专利名称：新生隐球菌多糖中的寡糖及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有生物活性的可药用的寡糖。
背景技术：
根据目前所知，新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是肺的病原菌，能引起病人的随机感染，损害病人的神经系统，已经成为世界上第四致死的病因。新生隐球菌的多糖有四种，它们的主链都是α-(1-3)-连接的甘露糖，在甘露糖的2位连接有木糖和葡萄糖醛酸，多糖简称为GXM，这四种多糖结构有如下的结构式 这些多糖起作用部位很可能就是它们的重复单元-寡糖，制备这些寡糖，就可能获得多糖所具备的活性，从而将其应用于药物。本发明就是首次揭示A类多糖寡糖的制备。
发明的公开本发明的首要目的是提供一种GXM寡糖；该寡糖具有下述结构式[I] 式中[Rx]n为所述寡糖的主链，Rx为糖基，Rx包括相同或不同的糖基，n为3-6的整数；(R1)m为所述寡糖的侧链，R1为单糖或寡糖，可相同或不同，m为0-4的整数；
R2为非还原端，R3为还原端，其中R2为H，R3选自H和碳原子数为1-18的烃基；所述的主链糖基Rx之间的连接为1→3连接，所述的侧链糖基R1与主链糖基Rx的连接为1→2连接。
所述的侧链R1在主链的糖基上紧密并排排列。
所述的侧链R1可在主链的糖基上由一个或至少一个主链糖基隔开排列所述R3选自碳原子数为1-18的烃基。
所述的主链糖基Rx为甘露糖、葡萄糖、半乳糖。
所述的主链Rx均为甘露糖基。
所述的寡糖包括4糖、5糖6糖7糖8糖。
所述的寡糖主链包括α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man或α-Man-1→3-α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man。
所述的6糖包括下列几式 R＝C1-18 alkyl，or C2-18 alkenyl
所述的寡糖的制备，用4，6异丙叉基或4，6-苄叉基保护的甘露糖为关键中间体，首先选择性地在它的3位上接糖基，然后再在它的2位上接糖基。用这种方法，可以先制备出1-3连接的、2位空出的甘露糖主链，然后在其2位再连上所需的支链，就能得到6糖。以下两个反应序列分别描述6糖6(附
图1)和6糖4(附图2)的制备。
所述的寡糖的用途，它用于制备诊断用试剂。
实现本发明的最佳方式下面结合实施例对本发明进行详细地说明，这些实施例仅用于说明本发明，本发明不受实施例的限制。
实施例1六糖6的制备。按反应式进行。其策略是先构筑三糖主链，用区选偶联的方法，使糖基供体8与糖基受体9偶联得到双糖10，偶联的3位区选性由10乙酰化得到11来证明。双糖10在碱性下脱乙酰基得到双糖受体12，与单糖供体13偶联得到三糖14，三糖14的结构也是通过乙酰化得到15来证明的。三糖14再与木糖供体16偶联，即得到五糖17。将17的异丙叉基水解再苯甲酰化得到18，选择性地脱除18的乙酰基得到五糖受体19。使19与葡萄糖醛酸的供体20偶联，得到六糖21，使21脱掉保护基，就得到GXM(A类)六糖。
以下为一些关键中间体及产物的鉴定数据三糖14[α]D+91.7(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.95-7.34(m，15H，3PhH)，5.94(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4)，5.75(dd，1H，J2，3＝3.3Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3)，5.53(dd，1H，J1，2＝1.8Hz，J2，3＝3.3Hz，H-2)，5.43(d，1H，J1，2＝1.8Hz，H-1)，5.31(d，1H，J1，2＝1.0Hz，H-1)，4.71(d，1H，J2，1＝1.0Hz，H-1)，3.36(s，3H，OCH3)，2.17(s，3H，COCH3)，1.56，1.45(2s，6H，isopropylidene)，1.37(s，6H，isopropylidene).13C NMR(100MHz，CDCl3)169.5(COCH3)，166.3，165.6，163.6(5C，5 COPh)，101.2，100.8，(2C，2 Me2C)99.9，99.4，98.3(3C，3 C-1)，54.8(OCH3)，29.1，28.9(2C，CH3CCH3)，20.6(COCH3)，19.2，19.0(2C，CH3CCH3).Anal.Calcd forC48H56O20C，60.50；H，5.92.FoundC，60.45；H，5.66.
