专利名称：携载基因支架及其制造方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗器械领域，具体涉及一种具有预防再狭窄作用的携载基因支架。
随着分子生物学的发展，许多疾病的发病机理在基因水平上得以阐明，这使得从基因水平诊断和根治疾病成为可能。在医治心脏病、肿瘤、糖尿病等方面利用基因转移和调位的治疗方法正在深入研究。例如将抗血栓形成基因导入心血管内，使之在血管内表达，从而达到抑制血栓形成，防止血管堵塞的目的。然而怎样将基因向生物体内靶向输送或局部定位，这一关键性的技术问题尚未得到解决。美国Micheal Simons等人曾用一种聚醚载体，将基因加入这种载体的凝胶中，然后将其送入动物的颈动脉中(Nature，359(3)，67-70，1992.9)。这种方法的缺点在于该凝胶遇到血流冲击后会很快溶解于血液中，根本无法定位于血管的某一部位，因此无法达到靶向输送基因的目的。
本发明所要解决的另一个技术问题是公开上述携带基因支架的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述血管支架在心血管及外周血管阻塞病变介入治疗中的应用。
本发明的技术构思是这样的发明人设想将抑制平滑肌细胞增生和迁移的基因和抑制血栓形成的基因吸附于带有涂层的支架表面，可以使基因在支架置入血管局部高效表达，从而达到安全有效地抑制支架置入后再狭窄的作用。将基因牢固地粘附在血管支架上，可以随血管支架定位于血管的任何部位，从而实现靶向输送或局部定位基因的目的。
本发明所述及的血管支架包括球囊扩张支架和自扩张支架，其结构形式已经在中国专利01246774.x以及其他有关文献中进行了公开描述，本发明不再赘述。它们主要用于冠状动脉、脑动脉、肺动脉、肾动脉、腹主、胸主动脉以及其他血管的阻塞病变。
本发明的携载基因支架包括支架和覆盖在支架表面的吸附层和涂布在吸附层表面的载体治疗基因层。
在本发明优选的技术方案中，在吸附层与支架之间可加一底层，用以提高吸附层与支架的结合力。
所说的底层为一种医药学上可接受的聚合物，包括丙交酯、乙交酯、ε-己内酯的均聚物和两者之间或三者的共聚物、纤维素类、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、阿拉伯胶、西黄蓍胶、海藻酸钠、白明胶、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙稀酸丁酯、乙烯-乙烯醇共聚物、乙烯-醋酸乙烯共聚物以及上述聚合物的混合物。
吸附层为一种含有经过交联处理的分子量大于10,000的蛋白质的组合物，包括97-100wt％的蛋白质，0-3wt％的添加剂。
所述及的蛋白质可以是明胶、胶原或白蛋白，优选的是明胶。
根据不同的用途、目的或改进涂层的某种性能，可以在蛋白质涂层中加入一种或多种添加剂，添加剂包括增塑剂、表面活性剂、交联剂或/和各种具有协助治疗某种疾病的特定药物等。
所述及的增塑剂包括甘油、脂肪酸、醚类、矿物油或/和硅油等，以增加涂层的柔性；所述及的表面活性剂包括十二烷基磺酸钠、烷基季胺盐或吐温类，用以改善蛋白质溶液的铺展性能；所述及的交联剂包括醛类、二酮类、异氰酸酯类或环氧类化合物中的一种及其混合物，其作用是破坏蛋白质载体的生物活性以及固定蛋白质载体。
所述及的特定药物包括抗凝剂(如肝素钠)，抗血小板沉积剂(如Tirofiban)，抗平滑肌细胞增生剂(如Rapamycin)，用以降低病人并发症或心脏不良事件的发生率。
所述及的载体治疗基因层中的载体治疗基因选自通过细胞、病毒、质粒、高分子材料及其他载体介导的基因如Keratin8基因、VEGF基因、EGF基因、PTEN、尿激酶前体(Pro-UK)基因、一氧化氮合酶(NOS)基因等和反义寡核苷酸，如反义C-myc等。载体治疗基因，通过抑制血管平滑肌细胞(VSMC)的过度增殖，或者促进血管内皮细胞的生长，或者阻止血管平滑肌细胞的迁移，或者抑制血管平滑肌细胞外基质过度增生，达到防止血管再狭窄的目的，并且可携带预防血栓形成的基因或双基因以达到多种生物学效应。
