专利名称：用于治疗血管性、炎性和免疫疾病的一氧化碳生成性组合物的制作方法
相关申请的声明本申请要求于2001年3月30日提交的美国临时专利申请第60/280,526号的优先权。
背景技术：
免疫系统是一种细胞和组合物的极为复杂的结合，其保护哺乳动物宿主(host)对抗多种多样的病原体，同时监视机体内的有害畸变，例如瘤形成。免疫系统的一个分支涉及各种执行免疫系统功能的细胞，包括(a)淋巴细胞，如骨髓衍生的B淋巴细胞、胸腺衍生的T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞、以及(b)单核吞噬细胞，包括单核细胞和巨噬细胞。由于具有特异性地识别和区分抗原决定簇的能力，淋巴细胞主要与特异性免疫应答有关，而单核吞噬细胞常常通过吞噬作用以及直接由微生物自身诱导的或对被抗原刺激的T细胞起反应而来的细胞因子的产生和分泌参与外来微生物的全面清除。淋巴细胞和单核吞噬细胞的功能高度相互关联并且对正常的免疫系统功能而言是必需的。
诸如各种干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、化学因子、造血生长因子、和迁移抑制因子这样的细胞因子是由免疫系统中的不同细胞类型产生的不同蛋白簇(group)。最重要的是，细胞因子是通过各种淋巴细胞和单核吞噬细胞响应各种刺激而产生和/或起反应。就大多数情况而言，细胞因子在自然和特异性免疫的效应期产生，并且起到调节和控制免疫和炎性反应的作用。像其它的多肽激素一样，细胞因子通过结合到靶细胞表面的特异性受体而引发其作用，其激活经常导致炎性反应。
虽然免疫应答和细胞因子诱导产生的炎性反应的激活对宿主的健康和免疫系统的正常功能极为重要，但在大多数情况下这种激活是不希望有的。一个特殊的方面是，细胞因子介导的炎性反应功能对宿主的健康造成不利影响，例如与诸如感染性休克、类风湿性关节炎、克隆氏症(Crohn’s症)、结肠炎等有关的炎性反应。另一种情况是，当细胞毒T淋巴细胞(CTLs)攻击那些MHC和相关的肽都是内源性的细胞时出现CTLs部分异常，与发生诸如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)这类自身免疫疾病一样。另一种情况与移植有关，其中很少在供体和受体之间存在相同的主要组织相容性复合体(MHC)抗原的匹配。
在细胞毒T淋巴细胞(CTLs)的激活并非所希望的情况下，免疫抑制成为一种常用的解决办法。然而，免疫抑制剂如环孢菌素A、FK506等有很多不希望得到的副作用。另外，多种方法已应用于控制或抑制炎性反应，然而这些方法中大多数也有一种或多种不希望得到的作用。因此，主要对鉴定新型药剂感兴趣，该新型药剂可对淋巴细胞，特别是CTLs的激活起抑制作用，并且对免疫系统的普遍免疫抑制作用少且副作用小，以便保留相当比例的免疫系统以保护宿主(host)免受外来感染。同样对鉴定具有控制或抑制不良炎性反应功能的新型药剂也引起很大兴趣。
血红素加氧酶(HO)是可催化血红素向胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁的转化过程(血红素向胆红素氧化性转化的第一步)中的限速酶。HO-2是呈现于生理条件下的结构异构体(constitutiveisoform)，而HO-1为可提供保护对抗氧化损伤的可诱导异构体。近来，HO-1对包括缺血性和致免疫效应的氧化应激和损伤的细胞应答的作用引起了极大兴趣。已经发现HO-1表达的上调(upregulation)或诱导可产生多种有效的抗炎和免疫抑制作用，其中包括同种移植存活期的延长和移植体对宿主疾病的缓解。
更近期，Otterbein等人在Nature America 6(4)422-28(2000)提出一氧化碳与HO-1一样可介导很多或全部抗炎作用。它们的资料表明一氧化碳可选择性地抑制促炎症反应细胞因子TNF-α、IL-1β、和MIP-1β的表达，并可能增加抗炎性细胞因子IL-10的产生。来自这些研究者的后续资料提出HO-1在防止移植体排斥中的保护性作用可能通过一氧化碳的产生介导。因此，对开发基于一氧化碳的方法很有兴趣，该方法用于治疗不同表现的炎性疾病并且用于改善移植成果，包括慢性排斥，其中一种药物可通过自身或合用其它药物起作用。
