人重组肝刺激因子在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途
【专利摘要】本发明涉及人重组肝刺激因子在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。发明人用饱和脂肪酸诱导内质网应激以建立脂毒性肝细胞模型，观察到人重组肝刺激因子能够通过稳定内质网结构与功能来对抗内质网应激。HSS对肝细胞的保护作用与维持SERCAs活性有关，还发现HSS通过发挥自由基清除剂的作用而提高钙泵活性，减轻细胞内钙稳态失衡，从而发挥肝细胞保护效应。
【专利说明】人重组肝刺激因子在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域，具体而言涉及肝病的治疗，尤其涉及肝刺激因子(h印aticstimulator substance, HSS)在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。
【背景技术】 [0002]HSS是最初在1975年由LaBrecque和Pesch在初断乳大鼠肝细胞胞浆内发现并提取出的一种活性物质，因其具有特异性刺激活化状态下肝细胞(如新生动物肝脏，肝部分切除后残留肝脏，肝毒物损伤)增殖的特性，故将之命名为肝刺激因子。重组HSS蛋白质的纯化结果显不，它由125个氨基酸组成,分子量为15kDa。HSS是一种热稳定蛋白，抗酸、耐碱，但对蛋白酶极其敏感，反映出该因子具有蛋白质本性(LaBrecque DR和Pesch LA, 1975 ；Yang ZC等人，2007)。早期研究表明，HSS具有严格的器官特异性而无种属特异性，在体内外均可促进肝源性细胞和肿瘤细胞的增殖；促进肝切后残留肝组织的再生。
[0003]非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD)是一类慢性代谢性疾病，是指无过量饮酒史，以肝细胞内脂肪堆积为特征的临床病理综合症(Festi D，2004)。自1980年这一概念首次提出至今，NAFLD患病率在全球范围内几乎增加了一倍。目前在中国，NAFLD已经成为感染性肝炎之外的主要肝脏疾病(Szcwpaniak LS等人，2007)。临床上，NAFLD是一个肝脏病变的疾病谱，它包含单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝脏纤维化以及肝硬化。NAFLD早期病程可逆，如果早期未加以干预则NAFLD向肝脏纤维化以及肝硬化方向发展，此阶段为原则上不可逆的阶段。发生NAFLD时，肝脏损伤的基本特征是:肝内脂肪堆积，炎症细胞浸润，以及大范围肝细胞发生气球样变。肝细胞发生脂肪变性是NAFLD的最早期阶段，此阶段通常被称为肝脏的“第一次打击”。在这个阶段，游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)聚集在肝细胞内并发生脂质过氧化，产生大量的活性氧簇(reactive oxygen species, R0S)和自由基,又反过来又对肝细胞产生严重损害(称为“第二次打击”)。此外，FFAs的毒性还可增加肝脏对环境或遗传等因素的敏感性，最终导致肝脏不可逆性损伤。虽然NAFLD的病因尚不明确，越来越多的研究表明:内质网应激可能是脂肪酸脂毒性对肝细胞损害乃至诱发NAFLD的重要原因之一(Harmeet M，2008)。当毒物、药物等因素损伤细胞时，内质网腔内出现错误折叠蛋白和未折叠蛋白聚积，并由此而引发的以分子伴侣表达上调为特征的一系列应激反应，称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)。
[0004]内质网应激:内质网是细胞内最大的膜结构细胞器，主要参与调节细胞内蛋白合成、蛋白折叠和转运，内质网还参与细胞应激反应以及胞内钙离子调节。当细胞遭遇药物等毒物因素损伤时，细胞内钙稳态失衡、大量错误折叠和未折叠蛋白在内质网内聚积，由此而引发的以分子伴侣表达上调为特征一系列应激反应称为内质网应激。内质网应激在一定程度上可以抑制稳态的失衡，对细胞起到保护作用，但是当应激因素持续存在超过了细胞自我调节的范围时，内质网应激通过一系列应答反应会引导细胞走向凋亡，并伴随着细胞内脂质合成增加和炎症反应出现。
