本发明的胶原/壳聚糖支架的生物相容性好，降解速率可控，且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单可行，重复性好，所构建的支架可以广泛地应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。
文档编号A61L31/04GK1394655SQ02112498
公开日2003年2月5日 申请日期2002年7月10日 优先权日2002年7月10日
发明者高长有, 马列, 王登勇, 毛峥伟, 沈家骢, 韩春茂 申请人:浙江大学