专利名称：一种预防或治疗骨质疏松症的药物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种预防或治疗骨质疏松症的药物及其制备方法和在制备预防和治疗骨质疏松症的药物中的应用。
背景技术：
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折增加为特征的一类疾病，常见于老年人特别是绝经期后的妇女，其发病率高、危害性大。统计数据表明由于骨质疏松引起的臀部骨折，1990年全世界为170万人，到2025年预计将达到630万人。单美国一个国家此项花费1990年为100亿美元，预计2040年此项花费将达到2400亿美元(Masahiko Sato et al，J.Med.Chem.1999，421)。成年期，骨组织不断经历破骨细胞对骨吸收和成骨细胞形成新骨的过程，使骨骼更新并保持形态结构完整性。若破骨细胞和成骨细胞之间平衡失调，骨吸收大于骨形成时，发生骨丢失，引起骨质疏松。治疗骨质疏松症的关键就是促进成骨细胞的成骨过程，缓解破骨细胞的破骨过程。大量研究表明组织蛋白酶B(Cathepsin B)和碳酸酐酶II(CarbonicAnhydrase II)与破骨细胞调节的骨吸收有密切关系(Fred H.Drake etal.，J.Biol.Chem.1996，27112511；P.Lehenkar，et al.，Exp.Cell Res.1998，1024)。因此，寻找组织蛋白酶B(Cathepsin B)和碳酸酐酶II(Carbonic Anhydrase II)抑制剂将会发现新的骨质疏松症治疗药物。迄今，现有技术中没有含有式(I和II)化合物老鹳草素(geraniin)作为有效成分在治疗骨质疏松症方面的报道，也没有该化合物作为组织蛋白酶B(Cathepsin B)和碳酸酐酶II(Carbonic Anhydrase II)抑制剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供含有有效量式(I和II)化合物及药用载体和/或赋形剂所制成的药物。为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案一种预防或治疗骨质疏松症的药物，其中含有预防或治疗骨质疏松症有效量的式I化合物(包括溶液中可能存在的另外一种形式II)老鹳草素(geraniin)及可药用载体和/或赋形剂。 本发明还提供了上述药物的制备方法，采集新鲜叶下珠(Phyllanthus urinaria)全草凉干、粉碎，用50％乙醇在常温下提取4次，提取液在40℃下减压浓缩至小体积，将浓缩液通过大孔树脂，先用纯水洗脱，然后用25％乙醇洗脱，将25％的洗脱液浓缩至小体积，通过反相硅胶柱层析，分别用水和25％乙腈洗脱，收集25％乙腈洗脱部分，放置即得权利要求1所述的化合物老鹳草素，然后再按药物常规制备方法配制成所需剂型。
本发明同时提供了上述药物在制备预防或治疗骨质疏松症药中的应用。
本发明化合物用作上述药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1～99％，优选为0.5～90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射(静注、肌注)两种形式给药。
口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣剂、胶囊、溶液、糖浆、滴丸剂等。
注射可用其固体或液体制剂，如粉针剂、溶液形注射剂等。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明的式(I和II)化合物老鹳草素(geraniin)及其与药物载体或赋形剂组成的药物的生物活性结果来说明它在医药领域中的应用。1、组织蛋白酶B(Cathepsin B)抑制活性试验其基本原理基于 (1)缓冲液配制缓冲液由100mM醋酸钠，20mM半胱氨酸，5mMEDTA组成，用6N HCl调至PH5.5。(2)底物为Z-phe-arg AMC(BaChem生产)，储备液为500mM(溶于DMSO中)，用缓冲液稀释，每孔加70μL，使终浓度为50μM。(3)阳性对照用亮抑酶肽(leupeptin，CalBioChem生产)，储备液为10mM，用缓冲液稀释，对照孔每孔加10μL，使终浓度为30nM。(4)组织蛋白酶B(储备液由CalBioChem生产)，取12.5μl酶用缓冲液稀释至10mL，每孔加20μL。(5)化合物配制成25μM浓度作为储备液(溶于DMSO中)，每孔加5μL，使终浓度为1.25μM。(6)阻断剂用亮抑酶肽，储备液为10mM，用缓冲液稀释至1.2μM。在室温下孵化60分钟后加入阻断剂20μL(终浓度为200nM)。(7)用荧光酶标仪在波长355ex/450em读数。根据试验测定得到老鹳草素(geraniin)对组织蛋白酶B(Cathepsin B)的抑制活性IC50为0.37μg/mL。2、碳酸酐酶II(Carbonic Anhydrase II)抑制活性试验其基本原理基于 (1)缓冲液用HEPES缓冲液，PH6.9。每孔加60μL。