含聚羟基烷醇酸酯的粒状体及其制备方法

专利名称：含聚羟基烷醇酸酯的粒状体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微胶囊等粒状体，其特征是含有聚羟基烷醇酸酯(以下简记作PHA)形成的固相，内包有固相、液相、气相中至少一种相所形成，而上述聚羟基烷醇酸酯至少含有以3-羟基链烷酸为单体的单元，进而涉及以对该PHA进行内包的固相、液相、气相中至少1种相进行包覆所形成的为特征的微胶囊等粒状体。另外，本发明涉及微胶囊等粒状体的制备方法，其特征是由水相及至少含PHA的油相形成的W/O型乳液、或者，使W/O型乳液进一步在水相中乳化的W/O/W型乳液，使PHA含有固相、液相、气相中至少1种相，进而进行包覆，例如涉及利用液中干燥法、相分离法、喷雾干燥法或者参照这些方法的方法，制备微胶囊等粒状体的方法。
本发明涉及制备方法，其特征是由至少含有PHA的油相及水相形成的O/W型乳液，用PHA进行胶囊化，进而对胶囊化包覆，例如，涉及利用液中干燥法、相分离法、喷雾干燥法或参照这些方法的方法，制备粒状体的方法。
进而本发明涉及微胶囊等粒状体的制备方法，其特征是在由水相及油相形成的W/O型乳液、或将该W/O型乳液进一步在水相中乳化的W/O/W型乳液中，利用水相中含有的PHA合成酶和3-羟酰基辅酶A合成PHA，使PHA中含有固相、液相、气相中的至少1种相，进而进行包覆。
本发明还涉及粒状体的制备方法，其特征是从由油相及至少含有PHA合成酶和3-羟酰基辅酶A的水相形成的O/W型乳液，通过该水相中的PHA合成酶使3-羟酰基辅酶A聚合合成PHA，由PHA进行胶囊化，再对胶囊化包覆。
进而本发明涉及医药品、农药等中含有药物的缓释型的微胶囊等粒状体及该微胶囊等粒状体的制备方法。
本发明还涉及含有颜料、染料、血红蛋白、化妆品成分或肥料成分形成的粒状体及其制备方法，进而涉及含有这些粒状体形成的油墨组合物、血细胞组合物、化妆品组合物或肥料组合物及其制备方法。
本发明还涉及内包气相形成的中空微胶囊等中空粒状体、其制备方法、以及将这些中空粒状体用作超声波反射体的超声波显像剂。此外，本发明也涉及利用这些中空微胶囊等中空粒状体，对经口服或不经口服给与生物体内、用于超声波诊断而使用的超声波显像剂的应用，及其制备方法。
背景技术：
微胶囊技术，在医药品、农药、食品、粘接剂、液晶等多学科领域内，都在进行研究。例如，在医药品中进行的研究是对至今药效持续时间短的药物进行改进获得一种缓释性制剂，能长时间内发挥效果的应用的研究，不用说，药理持续效果是期望对药物用量减少、副作用减轻、非顺应性的改进等效果。近几年来，作为缓释性制剂组合物提出各种方案，可以恒定率释放药物，将药物释放速度控制在零级释放的控释制剂组合物。作为这样的控释制剂，例如，正在开发研制口服制剂、注射剂、皮肤贴剂等。
不仅在医学、药学领域，例如，在化妆品领域中，对于稳定性存在问题的有效成分，期待着一种有选择地向患部转移、具有缓释性的材料。进而，在农业领域中，正在研究具有缓释性功能的农药和肥料，而在记录材料的领域中，正在研究各种胶囊油墨的应用，等等。
例如，在药学领域，作为使用聚羟基烷醇酸酯形成封装药剂的胶囊实例，如USP6146665中公开的，由聚羟基烷醇酸酯形成的多孔性颗粒捕捉(Enterapped)亲水性药剂的微粒子、和将作为芯材料溶解了亲油性药剂的油滴封装(Encapsulated)到由聚羟基烷醇酸酯形成的壳体中、制备药剂组合物的方法。
在这些中，对口服制剂进行广泛的研究和开发，许多制剂已上市出售，不过对于注射剂，仅有临床使用的一部分长效胰岛素制剂等。其理由是还没有开发出具有缓释性的高分子化合物。口服制剂中使用的高分子化合物未必一定要在生物体内被分解，但是，注射剂不能在生物体内出现毒性，被分解依靠代谢排泄出，在实用上是绝对的必须条件，进而要求极严格的条件，在其施用部位绝不能引起局部障碍等。
在这种状况下，近年来研究了很多的高分子化合物，这些中，手术缝合用的聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、羟基丁酸-乙醇酸共聚物等，有望作为安全且有用的高分子化合物(特公平1-57087号公报、WO94/10982公报、特开平8-151322号公报、特开平8-217691号公报)。实际上，以调制缓释性制剂为目的，使用这些高分子化合物的微胶囊化的技术也多有报导。关于聚-3-羟基丁酸(以下简写作pHB)，报导了控制活性成分释放的调节性肽的微胶囊和含有持续剂(ラステツド)的微胶囊(特开昭61-431119号公报、Drug Delivery System7(5)、367-371、1992、同8(2)、131-136、1993)。关于3-羟基丁酸/4-羟基丁酸共聚物，也公开了一种利用单体单元比控制生理活性物质释放率的缓释性制剂(特开平11-199514号公报)。
这些技术中多数是包含水易溶性药物的，例如，特开昭60-100516号和特开昭62-201816号中公开了一种利用水中干燥法，以高捕集率制备分散性良优选水溶性药物缓释性微胶囊的方法。特开平1-163135号公报、特开平2-124814号公报中公开了在聚乳酸-乙醇酸共聚物中含有水溶性药物的方法，在特开平2-124814号公报中公开了含有生理活性多肽的缓释性制剂、在特开平2-330741号公报中公开了含有顺铂的缓释性制剂，进而在特开平5-294839号公报中，公开了一种含有乳酸/乙醇酸的组成比为80/20～100/0，重均分子量为7000～30000的共聚物/均聚物的，可以在2个月以上的零级释放多肽的长期缓释型的微胶囊。
这样，大致区分一下以前的微胶囊制法，可分成3类，即，界面聚合法、原位聚合法等化学方法，相分离法(凝聚作用法)、界面沉淀法、液中干燥法、节流法等物理化学方法，喷雾干燥法、干式混合法等机械方法。这些中，作为使水溶性药物形成微胶囊化的方法，提出采用界面聚合法、原位聚合法、液中干燥法、节流法、相分离法(凝聚作用法)等。
关于各种生理活性多肽和低分子水溶性药物的缓释性微胶囊也多有报导Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、12卷、1-9页(1995)，特表平2-503315号公报；EPA 0586238；J.Pharm.Sci.75卷、750-755页(1986)，特开昭57-118512号公报]、其中很多是，(1)在制备过程中，药物向外水相泄漏很大，导致药物的封装率低、(2)得到的胶囊一般是多孔质，初期释放很大、(3)由制备过程导致生理活性物质变性，得不到充分的生物学利用率，从以上所说几点，当前的现状是还不能达到满足相应用途的长期的缓释性要求。
对于改进微胶囊的缓释性，在特开昭61-63613号中有所记载，在以聚乳酸为基质的微胶囊中，为防止给药一定时间后活性成分的释放速度降低，在分散了活性成分的聚乳酸有机溶剂溶液中，均匀溶解该溶剂能溶解，而且在生物体内能消化的脂溶性添加物(中链脂肪酸三甘油酯、低级脂肪酸三甘油酯等)。然而，关于在其他基剂的应用和使用活性成分的水溶液调制微胶囊，没有作出暗示。在特开平8-151321号公报中公开了一种由含有无晶型水溶性生理活性物质和高分子聚合物的，S/O/W型乳化物制备的微胶囊，但是，关于将药物水溶液用作内水相的微胶囊制备方法和使用水溶性生理活性肽的金属复合体的方法，都没有记载。在EP0765660号公报中记载了含有无晶型2-哌嗪酮-1-醋酸衍生物的微胶囊，在其制备中，使用了S/O/W型乳化剂。然而，对将药物水溶液用作内水相的微胶囊的制备方法和使用水溶性生理活性肽的金属复合体的方法，却没有记载。一般讲，在水溶性生理活性物质的微胶囊的制备中，就药物含量的均质性和操作性方面考虑，与使用固体状药物，例如，S/O型相比，W/O型更优越，所以在以工业规模大量生产中，优选使用W/O型。
这样，在使用了缓释性制剂的药剂释放控制中，屡次指出的问题是体内服用缓释性制剂后，在药剂释放的初期阶段，存在大量的药剂化合物一次释放的现象(初期猝发现象)。缓释性制剂产生初期猝发现象时，根据情况，体内血液中药剂化合物浓度会超过允许的上限，对患者带来危险。通过选择药剂化合物种类和生物体内分解性聚合物的结构，找到了避免某种程度初期猝发的方法，但根本防止初期猝发现象的解决方法还末发现。另一方面，为了使药剂化合物能长期缓释，或者从经济上考虑，尽可能地在制剂中含有少量的高价药剂，要求在微胶囊中，尽可能以高浓度含有药剂化合物。
然而，在以前公知的微胶囊调制方法中，药剂化合物进入微胶囊中的比例(进入率)往往很低。特别是将水溶性药物用作药物时，药物很容易向膜外散发，药物的封装率很低，这是个大问题。以提高进入率的方法调制的微胶囊，存在的缺点是在药剂释放时很容易引起初期猝发现象。
在超声波诊断或检查领域，作为超声波反射体，提出将聚合物微小球的微气球给药到生物体内。多年来就已知道，分散在液体中的细小包泡，即微气泡对于超声波诊断或检查就是非常有效的超声波反射体。然而，微气泡在短时间内，即使在添加稳定剂的状态下，充其量也在数分钟内消失掉。为此，需要在调制微气泡后立刻给药到生物体内，实际上在医疗现场很难使用。为了在给药到生物体内后易于通过血管透过，该气泡的尺寸必须在1～10μm。在微气泡中，生成的气泡大多在40～50μm，就此点，给以生物体内，用于超声波诊断，未必就好用。
为了解决这些微气泡具有的问题，如上述，提出了将聚合的微小球的微气球给药到生物体内(例如，特开平3-94774号公报)。但是，利用以前方法获得的微气球，为获得更高的显像效果(对比度效果)，必须大量给药，特别是心肌显像时，充分满足所要求的高显像效果(对比度效果)，但问题是没有有效的显像剂。作为其原因，是在微粒子内部没有中空结构，很难得到含有大量气泡的均匀微粒子。此外，大量服用这种微气球，根据情况，会对生物体造成过度负担，从安全角度考虑，仍存在进一步改进的问题。
因此，近年来，利用生物工程的方法制备高分子化合物的研究非常活跃，其中一部分已实用化。例如，作为来自微生物的高分子化合物，已知有pHB和3-羟基-正丁酸和3-羟基-正戊酸的共聚物(以下简记作pHB/V)等PHA、细菌纤维素或茁霉多糖等多糖类、聚-γ-谷氨酸和聚赖氨酸等聚氨基酸。特别是PHA、和以前的塑料一样，通过熔融加工等，可利用于各种制品，对生物体的适应性也很优良，有望作为医疗用软质材料等应用。
到目前为止，报导了大量的微生物生产PHA并蓄积在菌体内。例如，报导了利用富养产碱杆菌H16株(Alcaligenes eutr opus H16、ATCC No.17699)、甲基杆菌属(Methylobaoterium SP.)、副球菌属(Paracoccus SP.)、产碱菌属(Alcaligenes SP)、假单胞菌属(Pseudomonas SP.)的微生物生产pHB/V(特开平5-7492号公报、特公平6-15604号公报、特公平7-14352号公报特公平8-19227号公报等)。
还公开了食酸丛毛单胞菌1FO 13852株(Comamonas acidovorans 1FO13852)生产单体单元上具有3-羟基-正丁酸和4-羟基-正丁酸的PHA(特开平9-191893号公报)。进而公开了利用豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)生产3-羟基-正丁酸和3-羟己酸的共聚物(特开平5-93049号公报、特开平9-265065号公报)。
这些pHB和pHB/V的生物合成，是将从各种碳源经过生物体内的各种代谢途径生成的(R)-3-羟基丁酰CoA或(R)-3-羟基戊酰CoA作为底物，由酶进行聚合反应。
催化这种聚合反应的酶是pHB合成酶(pHB聚合酶、pHB合酶)。所说的CoA是辅酶A(Coenzyme A)的简称，其化学结构如下述化学式。 近年来，致力于对由3～12个碳原子的中链长(medium-chain length)的3-羟基链烷酸单位形成聚羟基烷醇酸酯(以下有时写作mcl-PHA)的研究。
例如，在特许公报第2642937号中公开了通过向食油假单胞菌ATCC29347株(Pseudomonas oleovorans ATCC29347)提供非环状脂肪族烃，生成具有6-12个碳原子的3-羟基链烷酸单体单元的PHA。在Appl.Environ.Microbiol 58 746(1992)中报导了利用食树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)将辛酸作为单一碳源、将3-羟基-正丁酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸形成单体单元，生产PHA、将己酸作为单一碳源、将3-羟基-正丁酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸作为单体单元，生产PHA。此处，导入链长比原料脂肪酸长的3-羟基链烷酸单体单元，认为是经由后述的脂肪酸合成途径。
在Int.J.Biol.Macromol.16(3)，119(1994)中报导了利用假单胞菌SP.61-3株(Pseudomonas sp.strain 61-3)，将葡萄糖酸钠作为单一碳源、将3-羟基-正丁酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、3-羟基十二酸等所谓3-羟基烷酸、和所说的3-羟基-5-顺-癸烯酸、3-羟基-5-顺-十二烯酸等所谓3-羟基酸作为单体酸，生产PHA。
上述的PHA是由侧链上具有烷基的单体单元形成的PHA(以下有时简写作usual-PHA)。然而，考虑到更广范围的应用时，例如作为功能性聚合物的应用时，在侧链上导入烷基以外的取代基(例如，苯基、不饱和烃基、酯基、烯丙基、氰基、卤代烃基、环氧化物等)的PHA(以下简写作unusual-PHA)是极其有用的。
作为生物合成具有苯基的unusual-PHA的实例，例如，Macromolecules 24，5256-5260(1991)、Macromol.Chem.1991，1957-1965(1990)、Chirality 3492-494(1991)等中，报导了利用食油假单胞菌，从5-苯基戊酸生产含有3-羟基-5-苯基戊酸单位的PHA。Macromolecules 29 1762-1766(1996)中报导了利用食油假单胞菌，从5-(4-甲苯基)戊酸(5-(4-甲基苯基)戊酸)生产含有3-羟基-5-(4-甲苯基)戊酸单位的PHA。进而，在Macromolecules 322889-2895(1999)中报导了利用食油假单胞菌，从5-(2，4-二硝基苯基)戊酸、生产含有3-羟基-5-(2，4-二硝基苯基)戊酸单位和3-羟基-5-(4-硝基苯基)戊酸单位的PHA。
作为具有苯氧基的unusual-PHA实例、在Macromol Chem Phys 1951665-1672(1994)中，报导了利用食油假单胞细菌，由11-苯氧基十一烷酸，生产含有3-羟基-5-苯氧基戊酸单位和3-羟基-9-苯氧壬烷酸单位的PHA。在Macromolecules 29 3432-3435(1996)中报导了利用食油假单胞菌，从6-苯氧基己酸生产含3-羟基-4-苯氧基丁酸单位和3-羟基-6-苯氧基己酸单位的PHA、从8-苯氧辛酸生产含有3-羟基-4-苯氧基丁酸单位、3-羟基-6-苯氧基己酸单位和3-羟基-8-苯氧基辛酸单位的PHA、从11-苯氧基十一烷酸生产含有3-羟基-5-苯氧基戊酸单位和3-羟基-7-苯氧基庚酸单位的PHA。
进而，在Can.J.Microbiol.41，27-24(1995)中，报导了利用食油假单胞菌ATCC 29347株和恶臭假单胞菌KT 2442株(Pseudomonas putida KT 2442)，由对氰基苯氧己酸或对硝基苯氧己酸，生产含有3-羟基对氰基苯氧基己酸单位或3-羟基硝基苯氧基己酸单位的PHA。特许第2989175号公报中记载了由3-羟基-5-(单氟苯氧基)戊酸单位或3-羟基-5-(二氟苯氧基)戊酸单位形成的均聚物、至少含有3-羟基-5-(单氟苯氧基)戊醇酸酯(盐)单位或3-羟基-5-(二氟苯氧基)戊醇酸酯(盐)单位的共聚物，及其制备方法，作为其效果，熔点高，保持了良优选加工性，而且能赋予立体规则性、疏水性。
作为具有环己基的unusual-PHA实例，在Macromolecules 301611-1615(1997)中报导了利用食油假单胞菌，从环己基丁酸或环己基戊酸生产该PHA。
在侧链上导入取代基的PHA中，作为开发侧链上具有硫醚型(-S-)的硫原子的PHA，在Macromolecules 32 8315-8315(1999)中报导了使用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)27NO1株，以辛酸和11-(苯基磺胺)十一烷酸作为底物，生产含有将3-羟基-5-(苯硫基)戊酸和3-羟基-7-(苯硫)庚酸作为单体单元的PHA。但是，这时，对于恶息假单胞菌27NO1株使用的方法是，作为增殖基质，在只含有辛酸的培养基中进行前培养，将其培养液作为基质，在只有11-(苯硫基)十一烷酸的培养基中进行接种。
进而，在Polymer Oreprints Japan Vol49、No.5 1034(2000)中报导了使用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)27 NO1株，将11-[(苯甲基)硫基]十一烷酸作为底物，生产由3-羟基-5-苄基硫代戊酸和3-羟基-7-[(苯甲基)硫基]庚酸的2种单体单元形成的PHA。但是，这种情况，对于假单胞菌的使用方法是，作为增殖基质，在只含有辛酸的培养基中进行前培养、将其培养液作为基质，在只含有11-[(苯甲基)硫基]十一烷酸的培养基中进行接种。这些mcl-PHA和unusual-PHA的生物合成是从形成原料的各种烷酸，将经过生物体内的各种代谢途径(例如，β氧化系和脂肪酸合成途径)生成的(R)-3-羟基酰基CoA作为底物，利用酶进行聚合反应。催化该聚合反应的酶是PHA合成酶(也称PHA聚合酶、PHA合酶)。上述pHB合成酶是在PHA合成酶中限定成为底物的单体的酶，所以pHB合成酶是包含在PHA合成酶的范畴之内。
以下示出经过利用β氧化系和PHA合成酶素进行聚合反应，由链烷酸到形成PHA的反应。
而经过脂肪酸合成途径时，是将由该途径中生成的(R)-3-羟酰基-Acp(Acp是载带酰基的蛋白质)转变成的(R)-3-羟酰基CoA作为基质，同样由PHA合成酶合成PHA。
近年来开始尝试从菌体取出上述pHB合成酶和PHA合成酶，用体外系(体外in vitro)合成PHA。例如，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92、6279-6283(1995)中报导了通过使3-羟基丁酰CoA被来自富养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)的pHB合成酶作用，成功地合成了由3-羟基-正丁酸单位形成的pHB。在Int.J.Biol Macromol、25、55-60(1999)中，报导了通过使3-羟基丁酰CoA和3-羟基戊酰CoA被来自富养产碱杆菌的pHB合成酶作用，成功地合成了由3-羟基-正丁酸单位和3-羟基-正戊酸单位形成的PHA。进而在该报导中公开了，作用于外消旋体3-羟基丁酰CoA时，根据酶的立体选择性，合成出只由R构型的3-羟基-正丁酸单位形成的pHB。在Macromol.Rapid Commun 2177-84(2000)中还报导了使用来自富养产碱杆菌的pHB合成酶在细胞外的pHB合成。
在FEMS Microbiol Lett 168 319-324(1998)中报导了使3-羟基丁酰CoA被来自酒色着色菌(Chromatium vinosum)的pHB合成酶作用，成功地合成了由3-羟基-正丁酸单位形成的pHB。
在Appl.Microbiol.Biotechnol 54 37-43(2000)中报导了使3-羟基癸酰CoA作用于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PHA合成酶，合成了由3-羟基癸酸单位形成的PHA。
如前所述，通过将生物工程的方法应用于高分子化合物的合成，期待着可以合成用以前的有机合成法难以实现的新型高分子化合物，并能赋予新的功能和结构。多数情况只用一段过程即可实现在以前的有机合成化学方法中，需要经过多段反应的制备过程，有望获得简化制备工艺、降低了费用，和缩短了所用时间等效果。进而，减少有机溶剂和酸、碱、表面活性剂等用量、设定温和的反应条件、可由非石油系原料和低纯度原料(*注释)合成等，还能实现对环境低负荷、且资源循环型的合成工艺。(*注释在生物工程合成工艺中，一般讲，由于作为催化剂的酶基质特异性很高，即使使用低纯度的原料，也能有选择地进行所希望的反应。因此也能期待使用废弃物和再循环原料等。)另一方面，作为对高分子化合物赋予更大付加值的核心技术，发明者们着眼于用高分子化合物包覆药物的微胶囊。通过用这类高分子化合物包覆特定的药物，可获得具有极有用的功能性，特别是缓释性的微胶囊。如上述制作微胶囊的尝试，以前利用有机合成的方法已进行了很多。
假如这些微胶囊利用如上述的生物工程方法也能制备的话，认为可期待能利用新的高分子化合物和赋予新的功能和结构，也能以低费用实现环境负荷低的、资源可循环型的制备工艺。例如，利用在生物催化作用下特有的极严密的分子识别能力和立体选择性，可以极简便，且环境负荷低的工艺，制备出由新功能性高分子化合物和极高手性的高分子化合物包覆的微胶囊。
因此，本发明的目的是提供一种利用上述高功能的高分子化合物形成的微胶囊等粒状体及其制备方法，进而提供一种利用生物工程的方法形成微胶囊等粒状体的制备方法。
如前所述，当前的现状是在生物降解性高分子的聚乳酸或乳酸一乙醇酸共聚物形成的微胶囊等中浸含了水溶性药物，就药物释放特性方面，仍残留着很多问题。关于水溶性药物，药物易散发，因此，不能使药物有效地保持在粒状体内，不能微胶囊化仍是很大的课题。
本发明就是为解决上述以前的老技术问题而形成的一项发明，就其目的是提供一种缓释性制剂及其制备方法，即使是含有药物，特别是含有水溶性药物的微胶囊等粒状体、或者含有实际上水中不溶解药物(这其中包括一般所说的难水溶性药物的药物)的微胶囊，也不显示形成实际上有问题的初期释放，而是在一定期间的实用中呈现出允许的零级释放。还提供一种将药物，特别是水溶性药物内包在胶囊等粒状体中，稳定性优选高药物含量的缓释性制剂及其制备方法。
例如，在USP 6146665中公开的由聚羟基烷醇酸酯形成的多孔性颗粒捕获了亲水性药剂的微粒子，无毒性、有生物降解性、可原位捕获药剂，但，因为是多孔性的结构，所以依靠扩散能迅速地释放出亲水性药剂，难以控制缓释性。
即，本发明要解决的一个课题是提供一种药剂保持粒子，通过使聚羟基烷醇酸酯的结构最佳化，获得药剂保持能力和缓释性最佳化，即使对于亲水性药剂及其他水溶性物质和亲油性药剂及其他疏水性物质，保持性都很优良，并能控制缓释性。
进而本发明还提供在上述粒状体中含有颜料、染料、农药成分、血红蛋白、化妆品成分或肥料成分形成的粒状体及其制备方法。还提供含有这些粒状体形成的油墨组合物、农药组合物、血细胞组合物、化妆料组合物或肥料组合物及其制备方法。
如前所述，在利用以前的方法获得的微胶囊中，因为微粒子内部没有中空结构，难以获得含有大量气泡的均匀微粒子，在超声波诊断和检查中，在达到高显像效果(对比度效果)方面必须大量给药，特别是在心肌显像方面，没有能充分满足所要求的高显像效果(对比度效果)的有效显像剂仍是很大的课题。大量给以这种微气球，根据情况，会使生物体承受过度的负担，就安全性方面仍存在进一步改进的课题。
本发明就是解决上述课题的发明，本发明提供一种中空微胶囊等的中空粒状体的制备方法，由于在微粒子中含有大量的气泡，可有选择地获得大量具有一片PHA膜、具有微胶囊状的中空结构的微粒子，利用这种中空微胶囊等中空粒状体，提供了能发挥高显像效果的超声波显像剂及其制备方法。更具体讲，提供了一种可应用于心肌、心腔或肝脏的超声波诊断和检查中的，显像效果高的超声波显像剂。

发明内容
本发明的这种粒状体是具有如下特征的粒状体，即，用含有聚羟基烷醇酸酯的固相内包固相、液相、气相中至少一种相，而聚羟基烷醇酸酯含有3-羟基链烷酸单位。
进而涉及一种生物工程的制备粒状体的方法，即，向含有PHA合成酶的反应体系内加入3-羟酰基CoA，进行反应，在水相/油相界面处合成所要求的PHA。再由PHA将固相、液相、气相中至少一种相形成胶囊化，进而进行包覆的粒状体。
本发明的这种制剂是含有上述粒状体的制剂。本发明的这种制剂制备方法是包括上述粒状体制备过程的制剂制备方法。这种制剂，对于药物，特别是实际上水不溶解的药物，作为初期释放很少、长期间内呈现出良好缓释性和高药物含量的缓释性制剂最适用。这种制剂对于药物、特别是水溶性药物，作为初期释放很少、长期间显出良优选缓释性、高药物含量的缓释性制剂最适用。
进而，本发明者们以开发显像效果(对比度效果)高的超声波显像剂为目的，进行了深入的研究，结果明确知道了本发明的中空粒状体，作为在微粒子中可含有大量气泡的中空粒状体是合适的，进而，将上述中空粒状体在水中分散后，减压下干燥，通过在干燥机内充满全氟化碳的气体，上述气体充满中空粒状体的内部中空结构即气泡内时，得到在生物体内超声波显像效果更高的显像剂，并至此完成本发明的这种超声波显像剂。即，本发明的超声波是含有上述中空粒状体的超声波显像剂。本发明的超声波显像剂可用于心肌显像用、心腔(构成心脏的心室、心房等空间)显像用或肝脏显像用。
附图简述

