专利名称：从人造血干细胞分化的CD8α的制作方法
技术领域：
本发明涉及从人造血干细胞分化的淋巴树突细胞，从人造血干细胞分化淋巴树突细胞的方法和用于免疫治疗，含有作为活性成分的淋巴树突细胞的药物组合物。
背景技术：
树突细胞(DC)是强有力的抗原呈递细胞(APC)，其协调针对特定抗原的各种免疫反应，并且通过除去潜在自身反应性的T细胞同时抑制自身免疫反应。
鼠DC基于它们的解剖学定位，移植实验和细胞表面表型可以细分为至少两种独特的亚型，髓样DS和淋巴DC。具有CD11c+，MHCII+，CD4+，CD8α-细胞表面表型的DC被称为CD8α-髓样DC，它能够由骨髓前体细胞获得，而具有CD11c+，MHCII+，CD4-，CD8α+细胞表面表型的DC被称为CD8α+淋巴DC，它们存在于胸腺或脾脏中。
已经报道鼠CD8α+淋巴DC对类似IL-12的NK细胞(天然杀伤细胞)和T细胞反应也产生IFN-γ(Toshiaki等.，Brief Definitive Report，189(12)，1981-1986(1999))，而且，当将淋巴DC如鼠朗氏细胞注射入CD8α-小鼠中时，它们被转移至淋巴结并分化成为CD8α+DC，并且分化了的CD8α+DC能产生IFN-γ(Miriam等.，Blood，96(5)，1865-1872(2000))。
此淋巴DC不仅诱导免疫耐受，而且行使强有力免疫原性的APC的职责抵抗各种同种异型抗原，通过合成IL-12和IFN-γ激活辅助性T细胞I型反应。
DC实际上存在于身体的所有组织中，但浓度很低，因此对于来自体内的操作，要获得足够数量的DC是困难的和麻烦的。
因此，使用例如几种细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-4(IL-4)，肿瘤坏死因子(TNF-α)和干细胞因子(SCF)，已经进行各种努力从HSC或单核细胞大规模地产生来自体内的DC。通过使用GM-CSF产生了表达CD1a+，CD4+，CD11c+，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，I+类HLA，II+类HLA，CD3-，CD8-和CD14-的DC(Williams等.，Int.Rev.Cytol.，153412(1994)；Santiago-Schwarz等.，Nature，360258(1993)；和Rosenzwajg等.，Blood，87535(1996))。
然而，尚没有过报道CD8α+免疫表型的DC(CD8α+DC)在人体内存在，或者CD8α+DC能够从人造血干细胞(HSC)分化而来。
发明概述因此，本发明的首要目的是提供一种CD8α+免疫表型的淋巴树突细胞，其是从人造血干细胞分化而来。
本发明的另一个目的是提供一种从人造血干细胞分化淋巴树突细胞的方法。
本发明还有一个目的是提供用于免疫治疗的包含淋巴树突细胞的药物组合物。
本发明另一个目的是提供一种在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的方法。
按照本发明的一个方面，提供了CD8α+免疫表型的淋巴树突细胞，其是从人造血干细胞分化而来。
按照本发明的另一方面，提供了一种分化淋巴树突细胞的方法，该方法包括分两步培养人造血干细胞，第一步在含有GM-CSF的第一种培养基中，接着在含有IFN-γ的第二种培养基中。
按照本发明的另一个方面，提供了一种用于免疫治疗的药物组合物，其包括治疗有效量的树突细胞。
按照本发明的另一个方面，提供了一种在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的方法，它包括以对治疗该疾病有效的量将淋巴树突细胞对需要其的受试者给药。
附图简述本发明的上述和其它目的和特征从结合下述附图的本发明的下述描述中将变得明显，其中
图1A，1B和1C从人造血干细胞分化的淋巴树突细胞的光学显微镜(A)，扫描电子显微镜(B)和透射电子显微镜(C)照片；图2树突细胞数依赖于培养时间的变化图3A和3B说明淋巴树突细胞免疫表型的柱状图(A培养7天后的细胞；B培养14天后的细胞；x轴细胞数；y轴荧光强度；空心的柱状图(open histogram)阴性对照，填充的柱状图对于细胞表面抗原阳性的细胞组)；图4A和4B说明淋巴树突细胞免疫表型的柱状图(A仅染色CD3和CD4，B仅染色CD3和CD8α)；图5A，5B和5C吞噬FITC-标记的葡聚糖的能力(A对照；B培养1周后的细胞组；C培养2周后的细胞组；空心的柱状图阴性对照，填充的柱状图吞噬FITC-标记的葡聚糖的细胞组)；图6刺激T细胞增殖的能力(◆培养1周后的细胞组，■培养2周后的细胞组)；图7A和7BELISA(酶联免疫吸附测定)结果说明CD的IL-12(A)和IFN-γ(B)的合成能力(1用GM-CSF培养1周后产生的蛋白量；2用GM-CSF培养1周后，接着用IFN-γ培养一周后产生的蛋白量；3用GM-CSF培养1周并用IFN-δ培养一周，接着与添加的离子霉素培养1天后产生的蛋白量)发明详述本发明的CD8α+淋巴树突细胞具有CD1a-，CD3-，CD4-，CD8+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+的免疫表型。
