专利名称：2’，4’－二羟基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查尔酮用于制备抗癌药物的新用途的制作方法
专利说明2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮 用于制备抗癌药物的新用途 本发明涉及一种2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮(2’，4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’，5’-dimethylchalcone)用于制备抗癌药物的新用途。癌症是当前对人类健康和生活质素危害最大的疾病之一。抗癌药物的开发一直是科学家们研究的热点课题。由于癌症发生机制的复杂性和特殊性，寻找高选择性、高效及低毒副作用抗癌药物努力，并未取得理想的结果。
血管内皮生长因子受体在肿瘤血管生成、肿瘤生长中起重要的作用。针对血管生成抗肿瘤，不同于常规化疗，血管生成抑制剂主要是针对肿瘤赖以生存的血管，而非直接针对肿瘤细胞，因此抗肿瘤的选择性高、疗效好、毒性低。特异性血管生成抑制剂不应该有引起骨髓抑制，胃肠道反应以及脱发等副作用，这并不是说该类药物没有副作用，但根据其作用特点，应该选择性高，毒副作用小。总的来说，血管生成抑制剂下调新生血管，是通过抑制细胞增殖和迁移，而不是通过细胞毒作用。目前，有许多抗血管生成抑制剂处于治疗肿瘤的研究之中，针对血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶的小分子药物如SU6668已完成临床前研究，准备进行临床试验，但国际上至今还没有一个正式被批准的针对血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶的抗肿瘤药物。近年来，针对抗血管生成治疗肿瘤研究已成为一大研究热点，给肿瘤治疗带来新的希望。本发明以血管内皮细胞生长因子受体为靶点，筛选了一系列化合物，发现新鲜水翁花蕾中分离得到的2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮(2’，4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’，5’-dimethylchalcone，简称为查尔酮衍生物ZW-ON-III)在1-10μg/mL浓度下对血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶有强力抑制作用；随后研究证明了2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮对血管内皮细胞生长有显著抑制作用，同时对其它几种人癌细胞株体外生长有一定的抑制作用，对人癌细胞裸鼠移植瘤生长有强烈的抑制作用。
本发明提供一种使用如下所示的查尔酮衍生物ZW-ON-III结构式或与它的药学组合物制剂用于治疗肿瘤的药物。
2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮为来自植物的天然化合物或来自化学合成的人工产物。
2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮是纯化合物(单体)或含有2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮的混合物，包括含这种查尔酮衍生物的植物提取物、分部提取物、分离部位以及化学合成中间体。
本发明通过体外抑制试验表明，查尔酮衍生物ZW-ON-III抑制血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶。
本发明通过人癌细胞株体外试验表明，查尔酮衍生物ZW-ON-III对血管内皮细胞生长有很强的抑制作用，同时对肝癌、鼻咽癌细胞株均有一定的生长抑制作用。
本发明通过人癌细胞裸鼠移植瘤模型体内试验，证明了查尔酮衍生物ZW-ON-III具有优良的抗瘤活性。
本发明通过动物药效实验，确定查尔酮衍生物ZW-ON-III或其药学组合的使用剂量范围是1-100mg/kg/day。
本发明通过动物毒理实验，确定查儿酮衍生物在有效治疗剂量范围内毒副作用小，可以长期服用的药物。
根据本发明，上述所示化合物和其药学组合可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、乳剂的形式使用；其给药途径可为经口服、静脉、肌肉、皮肤给药。以下通过下述实施例对本发明做进一步说明。一查儿酮衍生物ZW-ON-III的提取、分离及纯化新鲜水翁(Cleistocalyx operculatus)花蕾5公斤，用95％乙醇冷浸一次，乙醇提取液减压浓缩至无乙醇为止，加水，水溶液先用乙醚萃取5次，再用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得棕色粉末(13克)，将该棕色粉末上硅胶柱，用氯仿-甲醇(95.5∶0.5)洗脱，得到I的粗晶，经用苯重结晶得本发明的查尔酮衍生物(0.7克)。二查儿酮衍生物ZW-ON-III的鉴定查儿酮衍生物ZW-ON-III橙黄色簇状结晶，mp124-126C(苯)；UV(MeOH)λmax(nm)339(logε4.32)，306(logε4.25，sh)，UV(NaOMe)λmax(nm)280(logε4.16)；IR(CCl4)υmax(cm-1)3550(OH)，1620，1540，1500(Ar)，1640(C＝O)，1170；1H NMR(90 MHz，CDCl3)δ2.11，2.12(各3H，s，Ar-CH3)，3.62(3H，s，OCH3)，5.46(1H，s，7’-OH)，12.27(1H，s，5’-OH)，7.20-7.90(5H，m，Ar-H)，7.86，7.96(各1H，d，J＝16.0 Hz，H-a和H-b)；EIMSm/z(％)298(M+，76)，297(M+-H，56)，221(100)，195(37)，194(62)，193(22)，166(19)，165(24)，131(17).三ZW-ON-III对血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用方法取对数生长期的ECV304细胞，用培养液配成5×105/ml，再将其加入12孔板中，每孔加入1ml。第2天，将培养液吸出，并加入无血清培养液，再加入受试不同浓度ZW-ON-III处理30分钟，在收集细胞前5分钟加入20ng/ml的VEGF刺激，分别应用抗VEGFR的抗体和抗磷酸酪氨酸抗体Western blot检测VEGFR受体的蛋白及其磷酸化水平。