图1是实验例16中试验方法的原理说明图。
发明的详细描述作为本发明的粒状体(以下也叫作微胶囊，并不限定二层结构，只要是在固相中包含固相、液相、气相中的至少一种相即可)，例如，由含有侧链上带取代基的各种结构单体单元的PHA内包有固相、液相、气相中至少一种相形成的胶囊，进而具有包覆形态的微胶囊，作为高功能性微胶囊极为有用，以下对本发明作更详细的说明。
<微胶囊>
本申请说明书中使用的“微胶囊”术语的概念中，这些术语完全包含了一般在药品传递系统(DDS)和高分子化学中具有的概念，但不一定是等同的概念。关于本申请的权利要求和说明书中使用的“微胶囊”扫描电子显微镜的形态方式，例如也包括像具有很多悬钓子状或金米糖(こんペ～いとう、葡萄牙语的Confeito)状突起的方式、红细胞状的扁平方式、橄榄球状的旋转椭圆体方式、大肠杆菌状的纺锯形方式等。本申请说明书中言及到的“微胶囊”，通常具有作为构成，例如聚合物乳液、胶乳、聚合物悬浮液的微球特性。这样在本申请专利要求范围和说明书中使用的“微胶囊”术语，这些术语与药物传递系统(DDS)和高分子化学中的一般概念，不一定是等同的概念，但对本发明的杂聚合物体的本质“方式”，当谈及它时，用起来很方便。
例如，本发明的微胶囊中，作为固相、液相、气相中至少1相和PHA的相互关系方式，例如包括1)由在形成微小球中固相的PHA内分散·混合固相、液相、气相中至少1相的混合相1相形成的整体型、2)以在PHA的薄膜(包覆层)内部含有·保护固相、液相、气相中至少一个相的形式，由外膜和其内部的2个相形成的贮存器型等。
本发明中，从所说的在微胶囊内装有大量的固相、液相、气相中至少1个相的观点看，2)的形式更优选。例如，内包液相对，作为液相有油相和水相，也可采用将水相和油相混合存在于同一胶囊内的构成。此处所说的“油相”和“水相”分别相当于形成乳液时的“具有作为油相性质的相”和“具有作为水相性质的相”、本发明中，特别是在保持药剂等中，对于优选用的油相成分，特别是非限定性的代表实例，例如，可使用以下能与水形成乳液的油相成分，即，植物油(如大豆油、芝麻油、棉籽油、橄榄油、红花油、玉米油、菜籽油、花生油等)、中链脂肪酸三甘油酯类[例如，日本油脂株式会社制的パナセ一ト800、810、1000、1200等6～12个碳原子的脂肪酸(如辛酸、癸酸、月桂酸等)的甘油酯类]、液态烃类(例如，液体石蜡、角鲨烯、角鲨烷等)等。将PHA溶解在油相中，进行微胶囊化，作为将油相内包在微胶囊中时的油相，可使用下述溶解PHA的油相。形成水相时可使用以水为主体的水性溶剂。在这些相中溶解所希望的物质，可形成具有所希望功能的微胶囊。
作为本发明的这种微胶囊，有直径为1～10μm范围的微小球状微胶囊。
将药物等以固体物保持时，对于整体型型粒状体(微球)也可以使用。例如，作为本发明缓释性制剂组合物中含有的粒状体中的药物(A)和PHA(B)相互关系方式，例如有以下1)～4)种。
1)药物(A)含在单一的芯部分、PHA(B)含在壳部分，形成具有芯/壳结构的微胶囊方式。
2)药物(A)含在多个芯部分、PHA(B)含在壳部分，形成具有芯/壳结构的微胶囊方式。
3)药物(A)包含在多个岛状部分，包含岛状部分的PHA(B)包含在海状部分，形成具有芯/壳结构的微胶囊方式。
4)具有药物(A)和PHA(B)相容化的微相分离结构的方式。
这些方式中的芯部，可单独是药物，也可和其他成分形成组合物，壳部可单独是PHA，也可和其他成分形成组合物。
作为本发明的粒状体，例如，至少由具有药效的药物和PHA的组合物构成的直径为10nm(纳米)～100μm的微小球状制剂。从自身乳化性考虑，优选采用亚微米大小的(平均粒径1μm以下)。
本发明的中空粒状体是具有形成微粒子的外形的具有至少由PHA形成的部分、和其内部的至少是中空的部分，也包括在内部也有由PHA形成的隔壁部分和中空部分混合存在的情况。作为其一方式，例如有1)由PHA形成的微小球，中空部分是分散或混合的基本1个相的形成整体型的中空微粒子(也叫作微球)、2)在含有PHA的薄外膜(外被或壳)的内部包含有中空部分(芯)，形成保护形状，很明显是由外膜和其内部的2个相形成的贮存器型等中空微胶囊。
作为本发明中的冲空粒状体”方式，例如有利用至少含有PHA的组合物，构成其外壳的，直径为1～10μm的微小球状中空微粒子。
进而，本发明的中空粒状体中，有中空部分和PHA形成外壳的形态，更具体讲，作为气泡(A)和PHA(B)的相互关系方式，例如有以下1)～4)种。
1)气泡(A)含在单一的芯部，PHA(B)含在壳部，形成具有芯/壳结构的微胶囊方式。
2)气泡(A)含在多个芯部、PHA(B)含在壳部、形成具有芯、壳结构的微胶囊方式。
3)气泡(A)包含在多个岛状部分，内包岛状部分的PHA(B)含在海状部分，形成具有芯/壳结构的微胶囊方式。
4)具有气泡(A)和PHA(B)相容化的微相分离结构的方式。
这些方式中，芯部可单独是气泡，也可和其他成分组合形成组合物，壳部可是单独PHA，也可是和其他成分组合形成的组合物。
进而，在本发明的粒状体中，也可形成具有如下特征的粒状体，即，上述聚羟基烷醇酸酯的单体单元组成，从上述粒状体外壳的内侧向外侧方向上形成变化。
形成的粒状体也可具有下述特征，即，上述聚羟基烷醇酸酯，至少一部分是实施了化学修饰的聚羟基烷醇酸酯。
例如，上述实施了化学修饰的聚羟基烷醇酸酯，作为其化学修饰，可以至少含有具有接枝链的聚羟基烷醇酸酯。这时，上述接枝链可以是对于至少含有带环氧基的单体单元的聚羟基烷醇酸酯，通过对其环氧基的化学修饰导入的接枝链。上述接枝链可以是由具有氨基的化合物形成的接枝链。例如，上述具有氨基的化合物，优选末端氨基改性化合物。作为一例，上述末端氨基改性化合物可以是从聚乙烯胺、聚乙烯亚胺、末端氨基改性聚硅氧烷中至少选出一种的聚合物。
其他，作为实施上述化学修饰的聚羟基烷醇酸酯，也可以是将上述聚羟基烷醇酸酯的至少一部分形成交联化的聚羟基烷醇酸酯。例如，上述交联化的聚羟基烷醇酸酯，可以是相对于含有至少带环氧基的单体单元的聚羟基烷醇酸酯，对其环氧基形成交联化的聚羟基烷醇酸酯。这时，作为一例，上述交联化的聚羟基烷醇酸酯，可以是利用二胺化合物、琥珀酸酐、2-乙基-4-甲基咪唑、电子射线照射处理中至少选出一种方法，进行交联化的聚羟基烷醇酸酯。上述二胺化合物优选六亚乙基二胺。
上述的微胶囊，一般可用W/O/W(水包油包水，Water in oil in Water)型乳化法、O/W(水包油，oil in Water)型乳化法等进行调制。
更具体讲，本申请说明书中的其他发明是含有固相、液相、气相中至少1个相和PHA的微胶囊制备方法，是以下调制方法，即，1)将PHA溶解在氯仿等有机溶剂中，向其加入水溶液进行乳化得到W/O型乳液，2)根据需要，将该乳液投入大量水中，进行乳化得到W/O/W型乳液后，3)通过减压下蒸发等除去有机溶剂，生成微小球状沉淀物，根据需要进行回收和干燥，调制成微胶囊。
本申请说明书中的另一发明是含有固相、液相、气相中至少1种相和PHA的微胶囊制备方法，是以下调制微胶囊的方法，即，1)将PHA溶解于氯仿等有机溶剂中，2)将该有机相投入大量水中进行乳化，得到O/W型乳液，3)通过减压下蒸发等，除去有机溶剂，到超过PHA的溶解度的范围，生成微小球状的沉淀物，根据需要进行回收和干燥，调制成微胶囊。
本申请说明书中的另一发明是含有固相、液相、气相中至少1种相和PHA的微胶囊制备方法，是如下调制微胶囊的方法，即，1)向有机溶剂中添加含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的水溶液，进行乳化，得到W/O型乳液、2)通过进行PHA合成反应，生成微小球状沉淀物，根据需要，进行回收及干燥，调制成微胶囊。
本申请说明书中的另一发明是含有固相、液相、气相中至少1种相和PHA的微胶囊制备方法，是如下调制微胶囊的方法，即，1)向有机溶剂中添加水溶液进行乳化，得到W/O型乳液、2)将该乳液投入含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的大量水中，进行乳化，得到W/O/W型乳液后，3)通过进行PHA合成反应，生成微小球状沉淀物，根据需要，进行回收和干燥、调制成微胶囊。
本申请说明书中的另一发明是含有固相、液相、气相中至少1种相和PHA的微胶囊制备方法，是如下调制微胶囊的方法，即，1)向有机溶剂中投入含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的水溶液，进行乳化，得到W/O型乳液、2)将该乳液倾入含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的大量水中，进行乳化，得到W/O/W型乳液后，3)通过进行PHA合成反应，生成微小球状沉淀物，根据需要进行回收和干燥、调制成微胶囊。
本申请说明书中的另一发明是含有固相、液相、气相中至少1种相和PHA的微胶囊制备方法，是如下调制微胶囊的方法，即，1)向有机溶剂中添加含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的水溶液，进行乳化，得到W/O型乳液、2)将该乳液倾入大量水中，乳化得到W/O/W型乳液后、3)通过进行PHA合成反应，生成微小球状沉淀物，根据需要，进行回收和干燥、调制成微胶囊。
本申请说明书中的另一发明是含有固相、液相、气相中至少1种相和PHA的微胶囊制备方法，是如下调制微胶囊的方法，即，1)将有机溶剂添加到含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的大量水中，进行乳化，得到O/W型乳液、2)通过进行PHA合成反应，生成微小球状沉淀物，根据需要进行回收和干燥，调制成微胶囊。
<关于PHA示例及其制备方法>
作为本发明中可利用的PHA，可举出至少含有下述化学式[1]～[10]表示的单体单元的PHA示例。 (其中，该单体单元是从下述式中R1和a组合的任何单体单元中选出的至少一种。
R1是氢原子(H)、a为0～10的整数的任何一种单体单元、R1是卤原子、a为1～10的整数的任何一种单体单元、R1是发色团、a为1～10的整数的任何一种单体单元、R是羧基或其盐、a为1～10的整数的任何一种单体单元、R1是 ，a为1～7的整数的任何一种单体单元。 (式中，b表示0-7中的任何一个整数、R2表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中选出的任何一个) (式中，C表示1-8中的任一个整数、R3表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中选出的任何一个) (式中，d表示0-7中任何一个整数、R4表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中选出的任何一个。) (式中，e表示1-8中任何一个整数、R5表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5、-C3F7、-CH3、-C2H5和-C3H7中选出的任何一个。) (式中，f表示0-7中的任何一个数。) (式中、g表示1-8中任何一个整数。) (式中，h表示1-7中任何一个整数、R6表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-COOR’、-SO2R”、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、-C(CH3)3中选出的任何一个，其中R’是氢原子(H)、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个、R”是-OH、-ONa、-OK、卤原子、-OCH3和一OC2H5中的任何一个。) (式中，i表示1-7中的任何一个整数、R7表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-COOR’和-SO2R”中选出的任何1个、其中，R’是氢原子(H)、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个、R”是-OH、-ONa、OK、卤原子、-OCH3和-OC2H5中的任何一个。) (式中，j表示1-9中的任何一个数。)本发明中使用的PHA是将3-羟基烷醇酸酯作为单体单元的聚酯树脂。因此，利用微生物生产这种化合物时，该聚酯树脂是只由R体形成的全同立构聚合物，不过，只要在物性/功能两方面都能达到本发明的目的，没有特别必要是等规聚合物，对于无规聚合物也可以利用。通过使用有机金属系催化剂(例如，含有铝、锌、锡等的有机催化剂)对内酯化合物进行开环聚合的化学合成方法也能获得PHA。
调制W/O型乳液、W/O/W型乳液或O/W型乳液，同时利用PHA合成酶与3-羟酰基CoA的聚合反应合成PHA时，只要是利用涉及PHA的合成反应的PHA合成酶合成的PHA就可以，对此没有特殊限定。如前所述，PHA合成酶是在生物体内PHA合成反应体系中催化最终阶段的酶，因此，只要是在生物体内能合成已知的PHA就可以，均可接受该酶的催化作用合成。因此，通过使与所希望的PHA相对应的3-羟酰基CoA被PHA合成酶作用，在生物体内可合成的已知的所有种类的PHA，用该PHA制作含有固相、液相、气相中的至少1种相，进而包覆的微胶囊。
本发明中，关于侧链结构R1～R7可以从各种原子或官能基中选出1种以上的原子或官能基。关于R2～R7的取代位置，在邻位、间位或对位任何一个位置都能取得由相应的单体单元形成的PHA，但功能性、物性等在任何异性体内没有很大差异时，就收率或向聚合物中进入的难易程度考虑，优选使用间位或对位的置换体。
作为上述卤原子的具体实例，有氟、氯、溴等。作为上述的发色团，只要是能由含发色团的原料化合物合成PHA的就可以，没有特殊限定，当考虑到高分子合成时的立体障碍等时，在原料化合物烷醇酸酯末端的羧基和发色团之间，优选具有1～5个碳原子的亚甲基。如果发色团的光吸收波长在可见光区域内，得到着色的结构，即使光吸收波长在可见光区域以外，作为电子材料仍可使用，作为这样的发色团实例，有亚硝基、硝基、偶氮、二芳基甲烷、三芳基甲烷、呫吨、吖啶、喹啉、甲川、噻唑、吲哒胺、靛酚、内酯、氨基酮、羟基酮、二苯乙烯、吖嗪、噁嗪、噻嗪、蒽醌、酞菁、靛染料等。
作为本发明中使用的PHA，也可使用含有上述多个单体单元的无规共聚物和嵌段共聚物、通过利用各单体单元和所含官能基的特性可以控制PHA的性质、和赋予多种功能、利用官能基间的相互作用实现新的功能等。进而通过适当控制单体化合物的添加量和添加顺序、也可以合成任意的顺序和组成比的嵌段共聚物。根据需要，合成PHA后，或者在合成之中，也可实施化学修饰等。例如，通过历时改变底物3-羟酰基CoA的种类和浓度等组成，也可改变从微胶囊内侧向外侧方向中PHA的单体单元组成。适当选择微胶囊表层的PHA和内层的PHA，可进一步提高本发明的效果，例如液相或气相的保持功能、缓释性的控制、水溶液中自身的分散性等。更具体讲，适当选择PHA的单体单元，在从微胶囊内侧向外侧方向上变化，例如可形成多层结构或梯度结构。
通过在微胶囊表层的PHA中导入接枝链，可以由接枝链引发出现如液相或气相的保持功能、水溶液中自身分散性、缓释性控制等功能性。通过使微胶囊表层的PHA交联化，例如，可提高液相或气相的保持功能、提高微胶囊的机械强度、控制缓释性等。
这样使用微生物在体(in vivo)合成或体外体外(in vitro)合成生产本发明的PHA时，可含有上述各种单体单元，考虑到需要聚合物的机械性、物性等时，可设计含有适当的数量。一般讲，所含单体单元达到上述6种时，即可充分达到本发明的目的，希望有微妙的功能性、物性的控制时，也可以由更多种类的单体单元构成。
本发明微胶囊中使用的、通过PHA生产微生物或PHA合成酶进行体外合成而合成的PHA，一般是只由R体构成的全同立构型聚合物。
本发明中通过选择可合成PHA的微生物培养条件等，获得这些所要求物性的PHA。例如，通过控制培养时间，可控制数均分子量。另外，通过使用溶剂萃取，再沉淀等方法去除低分子量成分，可控制数均分子量。在体外合成中，通过适当选择反应溶液的组成、反应时间等条件，可控制各种物性。
PHA的分子量，以数均分子量计为1000～1000万左右，优选5000～100万左右。这些PHA的分散度(重是均分子量/数均分子量)，优选1～10，更优选1～5。
本发明的微胶囊中，例如，含有液相时，液相的保持和缓释功能，或水溶液中自身的分散性等是重要的。本发明的微胶囊具有的最大特征就是解决了这样的问题。即，液相保持和缓释功能、或水溶液中的自身分散性等，通过上述的控制PHA的单体单元的种类/组成比/分子量/结晶性，就可以控制。
作为缓释性制剂，含有药物，特别含有水溶性药物时，控制释放持性必须控制初期释放速度和之后的翻译速度两个方面。
本发明的缓释性制剂具有的最大特性是解决了上述问题。即，如上述，通过控制PHA的单体单元种类/组成比/分子量/结晶性，可控制药物的初期释放量，另外对于药物的释放时间，通过控制PHA的单体单元种类/组成比/分子量/结晶性，可与初期的释放量一样控制。本发明的缓释性制剂，并不仅限于药物释放特性只是零级释放的缓释性制剂，可任意提高设定初期的释放量，在药物释放时间上，也可以调制具有延时的缓释性制剂，其应用范围极其广泛。
进而，作为缓释性制剂，对于含有药物，特别是含有水不溶药物时，对于释放特性的控制，必须控制初期释放速度和之后的释放速度两个方面两方面控制。本发明缓释制剂的最大特征就是解决了此问题。即，如上述，通过控制PHA的单体单元种类/组成比/分子量/结晶性，可控制药物的初期释放量，关于药物的释放时间，通过控制PHA的单体单元种类/组成比/分子量/结晶性，也可以控制和初期的释放量一样。本发明的缓释性制剂，并不仅限于药物释放特性只是零级释放的缓释性制剂，可任意提高设定初期的释放量、对于药物的释放时间，也可以调制具有延时的缓释性制剂，其应用范围极其广泛。
就用作超声波显像剂而言，中空粒状体中所含气泡的量，以及该气泡的保持功能都是重要的。本发明的超声波显像剂的最大特征是提高了该气泡的保持功能，将本发明的中空粒状体用作超声波反射体。即，气泡的保持功能，通过控制PHA中所含单体单元的种类/组成比/分子量/结晶性，即可控制。
作为利用微生物生产获得PHA的具体方法，可以利用可由与式(1)～(10)的单体单元相对应的烷酸制备含有1种以上式(1)～(10)的单体单元的PHA的微生物，在含有相应的烷酸的培养基中培养而进行。作为本发明可制备PHA的微生物。有从生产PHA的微生物中适当选择的微生物，或者，导入了这些微生物的PHA合成酶基因的转化体等。有关培养方法以下讲述。
例如，通过对可由下式[22]表示的5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)制备含有下式[21]表示的3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(3-HFPV)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HFPV单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 另外，通过对可由下式[24]表示的4-苯氧基丁酸(PxBA)制备含有下式[23]表示的3-羟基-4-苯氧丁酸(3HPxB)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HPxB单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 或者，通过对可由下式[26]表示的4-环己基丁酸(CHBA)制备含有下式[25]表示的3-羟基-4-环己基丁酸(3HCHB)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HCHB单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 再者，通过对可由下式[28]表示的5-苯甲酰基戊酸(BzVA)制备含有下式[27]表示的3-羟基-5-苯甲酰基戊酸(3HBzV)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HBzV单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 另外，通过对可由下式[30]表示的5-(4-氟苯甲酰基)戊酸(FBzVA)制备含有下式[29]表示的3-羟基-5-(4-氟苯甲酰基)戊酸(3HFBzV)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HFBzV单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 通过对可由下式[32]表示的5-噻吩基戊酸(TVA)制备含有下式[31]表示的3-羟基-5-噻吩基戊酸(3HTV)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HTV单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 通过对可由下式[34]表示的5-噻吩甲酰基戊酸(ToVA)制备含有下式[33]表示的3-羟基-5-噻吩甲酰基戊酸(3HToV)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HToV单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 通过对可由下式[36]表示的5-(4-氟苯硫基)戊酸(FTPxVA)制备含有下式[35]表示的3-羟基-5-(4-氟苯硫基)戊酸(3HFTPxV)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HFTPxV单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 通过对可由下式[38]表示的5-[(4-氟苯甲基)硫基]戊酸，制备含有下式[37]表示的3-羟基-5-[(4-氟苯甲基)硫基]戊酸单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含3-羟基-5-[(4-氟苯甲基)磺胺基]戊酸单体单元的聚羟基烷醇酸酯。