优选的介导细胞包括内皮细胞，血管平滑肌细胞；优选的病毒包括腺病毒和腺辅助病毒载体；优选的质粒包括pc DNA 3.1、pB322衍生体或pUC衍生体。
所述及的高分子材料为医药学上可接受的高分子材料。
上述载体治疗的基因的制备方法为一种本领域公知的方法，简述如下1.人诱导型一氧化氮合成酶基因质粒的构建，2.质粒转染大肠杆菌(菌株编号DH5α)-70℃保存，3.使用QIAGEN公司的去内毒素质粒纯化试剂盒及方法提纯质粒。
本发明所述的涂层厚度为0.1-100微米。
本发明具有预防再狭窄涂层的携带基因支架的制备方法包括下列步骤1.底层涂覆涂覆的方法可以是浸涂或喷涂，然后进行干燥。
2.吸附层溶液的配制将蛋白质溶解于水和/或有机溶剂，根据需要加入添加剂，搅拌均匀，配制成蛋白质浓度为0.1％-40wt％，更准确地说是0.5％-15wt％，添加剂的浓度为0-3wt％。
3.吸附层的涂覆和交联可以采用高能辐射交联法或化学交联法。
(1)高能辐射交联法用γ-射线照射涂覆在支架上的蛋白质涂层，使其产生交联。
(2)化学交联可采用均相交联或非均相交联。均相交联是先将需用量的化学交联剂加入配制好的蛋白质溶液中，混合均匀后进行涂层，然后进行干燥；或者在蛋白质溶液涂于血管支架表面后，将需用量的交联剂加于涂层上，然后进行干燥；(3)非均相交联是在蛋白质溶液涂于血管支架表面后，用交联剂蒸汽交联，然后进行干燥。
所述及的化学交联剂可以选用醛类，如甲醛、乙醛、戊二醛等；二酮类，如丁二酮、己二酮等；异氰酸酯类，如甲苯二异氰酸酯、己二异氰酸酯等或环氧类化合物，如环氧氯丙烷中的一种或多种。
化学交联剂的用量为每100克蛋白质中加入0.01-10克(交联剂按100wt％浓度计)。
干燥时可将涂有蛋白质涂层的血管支架放入烘箱中，或在自然环境中进行干燥。
4.载体治疗基因层将载体治疗的基因原液或溶解于溶剂中，然后将涂覆了吸附层的支架浸泡在该溶剂中，使载体治疗的基因吸附在吸附层表面，干燥后获得本发明的支架。
所说的溶剂包括水、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMAC)中的一种，优选的为水，浓度以0.5％-5％为适宜。
载体治疗基因层的厚度通过调整溶液的浓度和涂覆次数来控制。
本发明公开的携带基因支架表面涂层无挂膜、挂丝，分布均匀，无开裂、剥落现象。
本发明与现有其它技术相比，具有的优点是本发明的血管支架的吸附层是一种可以携载治疗性目的基因的蛋白质涂层。蛋白质涂层之所以能够强烈地吸附基因，首先是因为蛋白质是基因的表达物，蛋白质分子上有大量可与基因形成氢键和其它价键的位点。其次，蛋白质涂层是一种水凝胶，它对基因等水溶性物质的强烈吸附是不言而喻的。本发明的蛋白涂层的原料来自机体组织，有很好的生物相容性，经过一段时间后自然被机体吸收、代谢、没有毒副作用。同时因为载体治疗基因被强烈地吸附于血管支架表面蛋白质吸附层上，所以基因很容易随血管支架被固定于治疗部位，达到靶向输送或局部定位基因的目的。
图2为自扩张支架。
将涂有该涂层的不锈钢血管内支架浸泡于腺病毒载体或质粒(pcDNA.3.1)介导的LacZ基因原液中1分钟，取出后用球囊导管将其植入小型猪冠状动脉中。七天后对该冠状动脉段进行xGal染色分析。结果是试验段冠状动脉内膜及中膜可见部分细胞核染成深蓝色，这表明LacZ基因在该段冠状动脉高效转染。同时，将不携带Lac Z基因的蛋白质涂层不锈钢血管支架进行同样的对照试验，结果是没有发生实验段股动脉的细胞核蓝染。这充分说明蛋白质涂层可以携载基因，并成功地将基因输送至靶部位。另外，该支架吸附腺病毒载体介导的Pro-UK基因或质粒(pc DNA 3.1)介导的NOS基因植入小型猪冠状动脉，过30天后与裸支架比较，可明显抑制支架内平滑肌细胞增生，预防再狭窄。
实施例2配制100ml浓度为2 wt％聚甲基丙稀酸丁酯四氢呋喃溶液，采用喷涂的方法涂底层，介质流量0.5ml/min，喷淋时间100秒。表干后在支架表面形成一底层，40℃干燥12小时。