(2)底物为对硝基苯乙酸酯(Sigma生产)，储备液为3mM(先溶于丙酮中，然后用缓冲液稀释)，每孔加25μL。(3)对照物为6-Ethoxyzolamide，储备液为10mM(溶于DMSO中，用DMSO稀释)，对照孔每孔加5μL。(4)碳酸酐酶II(Sigma生产)，储备液为100μM，每孔加10μL。(5)化合物配制成25μM浓度作为储备液(溶于DMSO中)，每孔加5μL。(6)阻断剂为6-Ethoxyzolamid，储备液为10mM(溶于DMSO中，用DMSO稀释)，对照孔每孔加5μL。在室温下孵化120分钟后加入阻断剂5μL。(7)用酶标仪在波长405nm测定吸收值。根据试验测定得到老鹳草素(geraniin)对碳酸酐酶II(CarbonicAnhydrase II)的抑制活性IC50为2.34μg/mL。
实验证明本发明涉及的老鹳草素(geraniin)化合物具有显著的抑制组织蛋白酶B(Cathepsin B)和碳酸酐酶II(Carbonic Anhydrase II)的活性。组织蛋白酶B(Cathepsin B)和碳酸酐酶II(Carbonic AnhydraseII)与骨质蔬松密切相关。
具体实施例方式下面结合实施例进一步对本发明的实质内容进行说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1采集新鲜叶下珠(Phyllanthus urinaria)8公斤，全草凉干、粉碎，然后用50％乙醇在常温下提取4次，提取液在40℃下减压浓缩得浸膏400克，用水溶解，通过大孔树脂，先用纯水洗脱，然后用25％乙醇洗脱。将25％的洗脱液浓缩至小体积，通过反相硅胶柱层析，分别用水和25％乙腈洗脱，收集25％乙腈洗脱部分，放置即得黄色晶体(即老鹳草素geraniin)30克。
该方法分离出的化合物老鹳草素(geraniin)，在溶液中该化合物可能以两种形式(I和/或II)存在。其化学结构式分别为 分子量为952，分子式C41H28O27，其性状为黄色结晶，易溶于甲醇、丙酮，微溶于水。
老鹳草素(geraniin)的结构是基于它的质谱和核磁共振数据并通过与文献中已知化合物的光谱进行对照而确定。负离子FAB-MS显示m/z 951(M-1)。有关核磁共振数据见表1。
表1老鹳草素(Geraniin)的NMR数据(溶剂为Me2CO-d6)
实施例2按实施例1制得化合物老鹳草素(geraniin)，按化合物晶体与赋形剂重量比1∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例3按实施例1制得化合物老鹳草素(geraniin)，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
实施例4按实施例1制得化合物老鹳草素(geraniin)，按化合物晶体与赋形剂重量比1∶2的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例5按实施例1制得化合物老鹳草素(geraniin)，按化合物晶体与赋形剂重量比1∶3的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例6片剂老鹳草素(geraniin) 100mg淀粉 100mg玉米浆17％ 适量硬脂酸镁 适量实施例7胶囊剂老鹳草素(geraniin) 100mg淀粉 100mg硬脂酸镁 适量制备方法将老鹳草素与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
实施例8安瓿剂老鹳草素(geraniin) 50mg制备方法将老鹳草素溶解于2毫升丙二醇中，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。
权利要求
1.一种预防或治疗骨质疏松症的药物，其中含有预防或治疗骨质疏松症有效量的式I化合物(包括溶液中可能存在的另外一种形式II)老鹳草素(geraniin)及可药用载体和/或赋形剂。
2.权利要求1的药物的制备方法，其特征在于采集新鲜叶下珠(Phyllanthus urinaria)全草凉干、粉碎，用50％乙醇在常温下提取4次，提取液在40℃下减压浓缩至小体积，将浓缩液通过大孔树脂，先用纯水洗脱，然后用25％乙醇洗脱，将25％的洗脱液浓缩至小体积，通过反相硅胶柱层析，分别用水和25％乙腈洗脱，收集25％乙腈洗脱部分，放置即得权利要求1所述的化合物老鹳草素，然后再按药物常规制备方法配制成所需剂型。
3.权利要求1所述药物在制备预防或治疗骨质疏松症药中的应用。
全文摘要
本发明提供一种预防或治疗骨质疏松症的药物及其制备方法和应用。具体地,利用药用植物叶下珠全草为原料,通过粉碎,酒精提取,大孔树脂处理,反相硅胶柱层析以乙腈/水洗脱,结晶得到药用有效成分老鹳草素(geraniin)化合物,然后按药物常规制剂制备方法制成药物。
文档编号A61P19/00GK1378858SQ0211365
公开日2002年11月13日 申请日期2002年4月23日 优先权日2002年4月23日
发明者刘吉开, 董泽军, 丁智慧, 沈志强 申请人:中国科学院昆明植物研究所