通过对可由下式[40]表示的5-噻吩硫基戊酸(TTxVA)，制备含有下式[39]表示的3-羟基-5-噻吩硫基戊酸(3HTTxV)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HTTxV单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 通过对可由下式[42]表示的辛酸(OA)，制备含有下式[41]表示的3-羟基-辛酸(3HO)单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3HO单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 通过对可由下式[44]表示的辛烯，制备含有下式[43]表示的3-羟基-7，8-环氧辛酸单体单元的聚羟基烷醇酸酯的微生物进行培养，可制备出含有3-羟基-7，8-环氧辛酸单体单元的聚羟基烷醇酸酯。 <微生物>
本发明方法中使用的微生物，只要是能在含有对应链烷酸的培养基中进行培养，进行生产含有化学式(1)～(10)中所示单位中至少1种的PHA获得的微生物，不管如何形成的微生物都可以。
作为合成PHA的微生物，可以使用pHB和pHB/V生产菌，作为这样的微生物，产单胞杆菌属(Aeromonas sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、有色菌属(Chromatium sp.)、丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)、甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、副球菌属(Paracoccus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)等，除此之外，还可以使用由本发明者们分离的洋葱伯克霍尔德氏菌·KKO1株(Burkholderia cepacia KKO1)、富养罗尔斯通氏菌·TB64株(Ralstonia eutropha TB64)、产碱杆菌属·TL2株(Alcaligenes sp.TL2)等。KKO1株的寄存编号为FERM BP-42 35，TB64株的寄存编号为FFRM BP-6933，TL2株的寄存编号为FERM BP-6913，分别寄存在经济产业省生命工学工业技术研究所特许微生物保藏中心。
例如，可使用mcl-PHA和unusual-PHA的生产菌，作为这样的微生物，有上述的食油假单胞菌、食树脂假单胞菌、假单胞菌属61-3株、恶臭假单胞菌·KT2442株、铜绿假单胞菌等，此外还可使用本发明者们分离的恶臭假单胞菌属·P91株(Pseudomonas putida P91)、菊苣假单胞菌·H45株(Pseudomonascichorii H45)、菊苣假单胞菌·YN2株(Pseudomonas cichorii YN2)、杰氏假单胞菌·P161株(Pseudomonas jessenii P161)等假单胞菌属微生物、和特开2001-78753号公报中记载的伯克霍尔德氏菌属·OK3株(Burkholderiasp.OK3 FERMP-17370)、特开2001-69968号公报中记载的伯克霍尔德氏菌属·OK4株(Burkholderiasp OK4、FERMP-17371)等伯克霍尔德氏菌属微生物。除了这些微生物外，也可以使用属于产单胞菌属(Aeromonas sp.)、丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)等生产mcl-PHA和unusual-PHA的微生物。P91株的保藏编号是FERM BP-7373、H45株的保藏编号是FERM BP-7374、YN2株的保藏编号是FERM BP-7375、P161株的保藏编号是FERM BP-7376，根据有关专利手序微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约，国际保藏在经济产业省产业技术综合研究所(旧通商产业省工业技术院)生命工学工业技术研究所专利微生物保藏中心。
列举上述P91株、H45株、YN2株和P161株的细菌学性质如下。关于P161株、16SrRNA的碱基序列示于列编号1(恶臭假单胞菌·P91株的菌学性质)(1)形态学的性质细胞的形状和大小杆菌、0.6μm×1.5μm细胞的多形性无运动性有芽胞形成无革兰氏染色性阴性菌落形状圆形、全缘光滑、低凸状、表层光滑、光泽、乳白色(2)生理学的性质过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验氧化型硝酸盐的还原阴性吲哚的生成阴性葡萄糖酸性化阴性精氨酸二水解酶阳性脲酶阴性七叶苷水解性阴性明胶水解性阴性β-半乳糖苷酶阴性在King’s B琼脂中的荧光色素产生阳性(3)底物利用能力葡萄糖阳性L-阿拉伯糖阴性D-甘露糖阴性
D-甘露醇阴性N-乙酰-D-氨基葡萄糖阴性麦芽糖阴性葡萄糖酸钾阳性正癸酸阳性己二酸阴性dl-苹果酸阳性柠檬酸钠阳性醋酸苯酯阳性(菊苣假单胞菌·H45株的菌学性质)(1)形态学性质细胞的形状和大小棒状，0.8μm×1.0-1.2μm细胞多形性阴性移动性可动芽胞形成阴性革兰氏染色阴性菌落性状环状；完整，光滑边界；低凸面；光滑表面；平滑；奶油色(2)生理学性质过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验氧化硝酸盐还原阴性吲哚生成阴性从葡萄糖生成酸阴性精氨酸二水解酶阴性脲酶阴性七叶苷水解阴性明胶水解阴性β-半乳糖苷酶阴性在King’s B琼脂上产生荧光颜料阳性在4％NaCl下生长阴性聚β-羟基丁酸酯累积阴性(3)底物吸收葡萄糖阳性L-阿拉伯糖阴性D-甘露糖阳性D-甘露糖醇阳性N-乙酰基-D-葡糖胺阳性麦芽糖阴性葡糖酸钾阳性正癸酸盐阳性己二酸盐阴性dl-苹果酸盐阳性柠檬酸钠阳性乙酸苯酯阳性(菊苣假单胞菌·YN2株的菌学性质)(1)形态学性质细胞的形状和大小棒状，0.8μm×1.5-2.0μm细胞多形性阴性移动性可动芽胞形成阴性革兰氏染色负菌落性状环状；完整，光滑边界；低凸面；光滑表面；平滑；透明(2)生理学性质过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验氧化(非发酵的)硝酸盐还原阴性吲哚生成阳性从葡萄糖生成酸阴性精氨酸二水解酶阴性脲酶阴性七叶苷水解阴性明胶水解阴性β-半乳糖苷酶阴性在King’s B琼脂上产生荧光颜料阳性在4％NaCl下生长阳性(微弱生长)聚β-羟基丁酸酯累积阴性(*)吐温80水解阳性(*)在营养琼脂上培养的菌落用苏丹黑染色用于测定。
(3)底物吸收葡萄糖阳性L-阿拉伯糖阳性D-甘露糖阴性D-甘露糖醇阴性N-乙酰基-D-葡糖胺阴性麦芽糖阴性葡糖酸钾阳性正癸酸盐阳性己二酸盐阴性dl-苹果酸盐阳性柠檬酸钠阳性乙酸苯酯阳性(杰氏假单胞菌·P161株的菌学性质)(1)形态学性质细胞的形状和大小球状，φ0.6μm，棒状，0.6μm×1.5-2.0μm细胞多形性伸长形式移动性可动芽胞形成阴性革兰氏染色阴性菌落性状环状；完整，光滑边界；低凸面；光滑表面；浅黄色(2)生理学性质过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验氧化硝酸盐还原阳性吲哚生成阴性从葡萄糖生成酸阴性精氨酸二水解酶阳性脲酶阴性七叶苷水解阴性明胶水解阴性β-半乳糖苷酶阴性在King’s B琼脂上产生荧光颜料阳性(3)底物吸收葡萄糖阳性L-阿拉伯糖阳性D-甘露糖阳性D-甘露糖醇阳性N-乙酰基-D-葡糖胺阳性麦芽糖阴性葡糖酸钾阳性正癸酸盐阳性己二酸盐阴性dl-苹果酸盐阳性柠檬酸钠阳性乙酸苯酯阳性<培养工艺>
在本发明的PHA制备方法中，利用其生上述PHA生产能力的微生物，从原料链烷酸生产含有以对应的上述通式(1)～(10)表示的，侧链末端具有各种官能基的3-羟基链烷酸单位的PHA，蓄积在细胞内。
通常微生物的培养，例如，为了制作保存菌株，确保PHA的生产中所需要的菌数和活性状态而进行的增殖等，可适当选用含有所用微生物增殖时必需成分的培养基。例如，只要对微生物的繁殖和生存不产生恶劣影响，可使用天然培养基(肉汁培养基、酵母提取物等)和添加了营养源的合成培养基等任何类型的培养基。温度、通气、搅拌等培养条件可根据所用微生物作适当选择。
另一方面，使用上述PHA生产微生物，制备所要求的含有3-羟基链烷酸单位的PHA时，作为培养基、作为PHA生产用原料，除了与该单体单元相对应的链烷酸外，可使用至少含有微生物增殖用碳源的无机培养基等。对于原料链烷酸优选选择初期含量，相对于培养基为0.01％～1％(w/v)，优选0.02％～0.2％(w/v)的范围。根据原料链烷酸的种类，也存在水溶性不优选，在本发明中，使用上述微生物时，培养基中即使呈现混悬状态，也没有任何问题。
为了提高原料链烷酸对培养基的溶解性，根据情况，溶解在1-十六碳烯和正十六烷一类的溶剂中，或者，以形成细微混悬物的形态添加到培养基中。这时，利用的像1-十六碳烯和正十六烷一类溶剂的添加浓度，相对于培养基，其浓度必须在3％(v/v)以下。
培养基中优选另外添加微生物在增殖中利用的增殖基质。这种增殖基质可使用酵母提取物和聚蛋白胨、肉提取物所谓的营养素。进而，根据所用菌株，考虑作为增殖基质的应用性，可从糖类、作为三羧酸循环中的中间体产生的有机酸，以及三羧酸循环之后一步至两步的生物化学反应生成的有机酸或其盐、氨基酸或其盐等中适当选择。在目的单体的比例也可以降低时，可将4～12个碳原子的直链链烷酸或其盐用作基质。但是，这种情况必须注意直链没有取代基的单纯单体(以下写作mcl)比例会增高。
其中，作为糖类可从以下中选取一种以上的化合物进行利用，即甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等所谓醛糖；甘油、赤藓糖醇、木糖醇等糖醇、葡萄糖酸等醛糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸等糖醛酸、麦芽糖、蔗糖、乳糖等所谓的二糖等。
作为有机酸或其盐，可从以下列举酸或其盐中选出至少1种以上的化合物使用，即，丙酮酸、草酰乙酸、柠檬酸、异柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、乳酸等。
作为氨基酸或其盐，可从谷氨酸、天冬氨酸或其盐中选出至少1种以上的化合物使用。
一般讲，在这些种类的增殖基质中，使用聚蛋白胨和糖类更优选。优选选择可与原料化合物共存的增殖基质，通常相对于培养基，这些增殖基质的含量为0.1％～5％(w/v)，优选为0.2％～2％(w/v)的范围。
作为在微生物中生产蓄积PHA的培养方法，可当充分增殖后，将菌体转移到氯化铵一类氮源受限的培养基中，在加入形成目的单位底物的化合物的状态下，进一步培养，有时可以提高生产率。例如，可采用多段方式，将上述由不同培养条件形成的工序，数段连接起来。这时，培养温度可以是能很好增殖上述菌株的温度，例如，15～40℃，优选20～35℃，更优选20～30℃。
培养可采用任何培养方法，液体培养、固体培养等，增殖所用的微生物，从培养基中含有的原料链烷酸，生产含有上述通式(1)～(10)所示单位的PHA的培养方法。进而，只要适当供给原料、增殖基质，以及供氧，培养、静间断培养、半连续培养、连续培养等种类。例如，作为液体间断培养的形态，有利用摇瓶进行振荡供氧的方法、利用发酵罐进行搅拌通气供氧的方法。
作为上述培养方法中使用的无机培养基，有磷源(例如，磷酸盐等)、氮源(例如铵盐、硝酸盐等)，只要能使微生物增殖的成分就可以，任何一种都可以，例如，作为无机盐培养基，有MSB培养基、E培养基(J.Biol.Chem. 218，97～106(1956)、M9培养基等。本发明实施例中使用的M9培养基组成如下。
Na2HPO46.2gKH2PO43.0gNaCl0.5gNH4Cl1.0g(1升培养基、pH7.0)进而，为了良好增殖和PHA合成酶的生产，在上述无机盐培养基中优选添加0.3％(v/v)的以下所示微量成分溶液。
(微量成分溶液)次氮基三乙酸1.5g MgSO43.0g MnSO40.5g NaCl1.0g FeSO40.1gCaCl20.1g CoCl20.1g Zn SO40.1g CuSO40.1g AlK(SO4)20.1g H3BO30.1gNa2MoO40.1g NiCl20.1g(1升中)<PHA的回收>
对于从本发明的培养液中取得PHA，可使用通常采用的方法。PHA分泌在培养液中时，可采用从培养液中提取精制的方法，蓄积在菌体中时，可采用从菌体中提取精制的方法。例如，从微生物培养菌体中回收PHA时，最简便的方法是利用通常采用的氯仿等有机溶剂提取的方法，除氯仿外有时也可使用二氧六环、四氢呋喃、乙腈、丙酮。在难以使用有机溶剂的环境中，可通过以下处理除去PHA以外的菌体成分，即，利用SDS等表面活性剂的处理、利用溶菌酶等酵等的处理、利用EDTA、次氯酸钠、过氧化氢、氨等试剂的处理，通过去除菌体内成分只回收PHA。
微生物的培养、利用微生物生产PHA和在菌体内蓄积、以及从菌体中回收PHA，并不仅限于上述方法。例如，本发明中PHA的生产方法所使用的微生物，除了上述4种菌株之外，还可以使用和这4种菌株一样具有本发明PHA生产能力的微生物。
<使用转化体的生物合成>
使用将具有上述PHA生产菌的PHA合成酶基因导入其他微生物的转化体，也可生产所要求的PHA。PHA合成酶基因的克隆、表达载体的制备、及制作转化体，可按照常规方法进行。在将大肠杆菌等细菌作为宿主得到的转化体中，作为培养用的培养基，有天然培养基或合成培养基，例如，LB培养基、M9培养基等。培养温度为25～37℃，在好氧条件下培养8～27小时，可获得微生物增殖。随后，收集菌体，回收蓄积在菌体内的PHA。在培养基中，根据需要，也可添加卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素等抗生素。在表达载体中，使用诱导性启动子时，在培养转化体时，也可向培养基中添加与该启动子相对应的诱导物质，以促进表达。例如，作为诱导物质有异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)、四环素、吲哚丙烯酸(IAA)等。
<3-羟酰基CoA>
在利用本发明生物工程方法的胶囊化方法中，作为用作PHA合成酶底物的3-羟酰基CoA，具体示例为以下述化学式[11]～[20]表示的3-羟酰基CoA。 (上述化学式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，式中R1和a的定义与上述化学式[1]相同) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，b和R2的定义与上述化学式[2]一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，C和R3的定义与上述化学式[3]一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，d和R4的定义与上述化学式[4]一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，e和R5的定义与上述化学式[5]一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，f和上述化学式[6]的定义一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，g和上述化学式[7]的定义一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，h和R6的定义与上述化学式[8]一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，l和R7的定义与上述化学式[9]一样) (式中-SCoA表示与链烷酸结合的辅酶A，j和上述化学式[10]的定义一样)这些3-羟酰基CoA可在如下合成方法中使用，例如从使用酶的体外合成法、使用微生物和植物等生物体的体内合成法、化学合成法等中适当选择。酶合成法是该底物合成中一般使用的方法，已知有使用市售酰基CoA合成酶(酰基CoA连接酶、E.C.6.2.1.3)按下述反应的方法等(Eur.J.Biochem，250，432-439(1997)、Appl.Microbiol.Biotechnol.54.37-43(2000)等)。
酰基CoA合成酶3-羟基链烷酸+CoA→3-羟酰基CoA在使用酶和生物体的合成工序中，可采用间歇式合成方法，或者使用固定化酶和固定化细胞的可连续生产。
<PHA合成酶及其生产菌>
本发明中使用的PHA合成酶，可使用从生产该酶的微生物中适当选取的微生物生产的、或者，利用导入了这些微生物的PHA合成酶基因的转化体等生产的，利用上述PHA生产菌是适宜的。
<PHA合成酶的获得>
本发明的PHA合成酶生产中使用的微生物通常的培养，例如，制作保存菌株、为确保PHA合成酶生产中必要的菌数和活性状态而进行增殖等，可适当选择在所用微生物增殖中含有必要成分的培养基。
培养，可采用液体培养和固体培养等，只要是增殖微生物的方法，可采用任何方法。无论间歇培养、加料(フエド)间歇培养、半连续培养、连续培养等种类均可。作为液体间歇培养的形态，有利用摇瓶振动供氧的方法，利用发酵罐搅拌通气方式的供氧方法。也可采用多段方式，将这些工序数段连接。
使用上述PHA生产微生物生产PHA合成酶时，例如，可采用将该微生物在含有辛酸和壬酸等链烷酸的无机培养基中进行增殖，由对数生长期到稳定期的初期，以离心分离等方法回收微生物，提取所要求酶的方法等。在上述条件下进行培养时，来自添加链烷酸的mcl-PHA在菌体内合成，这时，PHA合成酶一般是与菌体内形成的PHA微粒子结合存在。而且，根据本发明者们的研究，可知，将上述方法培养的菌体破碎液进行离心分离的上清液中存在着相当多的酶活性。推测，这可能是，如上述，由对数生长期到稳定期初期，比较早的初期培养中，在菌体内相当活跃地连接生产该酶，游离状态的PHA合成酶也大量存在之故。
作为上述培养方法中使用的无机培养基，有磷源(例如，磷酸盐等)、氮源例如，铵盐、硝酸盐等)等，只要是含有能使微生物增殖的成分，任何一种都可以。例如，作为无机培养基，可举出有MSB培养基、E培养基(J.Biol.Chem.，218，97-106(1956))、M9培养基等。M9培养基的组成如上述。为了良好地增殖和PHA合成酶的生产，在上述无机培养基中优选添加0.3％(v/v)的上述微量成分。
作为培养温度，只要是能使上述菌株很好增殖的温度就可以，例如15～40℃，优选20～35℃。
也可使用导入了具有上述PHA生产菌的PHA合成酶基因的转化体，生产所要求的PHA合成酶。PHA合成酶基因的克隆、制作表达载体和制作转化体，可按常规方法进行。在以大肠杆菌等细菌为宿主得到的转化体中，作为培养用的培养基，有天然培养基或合成培养基，如LB培养基、M9培养基等。培养温度为25～37℃，通过在好氧下培养8～27小时，以使微生物增殖。随后收集菌体，回收蓄积在菌体内的PHA合成酶。根据需要，培养基中也可添加卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素等抗生素。在表达载体中使用诱导性启动子时，培养转化体时，可向培养基中添加与该启动子对应的诱导物质，也可促进表达。例如，作为诱导物质有异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)、四环素、吲哚丙烯酸(IAA)等。
作为PHA合成酶也可以使用利用微生物的菌体破碎液和以硫酸铵等沉淀回收蛋白质成分的硫铵盐析物等粗酶，也可以使用以各种方法精制的精制酶。根据需要也可在该酶中适当添加金属盐、甘油、二硫代苏糖醇、EDTA、牛血清白蛋白(BSA)等稳定剂、活化剂。
PHA合成酶的分离·精制方法，只要是能保持PHA合成酶活性的方法，任何方法都可使用。例如，将得到的微生物菌体使用法式压榨机、超声波破碎机、溶菌酶和各种表面活性剂等破碎后，进行离心分离得到的粗酶液，或者，对由此调制的硫铵盐析物，单独采用或组合使用亲合性色谱法、阳离子或阴离子交换色谱法、凝胶过滤等方法，获得精制酶。特别是基因重组蛋白质，以N末端和C末端结合了组氨酸残基等“端基”(tag)的融合蛋白质形式出现，通过这种“端基”再与亲和性树脂结合，可更简便地精制。从融合蛋白质分离出所要求的蛋白质时也可以用下述方法，即用凝血酶、凝血因子Xa等蛋白酶进行切断，降低pH，添加作为结合竞争剂的高浓度咪唑等方法。或者，作为表达载体，像使用pTYB1(New Englan Biolab公司制)时，特征含有インテイン时，以二硫苏糖醇等作为还原条件进行切断。对于可利用亲合色谱法精制的融合蛋白质，除了组氨酸标记物外，还知道有谷胱甘肽S-转移酶(GST)、甲壳质结合区域(CBD)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、或硫氧还蛋白(TRX)等。GST融合蛋白质可利用GST亲合性树脂进行精制。
PHA合成酶的活性测定，可使用已报导的各种方法。例如，通过PHA合成酶的催化剂作用，使3-羟酰基CoA进行聚合，在形成PHA的过程中，释放出的CoA，用5，5’-二硫代二-(2-硝基苯甲酸)进行发色测定，将此作为测定原理，可按照如下所示方法进行测定。试剂1向0.1MTris-盐酸缓冲液(pH8.0)中溶解牛血清白蛋白(Sigma公司制)3.0mg/ml、试剂2向0.1M Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中溶解3-羟基辛酰基CoA 3.0mM、试剂3向0.1MTris-盐酸缓冲剂(pH8.0)中溶解三氯醋酸10mg/ml、试剂4向0.1MTris-盐酸缓冲液(pH8.0)中溶解5、5’-二硫代二-(2-硝基苯甲酸)2.0mM。第1反应(PHA合成反应)向试样(酶)溶液100μl中添加100μl试剂，混合，30℃下进行1分钟预温育。向其中添加100μl试剂2，混合，在30℃下进行1～30分钟温育后、添加试剂3，停止反应。第2反应(游离CoA的发色反应)将停止反应的第1反应液进行离心分离(15000×g，10分钟)，在其上清液500μl中添加500μl试剂4，30℃下温育10分钟后，测定412nm的吸光度。算出酶活性将1分钟内释放出1μmol CoA的酶量取为1单位(U)。
利用该酶合成的PHA，一般是只由R体构成的全同立构聚合物。
<粒状体及其制备方法-内包亲水性药物->
本发明中的粒状体是至少含有药物和PHA的粒状体，可采用微球形态和微胶囊形态等各种形态。作为具体例，例如有在含有PHA的芯内含有药物的微胶囊、或以分子状药物作为固溶体溶解或分散在PHA中的粒状体(微球)等。
本发明的缓释性制剂，例如可通过如下进行调制，即，将含有药物的溶液作内水相，将含有PHA的溶液作油相形成的W/O型乳液，或者，将该W/O型乳液进一步在外水相中乳化形成W/O/W型乳液，将其形成粒状体，得到单独的粒状体，或者，使粒状体和根据需要添加的各种添加剂一起进行调制。
成为粒状体的方法，例如，可采用液中干燥法、相分离法、喷雾干燥法或参照此的方法进行。
或者，也可将含有药物、PHA合成酶和3-羟酰基CoA的溶液作为内水相，形成的W/O型乳液、或者，将该W/O型乳液进一步在可含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的外水相进行乳化得到的W/O/W型乳液，通过PHA合成反应调制粒状体的方法(体外合成法)。
另外，将以含有药物的溶液作为内水相得到的W/O型乳液，在含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的外水相中进行乳化得到W/O/W型乳液，再通过进行PHA合成反应调制粒状体的方法也可以采用。
<W/O型乳液的调制-内包亲水性药物->
将含药物的溶液作为内水相，将含本发明PHA的溶液作为油相形成的W/O型乳液，可按如下进行制备。
首先，将水溶性药物加入水中溶解或分散，若需要，向其中加入明胶、琼脂、聚乙烯醇或碱性氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、赖氨酸)等药物保持物质，溶解或混悬，作为内水相。内水相中药物的浓度约为0.001～90重量％，优选为0.01～80重量％。该药物保持物质的添加量，对于生理活性物质，通常为0.01～100重量倍，优选为0.05～50重量倍。这些药物保持物质，首先以任意浓度与生理活性物质一起溶解于水中，用除菌、除尘过滤器过滤后，冷冻干燥并保存，调制时，溶解后使用。在本发明的缓释性制剂中，即使内水相中不使用药物保持物质时，生理活性物质的进入率也能充分满足。
内水相中，作为用于保持药物稳定性、溶解性的pH调整剂，也可添加碳酸、醋酸、草酸、柠檬酸、磷酸、盐酸等、氢氧化钠、精氨酸、赖氨酸以及它们的盐等。作为药物稳定剂，可以添加白蛋白、明胶、海藻糖、柠檬酸、乙二胺四乙酸钠、糊精、环糊精(α-，β-，γ-)及它们的衍生物(例如，麦芽糖基β-环糊精、β-环糊精磺丁基醚等)、亚硫酸氢钠、聚乙二醇等多元醇化合物、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯[例如，Tween 80、Tween 60(花王、日本)]、聚氧乙烯蓖麻油衍生物[例、HCO-60、HCO-70(日光Chemicals、日本)]等表面活性剂等，或者，作为防腐剂，还可添加一般使用的对羟基苯甲酸酯类(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、苄基醇、氯丁醇、硫柳汞等。
这样得到的内水相和含有PHA的溶液混合，接着进行乳化，调制成W/O型乳液。作为乳化操作，可使用公知的方法。例如，间断振荡法、使用桨式搅拌机、涡轮型搅拌机等混合器搅拌法、胶体研磨法、均化器法、超声波照射法等，本发明中，也可将这些方法适当组合使用。这种W/O型乳液，其乳化程度对药物释放产生影响，乳化不充分时，初期猝发趋向于增大，内水相达到某种程度以上，变得细微化，药物和PHA的相互作用很强，由PHA形成的释放控制，依赖于PHA的种类/组成比/分子量/结晶性，能更准确地进行长期释放控制因而更优选。
上述含PHA的溶液(油相)，是将该PHA溶解在与水不混合的有机溶剂中使用。该有机溶剂对水的溶解度，常温(20℃)下，优选在3重量％以下。有机溶剂的沸点优选在120℃以下。作为有机溶剂，例如有卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)、酮类(如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等)、醚类(如四氢呋喃、乙醚、异丙醚等)、酯类(如醋酸乙酯、醋酸丁酯等)、芳香族烃(如苯、甲苯、二甲苯等)。这些以适当比例2种以上混合使用。有机溶剂优选卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)。油相中PHA的浓度，随PHA的种类、分子量、溶剂的种类而不同，优选约0.01～80重量％，优选约是0.1～70重量％，特优选是1～60重量％。为改变与内水相的相溶性、有机溶剂向外水相的分配、挥散等，油相中也可添加部分亲水性有机溶剂，如乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃等。为了使内部的药物溶解或稳定，也可添加蔗糖脂肪酸酯等表面活性剂。这样得到的油相，也可用过滤器，除菌、除尘过滤后使用，虽然依赖于PHA的稳定性，也可将含有PHA的溶液在密闭容器内于室温乃至阴冷处下保存。
含药物的水溶液和含PHA的有机溶剂溶液的混合比例，前者每1重量份，后者为约0.1～1000重量份，优选约1-100重量份。缓释制剂中药物的配合量，随药物的种类、所要求的药理效果、和效果的持续期限等而不同，但对于PHA为约0.01～50重量％，约优选为0.1～40重量％，特优选1～30重量％。
<W/O/W型乳液的调制和液中干燥法-内包亲水性药物->
接着，将如此得到的W/O型乳液进行粒状体化工序。例如，利用液中干燥法等进行粒状体化时，将W/O型乳液进一步加到水相中(以下简称作外水相)，制备成W/O/W型乳液后，除去油相中的有机溶剂，调制成微胶囊等粒状体。
外水相的体积一般选为油相体积的约1～约10000倍。优选约2～约5000倍，特优选约5～约2000倍。
在外相的水相中也可加入乳化剂，作为其例，只要是能形成稳定的W/O/W型乳液，任何一种都可以，例如，阴离子表面活性剂(如油酸钠、硬脂酸钠、月桂基硫酸钠等)、非离子性表面活性剂[聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(Tween80、Tween 60、Power Aflas社制、美国)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(HCO-70、HCO-60、HCO-50、日光Chemicals社制)等]，或者，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶、透明质酸，及其衍生物等，可以这些中的一种，或任何种组合使用。外水相中乳化剂的浓度为约0.01～20重量％，优选0.05～10重量％，由其范围内适当确定。
在上述外水相中也可加入浸透压调节剂。作为本发明中使用的浸透压调节剂，作为水溶液时，只要显示浸透压的，任何物质都可以。作为该浸透压调节剂的具体例，例如，有水溶性的多元醇、水溶性的一元醇、水溶性的单糖类、二糖类及寡糖类，或它们的衍生物、水溶性的氨基酸、水溶性的肽、蛋白质，或它们的衍生物等。
作为上述水溶性的多元醇类，例如有甘油等二元醇类、阿拉伯糖醇、木糖醇、侧金盏糖醇等五元醇类、甘露糖醇、山梨糖醇、卫矛醇等六元醇类等。这些中，六元醇类优选。其中，甘露糖醇尤其好。作为上述水溶性的一元醇类，例如有甲醇、乙醇、异丙醇等。其中乙醇优选。作为上述水溶性的单糖类，例如有阿拉伯糖、木糖、核糖、2-脱氧核糖等五碳糖类、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、岩藻糖等六碳糖类。这些中，六碳糖类优。作为上述水溶性的二糖类，例如有麦芽糖、纤维二糖、α、α-海藻糖、乳糖、蔗糖等。这些中，乳糖、蔗糖优选。作为上述水溶性的寡糖。例如有麦芽三糖、棉子糖等三糖类、水苏糖等四糖类等。这些中优选三糖类。作为上述水溶性的单糖类、二糖类和寡糖的衍生物，例如有氨基葡萄糖、半乳糖胺、葡萄醛酸，半乳糖醛酸等。
作为上述水溶性的氨基酸、例如有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等中性氨基酸、天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸等。也可以使用这些水溶性氨基酸的酸(如，盐酸、硫酸、磷酸等)或和碱(如钠、钾等碱金属等)的盐。作为水溶性的肽、蛋白质或它们的衍生物，例如有酪蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白、白蛋白、明胶等。上述浸透压调节剂中，优选水溶性的多元醇类、以及水溶性的单糖类、二糖类和寡糖，或它们的衍生物。水溶性的多元醇类、水溶性的单糖类更优选，尤其优选水溶性的多元醇类。这些浸透压调节剂可单独使用，也可1种以上混合使用。这些浸透压调节剂的使用浓度，使外水相的浸透压为生理食盐水浸透压的约1/50～约5倍，优选约1/25～3约倍。具体讲，这些浸透压调节剂在外水相中的浓度，浸透压调节剂为非离子性物质时，为约0.001～60重量％，优选约0.01～40重量％、更优选约0.05～30重量％，尤其优选约1～10重量％。浸透压调节剂为离子性物质时，是用全体的离子价除上述浓度的浓度。浸透压调节剂的添加浓度，没有必要在溶解度以下，可以使其一部分呈分散态。
本发明的制备方法中，形成W/O/W型乳化物时，优选将W/O型乳液的粘度调整为50～10000cp。作为调整粘度的方法，例如有以下几种方法，即，(1)调整油相的PHA浓度、(2)调整水相和油相的量比、(3)调整W/O型乳化物的温度、(4)调整外水相的温度、(5)将W/O型乳化剂注入外水相时，例如用管线加热器、冷却器等调整W/O型乳化物的温度，等方法。这些方法可以单独或组合使用。最重要的是W/O型乳化物形成W/O/W型乳化物时，W/O型乳化物的粘度应调整在50～10000CP的范围内。上述(1)中，调整油相中PHA的浓度时的浓度，由于PHA的种类、有机溶剂的种类等发生变化，所以不能一概确定，但优选10～80重量％。上述(2)中，调整水相和油相的量比时的量比，根据药物的种类和量、不能由油相的性质一概而论，但优选W/O＝约1～50体积％。上述(3)中，调整W/O型乳化物温度时的温度，例如为-20℃～有机溶剂的沸点范围，更优选0～30℃，优选为10～20℃。调整W/O型乳化的粘度的时间，上述(1)和(2)的情况下，可在制备W/O型乳化物时进行。上述(4)中，例如，在将W/O型乳化物添加到外水相时，可预先调整外水相的温度，能得到和上述(3)同样的结果。外水相的温度，例如为5～30℃，优选10～25℃，更优选12～20℃。
去除有机溶剂的方法，可按公知的方法进行。例如，有利用桨式搅拌机和磁力搅拌器等，边搅拌，边在常压或减压下蒸发有机溶剂的方法，或使用旋转蒸发器等，一边调节真空度、温度、一边蒸发有机溶剂的方法等。
随后，利用离心分离或过滤分取粒状体，用蒸馏水反复清洗附着在粒状体表面上的游离药物、药物保持物质、乳化剂等，进而利用减压干燥，或在蒸馏水中再分散后，通过冷冻干燥，去除仍残留的溶剂、水分。
<相分离法-内包亲水性药物->
利用相分离法进行粒状体化时，搅拌下慢慢将凝聚剂加入到W/O型乳液中，通过PHA析出、固化，调制成粒状体。作为凝聚剂是与PHA的溶剂进行混合的高分子系、矿物油系或植物油系的化合物，优选能形成粒状体的不溶解PHA的化合物，例如有硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉籽油、棕榈油油、亚麻子油、矿物油、正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇等。这些可2种以上混合使用。凝聚剂的用量，对于W/O型乳液，为约0.01～1000体积倍、优选约0.1～200体积倍。将这样得到的粒状体通过离心分离或过滤分取后，用己烷、庚烷等清洗液反复清洗，除去凝聚剂，随后，加热以至减压蒸发掉清洗液。根据要求，和上述水中干燥法的情况一样，去除游离的药物和有机溶剂。
<喷雾干燥法-内包亲水性药物->
利用喷雾干燥法形成粒状体时，和W/O型乳液或水中干燥法的情况一样，使用带喷头的喷雾干燥装置(喷雾干燥机)将制备的W/O/W型乳液向干燥室内进行喷雾，在极短时间内，可使微粒化液滴内的有机溶剂和水分挥发掉，调制成微粒状的微胶囊等粒状体。作为喷头，例如有二液型喷头，压力型喷头，转盘型等。将这样得到的粒状体，按要求，用蒸馏水反复清洗，除去附在微胶囊等粒状体表面上的游离药物、药物保持物质、乳化剂等。接着，将清洗的微胶囊，进行减压干燥，或者在蒸馏水中再分散后进行冷冻干燥，进一步去除有机溶剂。
<微胶囊等粒状体及其制备方法-包含亲油性药物->
本发明的粒状体是至少含有药物和PHA的粒状体，可采取微球形态和微胶囊形态等各种形态。作为其具体例，例如有在含有PHA的芯内含有药物的微胶囊，或者以分子状，将药物以固溶体溶解或分散在PHA中的粒状体(微球)等。
本发明的粒状体，可由含有药物、PHA和有机溶剂的油相，去除有机溶剂进行制备。在本发明的制备方法中，作为制备含有(a)药物和(b)PHA的有机溶剂液的方法，只要是能使(a)和(b)在溶剂体系内最终形成溶解状态或均匀分散液，任何一种方法都可以。作为该方法，例如有(1)将(a)用溶剂形成溶液或分散液状态，将(b)用溶剂形成溶液或分散液状态，再将其混合、(2)将(a)用溶剂形成溶液或分散液状态，与(b)混合、(3)将(b)用溶剂形成溶液或分散液状态，与(a)混合，(4)将(a)、(b)和溶剂进行混合，使(a)和(b)在溶剂体系内形成溶液状态的方法。上述溶剂可适当选择，将各溶剂混合后，形成能使(a)和(b)形成溶解状态得到的溶剂体系。上述溶剂，具体使用的是例如在将上述有机溶剂的一种或二种以上以适当的比例混合的溶剂中，根据要求，加入不阻碍(a)和(b)溶解的上述有机溶剂。
由这样制备的、药物和PHA的溶液或分散液形成的油相中，除去有机溶剂，可制备出本发明的微胶囊等粒状体。具体讲可使用公知的微胶囊等粒状体调制方法，例如，将溶剂蒸发掉使粒状体固化的方法(液中干燥法)、或者向上述溶液或混悬液中添加与该液混合，但不溶解PHA的溶剂(所谓贫溶剂)，同时进行搅拌，使PHA进行相分离，调制固化粒状体的方法(相分离法)，或者用喷雾干燥法得到固化粒子的方法，或将除去上述油相中有机溶剂后的固体，使用喷射磨等方法粉碎成粒状体的气体粉碎法，或者，参照这些方法的方法。
优选使用的方法是将药物溶解和/或混悬在有机溶剂中，将该有机相倾入含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的大量水中，进行乳化，得到O/W型乳液，通过进行PHA合成反应，调制成微胶囊等粒状体的方法(体外合成法)。
<有机溶剂具体例-内包亲油性药物->
作为上述有机溶剂，优选对水的溶解度常温(20℃)下为3％(W/W)以下的有机溶剂。有机溶剂的沸点优选在120℃以下。作为这样的有机溶剂，例如有卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)、酮类(如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁酮等)、醚类(如四氢呋喃、乙醚、异丙醚等)、酯类(如醋酸乙酯、醋酸丁酯等)、芳香族烃(如苯、甲苯、二甲苯等)。这些中可以2种以上以适当比例混合使用。有机溶剂优选卤代烃类(如，二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)。
<药物/PHA的浓度-内包亲油性药物->
药物的使用量，根据药物的种类，所要求赋予持续性的时间而不同，作为溶液中的浓度，约为0.001～200％(W/W)、优选为0.001～100％(W/W)、优选为0.01～50％(W/W)中选取。作为药物的配合量，根据药物的种类、所要求的药理效果和效果持续时间等而不同，对于PHA使用约0.01-约60％(W/W)。优为0.1～55％(W/W)，优选使用1～50％(W/W)。PHA的浓度随分子量、溶剂的种类而不同，为优选约0.01～80％(W/W)，更优选约为0.1～70％(W/W)、优选为约1～约60％(W/W)。
<液中干燥法-内包亲油性药物->
在利用液中干燥法制备微胶囊等粒状体时，将含有药物、PHA和有机溶剂的油相分散在水相中，形成O/W型乳液后、除去油相中的溶剂而进行。水相的体积一般约为油相体积的1～10000倍，优选约为2～5000倍，更优选约5～2000倍，优选约为50～1000倍。水相的温度，例如预先调整为5～30℃，优选约为10～25℃，优选为10～20℃。也可向上述水相中加入乳化剂。该乳化剂，只要是能形成稳定的O/W型乳液的就可以。
作为乳化剂，优选使用无毒性、非抗原性乳化剂，具体有，例如阴离子性表面活性剂(油酸钠，硬脂酸钠、月桂基硫酸钠等)、阳离子性表面活性剂(月桂基三甲基氯化铵等)、两性离子性表面活性剂(N-月桂基甘氨酸等)、非离子性表面活性剂(聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯[吐温(Tween)80、吐温60、吐温40、吐温20、Atlas Powder公司]、聚氧乙烯蓖麻油衍生物[HCO-70、HCO)-60、HCO-50、日光Chemicals]等)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、卵磷脂、淀粉、酪蛋白、果胶、明胶、海藻酸、海藻酸盐、刺槐豆胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、黄原胶、琼脂、角叉菜胶、透明质酸、胆汗酸盐、胆酸钠、聚氧乙烯醚等。这些乳化剂可以将2种以上以适当比例混合后使用。
使用时乳化剂的浓度，约从0.001～20％(w/v)范围内适当选择。更优选在0.01～10％(w/v)范围内使用，更优选约在0.05～5％(w/v)范围内使用。乳化时可使用各种公知的混合装置。例如，间断振动法，桨式搅拌机或涡轮型搅拌机等混合的方法，将转子和定子形成狭窄的间隙并高速旋转的方法，超声波振动的方法，以音速以上的高速通过狭窄间隙的方法，通过硅球(シラスバル一ン)烧结的具有细微孔的无机质膜的方法等。
这种O/W型乳液，其乳化程度对药物的释放产生影响，乳化不充分时，初期猝发趋于增大，内油相细微到某种程度以上时，药物和PHA的相互作用很强，由PHA形成的释放控制取决于PHA的生物分解性，能准确地长期控制释放，故优选。
制备本发明的O/W型乳液时，供给构成成分的形式，也可根据公知技术采用各种方法。例如有，预先将PHA溶液装入容器内，再向其中添加含有乳化剂的水相成分的方法，将其添加顺序颠倒的方法，或者，将两者以一定比例连续供给的方法，等等。利用旋转混合时，按最初呈现出的顺序即好，这时初期是PHA成连续相、水相形成分散相，所谓的W/O型乳液，伴随着水相成分添加量的增加，会产生相转变，由W/O型转变成O/W型，从而促进了油相粒状体化。
去除有机溶剂的方法，可根据公知的方法进行。例如有用桨式搅拌机或磁力搅拌器边搅拌，边在常压或缓慢减压下使有机溶剂蒸发的方法，使用旋转蒸发器边调节真空度边蒸发有机溶剂的方法，等等。在对O/W乳液进行液中干燥时，有机溶剂挥发掉，微胶囊等粒状体固化，确定其结构。将这样得到的粒状体通过离心分离或过滤分取后，用蒸馏水反复清洗，除去附着在粒状体表面上的游离药物、药物保持物质、乳化剂等，再用蒸馏水等进行再分散，及冷冻干燥。
<相分离法-内包亲油性药物->
在利用相分离法制备微胶囊等粒状体时，在一定速度搅拌下，将凝聚剂缓慢加入到药物和PHA的有机溶剂溶液中，使PHA析出，固化。加入该凝聚剂的体积量约为药物和PHA的有机溶剂溶液体积的0.01～1000倍，优选约为0.05～500倍的体积量，更优选约0.1～约200倍的体积量。作为凝聚剂，是与PHA的溶剂进行混合的高分子系、矿物油系或植物油系的化合物，只要是不溶解PHA的即可，具体有硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亚麻子油、矿物油、正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇等。
这些可以2种以上混合使用。这样得到的微胶囊等粒状体过滤分取后，利用庚烷等反复清洗，除去凝聚剂，进而除去游离药物和溶剂。
<微胶囊及其制备方法-内包液相->
本发明的微胶囊是至少含有液相和PHA的微粒子，首先说明其形态。
本发明的微胶囊制备，例如，将内水相和含有PHA的溶液作油相形成的W/O型乳液，或者将该W/O型乳液在外水相中进一步乳化形成的W/O/型乳液，由含有PHA的油相和外水相形成的O/W型乳液，进行微胶囊化。该微胶囊化，例如，可按照液中干燥法，相分离法、喷雾干燥法或者参照这些方法的方法进行。
调制微胶囊的方法(体外合成法)优选采用如下方法，即，将含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的溶液作为内水相形成的W/O型乳液、或者将该W/O型乳液，在可含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的外水相中进一步乳化形成的W/O/W乳液，或者将含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的溶液作为外水相形成的O/W型乳液，进行PHA合成反应。
<W/O型乳液的调制-内包液相->
由内水相和含有本发明PHA的油相形成的W/O型乳液，可按如下进行制备。
首先，为了使内水相的水与外油相的有机溶剂溶液的比重一致，可采用溶解了无机盐或有机盐的水溶液形态。作为上述无机盐，例如有氯化钙、氯化钠、氯化钾、溴化钙、溴化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾等。作为有机盐，例如有醋酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、磷酸、抗坏血酸等有机酸的钠盐、钾盐等、这些中，本发明从经济性，易于比重一致、易于清洗方面考虑，优选使用氯化钙水溶液。这些无机盐或有机盐与PHA的有机溶剂溶液的比重一致，添加到水中，形成1～60重量/体积％，优选20～50重量/体积％的浓度。这样可获得水滴在油相内均匀分散的W/O型乳液。
将这样得到的内水相和含有PHA的溶液(油相)进行混合，接着进行乳化，调制成W/O型乳液。作为乳化可使用公知的方法。例如，有间断振荡法、用桨式搅拌机、涡轮型搅拌机等混合器的搅拌法、胶态研磨法、均化器法、超声波照射法等。在本发明中，也可将这些方法适当组合使用。特别是为保证最终微胶囊结构的均匀性，调制该W/O型乳液的一次乳化最为重要。在该阶段内，必须尽可能地使内水相均匀分散在PHA的有机溶剂溶液内。为此，优选尽可能地使内水相的水滴形成小的直径，采用的方法优选使超声波照射法与其他分散法组合的方法。
上述含有PHA的溶液(油相)，将PHA溶解在实际上与水不混合的有机溶剂中使用。该有机溶剂对水的溶解度，常温(20℃)下优选为3重量％以下，有机溶剂的沸点优选在120℃以下。作为有机溶剂。例如有卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)、酮类(如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁酮等)、醚类(如四氢呋喃、乙醚、异丙醚等)、酯类(如醋酸乙酯、醋酸丁酯等)、芳香族烃(如苯、甲苯、二甲苯等)等。这些中可将2种以上以适当比例混合使用。有机溶剂优选卤代烃(如，二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)。油相中PHA的浓度，根据PHA的种类、分子量、溶剂的种类而不同，但优选约为0.01～80重量％，更优选约为0.1～70重量％，优选约为1～60重量％，为了改变与内水相的相溶性，有机溶剂向外水相的分配、挥发等，可向油相中添加一部分亲水性的有机溶剂，例如，乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃等。这样得到的油相可以用过滤器除菌、除尘过滤后使用。虽然依赖于PHA的稳定性，但含有PHA的溶液优选在密闭容器中保存在室温至冷处。
水溶液和含有PHA的有机溶剂溶液的混合比例，前者每1重量份，后者约为0.1～1000重量份，优选约1～100重量份。
<W/O/W型乳液的调制和液中干燥法-内包液相->
接着，将这样得到的W/O型乳液赋予微胶囊化工序。例如，利用液中干燥法等进行微胶囊化时，将W/O型乳液进一步加入到水相(以下称作外水相)中，制成W/O/W型乳液后，去除掉油相中的有机溶剂，调制成微胶囊。
外水相的体积一般是油相体积的约1～10000倍。优选约2～5000倍，更优选5～2000倍。
外相的水相中也可加入乳化剂，作为其例，只要是能形成稳定的W/O/W型乳液任何一种都可以，例如有阴离子表面活性剂(如油酸钠、硬脂酸钠、月桂基硫酸钠等)、非离子性表面活性剂[聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(Tween 80、Tween 60、Atlas Powder公司制、美国)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(HCO-70、HCO-60、HCO-50、日光Chemicals社制)等]、或者聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷酯、明胶、透明质酸及其衍生物等。可以是这些中的一种，或任意种组合使用。外水相中乳化剂的浓度为约0.01～20重量％，优选从约0.05～10重量％的范围内适当决定。
在上述外水相中也可加入浸透压调节剂。作为本发明中使用的浸透压调节剂，作为水溶液时，只要能呈现出浸透压，任何物质都可以。作为该浸透压调节剂的具体例，例如有水溶性的多元醇类，水溶性的一元醇类、水溶性的单糖类、二糖类和寡糖，或它们的衍生物，水溶性的氨基酸、水溶性的肽、蛋白质或它们的衍生物等。
作为上述水溶性的多元醇，例如有甘油等二元醇类、阿拉伯糖醇、木糖醇、侧金盏糖醇等五元醇类、甘露糖醇、山梨糖醇、卫矛醇等六元醇类等。这些中，六元醇类较好，其中，甘露糖醇尤其好。作为上述水溶性的一元醇类，例如有甲醇、乙醇、异丙醇等。其中乙醇优。作为上述水溶性的单糖类，例如有阿拉伯糖、木糖、核糖、2-脱氧核糖等五碳糖类、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、岩藻糖等六碳糖类，这些中六碳糖类优选。作为上述水溶性的二糖类，例如有麦芽糖、纤维二糖、α、α-海藻糖、乳糖、蔗糖等。这些中，乳糖、蔗糖优选。作为上述水溶性的寡糖，例如有麦芽三糖、棉子糖等三糖类、水苏糖等四糖类等。这些中三糖类优选，作为上述水溶性的单糖类、二糖类和寡糖的衍生物，例如有氨基葡萄糖、半乳糖胺、葡糖醛酸、半乳糖醛酸等。
作为上述水溶液的氨基酸，例如有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异毫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等中性氨基酸、天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸等。也可以使用这些水溶性氨基酸的酸(如，盐酸、硫酸、磷酸等)或和碱(如钠、钾等碱金属等)的盐。作为水溶性的肽、蛋白质或它们的衍生物，例如有酪蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白、白蛋白、明胶等。上述浸透压调节剂中，优选水溶性的多元醇类、及水溶性的单糖类、二糖类或寡糖，或它们的衍生物，水溶性的多元醇类、水溶性的单糖类更优选。最优选是水溶性的多元醇类。这些浸透压调节剂可单独使用，也可1种以上混合使用。这些浸透压调节剂的使用浓度，使外水相的浸透压为生理食盐水浸透压的约1/50～约50倍，优选约1/25～约3倍。具体讲，这些浸透压调节剂在外水相中的浓度，浸透压调节剂为非离子性物质时，为约0.001～60重量％，优选约0.01～40重量％，更优选约0.05～30重量％，优选约1～10重量％。浸透压调节剂为离子性物质时，是用全体的离子价除上述浓度的浓度。浸透压调节剂的添加浓度，没有必要在溶解度以下，可以使其一部分呈分散状态。
W/O型乳液向水中乳化时，可将W/O型乳液分散在水中后，加以搅拌。作为搅拌方式可采用上述乳化方法中的任何一种，优选使用均化器，在单一层的有机溶剂溶液相中，可得到具有包入水结构的有机溶剂溶液的微胶囊，最为理想。使用均化器时，以100～100000rpm，优选1000～50000rpm，操作0.1～30分钟，优选0.5～20分钟。
利用这样的操作，可在外部水相中形成小直径的W/O型乳液滴。即，利用这种均化器的搅拌，并不改变W/O型乳液滴内的水相分散状态，而对降低W/O型乳液滴的直径有效。为了使最终微粒子形成一层高分子膜的结构，将W/O型乳液滴的直径降低到1～20μm是重要的。在此状态下，用桨式搅拌机等搅拌下放置。此时，W/O型乳液滴中的内水相由于不稳定，在PHA固化之前会相互合并，形成混合，成为一种大型水滴。另一方面，W/O型乳液自身，由于外水相中的乳化剂形成稳定化，结果形成内水相为单一层的PHA由有机溶剂溶液相围绕的胶囊结构。
为了促进具有这种胶囊结构的W/O型乳液滴的形成，优选适当调节内水相中盐的种类和用量、油相中聚合物的浓度、油相(W/O型乳液滴)及乳化它的外水相各相的温度，进而油相和水相的量比。特别是，在内水相中使用无机盐，可增大内水相的表面张力，促进水相的不稳定化，在粒子形成过程中，可使W/O型乳液滴内的水相相互合并，增加一层膜结构中乳液的比例。
在本发明的制备方法中，在形成W/O/W型乳化物时，优选将W/O型乳化物的粘度调整到50～10000cp的范围内。作为调整粘度的方法，例如有(1)调整油相的PHA浓度，(2)调整水相和油相的量比、(3)调整W/O型乳化物的温度、(4)调整外水相的温度、(5)在将W/O型乳化物注入外水相时，例如，用管线加热器、冷却器等调整W/O型乳化物的温度，等方法。这些方法可以单独使用，也可以组合使用。上述方法中，最重要的是W/O型乳化的形成W/O/W型乳化物时，W/O型乳化物的粘度应调整在50～10000CP的范围内，上述(1)中，调整油相中PHA的浓度时的浓度，由于PHA的种类、有机溶剂的种类等发生变化，所以不能一概确定，但优选约10～80重量％，上述(2)中，调整水相和油相的量比时的量比，根据油相的性质等，不能一概确定，但优选W/O＝约1～50体积％。上述(3)中，调整W/O型乳化物温度时的温度，例如为约-20℃～有机溶剂的沸点范围，优选0～30℃，更优选10～20℃，调整W/O型乳化物粘度的时间，上述(1)和(2)的情况下，可在制备W/O型乳化物时进行。上述(4)中，例如，在将W/O型乳化的添加到外水相时，可预先调整外水相的温度，能得到和上述(3)同样的结果。外水相的温度，例如为约5～30℃，优选约10～25，更优选约12～20℃。去除有机溶剂的方法，可按公知的方法进行。例如，利用桨式搅拌机和磁力搅拌器等，边搅拌边在常压或缓慢减压下蒸发有机溶剂的方法，或使用旋转蒸发器等，边调节真空度、温度、边蒸发有机溶剂的方法等。
之后，根据需要，利用离心分离或过滤分取微胶囊，用蒸馏水反复清洗附着在微胶囊表面上的乳化剂等，进而利用减压干燥、或在蒸馏水中再分散后，通过冷冻干燥去除仍残留的溶剂、水分，也可将上述工序调制的微胶囊浆液原样分散在适当的分散剂中后使用。
在蒸馏水中再分散时，也可加入分散剂。上述分散剂具有防止微粒子凝聚的作用。作为分散剂，例如有Tween 80系表面活性剂、蔗糖脂肪酸酯、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、半乳糖、蔗糖等。这些分散剂以约0.001～30重量的浓度溶解在水中使用。
将具有生成的PHA一层膜结构的微粒子原样再分散，其中含有具有多孔质结构的，所以清洗后，以低速进行离心分离，分成沉淀物和非沉淀物。这种离心分离以约50～3000rpm的转数进行1～60分钟，较为适宜。优选进行数次离心分离。
利用离心分离回收非沉淀物相中由PHA形成一层膜结构的微胶囊。为了获得干燥的微粒子，如果需要，进行加热，可使用减压干燥法、冷冻干燥法，但优选使用冷冻干燥法。
这样得到粒径为1～10μm的微胶囊。该微胶囊如下述实施例记载的，是胶囊表面无孔的球形。
<相分离法-内包液相->
利用相分离法进行微胶囊化时，搅拌下向W/O型乳液中缓慢加入凝聚剂，使PHA析出、固化，调制成微胶囊。作为凝聚剂，是与PHA溶剂进行混合的高分子系、矿物油系或植物油系的化合物，但也可以是不溶解胶囊化用的PHA的，例如有硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亚麻子油、矿物油、正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇等。这些可将2种以上混合使用。凝聚剂的用量，相对于W/O型乳液，例如为约0.01-1000体积倍、优选为约0.1-200体积倍。将这样得到的微胶囊利用离心分离或过滤分取后，用己烷、庚烷等清洗液反复清洗，除去凝聚剂，之后，加热、减压，使清洗液蒸发。进而根据要求，和上述水中干燥法的情况一样，去除有机溶剂。
<喷雾干燥法-内包液相->
在利用喷雾干燥法进行微胶囊化时，和W/O型乳液或水中干燥法的情况一样，将制备的W/O/W型乳液，用喷嘴向喷雾干燥装置(喷雾干燥机)的干燥室内进行喷雾，可在极短的时间内，使微粒化液滴内的有机溶剂和水份挥发掉，调制成微粒状的微胶囊。作为喷嘴，例如有二液型喷嘴，压力型喷嘴、转盘型。将这样得到的微胶囊，根据要求，用蒸馏水反复清洗，除去附着在微胶囊表面上的乳化剂等。接着，将清洗后的微胶囊进行减压干燥，或者，在蒸馏水中再分散后，进行冷冻干燥，进一步除去有机溶剂。
<O/W型乳液的调制-内包液相->
利用液中干燥法由O/W型乳液制备微胶囊时，通常是将含有PHA和有机溶剂的油相分散在水相中，形成O/W型乳液后，再去除油相中的溶剂。水相的体积一般是油相体积的约1～约10000倍。优选2～5000倍，更优选5～2000倍。优选为约50～约1000倍。该水相的温度，例如预先调整为5～30℃，优选10～25℃、更优选10～20℃。也可向上述水相中加入乳化剂。该乳化剂，只要是能形成稳定的O/W型乳液任何一种都可以，可使用上述乳化剂。使用时乳化剂的浓度为0.001～20％(w/v)，优选0.01～10％(w/v)，更优选0.05～5％(w/v)。关于乳化工序，也可使用上述公知的各种混合装置。
为了保证最终要求的微胶囊结构均匀性，最重要是调制该W/O型乳液的乳化，在此阶段内，必须尽可能地将含有PHA的内油相均匀分散在外水相中。为此，尽可能地减小内油相的液滴直径，所以优选采用将超声波照射法与其他分散法组合的方法。
在制备本发明的O/W乳液时，供给构成成分的形式，也可根据公知技术，采用各种方法。例如，预先将PHA溶液装入容器中，再向其中添加含有乳化剂的水相成分的方法，将其添加顺序颠倒的方法，或者将两者以一定比例连续供给的方法等。利用旋转混合时，优选最初呈现出的顺序，这时，初期PHA形成连续相，水相形成分散相，是所谓的W/O型乳液，伴随着水相成分添加量的增加，产生转相，由W/O型转变成O/W型，促进了油相的微粒子化。
去除有机溶剂的方法，可按照上述方法进行，这样得到的微胶囊，根据需要，通过离心分离或过滤分取后，也可用蒸馏水反复数次清洗附着在微胶囊表面上的乳化剂等，再在蒸馏水等中进行再分散，用冷冻干燥，也可将上述工序调制的微胶囊浆液，原样地分散在适当的分散剂中使用。
<中空粒状体及其制备方法>
本发明中的中空微胶囊等中空粒状体，至少是内部含有气泡，在其胶囊的外壳中含有PHA的微粒子，其形态，前面己作了详细说明。
本发明的超声波显像剂中可使用的中空粒状体可按如下进行制备，即，以内水相和将含有有机溶剂和PHA的溶液作为油相的W/O型乳液、或者，将该W/O型乳液在外水相中进一步乳化的W/O/W型乳液、或者，含有有机溶剂和PHA的溶液内油相和外水相形成的O/W型乳液为基础，使其油相中的PHA固化，形成中空微胶囊。该中空微胶囊化，例如可通过液中干燥法、相分离法、喷雾干燥法，或参照这些方法的方法进行。
优选使用如下调制中空粒状体的方法(体外合成法)，即，制作如下乳液，即将含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的溶液作为内水相形成的W/O型乳液、或者，将该W/O型乳液进一步在含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的外水相中乳化形成的W/O/W型乳液、或者，将含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的溶液作为外水相形成的O/W型乳液后，在水相中进行PHA合成反应，使其形成胶囊。
进而也可使用如下调制中空粒状体的方法，即，进一步将W/O型乳液，在含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA的外水相中进行乳化形成W/O/W型乳液后，在外水相中进行PHA合成反应，使其形成胶囊。
<W/O型乳液的调制-中空粒状体->
在制备本发明的中空粒状体时，所使用的，由内水相和含PHA的油相形成的W/O型乳液，可按如下调制。
首先，使内水相中使用的水，与外油相的有机溶剂溶液的比重一致，根据需要，可形成溶解了无机盐或有机盐的水溶液形态。作为上述无机盐，例如有氯化钙、氯化钠、氯化钾、溴化钙、溴化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾等。作为有机盐，例如有醋酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、磷酸、抗坏血酸等有机酸的钠盐、钾盐等。这些水溶性盐中，本发明从经济性、比重调整容易、清洗容易方面考虑，优选使用氯化钙。将这些无机盐或有机盐添加到水中，形成约1-60w/v％、优选约20-50w/v％的浓度，与PHA的有机溶剂溶液的比重一致。这样，在水溶液的比重和溶解了PHA的油相比重无差异下，可得到水滴在油相内均匀分散的W/O型乳液。
作为内水相的，实施上述比重调整的水溶液，和含有PHA的溶液(油相)进行混合，接着进行乳化作业，调制成W/O型乳液。在此乳化作业中，可使用公知的方法。例如有间断振荡法、使用桨式搅拌机、涡轮型搅拌机等混合器的搅拌法、胶体研磨法、均化器法、超声波照射法等。本发明中，也可将这些方法适当组合使用。由于W/O型乳液的内水相水滴直径确定形成中空粒状体的中空部大小，进而确定中空粒状体的外径，对保证最终要求的中空粒状体中空结构的均匀性是重要的，最重要的是调制该W/O型乳液的一次乳化。即，为了在任何中空粒状体中具有同等程度的一层膜中空结构，必须在该阶段内尽可能地使内水相均匀分散在PHA的有机溶剂溶液内。此外，将制作的中空粒状体用作超声波显像剂时，中空粒状体的外径，例如限定在10μm以下。当考虑到这种情况时，尽可能地减小内水相的水滴直径，所以优选采用将超声波照射法与其他分散法组合的方法。
上述含有PHA的溶液(油相)，是将PHA溶解在与水不混合的有机溶剂中后使用。有机溶剂对水的溶解度，常温下(20℃)在3％以下。有机溶剂的沸点优选在120℃以下。作为有机溶剂，例如，有卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)、酮类(如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁酮等)、醚类(如，四氢呋喃、乙醚、异丙醚等)、酯类(如醋酸乙酯、醋酸丁酯等)、芳香族烃(如、苯、甲苯、二甲苯等)等。这些有机溶剂可将2种以上以适当比例混合后使用。有机溶剂优选卤代烃类(如、二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)。油相中PHA的浓度，随PHA的种类、分子量、溶剂的种类而不同，但优选约0.01～80％，更优选约0.1～70％、尤其优选为约1～60％。
为了改变和内水相的相溶性、有机溶剂向外水相的分配、挥发等，可向油相中添加一部分亲水性的有机溶剂，例如乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃等。溶解PHA调制的油相，可以根据需要，用过滤器进行除菌、除尘过滤后使用。虽然依赖于PHA的稳定性，但调制含PHA溶液后，可将它在密闭容器中于室温下乃至阴冷处存放。水溶液和含有PHA的有机溶剂溶液的混合比例，前者每1质量份，后者为约0.1～1000质量份、优选1～100质量份。
<W/O/W型乳液的调制、及液中干燥法-中空粒状体->
接着，将得到的W/O型乳液赋予中空微胶囊化工序中，例如，利用液中干燥法等形成中空微胶囊时，将W/O型乳液加入到水相(以下称外水相)中，制备W/O/W型乳液后，去除油相中的有机溶剂，调制成中空粒状体。
外水相的体积一般约是油相体积的1～10000倍，优选约2～5000倍、更优选约5～2000倍。
在外相的水相中也可加入乳化剂，作为其例，只要是能形成稳定的W/O/W型乳液任何一种就可以。例如，有阴离子表面活性剂(如，油酸钠、硬脂酸钠、月桂基硫酸钠等)、非离子性表面活性剂[聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(Tween80、Tween 60、Atlas Powder公司制、美国)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(HCO-70、HCO-60、HCO-50、日光Chemicals社制)等]，或者聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷酯、明胶、透明质酸、它们的衍生物等，可以将这些中的一种，或任意种组合后使用。外水相中乳化剂的浓度为约0.01～20％、优选由0.05～10％的范围内适当确定。
在上述外水相中也可加入浸透压调节剂。作为本发明制备方法中使用的浸透压调节剂，形成水溶液时，只要能显示出浸透压的任何物质都可以。作为该浸透压调节剂的具体例，例如有水溶性的多元醇类、水溶性的一元醇类、水溶性的单糖类、二糖类和寡糖以及它们的衍生物，水溶性的氨基酸、水溶性的肽、蛋白质或它们的衍生物等。
作为上述水溶性的多元醇类，例如有甘油等二元醇类、阿拉伯糖醇、木糖醇、侧金盏糖醇等五元醇类、甘露糖醇、山梨糖醇、卫矛醇等六元醇类等。这些中，六元醇类较好，其中，甘露糖醇尤其好。作为上述水溶性的一元醇类，例如有甲醇、乙醇、异丙醇等。其中乙醇优选。作为上述水溶性的单糖类，例如有阿拉伯糖、木糖、核糖、2-脱氧核糖等五碳糖类、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、岩藻糖等六碳糖类。这些中，六碳糖类优选。作为上述水溶性的二糖类、例如有麦芽糖、纤维素二糖、α、α-海藻糖、乳糖、蔗糖等。这些中乳糖、蔗糖优选。作为上述水溶性的寡糖，例如有麦芽三糖、棉子糖等三糖类、水苏糖等四糖类等。这些中优选三糖类。作为上述水溶性的单糖类、二糖类和寡糖的衍生物，例如有甘氨萄糖、半乳糖胺、葡糖醛酸、半乳糖醛酸等。作为上述水溶性的氨基酸，例如有氨基醋酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等中性氨基酸、天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸等。也可以使用这些水溶性氨基酸的酸(如盐酸、硫酸、磷酸等)或和碱(如钠、钾等碱金属等)的盐。作为水溶性的肽、蛋白质或它们的衍生物，例如有酪蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白、白蛋白、明胶等。
上述浸透压调节剂中，优选是水溶性的多元醇类、以及水溶性的单糖类、二糖类和寡糖、或它们的衍生物。水溶性的多元醇类、水溶性的单糖类更优。尤其优选是水溶性的多元醇类，这些浸透压调节剂可单独使用，也可1种以上混合使用。这些浸透压调节剂的使用浓度，使外水相的浸透压为生理食盐水浸透压的1/50～5倍，优选1/25～3倍，具体讲，这些浸透压调节剂在外水相中的浓度，浸透压调节剂为非离子性物质时，为0.001～60％，优选0.01～40％，更优选0.05～30％，尤其好为1～10％，浸透压调节剂为离子性物质时，是用全体的离子价除上述浓度的浓度。但浸透压调节剂的添加浓度，没有必要在溶解度以下，可以使其一部分呈分散态。
W/O型乳液向水中乳化时，将W/O型乳液分散在水中后，加以搅拌。作为搅拌作业可采用上述任何一种乳化方法，特别是使用均化器，可获得具有由单一层有机溶剂溶液相中包入水的结构的有机溶剂溶液乳液粒子(微胶囊)，最为理想。使用均化器时，为100～100000rpm，优选1000～50000rpm操作0.1～30分钟，优选0.5～20分钟。
通过如此操作，可减小外部水相中W/O型乳液滴的外径。即，使用均化器的搅拌，不改变W/O型乳液滴内水相的分散状态，但能有效降低W/O型乳液滴的外径。为了使最终微粒子形成高分子一层膜的结构，最重要的是将W/O型乳液滴的外径降低到1～20μm。接着，在此状态下，用桨式搅拌机等搅拌，并放置。这时，由于W/O型乳液滴中的内水相不稳定，PHA在固化前，细小的水滴会相互合并，混合，形成较大的单一微小水滴。另一方面，W/O型乳液自身，由外水相内的乳化剂形成稳定化，结果是形成内水相由单一层的PHA有机溶剂溶液相围绕的胶囊结构。
为了促进具有这种胶囊结构的W/O型乳液滴的形成，优选适当调节内水相的盐种类及其用量、油相中聚合物的浓度、油相(W/O型乳液滴)及使其乳化的外水相各相温度，油相和水相的量比。特别是，内水相中使用无机盐时可增大内水相的表面张力，促进水相不稳定化，在粒子形成过程中W/O型乳液滴内的水相会相互合并，增加一层膜结构的乳液比例。
本发明的制备方法中，形成W/O/W型乳化物时，优选将W/O型乳化物的粘度调整为50～10000CP。作为调整粘度的方法，例如有，(1)调整油相中PHA的浓度，(2)调整水相和油相的量比，(3)调整W/O型乳化物的温度、(4)调整外水相的温度、(5)将W/O型乳化物注入外水相时、例如用管线加热器、冷却器等调整W/O型乳化物的温度，等方法，这些方法可单独使用，也可组合使用。使用上述方法，将W/O型乳化物形成W/O/W型乳化物时，可将该W/O型乳化物的粘度，优选一次调整到50～10000CP的范围内。上述(1)中，调整油相的PHA浓度时，由于该PHA的浓度随PHA的种类、有机溶剂的种类等而变化，不能一概确定，优选为10～80％。上述(2)中，调整水相和油相的量比时的量比，不能根据油相的性质等一概确定，优选W/O＝1～50v/v％。上述(3)中，调整W/O型乳化物的温度时，该温度，例如，为-20℃～有机溶剂的沸点范围，优选0～30℃，更优选10～20℃。W/O型乳化物粘度的调整时间，上述(1)和(2)的情况，可在制备W/O型乳化物时进行。上述(4)中，例如，向外水相添加W/O型乳化物时，通过预先调整外水相的温度，可取得和上述(3)同样的效果。外水相的温度，如约5～30℃，优选10～25℃，更优选10～20℃。
去除有机溶剂的方法，可按照公知的方法进行。例如，使用桨式搅拌机或磁力搅拌器，边搅拌边在常压或缓慢减压下蒸发有机溶剂的方法，使用旋转蒸发器边调节真空度、温度，边蒸发有机溶剂的方法等。
随后，利用离心分离或过滤分取微粒子，用蒸馏水反复数次清洗附着在微粒子表面上的乳化剂等，再通过减压干燥，或在蒸馏水中再分散后冷冻干燥等，除去残留的溶剂、水分。
在蒸馏水中再分散时，可加入分散剂。上述分散剂具有防止微粒子凝聚的作用。作为分散剂，例如有Tween 80系列表面活性剂、蔗糖脂肪酸酯、甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、半乳糖、蔗糖等。这种分散剂以约0.001～30％的浓度溶解于水中使用。
将具有生成的PHA一层膜结构的微粒子原样进行再分散，其中，由于含有具有多孔质结构的，所以清洗后，以低速离心分离时，分成沉淀物和非沉淀物。这种离心分离以50～3000rpm的转数进行1～60分钟，比较适宜。离心分离优选进行数次。
通过离心分离，回收非沉淀物相中由PHA形成的一层膜结构的中空粒状体，使用这种一层膜结构中空粒状体的超声波显像剂可发挥很高的超声波显像效果。为了获得干燥的微粒子，如果需要进行加热，可使用减压干燥法、冷冻干燥法等，优选使用冷却干燥法。
这样得到的是粒径1～10μm的中空粒状体。该中空粒状体是下述实施例中记载的微粒子表面无孔的，内部含有很多中空体的球形。
<相分离法-中空粒状体->
利用相分离法形成中空微胶囊时，在搅拌下，向W/O型乳液中缓慢加入凝聚剂，通过PHA析出。固化，调制成中空粒状体。作为凝聚剂，只要是能与PHA溶剂混合的高分子系、矿物油系或植物油系的化合物，不溶解胶囊化用的PHA的就可以，例如，有硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亚麻子油、矿物油、正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇等。这些可2种以上混合使用。凝聚剂的使用量，对于W/O型乳液，例如为0.01～1000体积倍，优选为0.1～200体积倍。将这样得到的微粒子通过离心分离或过滤分取后，用己烷、庚烷等清洗液反复清洗，以去除凝聚剂，随后，加热、减压，蒸发清洗液。进而根据要求，和上述水中干燥法的情况一样，去除有机溶剂。
<喷雾干燥法-中空粒状体->
利用喷雾干燥法形成中空微胶囊时，和W/O型乳液或水中干燥法的情况一样，将制备的W/O/W乳液，使用喷嘴向喷雾干燥装置(喷雾干燥机)的干燥室内进行喷雾，在极短的时间内，微粒化液滴内的有机溶剂和水分挥发掉，调制成微粒状的中空粒状体。作为喷嘴，例如有二液体型喷嘴、压力型喷嘴、转盘型。将这样得到的微粒子，根据要求，用蒸馏水反复清洗，除去附着在微粒子表面上的乳化剂等。接着，将清洗的微粒子进行减压干燥，或者在蒸馏水中再分散后，进行冷冻干燥，进一步去除有机溶剂。
<O/W型乳液的调制-中空粒状体->
以O/W型乳液作为基本，利用液中干燥法制备中空粒状体时，通常将含有PHA和有机溶剂的油相分散在水相中，形成O/W型乳液后，再去除油相中的有机溶剂。水相的体积一般是油相体积的1～10000倍，优选2～5000倍，更优选5～2000倍，尤其好50～1000倍。该水相的温度，例如预先调整为5～30℃，优选10～25℃，更优选10～20℃。上述水相中也可加入乳化剂。该乳化剂，只要能形成O/W型乳液的任何一种都可以，优选使用上述的乳化剂。使用时乳化剂的浓度可从0.001～20％(w/v)的范围内适当选择，优选从0.01～10％(w/v)，更优选从0.05～5％(w/v)的范围选取。对于乳化工序可使用上述公知的各种混合装置。
调制这种O/W型乳液的乳化，由于油相的液滴径规定了中空粒状体的外径，进而还规定了中空部的结构，所以为保证最终要求的中空粒状体的中空结构均匀性，是特别重要的。为了使任何中空粒状体具有同等程度的中空结构，在此阶段内，必须尽可能地使含有PHA的内油相均匀分散在外水相中。为此，最理想的是尽可能地减小内油相的液滴径，所以优选采用将超声波照射法与其他分散法组合的方法。
本发明的制备方法中，供给所使用的制备O/W型乳液时构成成分的形式，根据公知技术，可采用各种方法。例如有预先将PHA溶液装入容器中，再向其中添加含有乳化剂的水相成分的方法，将该添加顺序颠倒的方法、或者，将两者以一定比例连续供给的方法等。利用旋转混合时，最初呈现出的顺序最为理想，这时初期PHA成连续相，水相形成分散相，是所谓的W/O型乳液，伴随着水相成分添加量的增加，产生转相，由W/O型变成O/W型，促进了油相的微粒子化。
去除有机溶剂的方法，可按照适用于上述W/O型乳液的方法进行。将这样得到的中空粒状体，通过离心分离或过滤分取后，用蒸馏水反复数次清洗附着在微粒子表面上的乳化剂等，在蒸馏水等中进行再分散，并进行冷冻干燥。
<体外合成法>
利用体外合成法制备粒状体的过程，至少包括以下过程，即，如前所述，调制W/O型乳液，或者由该W/O型乳液调制W/O/W型乳液、或O/W型乳液的过程，使PHA合成酶与3-羟酰基CoA反应，合成PHA的过程。
PHA合成酶等的酶蛋白质是结合了很多氨基酸的多肽，由于具有赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等游离离子性基团的氨基酸，呈现出亲水性、由于具有丙氨酸、缬氨酸、毫氨酸、异毫氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等游离疏水性基的氨基酸，所以就有机高分子这一点，具有疏水性。因此，虽然存在某种程度差异，具有亲水性和疏水性两种性质的可存在于水相/油相界面处。
由于反应液(水相)的pH和盐浓度、温度可改变PHA合成酶表面电荷的正负性、电荷量和疏水性，所以在酶活性允许的范围内，调整反应液。例如，通过降低盐浓度，可增加PHA合成酶的电荷量。通过改变pH，可增加相反电荷。通过提高盐浓度，可增加疏水性。预先测定电泳或湿润角等，通过研究PHA合成酶的电荷状态和疏水性，也可设定适宜反应的溶液条件。也可直接测定W/O型乳液、W/O/W型乳液或O/W型乳液中水相/油相界面处PHA合成酶的存在量，求得条件。界面处存在量的测定，例如，使用已知浓度的PHA合成酶溶液，调制成W/O型乳液，W/O/W型乳液或O/W型乳液后，可通过测定水相中游离的PHA合成酶浓度求得。
在利用3-羟酰基CoA的聚合合成PHA的反应中，将1分钟内释放CoA的量达到1μmol的pH合成酶量取为1个单位(U)时，供给反应的酶量可设定在如下范围内，例如，每1g油相，为10个单位(U)～1000个单位(U)，优选50～500个单位(U)。
在含有上述PHA合成酶及构成PHA的原料3-羟酰基CoA的反应液中，通过由水相/油相界面的PHA合成酶合成PHA，形成水相为内水相由PHA包覆的粒状体。上述W/O型乳液或O/W型乳液中的水相，是调整到能发挥PHA合成酶活性条件的反应体系而构成的，例如通常用缓冲液调制pH5.5～pH9.0，优选7.0～pH8.5。但是，根据使用的PHA合成酶的适宜pH和pH稳定性，也不排除将条件设定在上述范围以外。缓冲液的种类，只要能使所用PHA合成酶发挥活性就可以，可根据设定的pH区域等适当选择使用，例如，一般生物化学反应中使用的缓冲液，具体可用醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸钾缓冲液、(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨丙烷磺酸(TAPS)缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(环己氨基)乙烷磺酸(CHES)缓冲液等。只要是能使所用PHA合成酶发挥活性，缓冲液的浓度没有特殊限定，通常5.0mM～1.0M，优选使用0.1M～0.2M浓度的。反应温度可根据使用PHA合成酶的特性适当设定，但通常为4～50℃，优选设定在20～40℃。但是，根据使用PHA合成酶的适宜温度和耐热性，并不排除也将条件设定在上述范围以外。反应时间，也根据使用PHA合成酶的稳定性等，通常在1分钟～24小时，优选在30分钟～3小时的范围内适当选择设定。反应液中3-羟酰基CoA浓度，在使所用PHA合成酶能发挥活性的范围内适当设定，通常设定为0.1mM～1.0M，优选设定为0.2mM～0.2M。反应液中3-羟酰基CoA的浓度很高时，一般反应体系的pH趋于降低，3-羟酰基CoA的浓度设定很高时，优选也提高上述缓冲液的浓度。
上述过程中，水系反应液中3-羟酰基CoA的种类和浓度等组成会随时间发生变化，所以可改变从内侧向外侧方向上构成粒状体的PHA单体单元组成。在形成微胶囊结构时，可改变从构成壳的PHA内侧向外侧方向上的PHA单体单元组成。
作为这种改变单体单元组成的粒状体形态，例如有使PHA被膜的组成变化连续的，从内侧向外侧方向上形成组成梯度的1层PHA被复了药物的微胶囊形态。作为制备方法，例如，可采用一边合成PHA，一边向反应液中添加另外组成的3-羟酰基CoA等方法。
作为另一形态，如有使PHA被膜的组成变化是阶段的，形成组成不同的PHA由多层被复药物的微胶囊形态。作为其制备方法，可采用如下等方法，即，以某种3-羟酰基CoA组成合成PHA后，利用离心分离等从反应液中一次回收调制中的微胶囊，再向其中添加由不同的3-羟酰基CoA组成形成的反应液。