配制100ml浓度为2wt％的明胶水溶液，加入1.0克甘油、混合均匀。不锈钢血管支架浸涂后在20℃下干燥10小时，然后再将支架浸入浓度为37％的甲醛溶液1分钟，取出后于-4℃冷冻干燥24小时，用丙酮浸提去残留的甲醛，从而在血管支架表面上形成一层牢固的柔性的吸附层。
将涂有该涂层的不锈钢血管内支架浸泡于pcDNA3.1质粒载体介导的人iNOS合成酶基因原液中10分钟，自然干燥10分钟-12小时。
实施例3配制100ml浓度为2wt％的乙烯-乙烯醇共聚物DMF溶液，采用喷涂的方法涂底层，介质流量0.2ml/min，喷淋时间100秒。表干后在支架表面形成一底层，80℃减压干燥12小时。
配制100ml 5wt％浓度的明胶水溶液，加入1.0克甘油、混合均匀。不锈钢血管支架浸涂后在20℃下干燥10小时，然后再将支架浸入浓度为10wt％的戊二醛溶液60分钟，取出后于20℃下减压干燥20小时，用丙酮浸提去残留的戊二醛，从而在血管支架表面上形成一层牢固的柔性的吸附层。
将涂有该涂层的不锈钢血管内支架浸泡于pcDNA3.1质粒载体介导的人iNOS合成酶基因原液中90分钟，自然干燥12小时。
实施例4配制100ml 2wt％(W聚甲基丙稀酸丁酯/W乙烯-乙烯醇共聚物＝1/4)DMSO溶液，采用喷涂的方法涂底层，介质流量0.3ml/min，喷淋时间100秒。表干后在支架表面形成一底层，80℃干燥12小时，用丙酮清洗，干燥后备用。
配制100ml 1wt％浓度的明胶水溶液，加入1.0克甘油、混合均匀。不锈钢血管支架浸涂后在20℃下减压干燥10小时，然后再将支架悬于甲醛溶液上方，保持溶液温度25℃，用毛细管鼓入N2，对支架进行蒸汽交联2小时，取出后于20℃下干燥20小时。从而在血管支架表面上形成一层牢固的柔性的吸附层。
将涂有该涂层的不锈钢血管内支架浸泡于pcDNA3.1质粒载体介导的人iNOS合成酶基因原液中60分钟，自然干燥12小时。
权利要求
1.一种携载基因支架，其特征在于包括支架和覆盖在支架表面的吸附层和涂布在吸附层表面的载体治疗基因层，吸附层包括97-100wt％的经过交联处理的分子量大于10,000的蛋白质，0-3wt％的添加剂。
2.根据权利要求1所述的支架，其特征在于，蛋白质为明胶、胶原或白蛋白。
3.根据权利要求2所述的支架，其特征在于，蛋白质为明胶。
4.根据权利要求1所述的支架，其特征在于，添加剂包括增塑剂、表面活性剂、交联剂或/和各种具有协助治疗疾病的活性药物。
5.根据权利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的增塑剂包括甘油、脂肪酸、醚类、矿物油或/和硅油。
6.根据权利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的表面活性剂包括十二烷基磺酸钠、烷基季胺盐或吐温类。
7.根据权利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的交联剂包括醛类、二酮类、异氰酸酯类或环氧类化合物中的一种或其混合物。
8.根据权利要求4所述的支架，其特征在于，所述及的特定药物包括抗凝剂、抗血小板沉积剂、抗平滑肌细胞增生剂。
9.根据权利要求8所述的支架，其特征在于，抗凝剂为肝素钠。
10.根据权利要求8所述的支架，其特征在于，抗血小板积集剂为tirofiban、eptifibatide、abciximab。
11.根据权利要求8所述的支架，其特征在于，抗平滑肌细胞增生剂为Rapamycin。
12.根据权利要求1-11任一项所述的支架，其特征在于，在吸附层与支架之间设有用以提高吸附层与支架的结合力的底层，所说的底层为一种医药学上可接受的聚合物。
13.根据权利要求12所述的支架，其特征在于，所述及的聚合物包括丙交酯、乙交酯、ε-己内酯的均聚物和两者之间或三者的共聚物、纤维素类、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、阿拉伯胶、西黄蓍胶、海藻酸钠、白明胶、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙稀酸丁酯、乙烯-乙烯醇共聚物、乙烯-醋酸乙烯共聚物及其混合物。