CD8α+淋巴树突细胞可以通过两步培养造血干细胞来制备，第一步在含有GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的第一种培养基中培养合适的一段时间例如3-9天，接着在含有IFN-γ(干扰素-γ)的第二种培养基中培养，例如3-9天。
在本发明的方法中，可将GM-CSF和IFN-γ每2-4天，优选3天，加入到培养基中，加入量分别为1-1,000ng/ml和1-1,000U/ml，优选分别为20-200ng/ml和50-500U/ml。
为了增强成熟DC的分化，优选在第二阶段培养的较后部分向第二种培养基中加入离子霉素，脂多糖(LPS)或血蓝蛋白(KLH)，加入量为0.1-10μg/ml，优选1μg/ml，并培养直至第二培养时期结束，优选1天。
本发明的CD8α+淋巴树突细胞具有优势在于可以高产率生产白介素-12和IFN-γ；可刺激T细胞增殖；并且可以通过活化辅助性T细胞和细胞毒性T淋巴细胞诱导强有力的细胞免疫反应。
本发明的CD8α+淋巴树突细胞可以作为免疫治疗免疫相关疾病的药物组合物的活性成分使用。可以通过使用本发明的CD8α+淋巴树突细胞治疗的免疫相关疾病的非限制实施例，包括任何种类的恶性疾病，结核感染，HIV感染和自身免疫疾病。
预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物可以通过将本发明的CD8α+淋巴树突细胞与药用赋形剂或载体混合来制备，或按照任何常规程序通过将其用药用稀释剂稀释来制备。合适的载体，赋形剂和稀释剂的实例是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，水和矿物油。制剂可另外包括填料，抗凝集剂，防腐剂等。可通过使用本领域熟知的任何程序来配制本发明的药物组合物，以便在将它们对哺乳动物给药后，提供活性成分的迅速，持续或延迟的释放。因此，制剂可以是无菌的可注射溶液，混悬液，乳剂，溶液等形式，其中无菌可注射溶液是优选的。
因此，本发明还提供一种在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的方法，其包括以对治疗疾病有效的量对需要其的受试者给药本发明的CD8α+淋巴树突细胞。
可用常规免疫治疗方法对患者给药本发明的CD8α+淋巴树突细胞。具体地，从患者身上取得自身细胞并培养以获得具有免疫增强作用的DC，并且用靶抗原脉冲(pulse)DC。在这个过程中，为了提高DC的免疫增强作用，可存在放射物或紫外处理过的癌细胞、通过冷冻-熔化或细胞毒性药物杀死的癌细胞裂解物的条件下脉冲DC。另一个方法是使用DNA，RNA，蛋白或多肽作为抗原脉冲DC。用特定抗原脉冲的DC可直接注入患者，或可注射由本发明DC激活的T细胞。另外，为了增强治疗效果，优选与IL-2一起注射本发明的DC。
可通过各种路径给药本发明的细胞组合物，包括透皮的，皮下的，静脉内的和肌内引入，和直接注射入癌症区域。
CD8α+淋巴树突细胞的典型单位剂量可在1×107-1×109细胞的范围内变动，并且它们可以以每周或每月的形式给药，给药6个月。然而，应该了解实际给药的活性成分的量应该按照各种相关因素确定，包括治疗的疾病，患者症状的严重性，选择的给药路线，年龄，性别和个体患者的体重；因此，不应以任何方式用上述剂量意图限制本发明的范围。
使用本发明的药物组合物的免疫治疗是有利的，因为由于使用从患者造血干细胞分化的树突细胞，不发生免疫排斥，还因为注射进身体的树突细胞能不断产生细胞因子。
发明的药物组合物诱导针对由特定抗原引起的疾病的强烈的细胞免疫-反应，刺激T细胞增殖，并且它可以在抗癌和抗病毒治疗中被有益地使用。
下述实施例意图进一步举例说明本发明而不限制其范围；除非另外声明，在本发明中使用的实验方法可以按照这下面给出的实施例实施。
另外，除非另外特殊说明，下面给出的固体在固体混合物中，液体在液体中和固体在液体中的百分比分别是基于重量/重量，体积/体积和重量/体积。