以上对包括由W/O型乳液和O/W型乳液形成微胶囊的粒状体作了说明，对于W/O/W型乳液同样能制备出粒状体。可在内水相和外水相中分别含有PHA合成酶和3-羟酰基CoA，但为了提高药物进入率，优选只在外水相中合成PHA。对于内水相和外水相中，PHA合成醇素和3-羟酰基CoA的存在形态，认为有4种组合，药物的进入率，优选考虑到其释放特性、简化制备过程、费用等进行确定。
由上述反应得到的粒状体，根据需要供入清洗工序。粒状体的清洗方法，就制备微胶囊等粒状体而言，优选不使该粒状体产生变化，对此没有特殊限定。例如，过滤分取后，利用庚烷等反复清洗，去除游离药物和溶剂。利用离心分离，沉淀出粒状体，通过除去上清液，即可除去反应液中所含的不需要成分。向其中添加庚烷等PHA不溶的清洗剂，通过离心分离作业可进一步清洗，根据需要，可将上述粒状体供到干燥工序。也可对该粒状体进行各种二次加工和化学修饰等处理。
例如，通过对微胶囊等粒状体表层的PHA实施化学修饰，可获得具备更有用功能和特性的粒状体。例如，通过引入接枝链，可获得由该接枝链产生的各种特性，例如提高了缓释性控制、液相或气相保持功能的微胶囊。通过使微胶囊等粒状体表层的PHA形成交联化，可提高微胶囊的缓释性控制、液相或气相的保持功能。
化学修饰方法，只要是能满足获得所要求功能和结构目的的方法就可以，没有特殊限定。例如，将侧链具有反应性官能基的PHA进行合成，利用该官能基的化学反应，将这样的化学修饰方法，可以作为最优选方法使用。
上述反应性官能基的种类，只要是能满足获得所要功能和结构目的的就可以，没有特殊限定，例如，可以上述环氧基为例，侧链上具有环氧基的PHA，可以进行和通常具有环氧基的聚合物一样的化学变换。具体讲，例如，可变换成羟基，可引入磺基。也可加成具有硫醇和胺的化合物，例如，添加末端具有反应性官能基的化合物，具体讲，通过添加末端具有与环氧基的反应性很高氨基的化合物等，进行反应，形成聚合物的接枝链。作为末端具有氨基的化合物，可例举出聚乙烯胺、聚乙烯亚胺、氨基改性聚硅氧烷(氨基改性硅油)等氨基改性聚合物。这些中，氨基变性聚硅氧烷，也可使用市售的变性硅酮油，也可使用J.Amer Chem Soc.，78.2278(1956)等中记载的方法进行合成，利用该聚合物的接枝链加成，可获得提高缓释性控制，保持液相或气相功能，提高水溶液中自身分散性等效果。
作为具有环氧基的聚合物化学变换的其他例，有，利用六亚甲基二胺等二胺化合物，琥珀酸酐、2-乙基-4-甲基咪唑等进行交联反应，作为物理化学变换例有利用电子射线照射等引发交联反应。这些中，侧链具有环氧基的PHA和六亚甲基二胺的反应，以下述所示方案进行，生成交联聚合物。 这样获得的粒状体，占据全部粒子内包部分的体积比例为10％～90％的范围、若考虑粒状体的功能、机械强度，最优选范围是35％～85％。
在得到的微胶囊等粒状体中，作为确认由PHA包覆药物的方法，一般可采用如下方法，例如，将利用气相色谱等进行组成分析和利用电子显微镜进行形态观察相组合的方法，使用飞行时间型二级离子质谱装置(TOF-SIMS)和离子溅射技术，由各构成层的质谱判定结构的方法等。然而，作为更直接，更简便的确认方法，也可使用本发明者们新开发的，将尼罗兰A染色和荧光显微镜观察相组合的方法。本发明者们对在使用PHA合成酶的体外系(in vitro)中的PHA合成进行简便判定的方法，进行了深入研究，结果发现，与PHA特异结合的具有发出荧光性质的试剂、即在Appl.Environ Microbiol.，44.238-241(1982)中报导的在用微生物细胞(in vivo)生产PHA中简便判断可使用的尼罗兰A，通过设定适当的使用方法和使用条件，也可以用来判定体外系中的PHA合成，并完成了上述方法。即，本方法中，将规定浓度的尼罗兰A溶液进行过滤后，与含有PHA的反应液混合，用荧光显微镜一边照射一定波长的激发光，一边进行观察，只由合成的PHA发出荧光，通过观察该荧光，即可简便地判定体外体系中的PHA合成。通过将上述方法应用于本发明粒状体的制备中，可直接观察和评价包覆了疏水溶液表面的PHA。
<赋形剂-内包亲水性药物->
本发明的缓释性制剂优选含有赋形剂。作为赋形剂优选生物体服用时毒性小，易于冷冻干燥或喷雾干燥等干燥、生物体服用时快速溶解、使用时能溶解的。作为这样的赋形剂，例如有糖、纤维素衍生物、氨基酸、蛋白质、聚丙烯酸衍生物、有机盐、无机盐等。这些赋形剂可将2种以上以适当比例混合后使用。其中，作为糖，例如有D-甘露糖醇、海藻酸钠、果糖、葡聚糖、糊精、白糖、D-山梨醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉类、海藻糖等。作为纤维素衍生物，例如有羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯等。作为氨基酸，例如有甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、赖氨酸等。作为蛋白质，例如有明胶、血纤维蛋白、骨胶原、白蛋白等。作为聚丙烯酸衍生物，例如有聚丙烯酸钠、甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物(オイドラギツト、Rohm公司制、德国)等。作为有机盐，例如有柠檬酸钠、酒石酸钠、碳酸钠、碳酸钾等、作为无机盐、例如有氯化钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾等。作为赋形剂，除上述之外，还可以使用不溶解缓释性制剂用基剂的聚合物的水溶性聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等，赋形剂优选糖类，特别是冷冻干燥容易，毒性小的D-甘露糖醇。
赋形剂的用量，可根据赋形剂的溶解度、溶解赋形剂所得溶液的张度、粘度、分散性、稳定性等进行确定，但干燥缓释性制剂时，干燥缓释性制剂中的赋形剂含量，例如为0.5～99重量％、优选1～90重量％，更优选2～60重量％，作为赋形剂使用D-甘露糖醇时，干燥缓释性制剂中赋形剂的含量，优选为2～40重量％。通过添加这些赋形剂，可获得如下优良效果，即，1)除低了缓释性制剂(特别是微球)干燥时和干燥后粒子的接触和冲突的频率，保证了冷冻干燥或喷雾干燥时粒子的均匀性、2)缓释性制剂可在玻化点以上的温度下干燥，并能完全除去水或有机溶剂，3)改进了缓释性制剂的经时稳定性、分散性良好，不限于冷藏处保存、例如，可获得室温下具有长期使用期限的缓释性制剂。
本发明中，含有赋形剂的缓释性制剂例如通过将利用上述水中干燥法、相分离法、或喷雾干燥法得到的粒状体和赋形剂进行混合制备。该粒状体，清洗后是减压干燥的，或者，清洗后在蒸馏水中再分散，是冷冻干燥的。混合方法，没有特殊限定，例如，使用混合机等进行，是获得均匀混合物最为理想的方法。含有赋形剂的缓释性制剂，例如，利用喷雾干燥法制备粒状体时，通过喷雾W/O型乳液的同是，由另一喷嘴喷雾赋形剂水溶液，进行制备。含有赋形剂的缓慢性制剂，制备水中干燥法和喷雾干燥法中使用的W/O型乳液时，通过在外水相中使用赋形剂水溶液进行制备。含有赋形剂的缓释性制剂，优选将利用水中干燥法、相分离法或喷雾干燥法得到的粒状体清洗，将清洗的粒状体分散到溶解或混悬了赋形剂的蒸馏水中，接着通过冷冻干燥或减压干燥进行制备。也可以将清洗的粒状体分散在蒸馏水中，在得到的分散液中溶解或混悬赋形剂后，再进行冷冻干燥或减压干燥。尤其是，将清洗的粒状体分散在溶解了赋形剂的蒸馏水中，或，将清洗的粒状体分散在蒸馏水中，在得到的分散液中溶解赋形剂后，通过冷冻干燥，得到均匀的混合物。
<加热处理-内包亲水性药物->
将上述利用水中干燥法、相分离法或喷雾干燥法得到的粒状体，根据要求，在高于PHA的玻璃化转变温度(Tg)，该粒状体的各粒子相互不附着的温度下加热，可完全去除粒状体中的水和有机溶剂，同时改进了缓释性。这时，有机溶剂优选去除到低于1000ppm，更优选低于500ppm，尤其好低于100ppm。加热的时间，根据要求，在添加了赋形剂后，或将粒状体冷冻干燥或减压干燥后，对此没有限定，例如，也可以在细分之后。
加热温度低于PHA的玻璃化转变温度，有时不能充分除去水或有机溶剂，而温度过高时，又增大了粒状体的融着、变形、药的分解、劣化等危险性，所以加热温度不能一概而论，考虑到PHA的物性(如分子量、稳定性等)、药物、粒状体的平均粒径、加热时间、粒状体的干燥程度、加热方法等，可适当确定。优选是高于PHA的玻璃化转变温度，该粒状体的各粒子不相互附着的温度下进行加热干燥。更优选是从PHA的玻璃化转变温度到比玻璃化转变温度约高30℃以下的温度，尤其好是从聚合物的玻璃化转变温度到比玻璃化转变温度约高20℃以下的温度。加热时间，随加热温度、处理的粒状体量等而不同，一般是，粒状体自身的温度达到规定的温度后，6～120小时，更优选12～96小时。加热时间的上限，是残存有机溶剂、水分在允许值以下，没有特殊限定，在玻璃化转变温度以上的条件下，粒状体会软化，粒状体彼此的物理接触或粒状体积层时的荷重引起变形，有机溶剂、水分的残存达到允许值以下时，加热迅速结束。加热方法没有限定，只要是能均匀加热粒状体任何方法都可以。作为加热干燥方法的优选实例，例如有在恒温槽、流动槽、移动层或炉中加热干燥的方法、用微波加热干燥的方法等。这些中，恒温槽中加热干燥方法最为理想。如上述，冷冻干燥后，通过将粒状体减压下加热，可有效去除粒状体中的有机溶剂，并能得到对生物体安全的粒状体。这样得到的粒状体中有机溶剂的残存量在100ppm以下。
<防凝剂-内包亲油性药物->
在用水中干燥法、凝聚法和体外合成法的制备中，为防止清洗中粒子相互凝聚，也可在清洗液的蒸馏水中加入防凝聚剂，作为防凝聚剂，例如有甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、淀粉类(如，玉米淀粉等)等水溶性多糖、甘氨酸、血纤维蛋白、骨胶原等蛋白质、氯化钠、磷酸氢钠等无机盐类等。
<喷雾干燥法-内包亲油性药物->
在利用喷雾干燥法制备微胶囊等粒状体时，使用喷嘴，将药物和PHA的有机溶剂溶液或分散液向喷雾干燥装置(喷雾干燥器)的干燥室内进行喷雾，在极短的时间内，微粒化液滴内的有机溶剂挥发掉，调制成粒状体。作为喷嘴，有二流体型喷嘴、压力型喷嘴，转盘型等。这时，根据需要以防止药物和PHA的有机溶剂溶液或分散液同时产生粒状体凝聚为目的，可利用另外的喷嘴将上述防凝聚剂的水溶液进行喷雾，也是很有效的。这样得到的粒状体，若需要，可在加热，减压下进一步去除粒状体中的水分和有机溶剂。
<有机溶剂去除方法-内包亲油性药物->
去除有机溶剂的方法，如上述，可按照公知的方法进行。例如有使用桨式搅拌机或磁搅器等，边搅拌，边在常压下或缓慢减压下蒸发有机溶剂的方法；使用旋转蒸发器等，一边调节真空度一边蒸发有机溶剂的方法等。在对0/W型乳液进行液中干燥时，挥发有机溶剂，固化微胶囊等粒状体，确定粒状体的结构。将这样得到的粒状体进行离心分离或过滤分取后，用蒸馏水反复数次清洗附着在粒状体表面上的游离药物、药物保持物质、乳化剂等，在蒸馏水等中再分散，并进行冷冻干燥。
<防凝聚剂-内包亲油性药物->
冷冻干燥时也可加入防凝聚剂。作为防凝聚剂，例如有甘露糖醇、淀粉类(如玉米淀粉等)等水溶性多糖、无机盐类、氨基酸、蛋白质等。这些中最优选是甘露糖醇。粒状体和防凝聚剂的混合比(重量比)为50∶1～1∶1、优选20∶1～1∶1，更优选10∶1～5∶1，为了防止清洗中粒子彼此凝聚，可向清洗液的蒸馏水中加入防凝聚剂。作为防凝聚剂，例如有甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、淀粉类(如玉米淀粉等)等水溶性多糖、甘氨酸、血纤维蛋白、骨胶原等蛋白质，氯化钠，磷酸氢钠等无机盐类等。防凝聚剂优选甘露糖醇。
<加热处理-内包亲油性药物->
冷冻干燥后，进一步通过减压下加热，去除粒状体中的水分和有机溶剂，以改善缓释性。加热温度在低于PHA的玻璃化转变温度下，没有改善药物过剩量初期释放性的效果，温度过高时，会增大粒状体的融着、变形、药物分解、劣化等危险性。加热温度不能一概而论。考虑到PHA的物性(如分子量、稳定性等)、药物、微胶囊等粒状体的平均粒径、加热时间、粒状体的干燥程度、加热方法等，可适当确定。有机溶剂优选去除到低于1000ppm、优选500ppm、尤其好100ppm以下。
优选在高于PHA的玻璃化转变温度，在粒状体各粒子不相互附着的温度下进行加热干燥。好是在从PHA的玻璃化转变温度到比玻璃化转变温度约高30℃的温度范围内进行加热干燥。更优选是在玻璃化转变温度以上，比玻璃化转变温度高10℃的温度以下的温度下，优选在玻璃化转变温度以上，比玻璃化转变温度高5℃的温度下(尤其比玻璃化转变温度高3～4℃的温度下)进行加热干燥，可改善缓释性。加热干燥时间随加热温度、处理粒状体的量等而不同，一般是微胶囊等粒状体自身的温度达到规定的温度后，约24～120小时，优选48～120小时，更优选48～96小时。关于其上限，加热时间，只要残存有机溶剂、水分达到允许值以下，任何时间都可以，在玻璃化转变温度以上的条件下，粒状体发生软化，由于粒状体彼此的物理接触或层叠时的荷重而发生变形。因此，在有机溶剂和水分的残留量达到允许值以下时，迅速终止加热干燥。
加热方法没有特殊限定，只要是能使粒状体均匀加热的方法，任何一种方法都可使用。作为加热干燥方法的优选实例，例如有使用恒温槽、流动槽、移动槽或炉中进行加热干燥的方法，用微波进行加热干燥的方法等，其中，在恒温槽中进行加热干燥的方法优选。
<含油相或水相物-内包液相->
上述微胶囊载带的物质，可根据本发明微胶囊的用途适当选择。
例如，将本发明的微胶囊用作例如农药组合物用的微胶囊时，作为微胶囊载带的物质，只要是农药要览(日本植物防疫协会发行)中记载的，任何药物都可使用。例如，可例举出氨基甲酸酯系杂虫剂、有机磷系杂虫剂、除虫菊酯类杂虫剂、脲系杀虫剂、酰替苯胺(アニライド)系杀菌剂、唑系杀菌剂、二羧基酰亚胺系杀菌剂等。
例如，将本发明的微胶囊用作肥料组合物用的微胶囊时，作为微胶囊载带的物质，例如，有硫铵、氯化铵、硝铵、尿素、乙醛缩合尿素、异丁醛缩合尿素等氮肥的水溶液、过磷酸钙、重过磷酸钙、熔成磷肥等磷酸质肥料的水溶液、硫酸钾、氯化钾等钾肥的水溶液、鱼渣、骨粉、大豆油渣、菜籽油渣等有机质肥料的水混悬液，磷铵、磷酸钾等三元复合肥料的水溶液，微量元素复合肥料的水溶液等。
将本发明的微胶囊用作化妆品用的微胶囊时，作为微胶囊载带的物质，例如有保湿成分、生药提取物、酪氨酸酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶一类的酶、视黄醇、抗坏血酸、生育酚、吡哆醛、核黄素一类的维生素、β-胡萝卜素、叶绿素一类的有机系色素、甘油、山梨醇、尿素、乳酸、丙二醇、聚苯乙烯二醇(ポリチレンゲリコ一ル)及共聚物、葡萄糖衍生物等一类的保温成分、石蜡、硬脂醇、鲸蜡醇、鲨烷、硅油、硬脂酯等一类的软化剂成分、加工成分、抑消化成分、养发、生发成分、紫外线吸收剂、防氧化剂、香料等。
将本发明的微胶囊用作人选红细胞用微胶囊时，作为微胶囊载带的物质，例如有血红蛋白、血兰蛋白等。
将本发明的微胶囊用作油墨或涂料用微胶囊时，作为微胶囊载带的物质，例如有染料水溶液或颜料分散液等，具体有C.I.酸性红52、C.I.酸性蓝-1、C.I.酸性黑2、同123等酸性染料、C.I.碱性蓝-7、C.I.碱性红1等碱性染料、C.I.直接黑19、C.I.直接蓝86等直接染料等、C.I.溶剂黑7、同123、C.I.溶剂红8、同49、同100、C.I.溶剂蓝-2、同25、同55、同70、C.I.溶剂绿3、C.I.溶剂黄-21、同61、C.I.溶剂橙37、C.I.溶剂紫8、同21等油溶性染料、C.I.活性黄-15、42、C.I.活性红24、218，C.I.活性蓝-38、220等反应性染料、炭黑、氧化铜、二氧化锰、苯胺黑、活性炭、非磁性铁氧体、磁铁体等黑色颜料、黄铅、锌黄、黄色氧化铁、镉黄、矿物第一黄、镍钛黄、拿浦黄、萘酚黄-S、汉萨黄-G、汉萨黄-10G、联苯胺黄-GR、喹啉黄沉淀色料、永久黄-NCG、酒石黄色料等黄色颜料、红色黄铅、钼橙、永久橙GTR、吡唑啉酮橙、巴尔干橙、联苯胺橙G、阴丹士林亮橙RK、阴丹士林亮橙GK等橙色颜料、铁丹、镉红铅丹、硫化汞、镉、永久红4R、立素红、吡唑啉酮红、颜料红、钙盐、色淀红C、色淀红D、亮胭脂红6B、亮姻脂红3B、吖啶黄色淀素、罗丹明色淀素B、茜素色淀素等红色颜料、绀青、钴蓝色、碱蓝色淀素、维多利亚蓝色淀素、酞菁蓝、无金属酞菁蓝、酞青蓝一部分氯化合物、第一天蓝、阴丹士林蓝-BC等蓝色颜料、锰紫、快速紫B、甲基紫色淀素等紫色颜料、氧化铬、铬绿、颜料绿B、孔雀绿色淀素、终黄绿G等绿色颜料、锌华、氧化钛、锑白、硫化锌等白色颜料、重晶石粉、碳酸钡、粘土、氧化硅、胶态氧化硅、滑石、胶态氧化铝等体质颜料、等。当然并不限于这些。
将本发明的微胶囊用作药物缓慢释放用胶囊时，作为微胶囊载带的药物，有水易溶性和水难溶性(脂溶性)两方面的药物。作为这样的药物，例如有甾醇(如，胆甾醇、谷甾醇)、雌激素(如，雌酮、雌二醇及其酯、乙炔雌二醇等)、类皮质激素及其酯、降钙素一类的肽激素、抗生素(如，庆大霉素、万古霉素、氨丁卡霉素、卡那霉素、链霉素、二甲胺四环素、四环素等)、氯霉素、大环内酯类抗菌素(如，红霉素及其衍生物、特别是它们的棕榈酸酯和硬脂酸酯、或者螺旋霉素等)、抗寄生菌剂和皮肤用药剂(如，克霉唑、氯苯咪唑、蒽三酚等)、消炎镇痛剂(如，消炎痛、双氯灭痛、氟联苯丙酸、苯酮苯丙酸、4-联苯醋酸及其乙基酯等)、维生素B12一类的维生素类、尿激酶一类的酶剂、氟脲嘧啶、促性腺激素一类的治癌剂等。
<赋形剂-内包气相->
利用本发明的中空粒状体调制的超声波显像剂，也可含有赋形剂。作为赋形剂，优选生物体服用时毒性小，易于冷冻干燥和喷雾干燥等干燥、生物体服用后快速溶解，或使用时能溶解的。作为这样的赋形剂，例如有糖、纤维素衍生物、氨基酸、蛋白质、聚丙烯酸衍生物、有机盐、无机盐等，这些赋形剂也可2种以上以适当比例混合后使用。
作为可用作赋形剂的糖，例如有D-甘露糖醇、藻酸钠、果糖、葡聚糖、糊精、白糖、D-脱水山梨醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉类、海藻糖等。作为纤维素衍生物，例如有羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯等。
作为氨基酸，例如有甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、赖氨酸等。作为蛋白质，例如有明胶、纤维蛋白纶、胶原、白蛋白等。作为聚丙烯酸衍生物，例如有聚丙烯酸钠、甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物(オイドラギツト、Rohm公司制、德国)等。作为有机盐，例如有柠檬酸钠、酒石酸钠、碳酸钠、碳酸钾等。作为无机盐，例如有氯化钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾等。
作为赋形剂，除上述之外，还可使用不溶解PHA的水溶性聚合物、例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等。赋形剂，优选糖类，特别是优选易于冷冻干燥、毒性小的D-甘露糖醇。
赋形剂的使用量，根据赋形剂的溶解度、溶解赋形剂得到的溶液的张度、粘度、分散性、稳定性等进行确定，在对超声波显像剂进行干燥时，干燥的超声波显像剂中赋形剂含量，例如，为0.5～99％、优选1～90％、更优选2～60％。作为赋形剂，使用D-甘露糖醇时，干燥的超声波显像剂中赋形剂的含量，优选为2～40％。通过添加这些赋形剂，可获得以下优良效果，即，1)降低了超声波显像剂(特别是微球)干燥时和干燥后的粒子的接触和冲突频率，保持了冷冻干燥或喷雾干燥时粒子的均一性，2)可在高于超声波显像剂玻璃化转变的温度下进行干燥、可更完全地去除水或有机溶剂，3)改进了超声波显像剂随时间的稳定性，分散性良好，不限于冷藏处保存，例如，获得了室温下具有长期使用期限的超声波显像剂。
本发明中，还含有赋形剂的超声波显像剂，例如可通过将上述利用水中干燥法、相分离法或喷雾干燥法得到的中空粒状体和赋形剂混合进行制备。该中空粒状体可以是清洗后减压下干燥的，或者是清洗后在蒸馏水中再分散后进行冷冻干燥的。混合方法，没有特殊限定，例如，使用混合机等进行，得到均一混合物的方法最为理想。含有赋形剂的超声波显像剂，例如，利用喷雾干燥法制备中空粒状体时，也可以在喷雾W/O型乳液的同时，由另一喷嘴喷雾赋形剂的水溶液，进行制备。含有赋形剂的超声波显像剂，以水中干燥法和喷雾干燥法制备所用的W/O/W型乳液时，也可通过在外水相中使用赋形剂水溶液制备。制备含有赋形剂的超声波显像剂，优选将利用水中干燥法、相分离法或喷雾干燥法得到的中空粒状体进行清洗，将清洗的中空粒状体分散在溶解或混悬了赋形剂的蒸馏水中，接着通过冷冻干燥或减压干燥进行制备。也可以将清洗的中空粒状体分散在蒸馏水中，在得到的分散液中溶解或混悬赋形剂后，进行冷冻干燥或减压干燥。特别是，将清洗的中空粒状体分散在溶解了赋形剂的蒸馏水中，或者将清洗的中空粒状体分散在蒸馏水中，再在得到的分散液中溶解赋形剂后，通过冷冻干燥得到均一的混合物。
<加热处理-内包气相->
进而，将上述利用水中干燥法、相分离法或喷雾干燥法得到的中空粒状体，根据要求，在高于PHA的玻璃化转变温度(Tg)，在中空粒状体的各粒子互不附着的温度下进行加热，可完全除去中空粒状体中的水分和有机溶剂，并能改进气泡的保持功能。这时，有机溶剂去除到低于1000ppm、优选低于500ppm、更优选低于100ppm的程度。加热的时间，优选在根据要求添加赋形剂后，或将中空粒状体冷冻干燥或减压干燥后进行，对此没有特殊限定，例如也可在细分后。
加热温度低于PHA的玻璃化转变温度时，有时不能充分去除水或有机溶剂，温度过高时，又增大了中空粒状体微粒子融粘、变形等的危险性，所以加热温度不能一概而论，可考虑PHA的物性(例如分子量，稳定性等)、中空粒状体的平均粒径、加热时间、中空粒状体的干燥程度、加热方法等，作适当确定。优选在PHA的玻璃化转变温度以上，在中空粒状体的各粒子不相互附着的温度下进行加热干燥。更优选在从PHA的玻璃化转变温度到比玻璃化转变温度高30℃的温度下，尤其优选在从聚合物的玻璃化转变温度到比玻璃化转变温度高20℃的温度下。
加热时间根据加热温度、处理中空粒状体的量等而不同，一般是中空粒状体自身的温度达到规定温度后，约6～120小时，优选12～96小时。加热时间的上限，只要在残留的有机溶剂和水分达到允许值以下就可以，没有特殊限定，在玻璃化转变温度以上的条件下，中空粒状体会软化，由于中空粒状体彼此间物理接触或中空粒状体层叠时的荷重，会导致变形，所以在有机溶剂和水分的残存量达到允许值以下时，优选迅速终止加热。
加热方法没有特殊限定，只要是能均一加热中空粒状体的方法，任何一种都可以。作为加热干燥方法的优选实例，例如，用恒温槽、流动槽、移动层或炉中进行加热干燥的方法，用微波加热干燥的方法等。其中优选在恒温槽中加热干燥的方法。如上述，冷冻干燥后，通过将中空粒状体减压下加热，可有效地除去中空粒状体中的有机溶剂，得到对生物体安全的中空粒状体。这样得到的中空粒状体中有机溶剂的残存量约在100ppm以下。
<应用-内包亲水性药物->
作为本发明中使用的药物，对其种类没有限制，可以使用从以下中选出1种或2种以上，即，生理活性多肽、抗生素、抗真菌剂、抗高血脂症剂、循环器官用剂、抗血小板药(抗血小板凝聚抑制剂)、抗血脂症剂、抗凝血剂、止血剂、抗肿瘤剂、解热剂、镇痛剂、消炎剂、镇咳去痰剂、镇静剂、肌肉缓松剂、抗癫痫剂、抗溃疡剂、抗郁闷剂、抗过敏剂、强心剂、抗心率不齐治疗剂、血管扩张剂、降压利尿剂、糖尿病治疗剂、激素剂、抗结核剂、麻药拮抗剂、骨吸收抑制剂、骨形成促进剂、血管新生阻滞剂等。特别优选水溶性药物<制剂-内包亲水性药物->
本发明的缓释性制剂，是将本发明的微胶囊等粒状体原状或将其作为原料物质制成各种制剂，例如可以是注射剂、埋植剂、口服制剂(如散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、糖浆剂、乳液、混悬剂等)、鼻腔给药制剂、栓剂(例如直肠栓剂、阴道栓剂等)等任何一种。这些制剂可利用制剂领域中一般使用的公知方法进行制备。例如，注射剂，通过将上述粒状体分散在水性或油性的分散剂中进行制备。作为水性分散剂，例如有将等张化剂(如氯化钠、葡萄糖、D-甘露糖醇、山梨糖醇、甘油等)、分散剂(如Tween 80、HCO-50、HCO-60、羧甲基纤维素、藻酸钠等)、保存剂(如，苄基醇、氯化新洁尔灭、酚等)、无痛化剂(如，葡萄糖、葡萄糖酸钙、盐酸普鲁卡因等)等溶解在蒸馏水中形成的溶液。作为油性分散剂，例如有橄榄油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、中链脂肪酸甘油酯等。该注射剂可填充到预装注射器的小室内，也可将分散剂和粒状体分别填充到双室的预装注射器(DPS)的不同小室内。制备注射剂时，除了上述组成外，也可以将赋形剂(如，甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖等)加入到粒状体中，再分散后，进行冷冻干燥或喷雾干燥固化，使用时，再加入注射用蒸馏水或适当的分散剂，得到更稳定的缓释性注射剂。此时的粒径，例如，用作混悬注射剂时，其分散度，只要是满足通针性的范围就可以，例如，平均粒径为0.1～500μm，优选1～300μm，更优选2～200μm。如上述，通过向水相中加入渗透压调节剂，也可将粒状体的形状形成适于通针的球状。将粒状体形成无菌制剂时，例如将制备全过程形成无菌的方法、用γ射线灭菌的方法、添加防腐剂的方法等，对此没有限定。
口服制剂的制备，例如，向上述粒状体中添加赋形剂(如，乳糖、白糖、淀粉等)、崩解剂(如，淀粉，碳酸钙等)、粘合剂(如，淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素等)、润滑剂(如，滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000等)，进行压缩成形，接着，根据需要为掩蔽味道、肠溶性或持续性为目的，用公知的方法进行包衣。作为包衣剂，例如有羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇醚、吐温80、普路罗尼克F68、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯、オイドラギツト(Rohm公司制，德国，甲基丙烯酸、丙烯酸共聚物)和色素(如，氧化钛、铁丹等)等。
鼻腔给药制剂可以是固体、半固体或液体中的任何一种。固体的鼻腔给药制剂的制备，例如可以是原样的微胶囊等粒状体，通常向该粒状体中添加赋形剂(如葡萄糖、甘露糖醇、淀粉、微晶纤维素等)、增粘剂(如天然橡胶类、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物等)等，并混合制备。例如，液体的鼻腔给药制剂可以和上述注射剂的情况一样制备。这些鼻腔给药制剂，任何一种都可以含有pH调节剂(例如碳酸、磷酸、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠等)、防腐剂(如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、氯化新洁尔灭等)等。栓剂可以是油性或水性的，也可以是固体、半固体或液体中的任何一种。栓剂通常使用油性基质、水性基质或水性凝胶基质进行制备。作为油性基质，例如有高级脂肪酸的甘油酯(如，可可脂、ウイテプゾル类(ダイナマイトノ一ベル社，德国)等)、中级脂肪酸(如，ミグリオ一ル类(ダイナマイトノ一ベル社，德国)等)、或植物油(如，芝麻油、大豆油、棉籽油等)等。作为水性基质，例如有聚乙二醇类、丙二醇类等。作为水性凝胶基质，例如有天然橡胶类、纤维素衍生物、乙烯基聚合物、丙烯酸聚合物等。
本发明的缓释性制剂，以低毒性可安全用于哺乳动物(如，人、牛、猪、狗、猫、鼠、大白鼠、兔等)。缓释性制剂的服用量，根据如下情况而不同，如药物的种类和含量、剂形、药物释放的持续时间、对象疾病(如，前列腺癌、前列腺肥大症、子宫内膜症、子宫肌瘤、子宫纤维瘤、思春期早发症、乳癌、膀胱癌、子宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、大肠癌、胃炎、何杰金氏病、恶性黑色瘤、转移、多发性骨髓瘤、非何杰金氏性淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、消化性溃疡、全身性真菌感染症、小细胞肺癌、心阀膜症、乳腺症、多囊胞性卵巢、不孕、慢性无排卵症妇女的适应性排卵诱发、痤疮、无月经(如继发性无月经)、卵囊及乳房的囊胞性疾患(包括多囊胞性卵巢)、妇科系癌、卵巢性高雄激素血症和多毛症、通过胸腺幼若化的T细胞产生引发的AIDS、为治疗男性性犯罪者的男性避孕等激素依赖性疾患的治疗和避孕、月经前症候群(PMS)的症状减轻、体外受精(IVF)等)、因对象动物等不同而不同，只要是药物的有效量即可。作为每1次药物的服用量，例如，缓释性制剂为1个月制剂时，对每1个成人，优选从约0.01～约100mg/kg体重的范围内适当选择。更优选从约0.05～约50mg/kg，尤其优选从约0.1～约10mg/kg体重的范围内选择。每1次缓释性制剂的服用量，对每1个人优选从约0.1～约500mg/kg体重的范围内适当选择，更优选从约0.2～约300mg/kg体重的范围内适当选择。服用次数，数周内1次、1个月内1次、或数月内1次等，可根据药物的种类和含量、剂形、药物释放持续时间、对象疾病、对象动物等作适当选择。
<应用-内包亲油性药物->
作为本发明中使用的药物，其种类没有限定，可从以下中选出1种或2种以上使用，即抗生素、抗真菌剂、抗高血脂症剂、循环器官用剂、抗血小板药(血小板凝集抑制剂)、抗肿瘤剂、解热剂、镇痛剂、消炎剂、镇咳去痰剂、镇静剂、抗癫痫剂、抗溃疡剂、抗郁闷剂、抗过敏性剂、强心剂、心率不齐治疗剂、血管扩张剂、降压利尿剂、糖尿病治疗剂、激素剂、骨吸收抑制剂等，特别优选水难溶性药物，例如优选使用如下药物，即甾类系统的药物、蛋白质药物、肽类药物、5-氟尿嘧啶、Me-CCUN、奥美拉唑(omeprazole)、白金制剂(具体如顺铂、カルボプラチン、イソプラチン或它们的修饰体等)的抗癌剂及其他一般的抗生剂等。
<制剂-内包亲油性药物->
本发明的缓释性制剂，是将本发明微胶囊等粒状体原样，或将粒收体作原料物质制成各种形剂，例如，注射剂、埋植剂、经口服用制剂(如散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、糖浆剂、乳液、混悬剂等)、鼻腔给药剂、栓剂(如直肠栓剂、阴道栓剂等)等任何一种。
这些制剂可利用制剂领域中通常使用的公知方法进行制备。例如，注射剂，将上述粒状体分散在水性或油性分散剂中进行制备。作为水性分散剂，例如，将等张化剂(如氯化钠、葡萄糖、D-甘露糖醇、山梨糖醇、甘油等)、分散剂(如，Tween 80、HCO-50、HCO-60、羧甲基纤维素、藻酸钠等)、保存剂(如，苄基醇、氯化新洁尔灭、苯酚等)、无痛化剂(如葡萄糖、葡萄糖酸钙、盐酸普鲁卡因等)等溶解在蒸馏水中形成的溶液。作为油性分散剂例如有橄榄油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、中链脂肪酸甘油酯等。该注射剂可填充到预装注射器的小室内，也可将分散剂和粒状体分别填充到双室的预装注射器(DPS)内的不同小室。制备注射剂时，除了上述组成外，也可以将赋形剂(如，甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖等)加入到粒状体中，再分散后，进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体，使用时，再加入注射用蒸馏水或适当的分散剂，得到更稳定的缓释性注射剂。此时的粒径，例如，用作混悬注射剂时，其分散度，只要是满足通针性的范围就可以，例如，平均粒径为0.1～500μm，优选1～300μm，更优选2～200μm。如上述，通过将渗透压调节剂加入到水相中，也可将粒状体的形状制成适于通针的球状。将粒状体形成无菌制剂时，例如，将制备全过程为无菌的方法，用γ射线灭菌的方法、添加防腐剂的方法等，对此没有限定。
口服制剂的制备，例如，向上述粒状体中添加赋形剂(如，乳糖、白糖、淀粉等)、崩解剂(如淀粉、碳酸钙等)、粘合剂(如，淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素等)、润滑剂(如、滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000等)、进行压缩成形，接着，根据需要，为掩蔽味道、肠溶解性或持继性，用公知的方法进行包衣。作为包衣剂，例如有羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇醚、吐温80、普路罗尼克F68、纤维素乙酸酯酞酸酯、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、羟甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯、オイドラギツト(Rohm公司制，德国，甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)和色素(如，氧化钛、铁丹等)等。
鼻腔给药制剂可以是固体、半固体或液体中的任何一种。固体的鼻腔给药制剂的制备，例如可以是原样的微胶囊等粒状体、通常向该粒状体中添加赋形剂(如葡萄糖、甘露糖醇、淀粉、微结晶纤维素等)、增粘剂(如天然橡胶类、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物等)，并混合制备。例如，液体的鼻腔给药制剂可以和上述注射剂的情况一样制备。这些鼻腔给药制剂的任何一种都可以含有pH调节剂(如碳酸、磷酸、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠等)、防腐剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、氯化新洁尔灭等)。栓剂可以是油性的或水性的，也可以是固体、半固体或液体中的任何一种。栓剂通常使用油性基质、水性基质或水性凝胶基质进行制备。作为油性基质、例如有高级脂肪酸的甘油酯(如，可可脂、ウイテプゾル类(ダイナマイトノ一ベル社，德国)等)、中级脂肪酸(如，ミグリオ一ル类(ダイナマイトノ一ベル社，德国)等)、或植物油(如，芝麻油、大豆油、棉籽油等)等。作为水性基质，例如，有聚乙二醇类、丙二醇类等。作为水性凝胶基质，例如有天然橡胶类、纤维素衍生物、乙烯基聚合物、丙烯酸聚合物等。
本发明的缓释性制剂，以低毒性可安全用于哺乳动物(如，人、牛、猪、狗、猫、鼠、大白鼠、兔等)。缓释性制剂的服用量，根据如下情况而不同，如药物的种类和含量、剂形、药物释放的持续时间、对象疾病(如，前列腺癌、前列腺肥大症、子宫内膜症、子宫肌瘤、子宫纤维瘤、思春期早发症、乳癌、膀胱癌、子宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、大肠癌、胃炎、何杰金氏病、恶性黑色瘤、转移、多发性骨髓瘤、非何杰金氏性淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、消化性溃疡、全身性真菌感染症、小细胞肺癌、心阀膜症、乳腺症、多囊胞性卵巢、不孕、慢性无排卵症妇女的适应性排卵诱发、痤疮、无月经(如继发性无月经)、卵囊及乳房的囊胞性疾患(包括多囊胞性卵巢)、妇科系癌、卵巢性高雄激素血症和多毛症、通过胸腺幼若化的T细胞产生引发的AIDS、为治疗男性性犯罪者的男性避孕等激素依赖性疾患的治疗和避孕、月经前症候群(PMS)的症状减轻、体外受精(IVF)等)、因对象动物等不同而不同，只要是药物的有效量即可。作为每1次药物的服用量，例如，缓释性制剂为1个月制剂时，对每1个成人，优选从约0.01～约100mg/kg体重的范围内适当选择。更优选从约0.05～约50mg/kg，尤其优选从约0.1～约10mg/kg体重的范围内选择。每1次缓释性制剂的服用量，对每1个人优选从约0.1～约500mg/kg体重的范围内适当选择，更优选从约0.2～约300mg/kg体重的范围内适当选择。服用次数，数周内1次、1个月内1次、或数月内1次等，可根据药物的种类和含量、剂形、药物释放持续时间、对象疾病、对象动物等作适当选择。
<应用-内包液相->
将本发明的微胶囊用作农药组合物时，可将微胶囊化工序中得到的浆液原料用作农药组合物，也可用作水性混悬剂、水合剂、粉剂、粒剂等更易于使用形态的制剂，其中优选用作水性混悬剂。该水性混悬剂是在上述得到有微胶囊浆液中，添加增粒剂、防冷冻剂、比重调节剂、防腐剂等稳定剂进行调制的。作为使用的增粘剂，有羧甲基纤维素、黄原胶、ラムザン胶、刺槐豆胶、角叉菜胶、ワエラン胶等多糖类，聚丙烯酸钠等合成高分子，硅酸铝镁、蒙脱石、膨润土、锂蒙脱石、干式法硅石等矿物质细粉末，氧化铝溶胶等。作为防冷冻剂，有丙二醇等醇类，作为比重调节剂，有硫酸钠等水溶性盐类、尿素等。
将本发明的微胶囊用作肥料组合物时，可将微胶囊化工序中得到的浆液原料用作肥料组合物，也可用作水性混悬剂、水合剂、粉剂、粒剂等易于使用形态的制剂，其中，优选用作水性混悬剂。该水性混悬剂的调制是将增粘剂、防冷冻剂、比重调节剂、防腐剂等稳定剂添加到上述得到的微胶囊浆液中。作为所用的增粘剂，有羧甲基纤维素、黄原胶、ラムザン胶、刺槐豆胶、角叉菜胶、ワエラン胶等多糖类，聚丙烯酸钠等合成高分子，硅酸铝镁、蒙脱石、膨润土、锂蒙脱石、干式法硅石等矿物质细粉末，氧化铝溶胶等。作为防冷冻剂，有丙二醇等醇类，作为比重调节剂，有硫酸钠等水溶性盐类、尿素等。
将本发明的微胶囊用作化妆料组合物时，作为分散剂，调制时，可分散在如下具有保湿作用的多元醇类等公知的化妆料基剂中，即，固体状或液体状石蜡、晶体油、白地蜡、地蜡或褐煤蜡等烃类；橄榄、地蜡、巴西棕榈蜡、羊毛脂或鲸蜡等植物或动物性油脂和蜡；硬脂酸、棕榈酸、油酸、甘油单硬脂酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油单油酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、异丙基硬脂酸酯或丁基硬脂酸酯等脂肪酸及其酯类；甲基聚硅氧烷、甲基聚环硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、硅酮聚醚共聚物等硅酮类；乙醇、异丙醇、鲸蜡醇、硬脂醇、棕榈醇或己基十二烷基醇等醇类；乙二醇、甘油或脱水山梨醇等。
将本发明的微胶囊用作人工红细胞组合物时，是将微胶囊化工序中得到的浆液混悬在生理食盐水中，利用凝胶过滤法、离心分离法等公知的方法除去粗大的粒子。
将本发明的微胶囊用作油墨组合物时，分散在水性介质中，为了辅助向水性介质中分散，在不明显降低涂膜耐水性的范围内，也可添加表面活性剂和保护胶体、水溶性有机溶剂等。还可添加防腐剂、粘度调整剂、pH调整剂、螯合化剂等。作为可向本发明水性颜料油墨中添加的保护胶体，具体有胶、明胶、酪蛋白、白蛋白、阿拉伯胶、鱼胶、等天然蛋白质和藻酸、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚环氧乙烷、羟乙基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、芳香族酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯基、聚酯等合成高分子等。以定着性、粘度调节、速干性为目的，根据需要可使用保护胶体，油墨中保护胶体的含有比例优选30质量％以下，更优选20质量％以下。
作为可向本发明的水性颜料油墨中添加的表面活性剂，可以是阴离子性、阳离子性、两性离子性、非离子性中的任何一种活性剂。作为阴离子性表面活性剂实例，例如有硬脂酸钠、油酸钾、半固化牛脂脂肪酸钠等脂肪酸盐类；十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸三(2-羟乙基)铵、十八烷基硫酸钠等烷基硫酸酯盐类；壬基苯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十八烷基苯磺酸钠十二烷基二苯基醚二磺酸钠等苯磺酸盐类；十二烷基萘磺酸钠、萘磺酸富尔马林缩合物等萘磺酸盐类；磺基琥珀酸二十二烷基钠、磺基琥珀酸二十八烷基钠等磺基琥珀酸酯盐类；聚氧乙烯十二烷基醚硫酸钠、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸三(2-羟乙基)铵、聚氧乙烯十八烷基醚硫酸钠、聚氧乙烯十二烷基苯基醚硫酸钠等聚氧乙烯硫酸酯盐类；十二烷基磷酸钾、十八烷基磷酸钠等磷酸酯盐类。作为阳离子性表面活性剂实例，例如有醋酸十八烷基铵、棕榈油胺醋酸盐等烷基铵盐类；氯化十二烷基三甲基铵、氯化十八烷基三甲基铵、氯化二十八烷基ジヤ’ル铵、氨化十二烷基苄基甲基铵等第4级铵盐类。作为两性离子性活性剂实例，例如有十二烷基甜菜碱、十八烷基甜菜碱等烷基甜菜碱类；十二烷基二甲基胺氧化物等胺氧化物类等。作为非离子性表面活性剂实例，例如有聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯(9-十八烷烯)醚等聚氧乙烯烷基醚类；聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯苯基醚类；聚氧化乙烯、共聚氧化乙烯氧化丙烯等环氧乙烷聚合物类；脱水山梨醇十二烷酸酯、脱水山梨醇十六烷酸酯、脱水山梨醇十八烷酸酯、脱水山梨醇(9-十八烷烯酸)酯、脱水山梨醇(9-十八烷烯酸)三酯、聚氧乙烯脱水山梨醇十二烷酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇十六烷酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇十八烷酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇十八烷酸三酯、聚氧乙烯脱水山梨醇(9-十八烷烯酸)酯、聚氧乙烯脱水山梨醇(9-十八烷烯酸)三酯等脱水山梨醇脂肪酸酯类；聚氧乙烯脱水山梨醇(9-十八烷烯酸)四酯等脱水山梨醇脂肪酸酯类；甘油十八烷酸酯、甘油(9-十八烷烯酸)酯等甘油脂肪酸酯类，这些非离子性活性剂中特别优选HLB在14以上的。本发明中所用上述表面活性剂的配合量，根据单独使用时或2种以上混合使用时，其配合量有所变动，但对于油墨组合物总量为0～10质量％，优选为0～5质量％，本发明的水性颜料油墨组合物，相对于组合物总量为20～95质量％，颜料优选含有1～60体积％。
<全氟化碳-内包气相->
向本发明的超声波显像剂中使用的中空粒状体的中空内部充满全氟化碳气，是将上述中空粒状体在水中分散后，减压下干燥，接着，向减压状态的干燥机内注入全氟化碳气，优选恢复到常压。这里，分散了中空粒状体的水，也也含有上述的分散剂。减压下的干燥，可使用根据需要进行加温的减压干燥法、冷冻干燥法等，但优选使用冷冻干燥法。作为全氟化碳，为了显像剂服用于生物体内后也能保持气体状态，沸点在体温以下，优选在10℃以下。具体讲有八氟环丁烷、八氟丙烷、六氟乙烷等。所使用的全氟碳气优选难溶于水的，这样，不会溶解在血液等体液内，可长时间保持显像效果。
<水性载体-内包气相->
根据本发明方法得到的中空粒状体，由于是干燥的微粒子状，作为超声波显像剂使用时，可分散在适当的水性载体中(生理食盐水、甘露醇水溶液等)，经口或不经口服用于生物体内。优选利用注射给药，在上述水性载体中，也可根据需要添加公知的分散剂。用作超声波显像剂时，相对于包括水性载体在内的显像剂总量，添加中空粒状体，形成0.01～80％的浓度，优选形成0.01～50％的浓度。
实施例以下列举实施例、比较例和实验例更具体地说明本发明，但这些并不对本发明形成限定。以下的实施例、比较例和实验例中，“％”没有特殊指出都表示重量％。对于以下的“微胶囊”是上述的2种形态，即1层(整体型)型的和2层(芯/壳)型的，将这些总称作微胶囊”。
(参考例1)具有pHB合成酶生产能力的转化体制作关于TB64株产生的具有pHB合成酶生产能力的转化体制作方法，发明者已先期申请，但此处列举其具体实例。将TB64株在100ml的LB培养基(1％胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH7.4)中，30℃下培养过夜后，利用マ-マ-等人的方法分离回收染色体DNA。用限制酶Sau3 Al将得到的染色体DNA进行部分分解。载体的制作，使用pUC18，用限制酶BamHl切断，脱磷酸化处理(Molecular Cloning 1卷，572页，1989年，Cold Spring Harbor Laboratory出版)后，使用DNA连接试剂盒Ver.11(宝酒造)与染色体DNA的Sou3 Al部分分解片段连接。接着用该连接DNA片段对大肠杆菌(Escheichia Coli)HB101株进行转化，制作成TB64株的染色体DNA文库。
接着，为获得含有TB64株的pHB合成系酶基因的DNA片段，进行表现型筛选。对于培养基，使用含有2％葡萄糖的LB培养基，在琼脂平板培养基上的菌落培育到足够大时，进行苏丹黑B溶液喷雾，取得利用UV光照射发出荧光的菌落。利用碱法从取得的菌落中回收质粒，得到含有pHB合成系酶群基因的DNA片段。
将取得的基因片段重组到含有不属于不和合性组的lncP.lncQ、或lncW中任何一个的广润宿主复制区域的载体pBBR 122(Mo Bi Tec)中，再利用电穿孔法，将该重组的质粒进行转化成ラルスト一ニヤ·ユ一トロファTB64ml株(pHB合成缺陷株)。再恢复TB64ml株的pHB合成能力，呈现出相补性。
接着，设计、合成在pHB合成酶基因的起始密码附近具有碱基序列的寡核苷酸(Amarsharn Pharmacial Biotech)，将该寡核苷酸作为引物进行PCR，扩增含有pHB合成酶基因的片段(LA-PCR试剂盒；宝酒造)。
接着，对这样得到的PCR扩增片段，用限制酶BamHl进行完全分解，用表达载体pTrc 99A的限制酶BamHl切断，进行脱磷酸化处理(Molecular Cloning1卷，5.7.2页、1989年，Cold Spring Harbor Laboratory出版)，再用DNA连接试剂盒Ver.11(宝酒造)连接。使用得到的重组质粒，利用氯化钙法转化大肠杆菌(Esoherichia Coli HB101)(宝酒造)，将由得到的重组体回收的重组质粒称为pTB 64-pHB。用pTB 64-pHB，利用氯化钙法对大肠杆菌(Escherichiacoli HB101)进行转化，得到pTB 64-pHB重组株。
(参考例2)具有GST融合pHB合成酶生产能力的转化体制备将PTB 64-pHB重细株接种入LB培养基200ml中，37℃下，以125次/分钟，振荡培养12小时，将这样得到的菌体利用离心分离进行回收，用常规法回收质粒DNA。
相对于PTB 64-pHB，分别设计、合成上游侧引物的寡核苷酸(序列号1)和下游侧引物的寡核苷酸(序列号2)(Amersham Pharmacia Biotech)。将该寡核苷酸作为引物，将PTB64-pHB作为模板进行PCR，将上游具有Bam Hl限制部位、下游具有Xhol限制部位的pHB合成酶基因扩增到完全长度(LA、PCR试剂盒；宝酒造)。
将精制的PCR扩增产物用Bam Hl和Xhol进行消化，插入到与质粒PGEX-6P-1(Amersham Pharmacia Biotech社制)相对应的部位，使用这些载体对大肠杆菌(JM 109)进行转化，得到表达用菌株。菌株的确认，是使用Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purifica tion Systems、PROMEGA社制)，对大量调制的质粒DNA，用Bam Hl、Xhol进行处理，利用得到的DNA片段进行。
(参考例3)pHB合成酶的调制在添加了氨苄青霉素(100μg/L)的2XYT培养基(胨16g/L、酵提取物10g/L、Nacl 5g/L、pH7.0)100ml中，30℃下，将得到的发现菌株预培养过夜。
将其添加到添加了氨苄青霉素(100μg/L)的2XYT培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、Nacl 5g/L、pH7.0)10升中，30℃下培养3小时后，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)使最终浓度达到1mM，30℃下，培养3小时。
4℃下，以78000m/S2(＝8000G)将回收的培养液离心处理10分钟，除去上清液后，将菌体颗粒在4℃的PBS溶液500ml中进行再混悬。将该菌液每次40ml注入到预先冷却到4℃的容器中，用法式压力器边加压到216MPa(＝2200kg/cm2)，边从喷嘴中每次少量地排出菌液，进行菌体破碎处理。4℃下，以78000m/s2(＝8000G)将菌体破碎液离心处理10分钟后，回收上清液。再用0.45μm的过滤器对该上清液过滤，除掉固体杂物，用SDS-PAGE确认上清液中所要求的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的pHB合成酶。
接着，用谷胱甘肽·琼脂糖4B(Glutathion S epharose 4BAmershamPharmacia Biotech社制)对上述GST融合的pHB合成酶进行精制。4℃下，以4900m/s2(＝500G)，将谷胱甘肽·琼脂糖4B的75％浆液6.65ml进行离心处理5分钟，除去上清液后，再混悬在4℃的PBS溶液200ml中，进而4℃下，以4900m/s2(＝500G)离心处理5分钟，除去上清液。再混悬在4℃的PBS溶液5ml中，形成谷胱甘肽·琼脂糖4B的50％浆液10ml。
向上述谷胱甘肽·琼脂糖4B的50％浆液10ml中添加事先调整的总量上清液，室温下缓慢振荡30分钟，由谷胱甘肽·琼脂糖4B对上清液中所要求的融合类蛋白质进行亲合吸附。之后，4℃下，以4900m/s2(＝500G)进行离心处理5分钟，除去上清液后，在4℃的PBS溶液5ml中再混悬，再次进行同样的离心处理，除去上清液。对于这种将GST融合的pHB合成酶固定化的谷胱甘肽·琼脂糖4B，再混悬于PBS溶液中，离心处理反复进行2次，清洗后，最后，在5℃的裂解缓冲液(Cleavage Buffer；Tris-HCl 50mM、NaCl 150mM、EDTA 1mM、Dithiothreitol 1mM、pH7)5ml中混悬。再向其中添加4％的予分离蛋白酶(PreScission Protease；Amersham Pharmacia Biotech社制)的裂解缓冲溶液0.5ml，5℃下缓慢振荡4小时。4℃下，以4900m/s2(＝500G)对其离心处理5分钟，回收上清液，然后将和上述一样调制的谷胱甘肽·琼脂糖4B的50％浆液1ml在4℃下以4900m/s2(＝500G)进行离心处理5分钟，向除去上清液后的谷胱甘肽·琼脂糖4B中添加事先回收的上清液，缓慢搅拌，由谷胱甘肽·琼脂糖4B吸附残留在上清液中的予分离蛋白酶。接着，4℃下以4900m/s2(＝500G)离心处理5分钟后回收上清液。利用SDS-PAGE测定上清液，呈现出单带，确认是精制的。
用以下方法测定含有的pHB合成酶活性。首先，将牛血清白蛋白(Sigma社制)溶解在0.1MTris-盐酸缓冲液(pH8.0)中形成3.0mg/ml的溶液100μL，将其溶液添加到酶溶液100μL中并混合，30℃下预培养1分钟。再向其中添加在0.1MTris-盐酸缓冲液(pH8.0)中溶解3.0mM 3-羟丁酰CoA形成的溶液100μl后混合，30℃下培养1～30分钟后，再添加在0.1MTris-盐酸缓冲液(pH8.0)中溶解Tris-氯醋酸形成的10mg/ml溶液300μl，停止反应。反应停止后，将该溶液进行离心分离(147000m/s2(＝15000G)、10分钟)，在上清液500μl中添加在0.1MTris-盐酸缓冲液(pH8.0)中溶解2.0mM 5，5’-二硫二-(2-硝基苯甲酸)形成的溶液500μl，30℃下培养10分钟后，测定412nm的吸光度。将1分钟内释放出1μmol CoA的酶量作为为1个单位(U)，计算出酶活性。其结果，作为比活性得到7.5U/ml。只添加ライホゲル外，将该液进行过滤浓缩形成10U/ml的溶液，将其作为精制酶液(1)。
(参考例4)含有pHB合成酶的粗酶液的调制方法将KKO1和TL2株在含有酵母提取物0.5％、矿物溶液(参照下述)0.3％的M9培养基(下述组成)10升中30℃下培养24小时，将回收的培养液4℃下以78000m/s2(＝8000G)离心处理10分钟，除去上清液后，将菌体颗粒在4℃的PBS溶液500ml中再混悬。将该菌液注入预先冷却到4℃的各容器中，每个40ml，利用法式压力器(フレンチプレス)边加压到2200kg/cm2，边少量地从喷嘴排出菌液，进行菌体破碎处理。将得到的菌体破碎液4℃下，以78000m/s2(＝8000G)进行10分钟离心处理后，回收上清液。将该上清液用0.45μm的过滤器过滤并除去固体杂物，以上述方法测定所含pHB合成酶的活性。结果是，作为比活性，对于KKO株为11.6U/mL、对于TL2株为1.2U/mL。将该液除添加生物体溶液试样浓缩剂(商品名みずぶとリくん、アト-社制)外，进行过滤浓缩，形成10U/mL的粗酶液，将由KKO1株产生的称为粗酶液(1)、将由TL2株产生的称为粗酶液(2)。
Na2HPO46.2gKH2PO43.0gNaCl0.5gNH4Cl1.0g(培养基1升中，pH7.0)(矿物溶液)氰三醋酸1.5g；MgSO43.0g；MnSO40.5g；NaCl1.0g；FeSO40.1g；CaCl20.1g；CoCl20.1g；ZnSO40.1g；CuSO40.1g；AlK(SO4)20.1g；H3BO30.1g；Na2MoO40.1g；NiCl20.1g(1升中，pH7.0)。
(参考例5)具有PHA合成酶生产能力的转化体的制作制作具有PHA合成酶生产能力的转化体。
将YN2株在100ml的LB培养基(1％蛋白胨(日本制药(株)制)、0.5％酵母提取物(Dif co社制)、0.5％氯化钠、pH7.4)中，30℃下培养一夜后，利用マ-マ-等人的方法分离回收染色体DNA。将得到的染色体DNA用限制酶Hind 111完全消化，对载体使用PUC18，用限制酶Hind 111进行切断。末端进行脱磷酸处理(Molecular Cloning，1，572，(1989)；Cold Spring Harbor Laboratory出版)后，用DNA连接试剂盒Ver.11(宝酒造(株)制)，将载体的切断部位(菌落侧)和染色体DNA的Hind 111完全消化片段进行连接。使用编入了该染色体DNA片段的质粒载体，对大肠杆菌(Escherichia Coli)HB101株进行转化，制作成YN2株的DNA文库。
接着，为选择含有YN2株的PHA合成酶基因的DNA片段，调制菌落·杂交用的探针。合成由序列号3和序列号4的碱基序列形成的寡核苷酸(AmershamPharmacia Biotech(株))、将该寡核苷酸作为引物，以染色体DNA作样板进行PCR。将可进行PCR扩增的DNA片段作探针。探针的标识化，可利用市售的标识酶系AIK phos Direct(Amersham Pharmacia Biotech(株)制)进行。
使用得到的标识化探针，根据菌落杂交法，由YN2株的染色体DNA文库中选取含有PHA合成酶基因的重组质粒的大肠杆菌菌株。利用碱法从选择的菌株中回收质粒，得到含有PHA合成酶基因的DNA片段。
将得到的基因DNA片段，重组到不属于不和合性的Incp、IncQ或IncW中任何一个的含有宽润宿主复制域的载体pBBR 122(Mo Bi Tec)中。在菊苣假单胞菌属YN 2ml株(PHA合成缺陷株)中利用电蚀孔法，对上述重组质粒进行转化时，YN2mL株可恢复PHA合成能力，呈现出互补性。因此，可确认选取的基因DNA片段在菊苣假单胞菌属YN 2ml株内，含有可翻译成PHA合成酶的PHA合成酶基因区域。
对于这种DNA片段，利用桑格法确定碱基序列，其结果，可以确认在确定的碱基序列中，对各个肽链进行编码，存在以序列号5和序列号6表示的碱基序列。对于这些PHA合成酶基因，将染色体DNA作模板进行PCR，再调制成完整长度的PHA合成酶基因。
即，对于以序列号5表示的碱基序列的PHA合成酶基因，合成上游侧引物(序列号7)和下游侧引物(序列号8)；对于以序列号6表示的碱基序列的PHA合成酶基因，合成上游侧引物(序列号9)和下游侧引物(序列号10)(Amersham Pharmacia Biotech(株))。使用这此引物，对序列号5和序列号6表示的碱基序列分别进行PCR，使PHA合成酶基因扩增到完整长度(LA-PCR试剂盒；宝酒造(株)制)。
接着，将得到的PCR扩增片段和表达载体pTrc 99A，用限制酶Hind 111进行切断，进行脱磷酸化处理(Molecular Cloning 1卷、572页，1989年；Cold Spring Harbor Laboratory出版)后，使用DNA连接试剂盒Ver.11(宝酒造(株)制)将含有除掉两末端无用碱基序列的PHA合成酶基因的完整长度的DNA片段，与该表达载体pTrc99A的切断部位进行连接。
利用氯化钙法以得到的重组质粒对大肠杆菌(Escherichia Coli HB101宝酒造)进行转化，培养得到的重组体，使重组质粒进行扩增，分别回收重组质粒，将保持序列号5的基因DNA的重组质粒称为pYN2-C1，将保持了序列号6基因DNA的重组质粒称为pYN2-C2。利用氯化钙法，以pYN2-C1、pYN2-C2对大肠杆菌(Escherichia coli HB101 fB fadB缺陷株)进行转化，得到各个保持重组质粒的重组大肠杆菌株、pYN2-C1重组株、pYN2-C2重组株。
(参考例6)PHA合成酶的生产1对于pYN2-C1，分别设计、合成上游侧引物的寡核甘酸(序列号11)和下游侧引物的寡核甘酸(序列号12)(Amersham Pharmacia Biotech(株))。将这种寡核苷酸作为引物，将pYN2-C1作为模板进行PCR，将上游具有BamHl限制部位、下游具有Xhol限制部位的PHA合成酵基因扩增到完整长度(LA-PCR试剂盒；宝酒造(株)制)。
利用Bam Hl和Xhol对精制的各个PCR扩增产物进行消化，插入到与质粒pGEX-6P-1(Amersham Pharmacia Biotech(株)制)相对应的部位上。使用这些载体对大肠杆菌(JM 109)进行转化，得到表达用菌株。使用Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems、PROMEGA社制)，用BamHl、Xhol对大量调制的质粒DNA进行处理，利用得到的DNA片段进行菌株的确认。将得到的菌株在LB-Amp培养基10mL中预培养一晚，将其0.1mL添加到10mL的LB-Amp培养基中，37℃下以170rpm振荡培养3小时，随后，添加IPTG(终浓度1mM)，37℃下继续培养4～12小时。
将IPTG衍生的大肠杆菌进行集菌(78000m/s2(＝8000G)、2分钟、4℃)，在1/10量的4℃磷酸缓冲生理食盐水(PBS，8g NaCl，1.44g Na2HPO4，0.24gKH2PO4，0.2g KCl，1000ml精制水)中再混悬。利用冷冻融解和声波振荡破碎菌体，进行离心(78000m/s2(＝8000G)、10分钟、4℃)除去固体杂物。用SDS-PAGE确认上清液中存在所要求的表达蛋白质后，对诱导表达的GST融合蛋白质，用谷胱甘肽·琼脂糖4B(Amersham Pharmacia Biotech(株)制)进行精制。
对使用的谷胱甘肽·琼脂糖，预先进行抑制非特异性吸附的处理。即，用同量的PBS对谷胱甘肽·琼脂糖洗涤3次(78000m/s2(＝8000G)、1分钟、4℃)后，加入同量的含有4％牛血清白蛋白的PBS，4℃下处理1小时。处理后，用同量的PBS洗涤2次，在1/2量的PBS中再混悬。
将上述处理的谷胱苷肽·琼脂糖40μL添加到体外提取液1ml中，4℃下安静搅拌。这样在谷胱甘肽·琼脂糖上吸附上融合蛋白质GST-YN2-C1和GST-YN2-C2。吸附后，进行离心(78000m/s2(＝8000G)、1分钟、4℃)回收谷胱甘肽·琼脂糖，用400μL的PBS洗涤3次。随后，添加10mM谷胱甘肽40μL，4℃下搅拌1小时，溶出吸附的融合蛋白质。进行离心(78000m/s2(＝8000G)、2分钟、4℃)，回收上清液后，对PBS进行透析，精制GST融合蛋白质。利用SDS-PAGE确认为单带。
用预分离蛋白酶(Amersham Pharmacia Biotech(株)制、5U)对各GST融合蛋白质500g进行消化后，通过谷胱甘肽·琼脂糖除去蛋白酶和GST。使用由PBS平衡化的葡聚糖凝胶G200柱，进行渗透流动分层，得到表达蛋白质YN2-C1和YN2-C2的最终精制物。利用SDS-PAGE分别确认为60.8kDa和61.5kDa的单带。
使用生物体溶液试样浓缩剂(おずぶとリくんAB-1100、アト-(株)制)对该酶进行浓缩，得到10U/mL的精制酶溶液。
用上述方法测定各精制酶活性。试样中的蛋白质浓度，利用全套微量BCA蛋白质定量试剂试剂盒(ピアスケミカル社制)进行测定。各精制酶的活性测定结果示于表1。
来源活性 比活性精制酶液(2)pYN2-C1 2.1U/mL 4.1U/mg蛋白质精制酶液(3)pYN2-C2 1.5U/mL 3.6U/mg蛋白质(参考例7)PHA合成酶的生产2将P91株、H45株、YN2株和P161株，植入含有酵母提取物(Difco社制)0.5％、辛烷酸0.1％的M9培养基200mL中，30℃下以125次冲程/分钟，进行振荡培养。24小时后，利用离心分离(98000m/s2(10000G)、4℃、10分钟)回收菌体，在0.1MTris盐酸缓冲液(pH8.0)200ml中再混悬，再次离心分离，进行洗涤。将菌体在0.1MTris盐酸缓冲液(pH8.0)2.0mL中再混悬，用超声波破碎机破碎后，进行离心分离(118000m/s2(＝12000G)、4℃、10分钟)，回收上清液，得到粗酶溶液，用上述方法测定各粗酶活性，结果示于表2。
来源活性粗酶液(3) P91株 0.1U/mL粗酶液(4) H45株 0.2U/mL粗酶液(5) YN2株 0.4U/mL粗酶液(6) P161株 0.2U/mL使用生物体溶液试样浓缩剂(おずぶとリくんAB-1100、アト-(株)制)对该粗酶溶液浓缩，得到10U/mL的精酶溶液。
(参考例8)3-羟酰基CoA的合成
(R)-3-羟辛酰-CoA，根据Rehm BHA，Kruger N，SteinbuchelA(1998)Journal of Biological Chemistry 273 pp24044-24051，除若干变动外，按如下进行，将酰基辅酶A合成酶(Sigma社制)溶解在含有2mM ATP、5mMMgCl2、2mM Coenzyme A、2mM(R)-3-hydroxyoctan oate的Tris盐酸缓冲液(50mM、pH7.5)中，形成0.1毫单位/微升。在37℃的温浴中保温，随时取样，用HPLC分析反应的进行。在取样的反应溶液中添加硫酸形成0.02N，停止酶反应后，用正庚烷提取去除未反应的基质(R)-3-羟基辛酸酯。在利用HPLC的分析中，使用RP18柱子(nucleosil C18、7μm、Knauser)，以25mM磷酸缓冲液(pH5.3)作流动相，使用乙腈的直线浓度梯度溶出，用二极管阵列检测器监测200～500nm的吸光光谱，检出由酶反应生成的硫代酯化合物。同样，调制(R)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA和(R)-3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酰CoA。
(实施例1)向含有D-葡萄糖0.5％和5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)0.1％的M9培养基20L中植入菊苣假单胞菌YN2株(Pseudomonas cichorlii YN2、FERM BP-7375)、以30℃、80转/分钟、通气量为2.5L/分钟进行通气搅拌培养。48小时后，离心分离回收菌体，在含有D-葡萄糖0.5％和FPVA 0.1％的、不含有氮源(NH4Cl)的M9培养基20L中再混悬，以30℃、80转/分钟、通气量为2.5L/分钟进行进行通气搅拌培养。48小时后，用离心分离回收菌体，从回收的湿菌体分取1g作分析评价用，用冷甲醇一次清洗后，进行冷冻干燥，得到冷冻干燥颗粒。
对于残留的湿菌体，在约1.7％的次亚氯酸钠水溶液500ml中进行混悬，在4℃振荡2小时并提取PHA。利用离心分离回收PHA，干燥，结果每1L培养基液量得到0.87g PHA。将该PHA作为示例化合物1。
将该冷冻干燥颗粒混悬在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，提取PHA。将提取液用孔径0.45的薄膜过滤器过滤后，用旋转蒸发器浓缩，将浓缩液在冷甲醇中再沉淀，只回收沉淀物，进行真空干燥，得到PHA。
对得到的PHA的组成进行如下分析。即，将约10mg PHA装入25ml茄子型烧瓶内，溶解在氯仿2ml中，加入含3％硫酸的甲醇溶液2ml，100℃下边回流边反应3.5小时。反应结束后，加入去离子水10ml并剧烈振荡10分钟后，分离成2层，取出下层氯仿层，用硫酸镁脱水后，将该氯仿层，用气相色谱-质量分析装置(GC-MS、岛津QP-5050，柱DB-WAX(J & W社0.32mmラ30m)E1法)对该氯仿层进行PHA单体单元的甲基酯化物的鉴定。结果，作为PHA单体单元，96％是3HFPV，4％是3-羟基丁酸的单位，以高收率获得来自FPVA的所要求的单体单元即3HFPV单体单元比例高的PHA。
利用凝胶渗透色谱法(GPC；东曹-HLC-8020、柱Polymer Labtorary PLgelMIXED-C(5.)、溶剂(氯仿、聚苯乙烯换算)评价该PHA的分子量，结果是Mn＝71,500、Mw＝158,000。
实施例2除了用4-苯氧丁酸(PXBA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基-4-苯氧丁酸(3HPxB)单体单元的PHA，每1升培养基液量得到0.15g的PHA。将该PHA作为示例化合物2。
对于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，95％是PxBA、5％是3-羟基丁酸的单位，以高收率获得来自PXBA的所要求的单体单元即3HPXB单体单元比例高的PHA。分子量是Mn＝71500，Mw＝158,000。
(实施例3)除了用4-环己基丁酸(CHBA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基-4-环己基丁酸(3HCHB)单体单元的PHA，每1L培养基液量得到0.79g的PHA，将该PHA作为示例化合物3。
对得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，98％是3HCHB，2％是3-羟基丁酸的单位，以高收率获得来自CHBA的所要求的单体单元即3HCHB单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝92,200，Mw＝218,000。
(实施例4)除了使用5-苯酰戊酸(BzVA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基-5-苯酰戊酸(3HBZV)单体单元的PHA，每1L培养基液量得到0.55g的PHA，将该PHA作为示例化合物4。
对得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，88％是3HBZV，12％是3-羟基丁酸、3-羟基己烷酸、3-羟基辛烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷基酸、3-羟基十二烷烯酸中的1种以上的单位，以高收率获得来自BzVA的所要求的单体单元即3HBZV单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝325,000，Mw＝124,0000。
(实施例5)
除了用5-(4-氟苯酰基)戊酸(FBZVA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基-5-(4-氟苯酰基)戊酸(3HFBzV)单体单元的PHA，每1L培养基液量得到0.35g的PHA，将该PHA作为示例化合物5。
对得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，79％是3HFBzV，21％是3-羟基丁酸、3-羟基己烷酸、3-羟基辛烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷烯酸中的1种以上的单位，以高收率获得来自FBZV的所要求的单体单元即3HFBZV单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝285,000，Mw＝833,000。
(实施例6)除了使用5-噻吩基戊酸(TVA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基-5-噻吩基戊酸(3HTV)单体单元的PHA，每1升培养基液量得到0.85g的PHA，将该PHA作为示例化合物6。
对于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，97％是3HTV，3％是3-羟基丁酸单位，以高收率获得来自TVA的所要求的单体单元即3HTV单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝75,000，Mw＝185,000。
(实施例7)除了使用5-噻吩酰基戊酸(ToVA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基-5-噻吩酰基戊酸(3HToV)单体单元的PHA，每1L培养基液量得到0.15g PHA，将该PHA作为示例化合物7。
对于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，62％是3HToV，38％是3-羟基丁酸、3-羟基己烷酸、3-羟基辛烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷烯酸中的1种以上单位，以高收率获得来自ToVA的所要求的单体单元即3HToV单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝105000，Mw＝252000。
(实施例8)除了使用5-(4-氟硫代苯氧基)戊酸(FTPxVA)取代FPVA外，其他和实施例1一样的条件下，合成含有3-羟基-5-(4-氟硫代苯氧)戊酸(3HFTPxV)单体单元的PHA，每1L培养基液量得到0.92g的PHA，将该PHA作为示例化合物8。
对于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，82％是3HFTPxV，18％是3-羟基丁酸、3-羟基己烷酸、3-羟基辛烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷烯酸中的1种以上单位，以高收率获得来自FTPXVA的所要求的单体单元即3HFTPxV单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝95000、Mw＝282000。
(实施例9)除了使用5-[(4-氟苯甲基)磺胺基]戊酸取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基-5-[(4-氟苯甲基)磺胺基]戊酸单体单元的PHA，每1L培养基液量得到0.35g PHA，将该PHA作为示例化合物9。
对于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，89％是3-羟基-5-[(4-氟苯甲基)磺胺基]戊酸单体单元，11％是3-羟基丁酸、3-羟基己烷酸、3-羟基辛烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷烯酸中1种以上的单位，以高收率获得来自5-[(4-氟苯甲基)磺胺基]戊酸的所要求的单体单元即3-羟基-5-[(4-氟苯甲基)磺胺基]戊酸单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝35000、Mw＝92000。
(实施例10)除了使用5-硫代噻吩氧戊酸(TTxVA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成3-羟基-5-硫代噻吩氧戊酸3HTTxV)单体单元的PHA，每1L培养基液量得到1.1g PHA，将该PHA作为示例化合物10。
关于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，90％是3HTTxV，10％是3-羟基丁酸、3-羟基己烷酸、3-羟基辛烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷烯酸中的1种以上单位，以高收率获得来自TTXVA的所要求的单体单元3HTTXV即单体单元比例高的PHA，分子量是Mn＝205000、Mw＝550000。
(实施例11)除了使用辛烷酸(OA)取代FPVA外，其他和实施例1完全相同的条件下，合成含有3-羟基辛烷酸(3HO)单体单元的PHA，每1L培养基液量得到0.75g PHA，将该PHA作为示例化合物11。
对于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，作为PHA单体单元，65％是3HO，35％是3-羟基丁酸、3-羟基己烷酸、3-羟基庚烷酸、3-羟基壬烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷烯酸中的1种以上单位，以高收率获得来自OA的所要求的单体单元即3HO单体单元比例高的PHA，分子量Mn＝132000、Mw＝312000。
(实施例12)将在含酵母提取物0.1％的M9琼脂培养基上培养的YN2株菌落，混悬在灭菌的生理食盐水中，形成OD(600nm)＝1.0。在预先制作的不含碳源的1/10N-M9琼脂培养基100枚上，涂布上述混悬液，在1-辛烷环境中，30℃下静置培养。
4天后，收集菌体，用甲醇清洗，离心分离收集菌体，减压下干燥。向干燥菌体中加入氯仿50mL。30℃下搅拌48小时，提取PHA。将氯仿层过滤，用蒸发器浓缩后，注入冷甲醇，回收沉淀，减压干燥，得到0.26g PHA。将该PHA作为示例化合物12。
对于得到的PHA和实施例1一样进行分析评价，再进行1H-NMR分析(使用的设备FT-NMRBruker DP×400，测定核种1H，使用溶剂氘代氯仿(加入TMS))。关于侧链末端的甲川、侧连的末端双键及环氧的质子归属，按照Macromolecules，31，1480-1486(1998)进行。其结果是，作为PHA单体单元，17％是环氧单位、30％是饱和单位、53％是不饱和单位。饱和、不饱和单位是3-羟基己烷酸、3-羟基庚烷酸、3-羟基辛烷酸、3-羟基癸烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基己烯酸、3-羟基庚烯酸、3-羟基辛烯酸、3-羟基十二烯酸中的1种以上单位，以高收率获得来自1-辛烷的所要求的单体单元即环氧单体单元比例高的PHA，分子量Mn＝251000、Mw＝550000。
(实施例13)将N-(S)-2-Tetrahydrofuroyl-Gly-D2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2(以下简称肽A)的醋酸盐(TAP社制)500mg，溶解在蒸馏水0.6ml中。将得到的溶液加入到在二氯甲烷5.8ml中溶解4.5g示例化合物1形成的溶液中，用小型均化器(キネマチカ社制)混合60秒，得到W/O型乳化物。将该W/O型乳化物冷却到16℃后，注入到预先冷却到16℃的0.1％聚乙烯醇(EG-40、日本合成化学制)水溶液1000ml中，使用涡轮型混均器(特殊机化制)，以7000rpm形成W/O/W型乳化物。将该W/O/W型乳化物在室温下搅拌3小时，挥发掉二氯甲烷，使W/O型乳化的固化后，用离心分离机(05PR-22、日立制作所)以2000rpm进行离心分离。将得到的沉淀物在蒸馏水中再分散后，对分散液进行离心分离，清洗去除游离药物。将得到的微胶囊在少量蒸馏水中再分散后，向分散液中加入D-甘露糖醇0.3g，冷冻干燥，得到微胶囊1的粉末。微胶囊中肽A的量示于表3。
(实施例14～24)除了使用示例化合物2～12取代示例化合物1外，其他和实施例13完全一样，得到微胶囊2～12。微胶囊中肽A的含量示于表3。
(实施例25)将上述微胶囊12的50质量份混悬在精制水50质量份中后，在该混悬液中，溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，通过冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到微胶囊13。微胶囊中肽A的含量示于表3。
对微胶囊13进行红外线吸收测定(FT-IR；パ一キンエルマ-社制、1720X)，处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在微胶囊13中消失。据此可知，侧链具有环氧单位的PHA与六亚甲基二胺发生了反应，得到由交联聚合物包覆的微胶囊13。
(实施例26)对于上述微胶囊12的50质量份中添加末端氨基改性的聚硅氧烷(变性硅酮油TSF4700，GE东芝Siliconン(株)制)10质量份，70℃下反应2小时，将其混悬在甲醇中，反复进行离心分离(10000×g、4℃、20分钟)作业，清洗、干燥、得到具有聚硅氧烷接枝链的微胶囊14。微胶囊中的肽A含量示于表3。
对微胶囊14进行红外线吸收测定(FT-IR；パ一キンエルマ-社制、1720X)，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在微胶囊14中消失。据此可知，侧链具有环氧单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧发生了反应，得到具有聚硅氧烷接枝链的微胶囊14。
(比较例1)除了使用乳酸-乙二醇酸共聚物(以下简称PLGA)(和光纯药制、lot.940810，乳酸/乙二醇酸(摩尔比)74/26，GPC重均分子量10000、GPC数均分子量3900、利用末端基定量法测定数均分子量3700)取代示例化合物外，其他和实施例13一样调制微胶囊15，微胶囊中的药物含量示于表3。
表3