三糖15[α]D+82.6(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.10-7.23(m，15H，3PhH)，6.04(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4)，5.64(dd，1H，J2，3＝3.2Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3)，5.45(dd，1H，J1，2＝2.0Hz，J2，3＝2.9Hz，H-2)，5.40(dd，1H，J1，2＝1.3Hz，J2，3＝3.4Hz，H-2)，5.32(d，1H，J1，2＝1.7Hz，H-1)，5.22(dd，1H，J1，2＝1.3Hz，J2，3＝2.9Hz，H-2)，5.10(d，1H，J1，2＝1.2Hz，H-1)，4.67(dd，1H，J2，3＝2.9Hz，J3，4＝12.1Hz，H-3)，4.63(d，1H，J1，2＝1.2Hz，H-1)，3.36(s，3H，OCH3)，2.31，2.18，2.07(3s，9H，3 COCH3)，1.56，1.52(2s，6H，isopropylidene)，1.37(s，6H，isopropylidene).Anal.Calcd forC52H60O22C，60.22；H，5.83.FoundC，60.47；H，5.61.
五糖18[α]D-58.6(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.11-7.34(m，65H，13PhH)，5.94(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4，Manp)，5.77(dd，1H，J2，3＝3.2Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3，Manp)，5.71(dd，J1，2＝J2，3＝6.3Hz，H-2，Xylp)，5.59(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4，Manp)，5.54(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.9Hz，H-4，Manp)，5.18(d，1H，J1，2＝0.7Hz，H-1，Manp)，5.16(dd，1H，J1，2＝1.0Hz，J2，3＝3.0Hz，H-2，Manp)，4.99(d，1H，J1，2＝0.8Hz，H-1，Manp)，4.80(d，1H，J1，2＝4.8Hz，H-1，Xylp)，4.53(d，1H，J1，2＝10Hz，H-1，Manp)，4.45(d，1H，J1，2＝6.1Hz，H-1，Xylp)，3.19(s，3H，OCH3)，1.90(s，3H，COCH3).13C NMR(100MHz，CDCI3)168.9(COCH3)，166.0，165.9，165.8，165.4，165.3，165.3，165.3，165.2，165.1，165.0，164.9，164.7，164.6(13C，13 COPh)，99.7，99.7，99.7，99.0，98.5(5C，5C-1)，54.8(OCH3)，20.3(COCH3)；Anal.Calcd for C122H104O38C，67.27；H，4.81.FoundC，67.45；H，5.96.
保护的六糖21[α]D-22.5(c 0.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ6.00(dd，1H，J3，4＝J4，5＝10.0Hz，H-4，Manp)，5.71(dd，1H，J2，3＝3.2Hz，J3，4＝10.0Hz，H-3，Manp)，5.15(d，1H，J1，2＝1.0Hz，H-1，Manp)，4.96(d，1H，J1，2＝0.9Hz，H-1，Manp)，4.75(d，1H，J1，2＝4.9Hz，H-1，Xylp)，4.60(d，1H，J1，2＝4.8Hz，H-1，Xylp)，4.56(d，1H，J1，2＝1.0Hz，H-1，Manp)，4.04(d，1H，J1，2＝6.6Hz，H-1，GluAp)，3.69(s，3H，COOCH3)，3.23(s，3H，OCH3)，1.96，1.92，1.31(3s，9H，3 COCH3).13C NMR(100MHz，CDCl3)167.0，168.5，168.5，168.3(3 C，3 COCH3，COOMe)，165.9，165.9，165.9，165.4，165.4，165.4，165.3，165.2，165.1，165.0，164.9，164.6，164.6(13 C，13COPh)，100.9(C-1，JC1，H1＝175Hz，Manp)，100.3(C-1，JC1，H1＝163Hz，GluAp)，99.9(C-1，JC1，H1＝164Hz，Xylp)，99.5(C-1，JC1，H1＝163Hz，Xylp)，98.5(C-1，JC1，H1＝172Hz，Manp)，95.2(C-1，JC1，H1＝176Hz，Manp)，54.8(OCH3)，52.3(COOCH3)，20.5，20.3，20.2(COCH3)；Anal.Calcd forC133H118O46C，65.13；H，4.85.FoundC，65.45；H，4.66.
目的物六糖22(相当于6，R＝Me)[α]D+99.6(c 0.5，H2O)；1H NMR(D2O，400MHz)δ5.11(s，1H，H-1，Manp)，4.75(s，1H，H-1，Manp)，4.31(s，1H，H-1，Manp)，4.29(d，1H，J1，2＝8.0Hz，H-1，GluAp)，4.12(d，1H，J1，2＝8.9Hz，H-1，Xylp)，4.10(d，1H，J1，2＝9.2Hz，H-1，Xylp)，3.33(s，3H，OCH3)；13C NMR(100MHz，D2O)174.1(-COONH4)，103.4，103.3，103.2，102.5，100.3，100.2(6 C-1)，79.0，78.5，78.4，78.3，78.3，76.4，76.2，75.9，75.8，73.6，73.4，73.2，72.9，72.9，70.7，70.3，69.5，69.5，68.4，67.0，66.7，66.5，65.4，65.3，61.5，60.6，60.6，56.6(O-CH3).MALDI-TOF MS Calcd forthe ammoniumsalt of 16，C35H61O30N975.8[M].found975.8(M)；980.9(M-NH4++Na+).