血红素加氧酶通路(pathway)也在调节和维护血管紧张度，以保证充足的组织氧合作用及灌流方面发挥关键作用。血管细胞通过诱导内源性抗氧化防御机制来应对氧化应激的环境。在生理条件下的主要的细胞内调节因子为内皮衍生的一氧化氮(NO)，一氧化氮通过对以鸟苷酸环化酶激活实现的血管平滑肌细胞内环鸟苷3’，5’-单磷酸盐(cGMP)水平的调节来维持正常血管紧张度。在诸如缺氧或粥样化这类的一氧化氮产生受损的情况下，血红素加氧酶的诱导可通过抗氧化性的胆红素和血管舒张剂一氧化碳的形成，为抗氧化提供重要的第二道防线。
近期的报告提出在这种情况下VSMC衍生的一氧化碳可能在血管内皮和平滑肌细胞中取代(其它因素)成为基因表达和cGMP水平的调节因子。参见Morita等的J.Clin.Investigation(临床调查杂志)962676-2682(1995)；Siow等的Cardivascular Res.(心血管研究)41385-394(1999)。尤其，一氧化碳通过一个cGMP机制被确定为VSMC的舒张剂，在内皮细胞中，能抑制内皮素-1(ET-1)和血小板衍生的生长因子B的基因表达从而抑制平滑肌细胞的增殖。通过对E2F-1(一种涉及细胞周期进展的转录因子)基因表达的抑制，一氧化碳对VSMC增殖也具有不依赖于内皮细胞的作用。参见Morita等的J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272(52)32804-9(1997)。
因此，血红素加氧酶通路(pathway)产生的内源性一氧化碳也防止VSMC过度增殖，它是包括动脉硬化、内膜增殖和肺动脉高血压等许多心血管疾病发病的主要起因。VSMC的增殖和积聚也与由诸如因气囊(balloon)损伤而致剥脱的这类动脉损伤引起的新生内膜形成有关。参见Togane等的Am J.Physiol.Heart Circ.Physiol.278H623-H632(2000)。气囊损伤导致几种血管活性因子的产生，包括ET-1，并且将VSMC层直接暴露给血流中的红细胞，这可能改变血管壁中的剪切力和氧化还原状态。一氧化碳抑制新生内膜形成，因此对动脉损伤具有重要的保护作用。
然而，不幸的是目前缺少一种可行的和可预测的治疗模式来增加细胞碳氧血红蛋白水平。考虑到长期吸入外源性一氧化碳有毒性，迫切需要找到对系统或局部碳氧血红蛋白水平有很好调节作用的替代模式，作为与用于预防和治疗感染性、免疫、和血管性疾病的方法一样的需求。这些模式可在与其它药物合用中派上用场，在这种情况下可将有明显副作用的其它药物以低剂量进行有效应用，以便减少有害的副反应。还对开发用于减小动脉硬化危险和减少诸如气囊血管成形术(ballon angioplasty)这类的与可导致动脉管壁损伤的外科手术过程有关的并发症的新方法引起很大兴趣。本发明致力于解决所有这些所关心的问题。
相关文献的简述血红素加氧酶已经成为许多研究的对象，其可在综述文章中得以证实，Abraham等的Int.J.Biochem.20(6)543-558(1988)，及Raju和Maines，Biochimica et Biophysica Acta 1217273-280(1994)、Neil等的J.of Ocular pharmacology and Therapeutics11(3)455-468(1995)、Haga等的ibid 131629-34(1996)、Willis等的Nature Medicine 2(1)87-90(1996)、以及Agarwal等的Transplantation61(1)93-98(1996)。