(实施例27)将肽A的醋酸盐(TAP社制)500mg溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)0.6ml中，再加入精制酶液(1)60μl、(R)-3-羟丁酰CoA(Sigma Aldrich Japan(株)社制)60mg，牛血清白蛋白(Sigma社制)5mg，溶解。将得到的溶液加入到二氯甲烷5.8ml中，用小型均化器(キネマチカ社制)混合60秒，得到W/O型乳化物。将该W/O型乳化物冷却到16℃后，注入预先冷却到16℃的0.1％聚乙烯醇(EG-40、日本合成化学制)水溶液1000ml中，用涡轮型混均器(特殊机化制)，以7000rpm形成W/O/W型乳化物。将该W/O/W型乳化物在室温下搅拌3小时，合成PHA，同时挥发掉二氯甲烷，使W/O型乳化物固化后，用离心分离机(05PR-22、日立制作所)，以2000rpm进行离心分离，将得到的沉淀物在蒸馏水中再分散后，将分散液再离心分离，清洗除去游离药物。将得到的微胶囊在少量蒸馏水中再分散后，向分散液中加入D-甘露糖醇0.3g，冷冻干燥，得到微胶囊16粉末。微胶囊中的肽A含量示于表4。
将胶囊16在20ml的氯仿中混悬，60℃下搅拌20小时，提取构成外壳的pHB。将提取液用0.45μm的薄膜过滤器过滤，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS、岛津QP-5050、El法)进行分析，进行pHB单体单元的甲基酯化物鉴定。结果是，在得到的色层谱中，主成分的峰，与标准品羟基丁酸的甲基化化合物的保持时间是一样的，从而可以确认得到的胶囊16外壳的主成分是pHB。
进而，利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020、柱Polymer LabtoraryPLgel MI XED-C(5μm)、溶剂氯仿、柱温度40℃、聚苯乙烯换算)评价该pHB的分子量，结果是Mn＝73000。
(实施例28)除了用粗酶液(1)取代实施例27中的精制酶液(1)外，其他和实施例27一样，得到胶囊17。胶囊中的药物含量示于表4。与实施例27一样进行评价，结果可以确认，得到的胶囊17外壳的主成分为pHB。利用凝胶渗透色谱法的解析结果是在得到的胶囊17中所含PHA的数均分子量为71000。
(实施例29)除了用粗酶液(2)取代实施例27中的精制酶液(1)外，其他和实施例27一样得到胶囊18，微胶囊中的药物含量示于表4。与实施例27一样进行评价，结果可以确认，得到的胶囊18外壳的主成分是pHB。利用凝胶渗透色谱法的解析结果是在得到的胶囊18中所含PHA的数均分子量为73000。
(实施例30)除了用精制酶液(2)取代实施例27中的精制酶液(1)，利用(R)-3-羟辛酰CoA(用Eur J.Biochem.，250、432-439(1997)中记载的方法调制)取代实施例27中的(R)-3-羟丁酰CoA外，其他和实施例27完全一样，得到胶囊19中所含的PHA。微胶囊中的药物含量示于表4。
和实施例27一样评价，结果可以确认得到的胶囊19外壳的主成分是由3-羟辛烷酸单位形成的PHA。利用凝胶渗透色谱法解析的结果是得到的胶囊19中所含PHA的数均分子量为24000。
(实施例31)使用精制酶液(3)取代实施例27中的精制酶液(1)，使用(R、S)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA(将利用Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯基戊酸酯水解，得到3-羟基-5-苯基戊酸后，用Eur.J.Biochem.250.432-439(1997)中记载的方法调制)取代实施例27中的(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，和实施例27一样，得到胶囊20，微胶囊中的药物含量示于表4。
和实施例27一样进行评价，结果可以确认得到的胶囊20外壳的主成分是由3-羟基-5-苯基戊酸单位形成的PHA。利用凝胶渗透色谱法解析的结果是所得胶囊20中所含的PHA数均分子量为21000。
(实施例32)使用粗酶液(3)取代实施例27中的精制酶液(1)、和用(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA(将用J.Org.Chem.55.1490-1492(1990)中记载的方法合成的3-苯氧丙醛及溴醋酸乙酯作原料，对利用锌的Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧戊酸酯水解，得到3-羟基-5-苯氧戊酸后，用Eur.J.Biochem.，250、432-439(1997)中记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他和实施例27完全一样，得到胶囊21。微胶囊中的药物含量示于表4。
和实施例27一样评价，结果可以确认得到的胶囊21外壳的主成分是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位形成的PHA。利用凝胶渗透色谱法解析的结果是所得胶囊21中含有的PHA数均分子量为24000。
(实施例33)用粗酶液(4)取代实施例27中的精制酶液(1)，和用(R、S)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA取代(R)-3-羟基丁酰CoA，除此之外，和实施例27完全一样进行PHA合成反应。在室温下反应1小时后，添加(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA 60mg，室温下反应2小时。以后的处理和实施例27完全一样，得到胶囊22。微胶囊中的药物含量示于表4。
对该胶囊结构体表面形成的聚合物质量，利用飞行时间型二次离子质量分析装置(TOF-SIMS IV，CAMECA制)进行测定。从得到的质谱，可以确认胶囊结构体表面的PHA是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位构成的。利用离子喷溅少量多次地除去胶囊结构体的表面，同样利用TOF-SIMS测定质谱时，可以确认此时构成胶囊结构体的PHA单体单元的主成分置换成了3-羟基-5-苯氧戊酸单位。由此可知本实施例的胶囊结构体是包覆了药1的、在聚(3-羟基-5-苯基戊酸)上包覆了聚(3-羟基-5-苯氧戊酸)的所要求的胶囊结构体。根据利用凝胶渗透色谱法解析的结果，所得胶囊22中所含的PHA数均分子量为21000。
(实施例34)用粗酶液(5)取代实施例27中的精制酶液(1)，利用48mg的(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA、12mg的(R、S)-3-羟基-7，8-环氧辛酰CoA(将用Int.J.Biol Macromol.，12 85-91(1990)中记载的方法合成的3-羟基-7-辛烯酸的不饱和部分用3-氯苯甲酸环氧化后，用Eur.J.Biochem.250、432-439(1997)中记载的方法调制)取代实施例27中的60mg的(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，和实施例27完全相同，得到胶囊23。微胶囊中的药物含量示于表4中。利用1H-NMR(使用机器FT-NMRBr uker DPX400，测定核种1H，使用溶剂氘代氯仿(TMS加入))的解析结果，可确认得到的胶囊23外壳是由3-羟基-5-苯基戊酸单位77％、3-羟基-7，8-环氧辛烷酸单位23％形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法解析的结果是所得胶囊23中所含PHA的数均分子量为22000。
(实施例35)对于上述胶囊23的50质量份在精制水50质量份中混悬后，在该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到胶囊24。微胶囊中的药物含量示于表4。
对胶囊24进行红外线吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制、1720X)，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在胶囊24中消失。由此可知在侧链上具有环氧单位的PHA与六亚甲基二胺发生了反应，得到由交联聚合物包覆的胶囊24。
(实施例36)对上述胶囊24，50质量份中添加10质量份末端氨基改性聚硅氧烷(变性硅酮油TSF4700、GE东芝Silicon(株)制)、70℃下反应2小时。将其在甲醇中混悬，反复进行离心分离(10000×g、4℃、20分钟)作业、清洗、干燥、得到具有聚硅氧烷接枝链的胶囊25、微胶囊中的药物含量示于表4。
对胶囊25进行红外线吸收测定(FT-IR、Perkin Elmer公司制，1720X)，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)及环氧(822cm-1附近)的峰在胶囊25中消失。由此可知，侧链上具有环氧单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷进行反应，得到具有聚硅氧烷接枝链的胶囊25。
表4