[0005]临床研究表明，NAFLD的患者肝脏中均有内质网应激的表现。肝细胞内聚集过多的脂肪酸发生脂质过氧化，产生大量的有害物质(如自由基分子和R0S)，这些有害物质不仅损伤内膜系统的结构和功能，也能诱导内质网发生应激反应(Gentile CL，2011)。ROS可直接攻击内质网膜上的钙泵(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+ATPase, SERCA),|丐泵损伤后会导致钙离子从内质网腔释放到胞浆中，引发未折叠蛋白和错误折叠蛋白在内质网腔中聚积，最终内质网稳态垮塌，诱导内质网途径细胞凋亡(Jiang Y,2011)o可见，内质网内钙稳态失衡是启动内质网应激介导的细胞凋亡过程中最关键的事件之一。因此，在NAFLD病程中，人们仍渴望能够使用某种药物对抗内质网应激来减轻或者延缓NAFLD的发展。
【发明内容】
[0006]根据本发明的一些实施方式，本发明提供了人重组肝刺激因子(human hepaticstimulator substance, hHSS)在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。 [0007]在具体的实施方式中，人重组肝刺激因子是CN200710008293.8中所描述的人重组肝刺激因子。
[0008]在具体的实施方式中，非酒精性脂肪性肝病选自:单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝脏纤维化以及肝硬化中的一种或多种。
[0009]根据本发明的一些实施方式，本发明提供了人重组肝刺激因子在制备用于改善非酒精性脂肪性肝病中内质网应激的药物中的用途。
[0010]在具体的实施方式中，改善非酒精性脂肪性肝病的内质网应激是指降低内质网应激标志蛋白的表达。内质网应激标志蛋白选自:GRP-78、SREBP-1C和P-PERK中的一种或多种。
[0011]在具体的实施方式中，改善内质网应激是指稳定内质网结构和/或形态。
[0012]在具体的实施方式中，改善内质网应激是指维持内质网钙稳态。
[0013]在具体的实施方式中，改善内质网应激是指缓解肝脏细胞凋亡。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1A:HSS的内质网定位。蛋白印迹实验显示内质网中存在HSS (HSS-Tr:转染HSS基因的BEL-7402细胞；PDI (蛋白质二硫键异构酶)为内质网的特异性标志蛋白，作为对照)。
[0015]图1B =HSS的内质网定位。第一排为野生型BEL-7402细胞；第二排为HSS-Tr (转染HSS基因的BEL-7402细胞)。免疫荧光显示HSS与内质网有共定位。
[0016]绿色:HSS ;红色:ER_Tracker ;黄色:共定位点；蓝色:DAPI。
[0017]图2A:棕榈酸(PA)诱导BEL-7402细胞的损伤。不同浓度PA作用细胞24小时后检测细胞生存率。HSS-Tr:转染HSS基因的BEL-7402细胞；vector-Tr:转染有空载体的BEL-7402 细胞。
[0018]图2B:PA诱导BEL-7402细胞的损伤。100 μ M PA作用细胞不同时间后检测细胞生存率。HSS-Tr:转染HSS基因的BEL-7402细胞；vector_Tr:转染有空载体的BEL-7402细胞，图中标尺为25 μ M。[0019]图2C和图2D:PA诱导BEL-7402细胞的损伤。尼氏红染色后通过共聚焦观察细胞内脂质堆积情况，图中标尺为10 μ M。
[0020]图2Ε和图2F:ΡΑ诱导BEL-7402细胞的损伤。尼氏红染色后通过电镜观察细胞内脂质堆积情况，图中标尺为10 μ Μ。
[0021]图2G:ΡΑ诱导BEL-7402细胞的损伤。细胞内的FFA含量。
[0022]图2Η:ΡΑ诱导BEL-7402细胞的损伤。细胞内的TG含量。
[0023]图3Α至图3C:对照试验中的内质网形态。图中箭头显示内质网管腔宽度和核糖体附着情况(HSS-Tr，转染HSS基因BEL-7402细胞；Vector_Tr，转染空载体BEL-7402细胞)。
[0024]图3D至图3F:PA诱导后的内质网形态。图中箭头显示内质网管腔宽度和核糖体附着情况(HSS-Tr，转染HSS基因BEL-7402细胞；Vector_Tr，转染空载体BEL-7402细胞)。
[0025]图3G:内质网应激标志蛋白GRP-78的检测。
[0026]图3H:内质网应激标志蛋白SREBP-1c的检测。
[0027]图31:内质网应激标志蛋白p-PERK的检测。
[0028](图3G 至 31 =HSS-Tr,转染 HSS 基因 BEL-7402 细胞；Vector_Tr，转染空载体BEL-7402 细胞；Mutant-Tr，转染突变体 BEL-7402 细胞)。
[0029]图4A:PA诱导损伤导致细胞内钙稳态失衡。NAC (N-乙酰半胱氨酸)和Na-DMPS(二巯基丙磺酸钠)预处理细胞I小时后加入PA或KCl作用30分钟，再用钙离子荧光探针Fluo-3AM标记胞浆内游离钙离子，荧光共聚焦显微镜观察观察细胞内钙储存和钙释放情况。
[0030]图4B:PA诱导损伤导致细胞内钙稳态失衡。KCl作用后细胞内质网钙负荷。