血红素加氧酶活性的调节已经披露于美国专利第5,756,492号及第6,060,467号和国际PCT公告号WO 00/36113、以及Woo等的Transplantation 69(4)623(2000)、DeBruyne等的Transplantation69(1)120(2000)、Amersi等的J.Clin.Invest.104(11)1631-39(1999)、Cuturi等的Mol.Med.5(12)820(1999)、Brouard等的Transplantation67(12)1614-31(1999)、Hancock等的Nature Med.4(12)1392-96(1998)、Squiers等的Transplantation 661558-65(1998)、Woo等的Transplant.Immunol.6(2)84-94(1998)、及Iyer等的J.Biol.Chem.273(5)2692-97，其披露的内容均结合于此处作为参考文献。
更近期，Otterbein等已经提出一氧化碳具有包括有丝分裂原激活的蛋白激酶通路的抗炎作用。参见Nature America6(4)422-428(2000)，而Sato和同事们已经证实外源性一氧化碳可替代血红素加氧酶用于防止移植排斥反应，参见J.Immunol.1664185-94(2001)、以及Brouard和同事们则已经证实一氧化碳可抑制内皮细胞的凋亡，参见J.Exp.Med.192(7)1015-25(2001)。
关于血管性疾病中的血红素加氧酶的诱导，参见Siow等的supra.，其综述了在动脉粥样化形成(atherogenesis)中的血红素加氧酶、一氧化碳、和胆红素的作用。Togane等报道了由动脉损伤引起的新生内膜发展中内源性一氧化碳的保护性作用，而上述Duckers等提出在血管损伤的情况下，即使没有组织缺氧，HO-1的抗增殖作用也具有保护性，参见Nature Med.7693-698(2001)。
发明内容
本发明提供使用一氧化碳生成性化合物用于治疗血管性、炎性、和免疫疾病的方法和组合物，该一氧化碳生成性化合物能够在体内经代谢产生一氧化碳。在优选具体实施例中，该一氧化碳生成性化合物为二氯甲烷(CH2Cl2)，其可在活体内被代谢为CO和CO2。
在一个具体实施例中，本发明提供一种用于治疗哺乳动物血管性、炎性、和免疫疾病的药物组合物，包括在所述哺乳动物中能够增加碳氧血红蛋白水平的一氧化碳生成性化合物。在优选具体实施例中，该一氧化碳生成性化合物包含二氯甲烷。在一个尤为优选的具体实施例中，本发明提供一种用于增加哺乳动物碳氧血红蛋白水平的药物组合物，包括在制药上可接受赋形剂(vehicle)的二氯甲烷。还提供了一种用于提高哺乳动物碳氧血红蛋白水平的方法，包括将诸如二氯甲烷这样的一氧化碳生成性化合物给予所述哺乳动物，其剂量足以提高血中碳氧血红蛋白水平至在约1-10％之间，更好为在约2-9％之间，最好为约在3-8％之间，通常在约3-10％之间。
在另一个具体实施例中，本发明提供用于调节整个机体炎性和免疫应答过程的方法和组合物。所述化合物能够调节各种免疫系统细胞的活性，抑制促炎性细胞因子(pro-inflammatory)的产生并增强抗炎性细胞因子的产生，从而在治疗与不良炎性反应有关的疾病时有效。
本发明还提供了用于延长器官移植体在受体中存活时间的方法，其中该方法包括将一氧化碳生成性化合物提供给所述受体，该一氧化碳生成性化合物起到调节针对器官移植体的免疫应答，因此器官移植体在受体中的存活时间得以延长。本发明中的一氧化碳生成性化合物可以通过任何方便的方法给予待移植的离体(ex vivo)器官或在体(in vivo)器官，包括母体、全身、或局部给药，并要给予足够的剂量以通过调节抗炎性和促炎性反应细胞因子的产生来充分抑制淋巴细胞的激活及引起炎症的过程。
在脉管系统中，所述化合物能够调节血管紧张度、抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、以及对氧化应激和组织缺氧起保护作用，对血管紧张度、内皮的通透性、和凝血功能有深刻的影响。所述一氧化碳生成性化合物将在治疗血管增殖疾病和其它与对氧化应激起反应的HO-1诱导有关的疾病中使用。