实施例1提取造血干细胞和产生树突细胞为了使外周血干细胞(PBSC)活动，将粒细胞集落刺激因子(G-CSF，Lenograstim，chugai，Co.，Tokyo，日本)以300μg/天的剂量分别皮下注射入10位患不同肿瘤疾病(乳腺癌，白血病，淋巴瘤)的患者中。在注射4天后，按照白细胞提取的方法，使用Cobe Spectra(Cobe BCT，Inc.，Lakewood，CO，美国)细胞分离器提取外周血干细胞。使用Ficoll-Hypaque(Histopaque，Sigma Chemical，St.Louis，MO，美国)，按照密度梯度离心的方法，从如此获得的外周血干细胞中分离单核细胞，并用磷酸盐缓冲的盐水(PBS，Sigma Chemical)洗涤两次。在含有5％小牛血清蛋白(BSA)的PBS中用30μm的尼龙网膜过滤该单核细胞。收集单核细胞，加入FcR封闭剂，与CD34微球(Miltenyi Biotec GmbH)在4℃反应30分钟，用含BSA的PBS洗涤，让细胞通过网孔，并通过高梯度免疫磁性分离法(HGIS；MidiMACS，Mitenyi biotech，美国)分离CD34+单核细胞。将1×105/ml分离的CD34+外周血干细胞在X-VIVO 20培养基(Biowhittaker，Walkersville，MD，美国)中培养两周，所述培养基中含有5％的人血清白蛋白，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素(Sigma)，100U/ml的L-谷氨酰胺(Sigma)，同时在第一周每三天加入50ng/ml的GM-CSF(Leucogen，LG Chemical Co.，韩国)，接着在第二周每三天加入200U/ml的IFN-γ(Intermax-γ，LG Chemical Co.，韩国)。在第13天，即第二周结束的前一天，向培养基中加入1μg/ml的离子霉素(Sigma)并培养1天以使细胞成熟。
如图1所示，培养的细胞具有相对丰富的细胞质，所述细胞质具有多个树突(Giemsa-Wright stain)。在培养早期，细胞集群并且在培养瓶的表面聚结，但在培养第二周加入IFN-γ时开始分离并且繁殖。另外，如在扫描和透射电子显微镜中可见，细胞展现了DC的特征核被移至区域的一边；在细胞表面存在多个树突；并且丰富的细胞质具有许多颗粒。
另一方面，为了检验树突细胞数培养时间-依赖性的增加，通过血细胞计数器检验1ml的一周和两周后的培养溶液的样品。
如图2所示，总细胞量在培养期内，特别时在加入IFN-γ之后连续增长。在第14天，培养的最后一天，细胞量约为30×105/ml，比初始细胞量高约30倍。
实施例2检验分化的DC的免疫表型为了证实培养的DC的免疫表型，在暗室中，在含5％FBS(胎牛血清(fatal bovine serum))的PBS溶液中，于室温下，将1×105细胞与荧光素异硫氰酸酯或藻红蛋白标记的特定单克隆抗体反应15分钟，该单克隆抗体是针对CD1a，CD3，CD4，CD8α，CD11c，CD14，CD80，CD83，CD86，I类HLA(ABC)，II类HLA(DR)(Pharmingen，San diego，CA，美国)，得到的溶液再用PBS洗涤，然后用流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson)分析。
如图3A和3B所示，在培养的第7天，细胞表达CD1a，CD11c以及CD40，CD54，CD80，CD86和I/II类HLA。然而，CD83+，成熟DC的标记，微弱的表达。离子霉素的加入将CD1a和CD14转变为阴性表型，并且CD83+表型的细胞增加。另外，如图4A和4B所示，细胞展示CD3和CD4的阴性表型，而CD8α表型是阳性的。
这些结果暗示，从人造血干细胞分化的淋巴树突细胞是表达CD1a-，CD3-，CD4-，CD8α+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+，以及最令人感兴趣的CD8α+的淋巴DC。
实施例3证实CD8α+DC的吞噬能力为了确认分化DC的吞噬能力，将2×105DC在没有FBS的情况下与葡聚糖-FITC(Sigma)在37℃混合孵育1小时。然后，用流式细胞仪检验吞没葡聚糖的细胞。
如图5B和5C所示，CD8α+CD具有高吞噬能力。另外，在培养的第14天，进一步增强吞噬能力。在4℃的对照实验(5A)显示观察到的本发明的CD8α+CD的吞噬活性是真实的，不是由测量条件产生的人为结果。
实施例4检验CD8α+CD在淋巴细胞增殖中的诱导能力(inductingability)为了检验DC刺激T细胞增殖的能力，如下进行异源混合淋巴细胞反应(MLR)。