(实施例37)将肽A的醋酸盐(TAP社制)500mg溶解在0.6ml蒸馏水中。将得到的溶液加入到二氯甲烷5.8ml中，用小型均化器(キネマチカ社制)混合60秒，得到W/O型乳化物。将该W/O型乳化物冷却到16℃后，注入预先冷却到16℃的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)、0.1％聚乙烯醇(EG-40、日本合成化学制)水溶液100ml中，用涡轮型混均器(特殊机化制)，以7000rpm形成W/O/W型乳化物，向该W/O/W型乳化物中，加入并溶解精制酶液(1)5ml、(R)-3-羟丁酰CoA(SigmaAldrich Japan(株)制)1g、牛血清白蛋白(Sigma社制)100mg。
将该W/O/W型乳化物室温下搅拌3小时，合成PHA，同时挥发掉二氯甲烷，使W/O型乳化物固化后，用离心分离机(O5PR-22、日立制作所)以2000rpm进行离心分离。将得到的沉淀物在蒸馏水中再分散后，再将分散液离心分离，清洗去除游离药物。将得到的微胶囊在少量蒸馏水中再分散后，向分散液中加入D-甘露糖醇0.3g，进行冷冻干燥，得到微胶囊26粉末，微胶囊中的肽A含量示于表5。
将胶囊26在20ml氯仿中混悬，60℃下搅拌20小时，提取构成外壳的pHB。用孔径0.45μm的薄膜过滤器过滤提取液，用旋转蒸发器减压浓缩后，按照常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS、岛津QP-5050、El法)进行分析，并确定pHB单体单元的甲基酯化物。结果是因为在所得色层谱中主成分的峰与标准品羟基丁酸的甲基化化合物的保持时间一致，所以可确认所得胶囊26外壳的主成分是pHB。
进而，利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020、柱Polymer LabtoraryPLgel MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿、柱温40℃、聚苯乙烯换算)评价该pHB的分子量，结果是Mn＝78000。
(实施例38)除了用粗酶液(1)取代实施例37中的精制酶液(1)，其他和实施例37完全一样，得到胶囊27。微胶囊中的药物含量示于表5。
和实施例37一样评价，结果可以确认所得胶囊27外壳的主成分是pHB。根据利用凝胶渗透色谱法的解析结果是所得胶囊27中所含PHA的数均分子量为75000(实施例39)除了用粗酶液(2)取代实施例37中的精制酶液(1)外，其他和实施例37完全一样，得到胶囊28。微胶囊中药物含量示于表5。
和实施例37一样评价，结果可以确认所得胶囊28外壳的主成分是pHB。根据利用凝胶渗透色谱法的解析结果是在所得胶囊28中所含PHA的数均分子量为77000。
(实施例40)使用精制酶液(2)取代实施例37中的精制酶液(1)、和使用(R)-3-羟辛酰CoA(用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)中记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，和实施例37完全一样，得到胶囊29，微胶囊中药物含量示于表5。
和实施例37一样评价，结果可以确认所得胶囊29外壳的主成分是由3-羟基辛烷酸单位形成的PHA。根据凝胶色谱柱解析的结果是在所得胶囊29中所含PHA的数均分子量为27000。
(实施例41)用精制酶液(3)取代实施例37中的精制酶液(1)、和使用(R、S)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA(将根据Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯基戊酸酯水解，得到3-羟基-5-苯基戊酸后，用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，和实施例37完全一样，得到胶囊30，微胶囊中的药物含量示于表5。
和实施例37一样评价，结果可以确认得到的胶囊30外壳的主成分是由3-羟基-5-苯基戊酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法解析的结果是所得胶囊30中所含PHA数均分子量为22000。
(实施例42)使用粗酶液(3)取代实施例37中的精制酶液(1)，和使用(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA(将用J.Org.Chem.55.1490-1492(1990)记载方法合成的3-苯氧丙醛和溴醋酸酯作原料，利用锌的Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧戊酸酯，水解得到3-羟基-5-苯氧戊酸后，用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，和实施例37完全一样，得到胶囊31。微胶囊中药物含量示于表5。
和实施例37一样评价，结果可以确认得到有胶囊31外壳的主成分是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果是所得胶囊31所含的PHA数均分子量为23000。
(实施例43)使用粗酶液(4)取代实施例37中的精制酶液(1)、和使用(R、S)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA取代(R)-3-羟丁酰CoA，除比之外，和实施例37完全一样，进行PHA合成反应。室温下反应1小时后，添加(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA 1g，室温下反应2小时，以后的处理和实施例37完全一样，得到胶囊32。微胶囊中的药物含量示于表5。
利用飞行时间型二次离子质量分析装置(TOF-SIMS IV CAMECA制)测定该胶囊结构体表面形成的聚合物质量。从得到的质谱，可以确认胶囊结构体表面的PHA主要由3-羟基-5-苯氧戊酸单位构成。利用离子喷溅少量多次地消除胶囊结构体的表面，同样用TOF-SIMS测定质谱，可以确认，此时构成胶囊结构体的PHA单体单元的主成分置换成了3-羟基-5-苯基戊酸单位。由此可知，本实施例的胶囊结构体是包覆了药物1的、在聚(3-羟基-5-苯基戊酸)上包覆了聚(3-羟基-5-苯氧戊酸)的所要求的胶囊结构体。根据凝胶渗透色谱法的解析结果是所得胶囊32中所含PHA数均分子量为24000。
(实施例44)使用粗酶液(5)取代实施例37中的精制酶液(1)，和使用800mg的(R、S)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA、200mg的(R、S)-3-羟基-7，8-环氧辛酰CoA(将用Int.J.Biol Macrom ol.，12、85-91(1990)记载的方法合成的3-羟基-7-辛烯酸的不饱和部分用3-氯苯甲酸环氧化后，再用Eur.J.Biochem. 250，432-439(1997)记载的方法调制)取代1g的(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，和实施例37完全一样，得到胶囊33。微胶囊中的药物含量示于表5。根据1H-NMR(使用设备FT-NMRBruker DPX400，测定核种1H，使用溶剂氘代氯仿(加入TMS))的解析结果，可以确认得到的胶囊33外壳是由3-羟基-5-苯基戊酸单位76％、3-羟基-7，8-环氧辛烷酸单位24％形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法解析的结果是所得胶囊33中所含PHA数均分子量为25000。
(实施例45)对于上述胶囊33，将50质量份混悬在精制水50质量份中后，向该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份，确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到胶囊34。微胶囊中药物含量示于表5。
对胶囊34进行红外线吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)，加热前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰，在胶囊34中消失，由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与六亚甲基二胺发生了反应，得到由交联聚合物包覆的胶囊34。
(实施例46)对于上述胶囊34，向50质量份中添加末端氨基改性聚硅氧烷(变性硅酮油TSF4700、GE东芝Silicon(株)制)10质量份，70℃下反应2小时。将其在甲醇中混悬，反复进行离心分离(10000×g、4℃、20分钟)作业、清洗、干燥，得到具有聚硅氧烷接枝链的胶囊35。微胶囊中的药物含量示于表5。
对于胶囊35进行红外吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制、1720X)，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在胶囊35中消失。由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷发生反应，得到具有聚硅氧烷接枝链的胶囊35。
表5