在一个具体实施例中，提供用于抑制新生内膜形成和改善侵入性血管过程成果的方法，包括向一位经受一个要求或涉及诸如气囊血管成形术这样的动脉损伤的病人给予对新生内膜发育有保护作用的一氧化碳生成性化合物。在另一个具体实施例中，所述一氧化碳生成性化合物用于防止动脉粥样化形成，或用于防止脉管系统中的特异性氧化性事件的反应中，或预防性地用于高危患者，如那些低密度脂蛋白(LDL)水平高而被认为将陷于动脉粥样化形成的患者。本发明中的一氧化碳生成性化合物可以通过任何方便的途径给药，包括母体、全身、或局部给药，需有足够剂量来充分抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和调节血管对氧化应激的应答。
另外的具体实施例在本说明书的阅读时将会变得明了。
图1A、1B和1C为使用或不使用500ppm气态一氧化碳进行LPS处理的小鼠体内血清TNF-α、碳氧血红蛋白、和O2Hb水平的图解。
图2为二氯甲烷给药对LPS诱导的TNF-α产生的影响的图解。
图3为二氯甲烷给药对血中碳氧血红蛋白水平的影响的图解。
图4为外源性一氧化碳对在离体大鼠肝脏经再灌注的冷缺血模型中门静脉阻力的影响的曲线图。
图5为外源性一氧化碳对在离体大鼠肝脏经再灌注的冷缺血模型中的胆汁产生的影响的曲线图。
图6所示为外源性一氧化碳对中性白细胞(neutrophil)活性影响的曲线图，其是在离体大鼠肝脏经再灌注的冷缺血模型中通过髓过氧物酶测定法进行测量的。
图7所示为外源性一氧化碳对在离体大鼠肝脏经再灌注的冷缺血模型中的COHb水平的影响的曲线图。
图8所示为在添加或不添加L-NAME(一种可诱导的一氧化氮抑制剂)、或LY-83583(一种cGMP类似物)、或用ZnPP(一种HO-1抑制剂)进行预处理的情况下，外源性一氧化碳对在离体大鼠肝脏经再灌注的冷缺血模型中的胆汁产生的影响的曲线图。
图9所示为在添加或不添加SB203580(一种p38 MAPK抑制剂)的情况下，外源性一氧化碳对在离体大鼠肝脏经再灌注的冷缺血模型中的胆汁产生的影响的图解。
图10所示为在暴露于Yac-1和用Ad-CD95+Ad-HO-1(实柱)和AD-CD95+Ad-β-gal(空柱)转染的Hela细胞后对携带Fas(Fas-bearing)的YAC-1靶细胞的体外(in vitro)细胞毒性的图解。
图11所示为在大鼠主动脉模型中经口服二氯甲烷给药后全身碳氧血红蛋白(COHb)水平的药物代谢动力学研究的曲线图。
图12所示为移植后第30天，在经对照物(Add1324)、Ad-HO-1、或二氯甲烷处理时同源和同种异体大鼠主动脉移植体的计算机辅助内膜厚度的形态测量的图表。
图13为说明受体动物的主动脉同种异体移植体经AdHO-1或CO处理的同种异体抗体水平的曲线图。
图14所示为在大鼠的胶原关节炎模型中的对照和经MC处理的关节炎评分的图表。
具体实施例方式
在本文中提供了用于在体外和体内通过使用一氧化碳生成性化合物治疗血管性、炎性和免疫疾病的方法和组合物。正如本文中所指出的，在体外和体内，被试化合物能够介导HO-1的细胞保护活性。因此，该被试化合物可用于模拟抗炎作用和其它伴随HO-1上调的保护作用。
在一个优选具体实施例中，本发明中的一氧化碳生成性化合物用于调节血管紧张度、抑制VSMC增殖和防止氧化应激，因此也对治疗各种诸如动脉粥样化形成、再狭窄、心脏压力或容积的超负荷、高血压、蛛网膜下腔出血、新生内膜形成和发育、血管收缩、肺水肿、和静脉循环中血栓形成这类的疾病有益。
在一个具体实施例中，提供了用于抑制新生内膜形成和改善侵入性血管过程的成果的方法，包括向一位经历诸如气囊血管成形术这样的涉及动脉损伤的过程的患者给予对新生内膜发育起保护作用的一氧化碳生成性化合物。在另一个具体实施例中，所述一氧化碳生成性化合物用于防止动脉粥样化形成、或用于对特异性氧化性事件的反应中、或预防性地用于高危病人，例如将那些低密度脂蛋白(LDL)水平高认为将陷于动脉粥样化形成的人。