[0031]图4C:PA诱导损伤导致细胞内钙稳态失衡。钙离子波形经过公式(Λ R/R)换算为柱形图。
[0032]图4D:PA诱导损伤导致细胞内钙稳态失衡。内质网钙泵活性。
[0033](图4A至图4D:HSS_Tr，转染HSS基因BEL-7402细胞；Vector_Tr，转染空载体BEL-7402 细胞；Mutant-Tr，转染突变体 BEL-7402 细胞)。
[0034]图5A:流式细胞分析术检测胞浆内ROS含量。波峰右移提示荧光强度增加。横坐标代表FITC-A，纵坐标代表计数。图框内数值代表荧光强度。
[0035]图5B:流式细胞分析术检测胞浆内ROS含量。各组细胞相对荧光值统计结果。
[0036](图5A 至 5B =HSS-Tr,转染 HSS 基因 BEL-7402 细胞；Vector_Tr，转染空载体BEL-7402 细胞；Mutant-Tr，转染突变体 BEL-7402 细胞；Ctrl:对照。)
[0037]图6A、图6B和图6C:内质网应激介导的细胞凋亡，Hoechst33342显示细胞核形态变化及其统计结果。
[0038]图6D:内质网应激介导的细胞凋亡，凋亡细胞比例。
[0039]图6E:内质网应激介导的细胞凋亡，流式细胞分析术检测细胞凋亡结果。横坐标代表FITC-A，纵坐标代表P1-A。
[0040]图6F:内质网应激介导的细胞凋亡，凋亡细胞比例。
[0041]图6G:内质网应激介导的细胞凋亡，细胞内ATP含量的检测。
[0042](图6D 至 6G =HSS-Tr,转染 HSS 基因 BEL-7402 细胞；Vector_Tr，转染空载体BEL-7402 细胞；Mutant-Tr，转染突变体 BEL-7402 细胞；Ctrl:对照)。【具体实施方式】
[0043] 以下将结合附图和实施例对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅起说明而非限定的作用。本领域技术人员完全可以在本发明披露的具体实施方案中的技术上做出改进，但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明范围之内所做出的改进都将落入本发明的保护范围。如下实施例中所用野生型BEL-7402细胞、转染HSS的BEL-7402细胞和转染空载体的BEL-7402描述于中国专利申请CN200710008293.8，其并入此处作为参考。
[0044]实施例1.突变体HSS及其载体的制备
[0045]采用定点突变试剂盒(美国Stratagene公司),针对HSS —级肽链的保守基序第62位半胱氨酸和第65位半胱氨酸设计PCR引物，定点改变DNA的两个碱基类型，使第62位和第65位的半胱氨酸变为丝氨酸，原来的第62位半胱氨酸和第65位半胱氨酸形成的二硫键在突变体HSS蛋白质中无法形成，从而影响其生物学功能。
[0046]上游引物
【权利要求】
1.人重组肝刺激因子在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述人重组肝刺激因子是中国专利申请CN200710008293.8中的人重组肝刺激因子。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述非酒精性脂肪性肝病选自:单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝脏纤维化以及肝硬化中的一种或多种。
4.人重组肝刺激因子在制备用于改善内质网应激的药物中的用途，其中所述内质网应激是指非酒精性脂肪性肝病中发生的内质网应激。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述人重组肝刺激因子是中国专利申请CN200710008293.8中的人重组肝刺激因子。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述改善内质网应激是指降低内质网应激标志蛋白的表达，其中所述内质网应激标志蛋白选自:GRP-78、SREBP-1c和p-PERK中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的用途，其中所述改善内质网应激是指稳定内质网结构和/或形态。
8.根据权利要求4所述的用途，其中所述改善内质网应激是指维持内质网钙稳态。
9.根据权利要求4所述的用途，其中所述改善内质网应激是指缓解肝脏细胞的凋亡。
【文档编号】A61P1/16GK103566356SQ201310556743
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】安威, 张静, 李媛, 俞豪 申请人:首都医科大学