实验例1将约20mg微胶囊12分散在分散溶剂(将2.5mg羧甲基纤维素、0.5mg聚山梨醇酯80、25mg甘露糖醇溶解在蒸馏水)0.5ml，用22G注射针注射到10周龄雄性SD大白鼠的背部皮下。注射后每隔一定时间屠杀大白鼠后，取出注射部位残存的微胶囊，测定取出的微胶囊中肽A的量，结果示于表6。
实验例2-9和比较例实验例1作为微胶囊，使用微胶囊13、14、15、23、24、25、33、34、35，除此之外，和实验例1完全一样，调制制剂，经时测定肽A量，残存率示于表6。
表6

(实施例47)将500mg的示例化合物1溶解在70ml的氯仿中。向其中加入10ml的水溶性染料ダイレクト·スペシヤル·ブラツクAXN(日本化药社制)的溶液，用探针型超声波振荡机(Ohtake)进行乳化，制作成W/O型乳化液。超声波照射，在50瓦的条件下，30秒、重复10次。将如此调制的乳化液置于旋转蒸发器中，60℃下，减压馏去有机溶剂，得到载有染料的微胶囊。蒸发器的真空度开始很高，随着有机溶剂的蒸发，使真空度逐渐降低进行调节，以使其不发生突然沸腾。随后通入氮气，以馏去载有染料的微胶囊中残存少量的有机溶剂。再向得到的载有染料的微胶囊中加入适量的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)，形成30ml，用1.2μm的过滤器(Acrodisc，Gelman)进行过滤，使用透析膜(SpectraporSpectrumMedical)，在10mM磷酸缓冲液中，透析24小时，除掉没有载有的染料，得到载有了染料的微胶囊36，作为油墨1。利用动态光散射法测定平均粒径，并通过光学显微镜和电子显微镜进行观察，结果示于表7。
(实施例48～58)作为聚合物，除了使用示例化合物2～12外，和实施例47一样，得到微胶囊37～47，作为油墨2～12。
利用动态光散射法测定的平均粒径，及利用光学显微镜和电子显微镜观察的结果示于表7。
(实施例59)将上述微胶囊47，50质量份混悬在精制水50质量份中后，在该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到微胶囊48，作为油墨13。利用动态光散射法测定的平均粒径，及利用光学显微镜和电子显微镜观察的结果示于表7。
对微胶囊48进行红外线吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在微胶囊48中消失。由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与六亚甲基二胺发生了反应，得到由交联聚合物包覆的微胶囊48。
(实施例60)对于上述微胶囊47，在50质量份中添加10质量份末端氨基改性聚硅氧烷(变性硅酮油TSF 4700，GE东芝Silicon(株)制)、70℃下反应2小时，将其在甲醇中混悬，反复进行离心分离(10000×g、4℃、20分钟)作业，清洗、干燥，得到具有聚硅氧烷接枝链的微胶囊49，作为油墨14。利用动态光散射法测定的平均粒径，及利用光学显微镜和电子显微镜观察的结果示于表7。
对于微胶囊49进行红外线吸收测定(FT-IRPerkin Elmer公司制、1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在微胶囊49中消失，由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷发生反应，得到具有聚硅氧烷接枝链的微胶囊49。
(比较例2)作为聚合物，除了使用聚DL乳酸(平均分子量7000)外，和实施例47一样，得到微胶囊50，作为油墨15。
利用动态光散射法测定的平均粒径及利用光学显微镜和电子显微镜观察的结果示于表7。
表7

(实施例61)向70ml氯仿中加入如下调制的溶液，即在水溶性染料ダイクト·スブシヤルブラツクAXN(日本化药社制)溶液中添加由参考例6中调制的来自Pseudomonas cichorii YN2的PHA合成酶YN2-C1 10U/ml，和由参考例8调制的(R)-3-羟辛酰CoA形成终浓度1mM，用探针型超声波振荡机(Ohtahe)进行乳化，制作成W/O型乳化液。超声波的照射，在50瓦的条件下，30秒，重复10次。将如此调制的乳化液，在37℃下，培养3小时，进行PHA合成反应。
将反应液通过凝胶过滤法(Sephadex G-50柱)进行粒径尺寸分划，得到微胶囊。利用动态光散乱法时，该微胶囊的平均粒径在820nm下呈单分散状态。
将制作的微胶囊一部分，真空干燥后，混悬在20ml的氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取形成外壳的PHA。用0.45μm薄膜过滤器过滤提取液，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS岛津QP-5050El法)进行分析，同时确定PHA单体单元的甲基酯化物。结果可以确认，该PHA是将3-羟基辛烷酸作单体单元的PHA。进而利用凝胶渗透色谱法(GPC；东曹-HLC-8020，柱Polymer Labtorary PLgel MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，柱温40℃，聚苯乙烯换算)评价该PHA的分子量，结果是Mn＝13000，Mw＝32000。
(实施例62)按如下调制载有抗生素万古霉素的微胶囊。在70ml氯仿中加入在5％葡萄糖溶液中添加了0.2g万古霉素、由参考例6调制的来自Pseudomonas cichoriiYN2的PHA合成酶YN2-C210U/ml、由参考例8调制的(R)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA的形成终浓度1mM的10mL，用探针型超声波振荡机(Ohtake)进行乳化，制作成W/O型乳化液。超声波的照射，在50瓦的条件下，30秒，重复10次。将如此调制的乳化液，37℃下培养3小时，进行PHA合成反应。将反应液利用凝胶过滤法(Sephadex G-50柱)进行粒径尺寸划分，得到微胶囊，当利用动态光散射法时，该微胶囊平均粒径在840nm下呈单分散状态。
将制作的微胶囊一部分真空干燥后，混悬在20ml氯仿中，60℃下，搅拌20小时，提取形成外壳的PHA。利用孔径0.45μm的薄膜过滤器过滤提取液，用旋转蒸发器进行减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS，岛津QP-5050，EI法)进行分析，并同时确定PHA单体单元的甲基酯化物。结果可以确认该PHA是将3-羟基-5-苯基戊酸作为单体单元的PHA。进而利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020，柱Polymer LabtoraryPLgel MlXED-C(5μm)，溶剂氯仿、柱温40℃，聚苯乙烯换算)评价该PHA的分子量，结果是Mn＝15000、Mw＝37000。
(实施例63)按如下调制载有了农药活性成分化合物二甲基(3-甲基-4-硝苯基)硫代磷酸酯的微胶囊。
向70ml的氯仿中加入在5质量％二甲基(3-甲基-4-硝苯基)硫代磷酸酯溶液中添加由参考例7调制的来自P161株的PHA合成酶10U/ml和由添加由参考例8调制的(R)-3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酰CoA形成终浓度1mM的10mL，用探针型超声波振荡机(ohtane)进行乳化，制成W/O型乳化液。超声波照射，在50瓦的条件下，30秒，重复10次。将如此调制的乳化液在37℃下培养3小时，进行PHA合成反应。
将反应液用凝胶过滤法(Sephadex G-50柱)进行粒径尺寸划分，得到微胶囊。利用动态光散射法测定该微胶囊平均粒径为770nm的单分散状态。
将制作的微胶囊一部分，真空干燥后，混悬在20ml的氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取成为外壳的PHA。将提取液用0.45μm的薄膜过滤器过滤，用旋转蒸发器减压浓缩后，按照常规方法，进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS、岛津QP-5050、EI法)进行分析，同时确定PHA单体单元的甲基酯化物。其结果是确认为该PHA是将(R)-3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸作为单体单元的PHA，进而利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020、柱PolymerLabtorary PLgel MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿、柱温度40℃、聚苯乙烯换算)评价该pHB的分子量，结果是Mn＝13000、Mw＝30000。
(实施例64)按如下调制作为化妆料的载有紫外线吸收剂一例的2，4-二羟基苯酮的微胶囊。
向70ml氯仿中，加入在5质量％的2，4-二羟基苯酮水溶液中添加由参考例7调制的来自H45株的PHA合成酶10U/mL、由参考例8调制的(R)-3-羟辛酰CoA形成终浓度1mM的10mL，用探针型超声波振荡机(ohtahe)进行乳化，制作成W/O型乳化液。超声波的照射，在50瓦的条件下，30秒，重复10次。将如此调制的乳化液在37℃下培养3小时，进行PHA合成反应。
将反应液用凝胶过滤法(Sephadex G-50柱)进行粒径尺寸划分，得到微胶囊。利用动态光散射法测定的微胶囊平均粒径为750nm的单分散状态。
将制作的微胶囊一部分，真空干燥后，混悬在20ml氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取成为外壳的PHA。将提取液用孔径为0.45μm的薄膜过滤器过滤，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS、岛津QP-5050，EI法)分析，同时确定PHA单体单元的甲基酯化物。结果可以确认该PHA是将3-羟辛烷酸作为单体单元的PHA。进而利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020，柱Polymer Labtorary PLgel MlXED-C(5μm)，溶剂氯仿、柱温度40℃、聚苯乙烯换算)评价该PHA的分子量，结果是Mn＝16000、Mw＝34000。
(实施例65)向70ml氯仿中，加入在水溶性荧光色素钙黄绿素水溶液中添加了参考例7调制的来自P91株的PHA合成酶10U/ml、和参考例8调制的(R)-3-羟辛酰CoA形成终浓度1mM的10mL，用探针型超声波振荡机(Ohtake)进行乳化，制作成W/O型乳化液。超声波的照射，在50瓦的条件下，30秒，重复10次。将如此调制的乳化液在37℃下培养3小时，进行PHA合成反应。
将反应液用凝胶过滤法(Sephadex G-50柱)进行粒径大小分划，得到微胶囊。利用动态光散射法测定的微胶囊平均粒径为770nm的单分散状态。
将制作的微胶囊一部分，真空干燥后，混悬在20ml氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取成外壳的PHA。将提取液用0.45μm薄膜过滤器过滤，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS，岛津QP-5050，EI法)分析，同时确定PHA单体单元的甲基酯化物。结果可以确认该PHA是将3-羟辛烷酸作为单体单元的PHA。进而利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020、柱Polymer Labtorary PLgel MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，柱温度40℃，聚苯乙烯换算)对该PHA的分子量进行评价，结果是Mn＝18000、Mw＝40000。
(实施例66)和实施例65完全一样，得到载有钙黄绿素的PHA包覆微胶囊。向上述微胶囊2质量份中，加入由参考例6调整的来自菊苣假单胞菌YN2的PHA合成酶YN2-C1 100U/mL、含有30mM的(R)-3-羟基庚二酰CoA(按J.Bacteriol.，1822753-2760(2000)记载的方法调制)、0.1％的牛血清白蛋白(Sigma社制)的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)100质量份。振荡3小时后，用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)清洗，除去未反应物等，风干，得到微胶囊。
将该微胶囊冷冻干燥后，用飞行时间型二次离子质量分析装置(TOF-SIMSIVCAMECA制)测定表面形成的聚合物质量。由得到的质谱可知微胶囊表面是由3-羟基庚二酸构成。利用离子喷溅，少量多次削去包覆聚羟基烷醇酸酯的核蛋白体表面，同样利用TOF-SIMS测定质谱，此时，构成PHA的单体单元变成了3-羟基辛烷酸，由此可知，本实施例的微胶囊是其表面由具有亲水性官能基的羟基庚二酸酯包覆，其下层由聚羟基辛烷酸包覆的2层结构。
利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020、柱Polymer Labtorary PLgelMlXED-C(5μm)，溶剂氯仿，柱温度40℃，聚苯乙烯换算)评价该PHA的平均分子量，结果是Mn＝19000、Mw＝42000。
(实施例67)和实施例65完全一样，得到载带钙黄绿素的PHA包覆微胶囊。向上述微胶囊1质量份中，加入由参考例6调整的来自Pseudomanas oichoii YN2的PHA合成酶YN2-C1、100U/Ml，和含有24mM的(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA(使由3-苯氧丙醛和溴醋酸乙酯的Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧戊酸酯水解得到3-羟基-5-苯氧戊酸后，用Eur J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)、6mM的(R、S)-3-羟基-7、8-环氧辛酰CoA(用Int.J.BiolMacromol.、12、85-91(1990)记载的方法合成的3-羟基-7-辛烯酸不饱和部分再用3-氯苯甲酸环氧化后，用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法制)、0.1％的牛血清白蛋白(Sigma社制)的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)49质量份。
振荡3小时后，用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)清洗、除去未反应物，风干，制得微胶囊51。
作为比较对照，除了将(R、S)-3-羟基-7、8-环氧辛酰基CoA变成3-羟辛酰基CoA外，其他以和上述相同的方法得到微胶囊52。
取上述试样10μl样品置于玻璃片上，添加1％尼罗兰A水溶液10μl，在玻璃片上混合后，放置盖玻片，进行荧光显微镜观察(330～380nm激发滤波器，420nm长通吸收滤波器，(株)ニコン制)。其结果可以确认任何一种试样，从微胶囊表面发出荧光。因此可知该微胶囊的表面是由PHA包覆的。
进而用离心分离(10000×g，4℃，10分钟)回收部分试样，真空干燥后，混悬于氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取形成外壳的PHA。对该提取液进行1H-NMR分析(使用设备FT-NMRBruker DPX400，测定核种类1H、使用溶剂氘代氯仿(加入TMS))。由此计算的各侧链单位的单位％示于表8。
表8胶囊结构体的外壳PHA的组成(1H-NMR、单位％)

将50质量份试样的微胶囊51进行离心分离(10000×g，4℃，10分钟)，回收微胶囊，混悬于精制水50质量份中，此操作重复3次后，向该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分(将其作为微胶囊53)。将微胶囊53在70℃下反应12小时(将其作为微胶囊54)。
将上述微胶囊53和微胶囊54混悬于氯仿中，在60℃下搅拌20小时，提取形成外壳的PHA，用真空干燥除去氯仿，用示差扫描热量计(DSCPerkin Elmer公司制，Pyris 1，升温10℃/分钟)装置进行测定。结果在微胶囊53中，在90℃附近看到明显的发热峰，聚合物中的环氧基和六亚甲基二胺发生反应，聚合物彼此进行交联。而在微胶囊54中，没有见到明显的热流，显示出交联反应基本结束。
对同样的样品进行红外吸收测定(FT-IRPerkin Elmer公司制，1720X)。其结果，在微胶囊53中见到的胺(3340cm-1附近)及环氧基(822cm-1附近)的峰，在微胶囊54中完全消失。从以上结果可以看出，通过侧链具有环氧单位的PHA和六亚甲基二胺进行反应，得到交联聚合物。
另一方面，作为比较对照，对胶囊52进行同样评价，如上述，没有获得明确显示聚合物彼此交联的评价结果。
(实施例68)将8-[1-氧代-3-[1-(苯甲基)哌啶-4-基]丙基]-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并二氮(以下称作药物1)200mg和2.0g示例化合物1溶解在二氯甲烷2ml中，将形成的溶液冷却到16-18℃后，注入到预先冷却到16～18℃的0.1％聚乙烯醇(EG-40、日本合成化学制)水溶液500ml中，用涡轮型混匀机(特殊机化制)，以7000rpm形成O/W型乳液。将得到的O/W型乳液在室温下搅拌3小时，使二氯甲烷挥发，油相固化后，以1500rpm进行离心分离。将得到的沉淀物再分散在蒸馏水中再分散后，将分散液进行离心分离，清洗除去游离药物。将得到的微胶囊再分散在少量蒸馏水中后，进行冷冻干燥、得到微胶囊粉末，将其作为胶囊55。微胶囊中的药物含量示于表9。药物含量的测定是将25mg的微胶囊溶解在含有60％乙腈的磷酸缓冲液(pH7)10ml中的样品以HPLC法进行定量测定。
(实施例69～79)除了使用示例化合物2～12外，其他和实施例68同样调制成微胶囊56～66。微胶囊中的药物含量示于表9。
(实施例80)将上述50质量份微胶囊66混悬在精制水50质量份中后，在该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到微胶囊67。对微胶囊67进行红外吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)时，在加热处理前观察的胺(3340cm-1附近)和环氧基(822cm-1附近)的峰在微胶囊67中消失。由此可知，在侧链具有环氧单位的PHA与六亚甲基二胺进行了反应，得到由交联聚合物包覆的微胶囊67。
(实施例81)向上述50质量份微胶囊66中，添加末端氨基改性聚硅氧烷(改性硅氧烷油TSF4700，GE东芝シリコ-ン(株)制)10质量份，在70℃下，反应2小时。将其混悬在甲醇中，反复进行离心分离(10000×g、4℃，20分钟)，清洗、干燥，得到具有聚硅氧烷接枝链的微胶囊68。
对微胶囊68进行红外吸收测定(FT-IR，Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察的胺(3340cm-1附近)和环氧基(822cm-1附近)的峰在微胶囊68中消失。由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷进行了反应，得到具有聚硅氧烷接枝链的微胶囊68。
(比较例3)除了使用乳酸-乙二醇酸共聚物(以下称作PLGA)(和光纯药制，Lot.No.K1030，乳酸/乙二醇酸组成比(摩尔％)75/25，GPC重均分子量13000)取代示例化合物外，其他和实施例68同样，调制微胶囊69。微胶囊中的药物含量示于表9。
表9

实施例82将1.5g药物1和4.5g示例化合物1溶解在二氯甲烷9ml中，将形成的溶液冷却到16～18℃后，注入到预先冷却到16～18℃的0.1％聚乙烯醇水溶液500ml中，用涡轮型混均机(特殊机化制)，以8000rpm形成O/W型乳液。将得到的O/W型乳液在室温下搅拌3小时，使二氯甲烷挥发掉，油相固化后，用离心分离机以1500rpm进行离心分离。将得到的沉淀物再分散在蒸馏水中后，将分散液离心分离，清洗除去游离药物。将得到的微胶囊再分散在少量蒸馏水中后，进行冷冻干燥、得到微胶囊粉末，将其作为胶囊70，微胶囊中的药物含量示于表10。
(实施例83～93)除了使用示例化合物2～12外，其他和实施例82同样，调制成微胶囊71～81，微胶囊中的药物含量示于表10。
(实施例94)
除了使用微胶囊81外，其他和实施例80一样，调制成微胶囊82，微胶囊中的药物含量示于表10。
(实施例95)除了使用微胶囊81外，其他和实施例81一样，调制成微胶囊83，微胶囊中的药物含量示于表10。
(比较例4)除了使用乳酸-乙二醇酸共聚物(以下称作PLGA)(和光纯药制，Lot.No.K1030，乳酸/乙二醇酸组成比(摩尔％)75/25，GPC重均分子量13000)取代示例化合物外，其他和实施例82同样，调制成微胶囊84。微胶囊中的药物含量示于表10。
表10

(实施例96)将200mg药物1溶解在二氯甲烷2ml中，将形成的溶液冷却到16～18℃，注入到预先冷却到16～18℃的溶解了0.1％聚乙烯醇(EG-40、日本合成化学制)的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)100ml中，用涡轮型混均器(特殊机化制)以7000rpm形成O/W型乳液，向得到的O/W型乳液中添加精制酶液(1)5ml、(R)-3-羟丁酰CoA(Sigma Aldrich Japan(株)社制)1g、牛血清白蛋白(Sigma社制)0.1g，溶解，室温下缓慢搅拌3小时，进行PHA合成和二氯甲烷的挥发，油相固化后，以1500rpm进行离心分离。将得到的沉淀物再分散在蒸馏水中后，将分散液进行离心分离，清洗除去游离药物。将得到的微胶囊再分散在少量蒸馏水中后，进行冷冻干燥、得到微胶囊粉末，将其作为胶囊85。微胶囊中的药物含量示于表11。药物含量的测定是将25mg微胶囊溶解在含有60％乙腈的磷酸缓冲液(pH7)10ml中的样品以HPLC法进行定量测定。
将胶囊85混悬在20ml氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取构成外壳的pHB。用0.45μm薄膜过滤器过滤提取液，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分析，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS，岛津QP-5050，El法)分析，同时确定pHB单体单元的甲酯化物，结果是由于所得色谱中主成分峰与标准品羟基丁酸的甲基化合物的保留时间相同，所以可确认所得胶囊85外壳的主成分是pHB。
进而利用凝胶渗透色谱法(GPC；东曹-HLC-8020，柱Polymer LabtoraryPLgel MlXED-C(5μm)，溶剂氯仿，柱温度40℃，聚苯乙烯换算)测定该pHB的分子量，结果Mn＝78000。
(实施例97)除了用粗酶液(1)取代实施例96中的精制酶液(1)外，其他和实施例96完全相同，得到胶囊86。微胶囊中的药物含量示于表11。和实施例96同样评价，结果可以确认所得胶囊86外壳的主成分是pHB。由凝胶渗透色谱法的分析结果，所得胶囊86中所含PHA的数均分子量为75000。
(实施例98)除了用粗酶液(2)代替实施例96中的精制酶液(1)外，其它和实施例96完全相同，得到胶囊87。微胶囊中的药物含量示于表11。和实施例96同样评价，结果可以确认所得胶囊87外壳的主成分是pHB。由凝胶渗透色谱法的分析结果，所得胶囊87中所含PHA的数均分子量为74000。
(实施例99)除了用精制酶液(2)代替实施例96中的精制酶液(1)和用(R)-3-羟辛酰CoA(按Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA外，其他和实施例96完全一样，得到胶囊88，微胶囊中的药物含量示于表11。
和实施例96同样评价，结果可以确认所得胶囊88外壳的主成分是由3-羟基辛酸单位组成的PHA。由凝胶渗透色谱法的分析结果，所得胶囊88中所含PHA的数均分子量为25000。
(实施例100)使用精制酶液(3)代替实施例96中的精制酶液(1)和用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA(利用Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯基戊酸酯水解得到3-羟基-5-苯基戊酸后，用Eur.J.Biochem.250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰基CoA，除此之外，其他和实施例96完全一样，得到胶囊89，微胶囊中的药物含量示于表11。
和实施例96一样评价，结果可以确认得到的胶囊89外壳的主成分是由3-羟基-5-苯基戊酸单位形成的PHA。由凝胶渗透色谱法分析的结果是所得胶囊89中含有的PHA数均分子量为22000。
(实施例101)使用粗酶液(3)取代实施例96中的精制醇素液(1)和使用(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA(将以J.Org.Chem.55，1490-1492(1990)记载的方法合成的3-苯氧丙醛和溴醋酸乙酯作为原料，用锌进行Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧戊酸酯水解得到3-羟基-5-苯氧戊酸后，再用Eur.J.Biochem.250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰基CoA，除此之外，和实施例96完全一样，得到胶囊90，微胶囊中的药物含量示于表11。
和实施例96一样评价，结果可以确认所得胶囊90外壳的主成分是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位形成的PHA。利用凝胶渗透色谱法分析的结果是所得胶囊90中含有PHA的数均分子量为24000。
(实施例102)使用粗酶液(4)取代实施例96中的精制酶液(1)和使用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA取代(R)-3-羟丁酰基CoA，除此之外，完全和实施例96一样，进行PHA合成。室温下反应1小时后，再添加(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA 1g、室温下反应2小时。以后的处理和实施例96完全一样，得到胶囊91。微胶囊中的药物含量示于表11。将在该胶囊结构体表面形成的聚合物质量，利用飞行时间型二次离子质量分析装置(TOF-SIMS IV CAMECA制)进行测定。由得到的质谱可以确认胶囊结构体表面的PHA主要是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位构成。利用离子喷溅少量多次地削去胶囊结构体的表面，同样利用TOF-SIMS测定质谱，可以确认此时构成胶囊结构体的PHA单体单元的主成分已置换成3-羟基-5-苯基戊酸单位。(由此可知本实施例的胶囊结构体是包覆药物1、在聚(3-羟基-5-苯基戊酸)上包覆了聚(3-羟基-5-苯氧戊酸)的所要求的胶囊结构体。利用凝胶渗透色谱法分析的结果是所得胶囊91中所含PHA的数均分子量为23000。
(实施例103)使用粗酶液(5)取代实施例96中的精制酶液(1)和使用0.8g的(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA、0.2g的(R、S)-3-羟基-7、8-环氧辛酰CoA(将以Int.J.Biol Macromol.，12，85-91(1990)记载的方法合成的3-羟基-7-辛烯酸的不饱和部分用3-氯苯甲酸环氧化后，再用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代1g的(R)-3-羟基丁酰基CoA，除此之外和实施例96完全一样，得到胶囊92，微胶囊中的药物含量示于表11。
根据1H-NMR(使用设备FT-NMRBruker DPX400，测定核种1H，使用溶剂氘代氯仿(加入TMS))的解析结果，确认得到的胶囊92外壳是由3-羟基-5-苯基戊酸单位75％、3-羟基-7、8-环氧辛酸单位25％形成的PHA。利用凝胶渗透色谱法解析的结果是所得胶囊92中含有的PHA数均分子量为20000。
(实施例104)将50质量份上述胶囊92混悬在精制水50质量份中后，向该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到胶囊93。微胶囊中的药物含量示于表11。
对胶囊93进行红外吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧基(822cm-1附近)的峰在胶囊93中消失。由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与六亚甲基二胺发生了反应，得到的是由交联聚合物包覆的胶囊93。
(实施例105)在50质量份上述胶囊92中添加末端氨基改性聚硅氧烷(改性硅酮油TSF4700，GE东芝Silicon(株)制)10质量份，70℃下反应2小时，将其混悬在甲醇中，反复进行离心分离(10000×g、4℃、20分钟)，清洗、干燥，得到具有聚硅氧烷接枝链的胶囊94。微胶囊中的药物含量示于表11。
对胶囊94进行红外吸收测定(FT-IRPerkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧基(822cm-1附近)的峰在胶囊94中消失。由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷发生了反应，得到的是具有聚硅氧烷接枝链的胶囊94。
表11

实验例10将实施例93中得到的62.8mg微胶囊81(作为药物，相当于30mg/kg体重)分散在0.5ml的分散剂(溶解了2.5mg羧甲基纤维素、1.0mg聚山梨醇酯80、25.0mg甘露糖醇的蒸馏水)中，用22G注射针，对10周龄雄性SD大鼠进行背部皮下注射。注射后，每隔一定时间处死大鼠，取出注射部位残存的微胶囊，定量测定取出微胶囊中的药物量，相对于注射量的残存率示于表12。
实验例11～15和比较实验例2除了使用微胶囊82、83、84、92、93、94作为药物，相当于30mg/kg体重之外，其它和实验例10完全一样，调制制剂，对药物进行经时定量，残存率示于表12。
表12

(实施例106)将2.0g示例化合物1溶解在二氯甲烷20ml中，注入精制水12ml，振荡、搅拌，调制成W/O型乳液。再照射超声波，以减小内水相的直径，接着用小型均浆器(キネマチカ社(瑞士)制的ポリトロン)边搅拌，边将上述W/O型乳液32ml注入到1w/v％聚乙烯醇水溶液200ml中，形成W/O/W型乳液，用搅拌机将W/O/W型乳液搅拌6小时，使油相中的有机溶剂二氯甲烷蒸发掉，使油相中的示例化合物1固化。利用离心分离收集微粒子，同时用冷却精制清水洗后，再分散在0.1％Tween 80水溶液，进行冷冻干燥，得到粉末状微粒子的中空微胶囊1。将使用中空微胶囊1的超声波显像剂作为超声波显像剂1。
用光学显微镜和电子显微镜观察得到的中空微胶囊微粒子，结果示于表13。
(实施例107～117)制作W/O型乳液时，作为溶解在该油相中的聚合物，除了使用示例化合物2～12外，其他和实施例106一样，得到粉末状微粒子的中空微胶囊2～12。将使用这些中空微胶囊的超声波显像剂分别作为超声波显像剂2-12。
将用光学显微镜和电子显微镜观察所得中空微胶囊微粒子的结果示于表13。
(实施例118)将上述50质量份中空微胶囊12混悬在精制水50质量份中后，向该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到中空微胶囊13。将使用进行交联化处理后的中空微胶囊13的超声波显像剂，作为超声波显像剂13，将用光学显微镜和电子显微镜观察所得中空微胶囊微粒子的结果示于表13。
对中空微胶囊13进行红外吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在微胶囊13中消失。由此可知，含有侧链具有环氧基单位的PHA与六亚甲基二胺发生了反应，得到由二胺和环氧基开环加成形成交联化的聚合物包覆表面的中空微胶囊13。
(实施例119)向50质量份的上述中空微胶囊12中，添加10质量份的末端氨基改性聚硅氧烷(变性硅酮油TSF 4700，GE东芝Silicon(株)制)，70℃下反应2小时，将其混悬在甲醇中，反复进行离心分离(10000×g，4℃，20分钟)，清洗后，干燥、得到具有聚硅氧烷接枝链的中空微胶囊14。将使用了其表面具有聚硅氧烷接枝链修饰的中空微胶囊14的超声波显像剂作为超声波显像剂14。将用光学显微镜和电子显微镜观察所得中空微胶囊微粒子的结果示于表13。
对中空微胶囊14进行红外吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在微胶囊14中消失。由此可知，通过含有侧链上具有环氧基单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷反应，环氧基和末端氨基的开环加成，得到由聚硅氧烷接枝链修饰的中空微胶囊14。
(比较例5)制作W/O型乳液时，作为溶解在油相中的聚合物，除使用聚DL乳酸(平均分子量7000)外，其他和实施例106一样，得到粉末状微粒子的中空微胶囊15，将使用了由该聚DL乳酸形成的中空微胶囊15的超声波显像剂作为超声波显像剂15。
将用光学显微镜和电子显微镜观察所得中空微胶囊微粒子的结果示于表13。
表13

有无孔表示在干燥时，是否因内相的水和有机溶剂的蒸发，而在外壳上生成孔。
(实施例120)在12ml的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中加入溶解精制酶液(1)0.6ml、(R)-3-羟丁酰基CoA(Sigma Aldrich Japan(株)社制)300mg、牛血清蛋白(Sigma社制)12mg，将此水溶液加入到20ml二氯甲烷溶液中，振荡、搅拌，调制成W/O型乳液，用超声波照射，减小内水相直径。接着，用小型均浆器(キネマチカ社(瑞士)制的ポリトロン)边搅拌，边将上述W/O型乳液32ml加入到1w/v％聚乙烯醇水溶液200l中，形成W/O/W型乳液。用搅拌机将该W/O/W型乳液搅拌6小时，合成PHA，同时使油相中的二氯甲烷蒸发掉，使PHA固化，调制成微胶囊状微粒子。通过离心分离收集得到的微粒子，同时用冷却的精制水清洗后，在0.1％Tween 80水溶液中再分散，进行冷冻干燥，得到粉末状微胶囊状微粒子的中空微胶囊16。将使用了这种中空微胶囊16的超声波显像剂称为超声波显像剂16。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
将中空微胶囊16混悬在20ml的氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取构成微胶囊外壳的pHB，将提取液用0.45μm薄膜过滤器过滤，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS，岛津QP-5050，EI法)分析，同时确定pHB单体单元的甲基酯化物。其结果，由于所得色谱中主成分的峰和标准品3-羟基丁酸甲基酯化化合物的保持时间相同，所以可确认所得中空微胶囊16外壳的主成分是pHB。
进而利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020，柱Polymer LabtoraryPLgel MIxED-C(5μm)，溶剂氯仿，柱温度40℃，聚苯乙烯换算)评价该pHB的分子量，结果是数均分子量Mn＝72000。
(实施例121)除了用来自KKO1株的粗酶液(1)取代实施例120中用的精制酶液(1)外，其他和实施例120的条件相同，得到中空微胶囊17。将使用了该中空微胶囊17的超声波显像剂称为超声波显像剂17。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
和实施例120一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊17外壳的主成分是pHB。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊17外壳的PHA数均分子量为73000。
(实施例122)除了用来自TL2株的粗酶液(2)取代实施例120中用的精制酶液(1)外，其它采用和实施例120相同的条件，得到中空微胶囊18。将使用了该中空微胶囊18的超声波显像剂称为超声波显像剂18。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
和实施例120一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊18外壳的主成分是pHB。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊18外壳的PHA数均分子量为72000。
(实施例123)用重组PHA合成酶的精制酶液(2)取代实施例120中用的精制酶液(1)和用(R)-3-羟辛酰CoA(Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他条件和实施例120一样，得到中空微胶囊19。将使用了该中空微胶囊19的超声波显像剂作为超声波显像剂19。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
和实施例120一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊19外壳的主成分是由3-羟辛酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊19外壳的PHA数均分子量为25000。
(实施例124)用重组PHA合成酶的精制酶液(3)取代实施例120中用的精制酶液(1)和用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA(利用Reformatsky反应获得的3-羟基-5-苯基戊酸酯水解，制作成3-羟基-5-苯基戊酸，接着，用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，其他条件和实施例27一样，得到中空微胶囊20，将使用了该中空微胶囊20的超声波显像剂作为超声波显像剂20。利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
和实施例120一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊20外壳的主成分是由3-羟基-5-苯基戊酸单位构成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊20外壳的PHA数均分子量为21000。
(实施例125)用重组PHA合成酶的精制酶液(3)取代实施例120中用的精制酶液(1)，和用(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA(用J.Org.chem.，55，1490-1492(1990)记载的方法合成的3-苯氧丙醛和溴醋酸乙酯作原料，用锌进行Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧戊酸酯，水解得到3-羟基-5-苯氧戊酸后，再用Eur.J.Biochem.，250 432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟基丁酰CoA，除此之外，其他条件和实施例120一样，得到中空微胶囊21，将使用了该中空微胶囊21的超声波显像剂作为超声波显像剂21。
用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
和实施例120一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊21外壳的主成分是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊21外壳的PHA数均分子量为22000。
(实施例126)使用来自P91株的粗酶液(4)取代实施例120中用的精制酶液(1)和用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他条件和实施例120一样，进行PHA合成反应。本例中，室温下反应3小时后，向水相中添加(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA 300mg，室温下再反应2小时，之后，蒸发掉油相中的二氯甲烷等，和实施例120一样，得到中空微胶囊22，将使用了该中空微胶囊22的超声波显像剂作为超声波显像剂22。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
利用飞行时间型二次离子质量分析装置(TOF-SIMS IV，CAMECA制)，测定该胶囊结构体表面形成的PHA聚合物中所含单体单元、碎片的质量。由所得质谱，可以确认胶囊结构体表面的PHA主要是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位构成的。利用离子喷溅少量多次地削去胶囊结构体表面，利用TOF-SIMS测定该部分PHA聚合物中含有单体单元、碎片的质量，由测定质谱可以确认，由外壳表面，喷溅进入到一定深度时，构成胶囊结构体的PHA单体单元主成分已变换成3-羟基-5-苯基戊酸单位。由此可知，本实施例的胶囊结构体是在当初酶反应生成的聚(3-羟基-5-苯基戊酸)的外壳层上，包覆了后来酶反应生成的聚(3-羟基-5-苯氧戊酸)、具有二层结构外壳的所需胶囊结构体。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊22外壳表面的PHA数均分子量为23000。
(实施例127)用来自YN2株的粗酶液(5)取代实施例120用的精制酶液(1)和用240mg的(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA、60mg的(R、S)-3-羟基-7、8-环氧辛酰CoA(将以Int.J.Biol Macromol 12.85-91(1990)记载的方法合成的3-羟基-7-辛烯酸的不饱和部分用3-氯苯甲酸进行环氧化后，再用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代60mg的(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他条件和实施例120一样，得到中空微胶囊23。将使用了该中空微胶囊23的超声波显像剂作为超声波显像剂23。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
利用1H-NMR(使用设备FT-NMRBruker DPX400，测定核种1H，使用溶剂氘代氯仿(加入TMS))评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊23的外壳是由3-羟基-5-苯基戊酸单位77％、3-羟基-7、8-环氧辛酸单位23％形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊23外壳PHA的数均分子量为25000。
(实施例128)将50质量份上述中空微胶囊23混悬在精制水50质量份中后，向该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份，确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到表面交联化处理的中空微胶囊24。将使用了实施交联化处理的中空微胶囊24的超声波显像剂作为超声波显像剂24。
利用光学显影镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
对中空微胶囊24进行红外吸收测定(FT-IRPerkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在中空微胶囊24中消失。由此可知，侧链具有环氧基单位的PHA与六亚甲基二胺发生反应，得到其表面由二胺和环氧基开环加成，形成交联的聚合物包覆的中空胶囊24。
(实施例129)向50质量份上述中空微胶囊23中，添加末端氨基改性聚硅氧烷(变性硅酮油TSF4700，GE东芝Silicon(株)制)10质量份，70℃下反应2小时，将其混悬在甲醇中，反复进行离心分离(10000×g，4℃，2分钟)，清洗、干燥、得到由聚硅氧烷接枝链加成修饰的中空微胶囊25。将使用了其表面由聚硅氧烷接枝链加成修饰的中空微胶囊25的超声波显像剂作为超声波显像剂25。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
对于中空微胶囊25进行红外吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在中空微胶囊25中消失，由此可知，含有侧链具有环氧基单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷发生了反应，由于环氧基和末端氨基的开环加成，得到其表面PHA由聚硅氧烷接枝链进行化学修饰的中空微胶囊25。
表14