使用Ficoll-Hypaque(Histopaque；Sigma Chemical，St.Louis，MO，美国)，按照密度梯度离心方法从正常的志愿者的血液中分离外周单核细胞(MNC)，并用PBS洗涤。室温下，将如此获得的3×108MNC在人T细胞富集柱(R&D，美国)中孵育10分钟，用PBS提取T细胞。然后，将γ-射线照射过的(30Gy)DC和T细胞(效应物∶反应者)以1∶1，1∶10，1∶102，1∶103和1∶104的不同比例加入到微量培养板，一式三份，接着37℃孵育3天。向其中加入20μl的BrdU(5-溴-2’-脱氧尿苷)并且再孵育24小时。向培养板中加入甲醛，并在室温下反应30分钟以固定细胞，向培养板中加入100μl抗-BrdU溶液，允许在室温下反应90分钟。然后，用PBS洗涤培养板，并与显色底物反应30分钟。向其中加入1N H2SO4以终止反应，并用ELSA培养板读数器(Molecular device，美国)测量450nm的吸光度。
如图6中的结果显示，观察到在1∶104(效应物∶反应者)的比例下，T细胞增殖的爆发。这说明淋巴DC在功能上可以刺激T淋巴(lymphoid)的增殖。
实施例5确认淋巴DC释放细胞因子如下通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量细胞的释放细胞因子的能力。
将抗-人IL-12和IFN-γ抗体(Pharmingen)在0.1mol/l的NaHCO3中稀释至2μg/ml，将50μl获得的溶液分到ELISA培养板(Corning)，在4℃孵育24小时。加入含5％FBS的PBS以封闭培养板3小时。向其中加入50μl的标样和50μl培养7天，13天和14天的每种培养液，并反应4小时。
将2μl/mg的生物素-偶联的检测抗体加入到培养板中并反应3小时。洗涤培养板，并用链霉抗生物素辣根过氧化物酶溶液(稀释至1∶2000)处理1小时，再次洗涤，然后用TMB(Zymed，San Francisco，CA，美国)处理，接着用ELISA微量培养板读数器(Molecular device，USA)测量450nm的吸光度。
如图7A和7B中的结果显示，产生的细胞因子的量一直到第13天都非常低，但在加入离子霉素后跳到高水平。
虽然关于上述具体的实施方案已经描述了本发明，但应承认那些本领域的技术人员可以对本发明进行各种修改和改变，这些修改和改变也属于如后附的权利要求所限定的本发明的范围内。
权利要求
1.一种CD8α+免疫表型的淋巴树突细胞，它是由人造血干细胞分化而来。
2.权利要求1的淋巴树突细胞，它具有CD1a-，CD3-，CD4-，CD8α+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+的免疫表型。
3.权利要求1的淋巴树突细胞，它能够诱导产生白介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)。
4.一种分化权利要求1的淋巴树突细胞的方法，该方法包括分两步培养人造血干细胞，第一步在含有GM-CSF的第一种培养基中，接着在含有IFN-γ的第二种培养基中。
5.权利要求4的方法，其中每2-4天分别以1-1,000ng/ml和1-1,000U/ml的量向所述各自的培养基中添加GM-CSF和IFN-γ。
6.权利要求4的方法，其还包括在所述第二步培养的过程中，向所述第二种培养基中加入0.01-10μg/ml的离子霉素，脂多糖(LPS)或血蓝蛋白(KLH)的步骤。
7.权利要求4的方法，其中所述淋巴树突细胞的免疫表型是CD1a-，CD3-，CD4-，CD8α+，CD11c+，CD14-，CD40+，CD54+，CD80+，CD83+，CD86+，HLA-I+和HLA-II+。
8.权利要求4的方法，其中所述淋巴树突细胞能够诱导产生白介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)。
9.一种用于免疫治疗的药物组合物，它包括治疗有效数量的、权利要求1至3任一项的树突细胞。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述免疫治疗是一种抗癌或抗病毒治疗。
11.一种在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的方法，它包括以对治疗疾病有效的量将权利要求1至3任一项的淋巴树突细胞对需要其的受试者给药。
全文摘要
用一种方法可以生产具有CD8α
文档编号A61P37/04GK1543502SQ02807665
公开日2004年11月3日 申请日期2002年3月28日 优先权日2001年3月29日
发明者金炫寿, 李京福, 金孝哲 申请人:金炫寿