结果ZW-ON-III在VEGF刺激下对ECV304细胞中KDR磷酸化有明显的抑制作用，呈现浓度效应关系，而KDR受体蛋白表达水平不受其影响。ZW-ON-III(ug/ml 00 1.25 2.5 5.0 10.0 20.0 40.0VEGF(ng/ml) -+ +++++ + 四ZW-ON-III对血管内皮细胞ECV304、肝癌细胞Bel7402、肺癌细胞GLC82等体外生长的抑制作用方法取对数生长的血管内皮细胞ECV304、肝癌细胞Bel7402、肺癌细胞GLC-82加入96孔板中，每孔100μl含有2000-4000个细胞。再加入药物，每组设3个平行孔，置37℃培养72小时，实验终止前4h加入10μL 5mg/mL MTT液，再培养4h，弃去培养液加入0.2mL DMSO，待结晶溶解后在酶联检测仪上检测570nm波长的每孔的OD值。按下列公式求出生长抑制率，再按BLISS法计算机程序求出半数抑制率〔IC50值〕。 结果见表1。表1ZW-ON-III对人血管内皮细胞ECV304、肝癌细胞Bel7402、肺癌GLC-82的体外生长抑制作用
五ZW-ON-III对人癌细胞株裸鼠移植瘤的抗瘤作用方法分别收集人肝癌细胞株Bel7402和肺腺癌GLC-82，制成1×107/mL细胞悬液。取0.2mL接种于裸小鼠腋窝皮下。待肿瘤长至约10mm3大小时，随机分成5组，每8只，每组分别腹腔注射给药如下①溶剂对照组(DMSO)；②CTX15mg·(kg·d)-1组或DDP1.5mg·(kg·d)-1组；③ZW-ON-III5mg·(kg·d)-1组；④ZW-ON-III10mg·(kg·d)-1组；⑤ZW-ON-III20mg·(kg·d)-1组，每周用药6次，连用4周。每5天量度瘤体积及称体重，停药次日量瘤体积、称体重、处死裸鼠，剥瘤块称瘤重，按下列公式计算抑瘤率，并作t检验。实验重复2次。公式
结果在5.0mg·(kg·d)-1、10.0mg·(kg·d)-1和20mg·(kg·d)-1剂量作用28天下，ZW-ON-III对肝癌裸鼠移植瘤的平均抑瘤率分别为42.44％、59.5％和65.6％(详见表.2，3)。结果可见不同剂量的ZW-ON-III对人肝癌裸鼠移植瘤均有不同程度的抑瘤作用，抑制作用与剂量相关。表2查尔酮衍生物ZW-ON-III对人肝癌(Bel7402)裸鼠移植瘤的抑制率
表3查尔酮衍生物ZW-ON-III对人肝癌(GLC-82)裸鼠移植瘤的抑制率
本发明的上述实验表明(1)通过查尔酮衍生物ZW-ON-III对血管内皮细胞与癌细胞抑制试验和癌细胞裸鼠移植瘤模型试验，证明了天然化合物查尔酮衍生物ZW-ON-III，具有优良的抗癌活性。
(2)使用本发明的查尔酮衍生物ZW-ON-III，使用剂量范围是1-100mg/kg/day。
(3)使用本发明的查尔酮衍生物ZW-ON-III，在正常剂量下，其作为药物应用是安全的。
(4)本发明的化合物或它的药学组合，具有抗癌效果好，副作用更小和应用范围广的特点。
权利要求
1.一种2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮用于制备抗癌药物的新用途，其特征在于2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮用于抗肿瘤药物使用的新用途。
2.根据权利要求书1所述的2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮用于制备抗癌药物的新用途，其特征在于2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮为来自植物的天然化合物或来自化学合成的人工产物。
3.根据权利要求书1所述的2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮用于制备抗癌药物的新用途，其特征在于2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮是纯化合物或含有2’，4’ -二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮的混合物，包括含这种查尔酮衍生物的植物提取物、分部提取物、分离部位以及化学合成中间体。
4.根据权利要求书1所述的2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮用于制备抗癌药物新用途，其特征在于2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮的药学制剂用于抗肿瘤的新用途，药学组合的使用剂量范围是1-100mg/kg/day。
5.根据权利要求书1、4所述的2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮用于制备抗癌药物的新用途，其特征在于2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮的药学制剂是注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、乳剂。
全文摘要
本发明涉及一种2’，4’－二羟基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查尔酮用于制备抗癌药物中的新用途。其特征为2’，4’－二羟基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查尔酮用于抗肿瘤药物使用的新用途。查尔酮衍生物2’，4’－二羟基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查尔酮对血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶具有强烈的抑制作用，对血管内皮细胞株ECV304体外生长具有显著的抑制作用，对人肝癌细胞株Bel7402、鼻咽癌细胞株CNE2具有一定的细胞生长抑制作用；同时也发现对人肝癌细胞株Bel7402以及肺腺癌GLC－82裸鼠移植瘤生长有很强抑制作用。
文档编号A61P35/00GK1454895SQ0215192
公开日2003年11月12日 申请日期2002年11月12日 优先权日2002年11月12日
发明者朱孝峰, 刘宗潮, 谢冰芬, 冯公侃, 曾益新, 魏孝义, 张凤仙, 刘梅芳 申请人:中山大学肿瘤防治中心, 中国科学院华南植物研究所