14.根据权利要求1-11任一项所述的支架，其特征在于，所述及的载体治疗基因层中的载体治疗基因选自由细胞、病毒、质粒、高分子材料及其他载体介导的基因。
15.根据权利要求14所述的支架，其特征在于，所述及的基因为Keratin8基因、VEGF基因、EGF基因、PTEN、尿激酶前体(Pro-UK)基因、一氧化氮合酶(NOS)基因或反义寡核苷酸。
16.根据权利要求15所述的支架，其特征在于，反义寡核苷酸为反义C-myc。
17.根据权利要求14所述的支架，其特征在于，介导细胞包括内皮细胞或血管平滑肌细胞。
18.根据权利要求14所述的支架，其特征在于，介导病毒包括腺病毒和腺辅助病毒载体。
19.根据权利要求14所述的支架，其特征在于，介导质粒包括pcDNA 3.1，pB322衍生体或pUC衍生体。
20.根据权利要求14所述的支架，其特征在于，高分子材料为医药学上可接受的高分子材料。
21.根据权利要求1所述的支架，其特征在于，载体治疗基因层厚度为0.1-100微米。
22.根据权利要求1-21任一项所述的支架的制备方法，其特征在于包括下列步骤(1)底层涂覆涂覆的方法为浸涂或喷涂，然后进行干燥；(2)吸附层溶液的配制将蛋白质溶解于水和/或有机溶剂，加入添加剂，蛋白质浓度为0.1％-40wt％，添加剂的浓度为0-3wt％；(3)吸附层的涂覆和交联；(4)载体治疗基因层将载体治疗的基因原液或溶解于溶剂中，然后将涂覆了吸附层的支架浸泡在该溶剂中，使载体治疗的基因吸附在吸附层表面，干燥后获得本发明的支架。
23.根据权利要求22所述的支架的制备方法，其特征在于蛋白质浓度为0.5％-15wt％。
24.根据权利要求22所述的支架的制备方法，其特征在于用γ-射线照射蛋白质涂层使其产生交联。
25.根据权利要求22所述的支架的制备方法，其特征在于先将需用量的化学交联剂加入配制好的蛋白质溶液中，混合均匀后进行涂层，然后进行干燥；或者在蛋白质溶液涂于血管支架表面后，将需用量的交联剂加于涂层上，然后进行干燥。
26.根据权利要求22所述的支架的制备方法，其特征在于在蛋白质溶液涂于血管支架表面后，用交联剂蒸汽交联，然后进行于燥。
27.根据权利要求25所述的支架的制备方法，其特征在于所述及的化学交联剂为醛类、二酮类、异氰酸酯类，己二异氰酸酯或环氧类化合物中的一种或多种化学交联剂的用量为每100克蛋白质中加入0.01-10克。
28.根据权利要求25所述的支架的制备方法，其特征在于所述及的化学交联剂为醛类、二酮类、异氰酸酯类，己二异氰酸酯或环氧类化合物中的一种或多种，化学交联剂的用量为每100克蛋白质中加入0.01-10克。
29.根据权利要求1-21任一项所述的支架在心血管及外周血管阻塞病变介入治疗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种携载基因支架及其制备方法和应用。本发明将抑制平滑肌细胞增生和迁移的基因和抑制血栓形成的基因吸附于带有涂层的支架表面，可以使基因在支架置入血管局部高效表达，从而达到安全有效地抑制支架置入后再狭窄的作用，实现靶向输送或局部定位基因的目的。本发明的血管支架的吸附层是一种可以携载治疗性目的基因的蛋白质涂层，蛋白质分子上有大量可与基因形成氢键和其它价键的位点。本发明的蛋白涂层的原料来自机体组织，有很好的生物相容性，没有毒副作用。同时因为载体治疗基因被强烈地吸附于血管支架表面蛋白质吸附层上，所以基因很容易随血管支架被固定于治疗部位，达到靶向输送或局部定位基因的目的。
文档编号A61M29/00GK1408446SQ02136779
公开日2003年4月9日 申请日期2002年9月3日 优先权日2002年9月3日
发明者张一 , 高润霖, 王建科, 唐智荣, 何水英, 周顺华 申请人:微创医疗器械(上海)有限公司