另一个优选具体实施提供用于在体外和在体内情况下调节炎性和免疫应答过程的方法和组合物。本发明中的一氧化碳生成性化合物可用于抑制炎性细胞因子的产生并增强，包括TNFα、诸如干扰素-γ这类的干扰素、诸如IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、MIP1α这类的白细胞介素、化学因子、造血生长因子等这类的抗炎性细胞因子的产生，因此可用于在体外和在体内情况下抑制与各种诸如类风湿性关节炎、感染性休克、克隆氏症(Crohn’s disease)、结肠炎、多发性硬化、肉芽肿性炎症、肝炎、过敏反应、自身免疫疾病、缺血/再灌注损伤等这类的疾病有关的炎性反应，并且延迟有潜在胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)风险的患者中IDDM的发作。在一个尤为优选的具体实施例中，发现该被试化合物可用于治疗类风湿性关节炎、改善器官移植(如肾脏、肝脏、心脏等)的成果、和防止缺血/再灌注损伤。
在体内和在体外情况下，上述一氧化碳生成性化合物将在导入其的宿主或样本中发挥调节炎症和/或免疫应答。通常该调节作用将通过抑制促炎性反应细胞因子表达和/或提高抗炎性细胞因子的产生来作为例子。决定这些细胞因子表达水平的可靠且敏感的检测方法为人熟知并且在商业上可从诸如在加利福尼亚州Camarillo的BioSource International公司等获得。
“一氧化碳生成性化合物”是指那些通过代谢转化成一氧化碳的化合物和其它生物适合的(biocompatible)分解产物。在一个优选具体实施例中，一氧化碳生成性化合物是二氯甲烷(MC)，它通过细胞色素P-450氧化系统专一地被代谢成一氧化碳和二氧化碳。参见Gargas等的Toxicol.Appl.Pharmacol.87211-23(1986)、Andersen等的Toxicol.Appl.Pharmacol.87185-205(1987)。例如二氯甲烷，这些化合物代谢产生的一氧化碳将在体内结合到血红蛋白中，以便将患者的碳氧血红蛋白的水平提高到治疗范围。优选一氧化碳生成性化合物以足以将患者的全身(即血中)COHb水平提高到约1-10％的剂量给予患者，更好为2-9％，最好为3-8％，一般情况下为3-10％。针对全身监测以及个别组织和器官的监测，所得到的COHb水平监测可使用灵敏的检测方法很容易地实现，这些方法对于熟练技术人员是已知的且是可利用的。参见例如Wong等的Trans.Am.Clin.Climatol.Assoc.111(1)61-75(2000)。
该被试的一氧化碳生成性化合物可依照给药的性质和目的、所治疗的特异性的炎性疾病、特别的生成性化合物、给药次数、其它药物的参与或应用等情况以多种方式配制，而这些由本领域的熟练技术人员凭经验确定。通常该配制将以生理上可接受的形式，并且可包括不同的载体或溶剂如水、去离子水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇水溶液、葡萄糖、丙二醇、植物油、橄榄油等。就某些情况而言，可将该被试的一氧化碳生成性化合物配制成为缓释剂型，其中该被试化合物可被封装于各种各样的载体中，可以胶囊或药物前体给药。该剂型还包括细菌制剂、稳定剂、缓冲剂等。
该被试的一氧化碳生成剂也可用于对其它抗炎化合物(如甾体类、非甾体类抗炎制剂(NSAIDS)、单克隆抗体如Remicade、细胞因子拮抗剂、或抑制剂如Enbrel(TNF抑制剂)等)、或免疫抑制药物(如环孢菌素Prograf(FK-506)、酶酚酸酯(mycophenolate)、单克隆抗体如Simulect、Zenapax或其它生物制剂如Thymoglobulin、Lymphoglobuline等)的辅助治疗，在这样的情况下可减量用药，一般从所建议治疗剂量减量至少25％，更经常至少40％或更多。被试化合物结合其它可用于本文讨论的特定疾病适应症的制剂(如抗生素、抗代谢物或其它细胞毒性制剂、人类白细胞抗原、环氧化酶抑制剂、脂质改善(lipid-altering)制剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACE)或其它血管扩张剂、柳氮磺胺吡啶、及其相关的化合物等)。