实施例2六糖4的制备。按反应式进行。首先使木糖供体16与2位为羟基的甘露糖受体23偶联，得到双糖24，使其1位活化，得到双糖供体25，使25与受体26选择性地在3位偶联得到三糖27，使27再与一个木糖供体偶联，得到四糖28，将其苄叉基水解掉，苯甲酰化得到29，然后活化29的1位，得到四糖供体30，使30与单糖受体31选择性地在3位偶联，得到五糖32，先乙酰化，再将苄叉基水解掉，再苯甲酰化得到33，用2％MeCOCl-MeOH选择性地脱掉乙酰基，得到五糖受体34，使34与葡糖醛酸供体20偶联，得到保护的六糖35，最后在甲醇-氨-水中脱掉保护基，即得到目标六糖36(相当于六糖4，R＝Me)。以下为一些关键中间体及产物的鉴定数据三糖27[α]D+66.3(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.86(m，1H，OCH2CH＝CH2)，5.83(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.9Hz，H-4，Manp)，5.64(dd，1H，J2，3＝3.1Hz，J3，4＝9.9Hz，H-3，Manp)，5.62(s，1H，PhCHO2)5.45(dd，1H，J2，3＝J3，4＝8.6Hz，H-3，Xylp)，5.32(dd，1H，J1，2＝6.6Hz，J2，3＝8.6Hz，H-2，Xylp)，5.30(d，1H，J1，2＝1.5Hz，H-1，Manp)，5.05(m，1H，H-4，Xylp)，4.87(d，1H，J1，2＝1.3Hz，H-1，Manp)，4.47(dd，1H，J1，2＝1.6Hz，J2，3＝3.2Hz，H-2，Manp)，4.41(d，1H，J1，2＝6.6Hz，H-1，Xylp).
四糖28[α]D+81.1(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.92(dd，1H，J2，3＝3.0Hz，J3，4＝9.8Hz，H-3，Manp)，5.85(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.66(dd，1H，J1，2＝J2，3＝4.0Hz，H-2，Xylp)，5.52(s，1H，PhCHO2)，5.66(dd，1H，J1，2＝J2，3＝5.8Hz，H-2，Xylp)，5.38(dd，1H，J1，2＝1.2Hz，H-1，Manp)，5.32(dd，1H，J2，3＝4.0Hz，J3，4＝8.2Hz，H-3，Xylp)，5.25-5.17(m，2H，OCH2CH＝CH2)，5.04(m，1H，H-4，Xylp)，4.83(d，1H，J1，2＝0.7Hz，H-1，Manp)，4.60(d，1H，J1，2＝4.1Hz，H-1，Xylp)，4.19(d，1H，J1，2＝6.0Hz，H-1，Xylp).五糖33[α]D+6.6(c 1.0，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.90(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.9Hz，H-4，Manp)，5.71(dd，1H，J2，3＝3.3Hz，J3，4＝9.8Hz，H-3，Manp)，5.70(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.64(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.38-5.33(m，4H)，5.22(dd，J1，2＝J2，3＝5.7Hz，H-2，Xylp)，5.18(dd，J1，2＝J2，3＝5.9Hz，H-2，Xylp)，5.06(s，1H，H-1，Manp)，5.01(d，1H，J1，2＝0.6Hz，H-1，Manp)，4.98(m，1H，H-4，Xylp)，4.70(d，1H，J1，2＝0.8Hz，H-1，Manp)，4.40(d，1H，J1，2＝6.0Hz，H-1，Xylp)，3.84(d，1H，J1，2＝5.8Hz，H-1，Xylp)，3.23(s，3H，OCH3)，2.04(s，3H，COCH3).13C NMR(100MHz，CDCl3)170.3(COCH3)，166.0，165.9，165.8，165.4，165.3，165.3，165.1，165.1，164.9，164.8，164.6，164.5，164.4(13C，13 COPh)，99.7，98.6，98.6，98.4，98.4(5C，5C-1)，55.1(OCH3)，20.9(COCH3)；Anal Calcd for C122H104O38C，67.27；H，4.81.FoundC，67.09；H，5.72.
