古罗糖醛酸寡糖的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开古罗糖醛酸寡糖的应用，将所述古罗糖醛酸寡糖用于制备一氧化氮生成促进剂。经过研究发现，古罗糖醛酸寡糖可激活巨噬细胞表达iNOS?mRNA和蛋白，进而促进NO的生成，因此，可将古罗糖醛酸寡糖作为一氧化氮生成促进剂。
【专利说明】古罗糖醛酸寡糖的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，尤其涉及古罗糖醛酸寡糖作为一氧化氮生成促进剂的新应用。
【背景技术】
[0002]一氧化氮(NO)被美国《Nature》杂志选为1992年的“明星分子”之一，在机体生理功能的调控上具有重要的作用，包括作为内皮细胞松弛因子、神经递质以及调控宿主防御等。NO在体内主要通过一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸和分子氧生成L-胍氨酸的过程中生成的。NOS有3种同工酶，包括内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS )、神经型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，存在于多种不同的细胞和组织中。iNOS主要存在于巨噬细胞等免疫细胞中。巨噬细胞是参与免疫反应的重要细胞之一，巨噬细胞参与免疫反应时，通过释放NO和ROS来杀伤外来侵入微生物和肿瘤细胞，对于机体防御具有重要的作用。
【发明内容】
[0003]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供古罗糖醛酸寡糖的新应用，将古罗糖醛酸寡糖作为一氧化氮生成促进剂，旨在提供一种新的促进巨噬细胞生成一氧化氮的方法。
[0004]本发明的技术方案如下:
[0005]古罗糖醛酸寡糖的应用，其中，将所述古罗糖醛酸寡糖用于制备一氧化氮生成促进剂。
[0006]古罗糖醛酸寡糖的应用，其中，将所述古罗糖醛酸寡糖用于制备促进巨噬细胞生成一氧化氮的一氧化氮生成促进剂。
[0007]古罗糖醛酸寡糖的应用，其中，所述一氧化氮生成促进剂为药物或保健食品。
[0008]有益效果:本发明中首次发现GOS能通过激活RAW264.7细胞中iNOS基因和蛋白水平的表达，进而促进NO的生成，并且呈时间依赖性和浓度依赖性。说明GOS可作为一种促进巨噬细胞生成NO的增强剂，对GOS作用NO生成促进剂的新药研制以及保健食品的开发提供新的方向。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1A为本发明实施例1中促进RAW264.7细胞生成NO的检测结果图。
[0010]图1B为本发明实施例1中GOS促进RAW264.7细胞生成NO的时间梯度实验检测
结果图。
[0011]图1C为本发明实施例1中GOS促进RAW264.7细胞生成NO的浓度梯度实验。
[0012]图2A为本发明实施例2中促进RAW264.7细胞表达iNOS mRNA的检测结果图。
[0013]图2B为本发明实施例2中GOS促进RAW264.7细胞表达iNOS mRNA的时间梯度实验的检测结果图。
[0014]图2C为本发明实施例2中GOS促进RAW264.7细胞表达iNOS mRNA的浓度梯度实验的检测结果图。
[0015]图3为本发明实施例3中促进RAW264.7细胞中iNOS蛋白的表达的检测结果图。
[0016]图4A1~4A3分别为本发明实施例4中Ctrl组、LPS组和GOS组的流式仪直方图。
[0017]图4B为本发明实施例4中ROS荧光强度的检测结果图。
【具体实施方式】
[0018]本发明提供古罗糖醛酸寡糖的新应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019]褐藻胶来源于海带等海洋植物，来源广泛、丰富，对其进行酶解可获得古罗糖醛酸寡糖(G0S)。研究发现，GOS具有很多的生物活性和作用，包括诱导巨噬细胞分泌TNF-α等细胞因子、促进植物及微藻的生长、及抗肿瘤活性等。但对于GOS作为NO增强剂的作用仍未有发现。目前市场上对NO增强剂等这类保健品的开发主要具有改善性功能，增强肌肉力量，防止心血管疾病等作用。经过研究发现，GOS能诱导巨噬细胞生成NO，可将古罗糖醛酸寡糖作为一氧化氮生成促进剂；而NO具有血压调控，预防中风和心脏病，促进免疫调节，降低胆固醇，改善糖尿病症状，以及作为胃肠道动力强抑制剂神经递质，扩张血管，保护胃黏膜等的作用，因此GOS可作为一种激活巨 噬细胞参与免疫反应的激活剂，本发明中的发现是具有创新性和重要意义的。
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0021]实施例1:G0S促进RAW264.7细胞生成NO
[0022]将由褐藻胶分离获得的均聚古罗糖醛酸(PG)经褐藻胶裂解酶降解后获得G0S。RAW264.7细胞(2 X IO5个/孔)贴壁于96孔板中，4_6h后，弃上清，加入lmg/ml GOS和Img/ml PG,以无血清RPMI1640培养基为阴性对照组(Ctrl)，I μ g/ml脂多糖(LPS)为阳性对照，刺激24h后，应用Griess检测培养基中的NO生成量，其结果如图1A所示。在时间梯度实验中，GOS分别刺激RAW264.7细胞6，12，24，36h后，应用Griess检测培养基中的NO生成量,其结果如图1B所示。在浓度梯度实验中，GOS (0.lmg/ml, 0.5mg/ml, 1.0mg/ml)刺激RAW264.7细胞24h后，按Griess检测培养基中的NO生成量，其结果如图1C所示。
[0023]结果表明，与Ctrl组相比，GOS能促进RAW264.7细胞生成NO，并且具有显著差异性(图1A)。在时间梯度的实验中发现，GOS的刺激时间为24h时，RAW264.7细胞生成较多的NO(图1B)。在浓度梯度实验中发现，GOS促进RAW264.7细胞生成NO的量随着GOS浓度的增加而增加，呈浓度依赖性(图1C)。