(实施例130)向20ml二氯甲烷溶液中加入12ml精制水，振荡搅拌，调制成W/O型乳液。再照射超声波减小内水相直径。接着，在0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中加入溶解1w/v％的聚乙烯醇、精制酶液(1)5ml、(R)-3-羟丁酰CoA(Sigm AldrichJapan(株)社制)1g、牛血清白蛋白(Sigma社制)100mg，向该水溶液100ml中，边用小型匀浆器(キネマチカ社(瑞士)制的ポリトロン)搅拌，边加入上述W/O型乳液32ml，形成W/O/W型乳液。用搅拌机将该W/O/W型乳液搅拌6小时，合成PHA，同时蒸发掉二氯甲烷，使生成的PHA固化，调制成微胶囊微粒子。利用离心分离收集该微粒子，同时用冷却的精制水清洗后，再分散在0.1％Tween 80水溶液中，冷冻干燥，得到粉末状微胶囊微粒子的中空微胶囊26。将使用了该中空微胶囊26的超声波显像剂作为超声波显像剂26。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表14。
将中空微胶囊26在20ml氯仿中混悬，60℃下搅拌20小时，提取构成外壳的pHB。将提取液用孔径0.45μm的薄膜过滤器过滤，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS，岛津QP-5050，El法)分析，同时确定pHB单体单元的甲基酯化物。其结果，由于所得色谱中主成分的峰与标准品羟基丁酸的甲基酯化化合物的保留时间相同，所以可以确认所得中空微胶囊26外壳的主成分是pHB。
进而利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020，柱Polymer LabtoraryPLgel MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，柱温度40℃，聚苯乙烯换算)评价该pHB的分子量，结果是数均分子量Mn＝71000。
(实施例131)使用来自KKO1株的粗酶液(1)取代实施例130中用的精制酶液(1)，除此之外其他条件和实施例130相同，得到中空微胶囊27。将使用了该中空微胶囊27的超声波显像剂作为超声波显像剂27。
用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
和实施例130一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊27外壳的主成分是pHB。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊27外壳的PHA数均分子量为76000。
(实施例132)用来自TL2株的粗酶液(2)取代实施例130中用的精制酶液(1)，其他条件和实施例130相同，得到中空微胶囊28，将使用了该中空微胶囊28的超声波显像剂作为超声波显像剂28。
用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
和实施例130一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊28外壳的主成分是pHB。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊28外壳的PHA数均分子量为75000。
(实施例133)使用来自TL2株的粗酶液(2)取代实施例130中用的精制酶(1)，用(R)-3-羟辛酰CoA(按Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他和实施例130一样，得到中空微胶囊29。将使用了该中空微胶囊29的超声波显像剂作为超声波显像剂29。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
和实施例130一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊29外壳的主成分是由3-羟辛酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊29外壳的PHA数均分子量为25000。
(实施例134)使用来自P91株的粗酶液(3)取代实施例130中用的精制酶液(1)，和用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA(利用Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯基戊酸酯水解得到3-羟基-5-苯基戊酸后，再用Eur.J.Biochem.，250432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他和实施例130，得到中空微胶囊30，将使用了该中空微胶囊30的超声波显像剂作为超声波显像剂30。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
和实施例130一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊30外壳的主成分是由3-羟基-5-苯基戊酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊30外壳的PHA数均分子量为21000。
(实施例135)使用来自P91株的粗酶液(3)取代实施例130中用的精制酶液(1)，和用(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA(将用J.Org.Chem.，55，1490-1492(1990)记载的方法合成的3-苯氧丙醛和溴醋乙酸酯作原料，将利用锌进行Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧戊酸酯水解，得到3-羟基-5-苯氧戊酸，随后，用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，其他条件和实施例130一样，得到中空微胶囊31，将使用了该中空微胶囊31的超声波显像剂作为超声波显像剂31。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
和实施例130一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊31外壳的主成分是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊31外壳的PHA数均分子量为23000。
(实施例136)使用粗酶液(4)取代实施例130中用的精制酶液(1)和使用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA取代(R)-3-羟丁酰CoA，其他条件和实施例130一样，进行PHA合成反应。在本实施例中，室温下反应3小时后，再向水相中添加(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA 1g，室温下再反应2小时。以后的处理和实施例130一样，得到中空微胶囊32，将使用了该中空微胶囊32的超声波显像剂作为超声波显像剂32。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
利用飞行时间二次离子质量分析装置(TOF-SIMS IV，CAMECA制)测定该胶囊结构体表面形成的聚合物的质量。由所得质谱，可以确认胶囊结构体表面的PHA主要是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位构成的。利用离子喷溅少量多吹地削去胶囊结构体表面，同样利用TOF-SIMS测定质谱时，可以确认在某时间点构成胶囊结构体的PHA单体单元主成分已置换成3-羟基-5-苯基戊酸单位。由此可知，本实施例的胶囊结构体，是在初期生成的聚(3-羟基-5-苯基戊酸)的外壳层上，包覆了后来生成的聚(3-羟基-5-苯氧戊酸)的具有二层结构的所需的胶囊结构体。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊32外壳的PHA数均分子量为22000。
(实施例137)使用粗酶液(5)取代实施例130中用的精制酶液(1)和使用800mg的(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA、200mg的(R、S)-3-羟基-7、8-环氧辛酰CoA(将用lnt.J.Biol Macromol.，12，85-91(1990)记载的方法合成的3-羟基-7-辛烯酸的不饱和部分用3-氯安息得酸环氧化后，再用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代1g的(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外其他条件和实施例130一样，得到中空微胶囊33。将使用了该中空微胶囊33的超声波显像剂作为超声波显像剂33。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
根据1H-NMR(使用设备FT-NMRBruker DPX400，测定核种1H，使用溶剂氘代氯仿(加入TMS))的解析结果，可以确认所得中空微胶囊33的外壳是由3-羟基-5-苯基戊酸单位76％、3-羟基-7、8-环氧辛酸单位24％形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊33外壳的PHA数均分子量为23000。
(实施例138)将50质量份上述中空微胶囊33混悬在精制水50质量份中后，向该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份。确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到中空微胶囊34。将使用了该中空微胶囊34的超声波显像剂作为超声波显像剂34。利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
对中空微胶囊34进行红外吸收测定(FT-IRPerkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在中空微胶囊34中消失，由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与六亚甲基二胺发生反应，得到由交联聚合物包覆的中空微胶囊34。
(实施例139)50质量份上述中空微胶囊33中添加末端氨基改性聚硅氧烷(变性硅酮油TST-4700，GE东芝シリコ-ン(株)制)10质量份，70℃下反应2小时，将其混悬在甲醇中，反复进行离心分离(10000×g，4℃，20分钟)，清洗、干燥，得到具有聚硅氧烷接枝链的中空微胶囊35。将使用了该中空微胶囊35的超声波显像剂作为超声波显像剂35。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表15。
对中空微胶囊35进行红外吸收测定(FT-1R；Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在中空微胶囊35中消失，由此可知，侧链具有环氧单位的PHA与末端氨基变性聚硅氧烷进行了反应，得到具有聚硅氧烷接枝链的中空微胶囊35。
表15

(实施例140)将二氯甲烷2ml冷却到16～18℃后，注入到预先冷却到16～18℃的溶解了0.1％聚乙烯醇(EG-40、日本合成化学制)的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)100ml中，用涡轮型混均器(特殊机化制)以7000rpm搅拌，形成O/W型乳液。向得到的O/W型乳液中添加精制酶液(1)5ml、(R)-3-羟丁酰CoA(Sigma AldrichJapan(株)社制)1g、牛血清白蛋白(Sigma社制)0.1g，溶解、室温下缓慢搅拌3小时，合成PHA，挥发掉二氯甲烷，使溶解在油相中的PHA固化后，以1500rpm进行离分离。将得到的沉淀物再分散在蒸馏水中后，将分散液离心分离，清洗除去游离药物。将得到的微胶囊再分散在少量蒸馏水中后，进行冷冻干燥，得到中空微胶囊36粉末。将使用了该中空微胶囊36的超声波显像剂作为超声波显像剂36。
利用光学显微镜和电子显微镜观察得到的微胶囊微粒子的结果示于表16。
将中空微胶囊36混悬在20ml氯仿中，60℃下搅拌20小时，提取构成外壳的pHB，用孔径0.45μm的薄膜过滤器过滤提取液，用旋转蒸发器减压浓缩后，按常规方法进行甲醇分解，用气相色谱仪-质量分析装置(GC-MS、岛津QP-5050、EI法)进行分析，同时确定pHB中所含单体单元的甲基酯化物。其结果是得到的色谱中主成分的峰与标准品羟基丁酸的甲基酯化化合物的保留时间相同，可以确认得到的中空微胶囊36外壳的主成分是pHB。
进而利用凝胶渗透色谱法(GPC东曹-HLC-8020，柱Polymer LabtoraryPLgel MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，柱温度40℃，聚苯乙烯换算)评价该pHB的分子量，结果是数均分子量Mn＝75000。
(实施例141)除了用粗酶液(1)取代实施例140中用的精制酶液(1)外，其他和实施例140一样，得到中空微胶囊37。将使用了该中空微胶囊37的超声波显像剂作为超声波显像剂37。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表16。
和实施例140一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊37的外壳主成分是pHB。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊37外壳的pHB数均分子量为73000。
(实施例142)除了用粗酶液(2)取代实施例140中用的精制酶液(1)外，其他和实施例140一样，得到中空微胶囊38。将使用了该中空微胶囊38的超声波显像剂作为超声波显像剂38。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表16。
和实施例140一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊38外壳的主成分是pHB。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊38外壳的pHB数均分子量为71000。
(实施例143)使用精制酶液(2)取代实施例140中用的精制酶液(1)、用(R)-3-羟辛酰CoA(Eur.J.Bio Chem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)代替(R)-3-羟丁硫CoA，除此之外其他条件和实施例140一样，得到中空微胶囊39。将使用了该中空微胶囊39的超声波显像剂作为超声波显像剂39。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表16。
和实施例140一样，评价构成微胶囊外壳PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊39外壳的主成分是由3-羟辛酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊39外壳的PHA数均分子量为23000。
(实施例144)使用精制酶液(3)取代实施例140中用的精制酶液(1)，和使用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA(将利用Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯基戊酸酯水解得到3-羟基-5-苯基戊酸后，再用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外其他条件和实施例140一样，得到中空微胶囊40，将使用了该中空微胶囊40的超声波显像剂作为超声波显像剂40。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表16。
和实施例140一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊40外壳的主成分是由3-羟基-5-苯基戊酸单位形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊40外壳的PHA数均分子量为20000。
(实施例145)使用粗酶液(3)取代实施例140中用的精制酶液(1)，用(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA(将以J.Org.Chem.，55.1490-1492(1990)记载的方法合成的3-苯氧丙醛和溴醋酸乙酯作原料，利用锌进行Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧戊酸酯水解，得到3-羟基-5-苯氧戊酸后，再用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他条件和实施例140一样，得到中空微胶囊41，将使用了该中空微胶囊41的超声波显像剂作为超声波显像剂41。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表16。
和实施140一样，评价构成微胶囊外壳的PHA组成，结果可以确认所得中空微胶囊41外壳的主成分是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位形成的PA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊41外壳的PHA数均分子量为24000。
(实施例146)使用粗酶液(4)取代实施例140中用的精制酶液(1)，用(R、S)-3-羟基-5-苯戊酰CoA取代(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外，其他和实施例140一样进行PHA合成反应。本实施例中，室温下反应1小时后，再向水相中添加(R、S)-3-羟基-5-苯氧戊酰CoA 1g，室温下反应2小时。以后的处理和实施例140一样，得到中空微胶囊42，将使用了该中空微胶囊42的超声波显像剂作为超声波显像剂42。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微料子的结果示于表16。
利用飞行时间二次离子质量分析装置(TOF-SIMS IV、CAMECA制)测定该胶囊结构体表面形成的聚合物质量。从得到的质谱，可以确认胶囊结构体表面的PHA主要是由3-羟基-5-苯氧戊酸单位构成。利用离子喷溅少量多次地削去胶囊结构体的表面，利用TOF-SIMS测定质谱时，可以确认，从外表面达到一定深度时间时，构成胶囊结构体的PHA单体单元主成分已置换成3-羟基-5-苯基戊酸单位。由此可知本实施例的胶囊结构体，是在初始生成的聚(3-羟基-5-苯基戊酸)的外壳层上，包覆了后来生成的聚(3-羟基-5-苯氧戊酸)、具有二层结构外壳的所需的胶囊结构体。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊42外壳的PHA数均分子量为21000。
(实施例147)使用粗酶液(5)取代实施例140中用的精制酶液(1)，用0.8g的(R、S)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA、0.2g的(R、S)-3-羟基-7、8-环氧辛酰CoA(将以Int.J.Biol Macromol.，12，85-91(1990)中记载的方法合成的3-羟基-7-辛烯酸的不饱和部分用3-氯苯甲酸环氧化后，再用Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)记载的方法调制)取代1g的(R)-3-羟丁酰CoA，除此之外其他条件和实施例140一样，得到中空微胶囊43。将使用了该中空微胶囊43的超声波显像剂作为超声波显像剂43。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表16中。
根据1H-NMR(使用设备FT-NMRBruker DPX400，测定核种1H，使用溶剂氘代氯仿(加入TMS))的解析结果，可以确认所得中空微胶囊43的外壳是由3-羟基-5-苯基戊酸单位75％、3-羟基-7、8-环氧辛酸单位25％形成的PHA。根据凝胶渗透色谱法的解析结果，构成所得中空微胶囊43外壳的PHA数均分子量为21000。
(实施例148)将50质量份的上述中空微胶囊43混悬在精制水50质量份中后，向该混悬液中溶解作为交联剂的六亚甲基二胺0.5质量份，确认溶解后，利用冷冻干燥除去水分后，70℃下反应12小时，得到表面交联化处理的中空微胶囊44。将使用了该中空微胶囊44的超声波显像剂作为超声波显像剂44。
利用光学显微镜和电子显微镜观察所得微胶囊微粒子的结果示于表16。
对中空微胶囊44进行红外吸收测定(FT-IRPerkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在微胶囊44中消失，由此可知，含有侧链上具有环氧基单位的PHA与六亚甲基二胺发生了反应，得到表面由交联化聚合物包覆的中空微胶囊44。
(实施例149)向50质量份的上述中空微胶囊43中，添加末端氨基改性聚硅氧烷(变性硅酮油TSF4700GE东芝Silicone(株)制)10质量份，70℃下反应2小时，将其混悬在甲醇中，反复进行离心分离(10000×g、4℃、20分钟)，清洗后干燥，得到具有聚硅氧烷接枝链的中空微胶囊45。将使用了该中空微胶囊45的超声波显像剂作为超声波显像剂45。
利用光学显微镜和电子显微镜观察得到的微胶囊微粒子的结果示于表16。
对中空微胶囊45进行红外吸收测定(FT-IR；Perkin Elmer公司制，1720X)时，加热处理前观察到的胺(3340cm-1附近)和环氧(822cm-1附近)的峰在中空微胶囊45中消失。由此可知侧链具有环氧单位的PHA与末端氨基改性聚硅氧烷发生了反应，得到具有聚硅氧烷接枝链的中空微胶囊45。
表16

实验例16(体外超声波显像效果的试验)使用图1所示试验装置，对使用了中空微胶囊的超声波显像剂研究超声波显像效果。即将装入100ml生理食盐水的聚丙烯制容器1固定在水槽2中，容器1内放入搅拌子3，利用磁力搅拌器搅拌。将规定量的上述实施例和比较例中得到的各中空微胶囊微粒子混悬在1w/v％的Tween 80水溶液1ml中，注入到容器1的生理食盐水中，利用安装了具有5MHz中心频率的扇形式探针的超声波图像诊断装置(东芝社制的SONOLAYER αSSH-140)，将容器1向图面上的中心位置进行扫描，在显像图面的静止图像中，求出容器1前方部分或容器1内整体光点的明亮度，作为超声波显像效果的指针。
使用实施例117～119、127～129、137～139、147～149和比较例5中得到的各微粒子状微胶囊，对于超声波显像剂12～14、23～25、33～35、43～45和15，每1ml 1w/v％的Tween 80水溶液，选择几种添加量，装入到100ml上述生理食盐水中，研究容器1前方部分光点明亮度随时间的变化。
结果是，超声波显像剂12～14、23～25、33～35、43～45任何一种，添加量在20mg以下时，初期光点的明亮度平均值恒定在25～30。另一方面，随时间的衰减速度取决于添加量(混悬浓度)而不同，中空微胶囊微粒子的混悬浓度越稀，衰减速度越大，例如，添加量为5mg或2.5mg时，投放后约5分钟，光点的明亮度平均值达到20以下。另一方面，添加量为10mg或20mg时，投放后经过30分钟时，光点的明亮度平均值也在20以上。
另一方面，中空微胶囊微粒子的添加量在40mg以上时，初期见到声影，光点明亮度的初期值比添加量为10mg或20mg时低，约为23，但投放后，伴随着分散的进行，该光点明亮度随时间变化而增大。在约10分钟时，上升到28。随后，微粒子的混悬浓度高时(添加量80mg)，高光点明亮度持续暂短时间，混悬浓度降低时(添加量40mg)，慢慢衰减，但任何浓度下，光点的明亮度达到峰值后，经过30分钟时，其光点明亮度的平均值还在25以上。因此可知，使用本发明PHA制的中空微胶囊时，每1ml水，添加量为10mg这种混悬浓度用来调制超声波显像剂，可在很长时间内发挥很高的显像效果。
另一方面，用聚DL乳酸(平均分子量为7000)制作的中空微胶囊15，在使用该微胶囊15的超声波显像剂15中，在任何混悬浓度，初期的光点明亮度平均值在20以上，随后，光点的明亮度急速衰减，约5分钟后达到10以下，约10分钟后只达到5，投放后显像效果的持续性，与本发明的超声波显像剂相比，相当低劣。
序列表<110>佳能株式会社<120>含聚羟基烷醇酸酯的粒状体及其制备方法it<130>CFO16533<160>15<170>Microsoft Word<210>1<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>1cgggatccag taacaagagt aacgatgagt 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>2cgatctcgag ttaccgttcg tgcacgtacg 30<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<400>3tgctggaact gatccagtac 20<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<400>4gggttgagga tgctctggat gtg 23<210>5<211>1680<212>DNA<213>Pseudomonas cichorii YN2；FERM BP-7375<400>5atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac 50cttggggctt aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt 100ctgctcgaat ggtgcttagg caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc 150aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc aagaacgtac tgctgggtaa 200atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc gatccggcct 250ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga 350tgtggcgcgt gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gccatggcgc 400cgaccaacac cgcggccaac ccggcggcag tcaaacgctt tttcgaaacc 450ggtggcaaaa 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atccgggtgg cctggaagtg tgcggcaccc 1300cgatcgactt gcaaaaggtc accgtcgaca gtttcagcgt ggccggcatc 1350aacgatcaca tcacgccgtg ggacgcggtg tatcgctcaa ccctgttgct 1400cggtggcgag cgtcgctttg tcctggccaa cagcggtcat gtgcagagca 1450ttctcaaccc gccgaacaat ccgaaagcca actacctcga aggtgcaaaa 1500ctaagcagcg accccagggc ctggtactac gacgccaagc ccgtcgacgg 1550tagctggtgg acgcaatggc tgggctggat tcaggagcgc tcgggcgcgc 1600aaaaagaaac ccacatggcc ctcggcaatc agaattatcc accgatggag 1650gcggcgcccg ggacttacgt gcgcgtgcgc tga 1683<210>7<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>7ggaccaagct tctcgtctca gggcaatgg 29<210>8<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>8cgagcaagct tgctcctaca ggtgaaggc 29<210>9<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>9gtattaagct tgaagacgaa ggagtgttg 29<210>10<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>10catccaagct tcttatgatc gggtcatgcc 30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>11cgggatccag taacaagagt aacgatgagt 30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>12cgatctcgag ttaccgttcg tgcacgtacg 30<210>13<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>13cgggatcccg cgataaacct gcgagggagt 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>14cgatctcgag gcgcacgcgc acgtaagtcc 30
权利要求
1.一种粒状体，由含有聚羟基烷酸酯的第一固相的外相，和包在上述外相内的内相所构成，其中上述内相是第二种固相、液相、气相中的至少一个相。
2.根据权利要求1记载的粒状体，具有在壳内包有芯部结构的微胶囊的形态，上述聚羟基烷酸酯含在该壳内，上述内相中至少1种的相含在芯部。
3.根据权利要求1记载的粒状体，其特征是上述聚羟基烷酸酯是含有从化学式(1)～化学式(10)所示单体单元中选出至少一种的聚羟基烷酸酯， 该单体单元是式中R1和a的组合为以下中任何一种单体单元组成的组中选出的至少一种，R1为氢原子(H)、a为0～10中任一整数的单体单元、R1为卤原子、a为1～10中任一整数的单体单元、R1为发色团、a为1～10中任一整数的单体单元、R1为羧基或其盐、a为1～10中任一整数的单体单元、R1是 ，a为1～7中任一整数的单体单元； 式中，b表示0-7中的任一整数，R2表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5及-C3F7中的任何一种； 式中C表示1-8中的任一整数，R3表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中的任何一种； 式中d表示0-7中的任一整数，R4表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中的任何一种； 式中e表示1-8中的任一整数，R5表示氢原子、卤原子、-CN、-CO2、-CF3、-C2F5、-C3F7、-CH3、-C2H5和-C3H7中的任何一个； 式中f表示0-7中的任一整数； 式中g表示1-8中的任一整数； 式中h表示1-7中的任一整数，R6表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-COOR’、-SO2R”、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、和-C(CH3)3中的任何一个，其中R’是氢原子、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个、R”是-OH、-ONa、-OK、卤原子、-OCH3和一OC2H5中的任何一个； 式中i表示1-7中的任一整数，R7表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-COOR’和-SO2R”中的任何1个，其中R’是氢原子、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个，R”是-OH、-ONa、OK、卤原子、-OCH3和-OC2H5中的任何一个； 式中j表示1-9中的任一整数。
4.根据权利要求1记载的粒状体，其特征是上述聚羟基烷酸酯的数均分子量为5000～1000000。
5.根据权利要求1记载的粒状体，其特征是上述聚羟基烷酸酯的单体单元组成，从上述粒状体的内侧向外侧方向上发成变化。
6.根据权利要求1记载的粒状体，其特征是上述聚羟基烷酸酯的至少一部分是化学修饰的聚羟基烷酸酯。
7.根据权利要求6记载的粒状体，其特征是上述化学修饰的聚羟基烷酸酯是至少具有接枝链的聚羟基烷酸酯。
8.根据权利要求7记载的粒状体，其特征是上述接枝链是对至少含有带环氧基的单体单元的聚羟基烷酸酯进行化学修饰的接枝链。
9.根据权利要求7记载的粒状体，其特征是上述接枝链是具有氨基的化合物接枝链。
10.根据权利要求9记载的料状体，其特征是上述具有氨基的化合物是末端氨基改性化合物。
11.根据权利要求10记载的粒状体，其特征是上述末端氨基改性化合物是选自聚乙烯胺、聚乙烯亚胺、末端氨基改性聚硅氧烷中的至少一种。
12.根据权利要求6记载的粒状体，其特征是上述聚羟基烷酸酯的至少一部分是交联化的聚羟基烷酸酯。
13.根据权利要求12记载的粒状体，其特征是上述交联化的聚羟基烷酸酯是对至少含有带环氧基单体单元的聚羟基烷酸酯进行交联化的聚羟基烷酸酯。
14.根据权利要求12记载的粒状体，其特征是上述交联化的聚羟基烷酸酯是通过从二胺化合物、琥珀酸酐、2-乙基-4-甲基咪唑、电子射线照射中选出的至少一种进行交联化的聚羟基烷酸酯。
15.根据权利要求14记载的粒状体，其特征是上述二胺化合物是六亚甲基二胺。
16.一种粒状体的制备方法，其特征是包括准备含有聚羟基烷酸酯和有机溶剂的油相的工序，从上述油相中除去上述有机溶剂和/或水的工序，调制含有来自上述油相的固相、液相、气相中至少1种相的粒状体。
17.根据权利要求16记载的粒状体制备方法，其特征是还包括用上述油相和水相调整乳液的工序。
18.根据权利要求17记载的粒状体制备方法，其特征是还包括将上述水相分散在上述油相中调制W/O型乳液的工序，和从上述W/O型乳液中除去有机溶剂和/或水的工序。
19.根据权利要求17记载的粒状体制备方法，其特征是包括如下工序，即，将上述水相分散在上述油相中调制W/O型乳液的工序，将上述W/O型乳液分散在第二水相中调制成W/O/W型乳液的工序，和从W/O/W型乳液中除去有机溶剂和/或水的工序。
20.根据权利要求17记载的粒状体制备方法，其特征是还包括将上述油相分散在上述水相中调制成O/W型乳液的工序、和从上述O/W型乳液中除去有机溶剂和/或水的工序。
21.根据权利要求16记载的制备方法，其特征是除去上述有机溶剂和/或水，至少利用液中干燥法、相分离法、喷雾干燥法中的一种方法进行。
22.根据权利要求16记载的制备方法，其特征是上述聚羟基烷酸酯是含有从化学式[1]～[10]所示单体单元中选出至少一种的聚羟基烷酸酯， 该单体单元是式中R1和a的组合为以下中任何一种单体单元组成的组中选出的至少一种，R1为氢原子(H)、a为0～10中任一整数的单体单元、R1为卤原子、a为1～10中任一整数的单体单元、R1为发色团、a为1～10中任一整数的单体单元、R1为羧基或其盐、a为1～10中任一整数的单体单元、R1是 ，a为1～7中任一整数的单体单元； 式中，b表示0-7中的任一整数，R2表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5及-C3F7中的任何一种； 式中C表示1-8中的任一整数，R3表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中的任何一种； 式中d表示0-7中的任一整数，R4表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中的任何一种； 式中e表示1-8中的任一整数，R5表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5、-C3F7、-CH3、-C2H5和-C3H7中的任何一个； 式中f表示0-7中的任一整数； 式中g表示1-8中的任一整数； 式中h表示1-7中的任一整数，R6表示氢原子、卤原子、-CN、-CO2、-COOR’、-SO2R”、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、和-C(CH3)3中的任何一个，其中R’是氢原子、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个、R”是-OH、-ONa、-OK、卤原子、-OCH3和一OC2H5中的任何一个； 式中i表示1-7中的任一整数，R7表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-COOR’和-SO2R”中的任何1个，其中R’是氢原子、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个，R”是-OH、-ONa、OK、卤原子、-OCH3和-OC2H5中的任何一个； 式中j表示1-9中的任一整数。
23.根据权利要求16记载的制备方法，其特征是使用具有生产该聚羟基烷酸酯能力的微生物，生产上述聚羟基烷酸酯。
24.根据权利要求23记载的制备方法，其特征是利用导入涉及生产聚羟基烷醇酸酯基因的转化体，生产上述聚羟基烷醇酸酯。
25.根据权利要求24记载的制备方法，其特征上述基因是从具有生产聚羟基烷醇酸酯能力的微生物中获得的基因。
26.根据权利要求23记载的制备方法，其特征是具有生产上述聚羟基烷醇酸酯能力的微生物是从属于假单胞菌属(Pseudomonas.sp)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia.sp)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.)和产碱菌属(Alcaligenes sp)的微生物中选出的至少1种微生物。
27.根据权利要求26记载的制备方法，其特征是属于上述假单胞菌属(pseudomonas sp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.)和产碱菌属(Alcaligenes sp)的微生物是从以下中选出的至少一种微生物，即恶臭假单胞菌P91株(Pseudomonas putida P91，FERMBP-7373)，菊苣假单胞菌H45株(Pseudomonas cichorii H45、FERM BP-7374)、菊苣假单胞菌YN2株(Pseudomonas cichorii YN2、FERM BP-7375)、假单胞菌属P161株(Pseudomonas jessenii P161、FERM BP-7376)、洋葱伯克霍尔德氏菌KKO1株(Burkholderia cepacia KKO1、FERM BP-4235)、伯克霍尔德氏菌属OK3株(Burkholderia sp.OK3、FERM P-17370)、伯克霍尔德氏菌属OK4株(Burkholderia sp.OK4、FERM P-17371)、富养罗尔斯通氏菌TB64株(Ralstonia eutropha TB64、FERM MP-6933)、产碱菌属TL2株(Alcaligenessp.TL2、FERM P-14642)。
28.根据权利要求24记载的制备方法，其特征是具有生产上述聚羟基烷醇酸酯能力的转化体宿主微生物是大肠埃希氏菌(Escheichia coli)。
29.一种粒状体的制备方法，其特征是包括以下工序，即，准备含有聚羟基烷醇酸酯合成酶和3-羟酰基辅酶A的水相的工序、用上述水相和油相调制乳液的工序、利用聚羟基烷醇酸酯合成酶聚合3-羟酰基辅酶A，合成聚羟基烷醇酸酯的工序、和除去有机溶剂和/或水的工序、调制含有来自上述水相的固相、液相、气相中至少一种相的粒状体。
30.根据权利要求29记载的粒状体制备方法，其特征是包括将上述水相分散在上述油相中调制W/O型乳液的工序，和由上述W/O型乳液中除去有机溶剂和/或水的工序。
31.根据权利要求29记载的粒状体制备方法，其特征是包括将第一水相分散在上述油相中，调制W/O型乳液的工序、将上述W/O型乳液再分散在第二水相中，调制W/O/W型乳液的工序、由上述W/O/W型乳液中除去有机油剂和/或水分的工序。
32.根据权利要求31记载的粒状体制备方法，其特征是上述第一水相含有聚羟基烷醇酸酯合成酶和3-羟酰基辅酶A。
33.根据权利要求31记载的粒状体制备方法，其特征是上述第二水相含有聚羟基烷醇酸酯合成酶和3-羟酰基辅酶A。
34.根据权利要求31记载的粒状体制备方法，其特征是上述第一和第二水相含有聚羟基烷醇酸酯合成酶和3-羟酰基辅酶A。
35.根据权利要求29记载的粒状体制备方法，其特征是还有将上述油相分上述水相中调制O/W型乳液的工序、和从上述O/W型乳液中除去有机溶剂和/或水分的工序。
36.根据权利要求29记载的制备方法，其特征是上述有机溶剂的去除，至少利用液中干燥法、相分离法、喷雾干燥法中的一种方法进行。
37.根据权利要求29记载的制备方法，其特征是上述聚羟基烷醇酸酯是含有从化学式[1]～[10]表示单体单元组成的组中选出至少一种的聚羟基烷醇酸酯，与上述单位分别对应的3-羟酰基辅酶A，依次是化学式[11]～[20]表示的3-羟酰基辅酶A， 该单体单元是式中R1和a的组合为以下中任何一种单体单元组成的组中选出的至少一种，R1为氢原子(H)、a为0～10中任一整数的单体单元、R1为卤原子、a为1～10中任一整数的单体单元、R1为发色团、a为1～10中任一整数的单体单元、R1为羧基或其盐、a为1～10中任一整数的单体单元、R1是 ，a为1～7中任一整数的单体单元； 式中，b表示0-7中的任一整数，R2表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5及-C3F7中的任何一种； 式中C表示1-8中的任一整数，R3表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中的任何一种； 式中d表示0-7中的任一整数，R4表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7中的任何一种； 式中e表示1-8中的任一整数，R5表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5、-C3F7、-CH3、-C2H5和-C3H7中的任何一个； 式中f表示0-7中的任一整数； 式中g表示1-8中的任一整数； 式中h表示1-7中的任一整数，R6表示氢原子、卤原子、-CN、-NO2、-COOR’、-SO2R”、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CH(CH3)2、和-C(CH3)3中的任何一个，其中R’是氢原子、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个、R”是-OH、-ONa、-OK、卤原子、-OCH3和一OC2H5中的任何一个； 式中i表示1-7中的任一整数，R7表示氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-COOR’和-SO2R”中的任何1个，其中R’是氢原子、Na、K、-CH3和-C2H5中的任何一个，R”是-OH、-ONa、OK、卤原子、-OCH3和-OC2H5中的任何一个； 式中j表示1-9中的任一整数； 上述化学式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，式中R1和a的定义与上述化学式[1]相同； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，b和R2的定义与上述化学式[2]一样； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，c和R3的定义与上述化学式[3]一样； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，d和R4的定义与上述化学式[4]一样； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，e和R5的定义与上述化学式[5]一样； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，f和上述化学式[6]的定义相同； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，g和上述化学式[7]的定义相同； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，h和R6的定义与上述化学式[8]一样； 式中-S CoA表示与链烷酸结合的辅酶A，i和R7的定义与上述化学式[9]一样。
38.根据权利要求29记载的制备方法，其特征是通过随时间改变上述3-羟酰基辅酶A的组成，可在从上述粒状体从内侧向外侧方向上变化上述聚羟基烷醇酸中3-羟基烷酸单位的组成。
39.根据权利要求29记载的制备方法，其特征是还有对上述聚羟烷醇酸酯至少一部分实施化学修饰的工序。
40.根据权利要求29记载的制备方法，其特征是使用具有能生产该酶的微生物，生产上述聚羟基烷醇酸酯合成酶。
41.根据权利要求40记载的制备方法，其特征是利用导入有关能生产该酶基因的转化体，生产上述聚羟基烷醇酸酯合成酶。
42.根据权利要求41记载的制备方法，其特征是上述基因是由具有能生产聚羟基烷醇酸酯合成酶的微生物中获得的基因。
43.根据权利要求40记载的制备方法，其特征是具有生产上述聚羟基烷醇酸酯能力的微生物是从属于假单胞菌属(pseudomonas sp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.)和产碱菌属(Alcaligenes sp)的微生物中至少选出的1种微生物。
44.根据权利要求43记载的制备方法，其特征是属于上述假单胞菌属(pseudomonas sp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.)和产碱菌属(Alcaligenes sp)的微生物是从以下中选出的至少一种微生物，即，恶臭假单胞菌P91株(Pseudomonas putida P91，FERMBP-7373)、菊苣假单胞菌H45株(Pseudomonas cichorii H45、FERM BP-7374)、菊苣假单胞菌YN2株(Pseudomonas cichorii YN2、FERM BP-7375)、杰氏假单胞菌P161株(Pseudomonas jessenii P161、FERM BP-7376)、洋葱伯克霍尔德氏菌KKO1株(Burkholderia cepacia KKO1、FERM BP-4235)、伯克霍尔德氏菌属OK3株(Burkholderia sp.OK3、FERMP-17370)、伯克霍尔德氏菌属OK4株(Burkholderia sp.OK4、FERMP-17371)、富养罗尔斯通氏菌TB64株(Ralstonia eutropha TB64、FERM MP-6933)、产碱菌属TL2株(Alcaligenessp.TL2、FERM P-14642)。
45.根据权利要求41记载的制备方法，其特征是具有生产上述聚羟基烷醇酸酯合成酶能力的转化体的宿主微生物是大肠埃希氏菌(Escheichia coli)。
46.根据权利要求1记载的粒状体，上述内相含有医药成分。
47.含有权利要求46粒状体形成的制剂。
48.根据权利要求1记载的粒状体，上述内相含有农药成分。
49.含有权利要求48粒状体形成的农药组合物。
50.根据权利要求1记载的粒状体，上述内相含有气相部分。
51.根据权利要求50记载的粒状体，上述气相部分中充满了全氟化碳气体。
52.含有权利要求50记载的粒状体形成的超声波显像剂。
53.根据权利要求1记载的粒状体，上述内相至少含有颜料或染料。
54.含有权利要求53粒状体形成的油墨组合物。
55.根据权利要求1记载的粒状体，上述内相含有血红蛋白。
56.含有权利要求55粒状体形成的血细胞组合物。
57.根据权利要求1记载的粒状体，上述内相含有化妆品成分。
58.含有权利要求57粒状体形成的化妆品组合物。
59.根据权利要求1记载的粒状体，上述内相含有肥料成分。
60.含有权利要求59粒状体形成的肥料组合物。
全文摘要
本发明提供的是含有药物的微胶囊等粒状体，实质上不显示成为障碍的初期释放，而显示一定时间实用上允许的零级释放的缓释性制剂及其制备方法，进而提供将药物内包在稳定性优选胶囊等粒状体中的药物含量高的缓释性制剂及其制备方法。还提供利用高功能的高分子化合物的、将油相或水相一种以上含在固相中的微胶囊等粒状体及其制备方法。进而提供可在微粒子中含有大量气泡的、作为外壳具有一层聚合物膜的微胶囊状中空结构的粒状体，以及选择性的以高再现性制作该中空粒状体的制备方法。使用特定结构的聚羟基烷醇酸酯形成胶囊等粒状体，其中含有目的用途中使用的药物、油相或水相中的1种以上，或气相(中空部分)。
文档编号A61K49/22GK1431041SQ02151808
公开日2003年7月23日 申请日期2002年7月10日 优先权日2001年7月10日
发明者矢野哲哉, 野本毅, 古崎真也, 本间务 申请人:佳能株式会社