保护的六糖35[α]D-31.3(c 0.5，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ6.55(dd，2H，J1，2＝J2，3＝7.7Hz，2H-2，Xylp)，6.09(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.6Hz，H-4，Manp)，6.01(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.8Hz，H-4，Manp)，5.77(dd，1H，J3，4＝J4，5＝9.7Hz，H-4，Manp)，5.29(d，1H，J1，2＝0.7Hz，H-1，Manp)，5.15(d，1H，J1，2＝0.8Hz，H-1，Manp)，4.96(d，1H，J1，2＝0.9Hz，H-1，Manp)，4.81(d，1H，J1，2＝8.0Hz，H-1，Xylp)，4.75(d，1H，J1，2＝7.8Hz，H-1，Xylp)，4.43(d，1H，J1，2＝0.6Hz，H-1，Manp)，4.03(d，1H，J1，2＝8.4Hz，H-1，G1uAp)，3.52(s，3H，COOCH3)，3.19(s，3H，OCH3)，2.19，2.13，2.01(3s，9H，3 COCH3).13C NMR(100MHz，CDCl3)171.3，170.9，169.7，169.2(4C，3 COCH3，COOMe)，167.2，167.1，166.1，166.0，165.8，165.4，165.3，165.3，165.2，165.2，165.2，165.0，164.5(13C，13 COPh)，102.6，100.6，100.4，99.6，98.9，98.2(6C，6C-1)，54.7(OCH3)，52.7(COOCH3)，20.7，20.6，20.5(COCH3)；Anal.Calcd for C133H118O46C，65.13；H，4.85.FoundC，65.00；H，4.96.六糖36(相当于六糖4，R＝Me)1H NMR(D2O，400MHz)δ5.08(s，1H，H-1，Manp)，4.73(s，1H，H-1，Manp)，4.31(s，1H，H-1，Manp)，4.28(d，1H，J1，2＝7.5Hz，H-1，GluAp)，4.12(d，1H，J1，2＝8.9Hz，H-1，Xylp)，4.10(d，1H，J1，2＝9.2Hz，H-1，Xylp)，3.33(s，3H，OCH3)；13C NMR(100MHz，D2O)174.0(-COONH4)，103.5，103.3，103.1，102.7，100.2，100.1(6C-1)，56.6(O-CH3).MALDI-TOF MS Calcd for the ammonium salt of 37，C35H61O30N975.8[M].found975.8(M)；980.7(M-NH4++Na+).
用相似的方法可制备出末端为H(即六糖1，2，3)，及末端为C2-18的饱和或不饱和链的六糖(即六糖4，5，6)，或比六糖更大的糖。
权利要求
1.一种寡糖，其特征在于，该寡糖具有下述结构式[I] 式中[Rx]n为所述寡糖的主链，Rx为糖基，Rx包括相同或不同的糖基，n为3-6的整数；(R1)m为所述寡糖的侧链，R1为单糖或寡糖，可相同或不同，m为0-4的整数；R2为非还原端，R3为还原端，其中R2为H，R3选自H和碳原子数为1-20的烃基；所述的主链糖基Rx之间的连接为1→3连接，所述的侧链糖基R1与主链糖基Rx的连接为1→2连接。
2.权利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的侧链R1在主链的糖基上紧密并排排列。
3.权利要求1所述的寡糖，所述的侧链R1可在主链的糖基上由一个或至少一个主链糖基隔开排列
4.权利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述R3选自碳原子数为1-18的烃基。
5.权利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的主链糖基Rx为甘露糖、葡萄糖、半乳糖。
6.权利要求4所述的寡糖，其特征在于，所述的主链Rx均为甘露糖基。
7.权利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的寡糖包括4糖、5糖、6糖、7糖、8糖。
8.权利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的寡糖主链包括α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man或α-Man-1→3-α-Man-1→3-α-Man-1→3-Man。
9.权利要求1所述的寡糖，其特征在于，所述的6糖包括下列几式
10.权利要求9所述的寡糖，其特征在于，所述的6糖包括下列几式 R＝C1-18 alkyl，or C2-18 alkenyl
11.权利要求9，10所述的寡糖的制备，其特征在于，用4，6异丙叉基或4，6-苄叉基保护的甘露糖为关键中间体，首先选择性地在它的3位上接糖基，然后再在它的2位上接糖基。用这种方法，可以先制备出1-3连接的、2位空出的甘露糖主链，然后在其2位再连上所需的支链，就能得到6糖。以下两个反应序列分别描述6糖6(附图1)和6糖4(附图2)的制备
12.权利要求9，10所述的寡糖的用途，其特征在于，它用于制备诊断用试剂。
全文摘要
本发明涉及新生隐球菌多糖中的寡糖(GXM多糖中的寡糖)，该寡糖的主链为1，3α－连接的甘露糖，其侧链为甘露糖2位连接的木糖及葡萄糖醛酸。这些寡糖可用于制备诊断用疫苗。
文档编号A61K31/715GK1510038SQ0215857
公开日2004年7月7日 申请日期2002年12月26日 优先权日2002年12月26日
发明者孔繁祚, 张建军 申请人:中国科学院生态环境研究中心