[0024]实施例2 =GOS激活RAW264.7细胞中iNOS基因的表达
[0025]RAW264.7细胞(2X106个/孔)贴壁于6孔板中，4_6h后，弃上清，加入lmg/mlG0S,以无血清RPMI1640培养基为阴性对照组(Ctrl)，I μ g/mlLPS为阳性对照，刺激12h后，按总RNA细胞急速抽提试剂盒(上海飞捷生物公司)提取总RNA，其结果如图2A所示。在时间梯度实验中，GOS分别刺激RAW264.7细胞4、8、12h后，提取总RNA，其结果如图2B所示。在浓度梯度实验中，GOS (0.1, 0.5，lmg/ml)刺激RAW264.7细胞12h后，提取总RNA，其结果如图2C所示。然后通过反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)将总RNA反转录成cDNA，再通过 PCR 获得 iNOS 的基因(iNOS 弓丨物为:FE5' -CAACCAGTATTATGGCTCCT-3'，RE5'-GTGACAGCCCGGTCTTTCCA-3' ；β -actin:FE5/ - GGAGAAGATCTGGCACCACACC-3' ,RE5/ -CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG-3')。
[0026]结果表明，与Ctrl相比，GOS能够激活RAW264.7细胞中iNOS基因的表达，并且差异性明显(图2A)。并且在时间梯度(图2B)和浓度梯度实验(图2C)中发现，随着GOS刺激时间的增长和作用浓度的增加，RAW264.7细胞表达的iNOS基因也随之增加，表明GOS可以激活RAW264.7细胞iNOS基因表达的作用，且呈时间依赖性和浓度依赖性。
[0027]实施例3:G0S激活RAW264.7细胞中iNOS蛋白水平的表达
[0028]RAW264.7细胞(2父106个/孔)贴壁于6孔板中，4-611后，弃上清，加入111^/1111 G0S,以无血清RPMI1640培养基为阴性对照组(Ctrl)，I μ g/mlLPS为阳性对照，刺激24h后，提取细胞总蛋白，通过Western Blot检测RAW264.7细胞中的iNOS蛋白水平，其结果如图3所示。
[0029]结果表明，与Ctrl相比，GOS能够激活RAW264.7细胞表达iNOS蛋白，并且差异性明显(图3)。
[0030]实施例4:G0S促进RAW264.7细胞产生ROS
[0031]RAW264.7细胞(5父105个/孔)贴壁于24孔板中，4_6h后，弃上清，加入lmg/mlG0S,以无血清RPMI1640培养基为阴性对照组(Ctrl)，I μ g/mlLPS为阳性对照，刺激24h。去除细胞培养液，加入5μ M DCFH-DA (二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯)孵育20min。然后去除上清，用RPMI1640培养基洗涤细胞2次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。最后用预冷的PBS (磷酸盐缓冲溶液)洗涤I次后，加入PBS吹打细胞，然后转移至流式细胞管中，置于流式细胞仪进行检测，激发波长488nm，发射波长525nm，其结果如图4A1~图4A3所示。
`[0032]应用DCFH-DA荧光探针，通过流式细胞术检测细胞内DCF的荧光强度，即可对单细胞内的ROS (活性氧族)进行原位实时检测，并根据荧光强度研究细胞内ROS的水平，其结果如图4B所示。
[0033]从流式仪直方图(图4A1~图4A3)及检测到的DCF荧光强度(图4B)可知，与Ctrl相比，小鼠巨噬细胞RAW264.7经GOS刺激后，检测到的ROS荧光强度增强，并且差异性显著，说明GOS能够促进RAW264.7细胞产生ROS。
[0034]根据上述实施例1~4，利用酶解法将来源于褐藻胶的PG酶解成G0S，进行促进巨噬细胞生成NO活性的研究，得出以下结论:
[0035]第一:G0S能够促进RAW264.7细胞生成NO，当刺激时间为24h时，NO的生成量最多，且呈浓度依赖性；
[0036]第二:G0S能激活RAW264.7细胞中iNOS基因的表达，且其作用呈时间依赖性和浓度依赖性；
[0037]第三:G0S能激活RAW264.7细胞中iNOS蛋白水平的表达；
[0038]第四:GOS能促进RAW264.7细胞产生ROS。
[0039]综上所述，本发明研究中首次发现GOS可激活巨噬细胞表达iNOS mRNA和蛋白，进而促进NO的生成，说明GOS可作为一种促进巨噬细胞生成N0、R0S等自由基分子的增强剂，从而为作为免疫激活剂的应用提供实验基础。NO的生成具有扩张血管，维持正常血压，防止心血管疾病；增强血液循环，改善性功能；调节胰岛素分泌，改善糖尿病症状；增强肌肉力量，增强人体体质等作用。GOS作为一种NO生成促进剂，同样可能具备以上作用，可以作为防治以上疾病潜在的新药和保健食品，具有广阔的市场开发前景。
[0040]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。`
【权利要求】
1.古罗糖醛酸寡糖的应用，其特征在于，将所述古罗糖醛酸寡糖用于制备一氧化氮生成促进剂。
2.根据权利要求1所述的古罗糖醛酸寡糖的应用，其特征在于，将所述古罗糖醛酸寡糖用于制备促进巨噬细胞生成一氧化氮的一氧化氮生成促进剂。
3.根据权利要求1或2所述的古罗糖醛酸寡糖的应用，其特征在于，所述一氧化氮生成促进剂为药物或保健食品`。
【文档编号】A61P1/04GK103550197SQ201310556772
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】续旭, 吴小婷, 王青青, 李森, 万敏 申请人:深圳大学