被试的生成性(generator)化合物可以在体内、离体、或体外给药，并且可由母体或口服摄取，一般是血管内、皮下、静脉、或肌肉内给药。就在体内给药而言还包括，但不局限于通过导管或其它灌注方法直接注入相关的或被不良的增殖性、炎性或免疫应答影响的脉管、器官、或组织的其它方法。被试化合物可于邻近如移植器官或发炎组织的部位经血管给药或全身给药。在本领域的普通技巧之一是认清每一种给药方式的优点和缺点，并且能够不用过多的试验即可确定令人满意的给药方式和服药法(delivery regimen)。
给药剂量将依照给予何种药物、给药的目的(如预防或治疗)、宿主状态、给药方式、给药次数、和给药间隔等而变化，所有这些条件可由本领域熟练技术人员通过经验来确定。应用这些因素，剂量一般在约5-500mg/kg的范围内。经母体给药时，被试的一氧化碳生成性化合物的日总剂量一般在约1-500mg/kg的范围内，通常更好在约1-100mg/kg范围内，最好优选在1-10mg/kg的范围内。
该剂量可单次给予或可分次给予以使宿主体内的一氧化碳在一段时间内维持所需水平，并将依据被试化合物的代谢转化率进行调整。以二氯甲烷为例，只有约50-80％的化合物转化成一氧化碳。因此，给予10-500mg/kg的二氯甲烷一般将在活体产生3-165mg/kg的一氧化碳。有关这些化合物药物动力学和代谢特点的信息已被行业内所熟知且可被专业领域的熟练技术人员所获得，来用于确定合适的剂量。例如，参见Angelo等的J.Pharmacokinetics andBiopharmaceutics 12(4)413-435(1984)。
在本文中二氯甲烷是尤为优选的具体实施例，因为它有近于线性的剂量反应关系，所以给熟练技术人员提供控制COHb生成的程度，以便使COHb水平维持在所需的治疗量范围内。因此，二氯甲烷提供了超过其它治疗模式的相当多的优势，因为其剂量反应关系的可预测性使维持COHb的治疗水平同时避免与严重一氧化碳中毒有关的毒性如碳氧血红蛋白血症。在人体内，二氯甲烷优先口服给药，剂量在约1-100mg/kg，更好在约1-80mg/kg，最好在约1-60mg/kg，一般在约1-30mg/kg。
如上所提示，在本文中所述这些一氧化碳生成性化合物也可单独使用或与其它免疫抑制剂合用来抑制免疫系统细胞激活，特别是在延长移植体寿命中。因此，在一个可选的具体实施例中，本发明提供了一种用于在一个哺乳动物宿主上延长接受移植体(theacceptance of transplants)的方法，应用在移植之前和同时给予一氧化碳生成性化合物的方法。采用特殊的给药疗法，其中单次或多次剂量可在器官植入受体之前、同时、或之后给予。特殊的实验设计(protocol)将依据器官的性质、供体、受体或器官是否在进行处理、施用特别的一氧化碳生成性化合物、以及使用其它免疫抑制剂的情况而定。
用药可开始于移植之前的14天内，优选在约3天内，并且理想地包括移植前的一天，而最好在同一天和/或移植后的一天。可进行连续按天或不连续按天地给药，一般给药间隔少于10天。在一个优选的具体实施例中，采用与移植同时或在同一天给药的方法，并且在一个尤为优选的具体实施例中，用药将开始于移植的同一天或前一天，并可能持续至移植体稳定，一般不超过12个月，通常更好为不超过4至12周。然而，植入后被试化合物可根据受体对器官或细胞的反应情况依需要给予。就某些情况而言，只要在宿主体内存在植入物，该被试化合物可长期地给药。该一氧化碳生成性化合物还可用于供体，通常在器官切除的三天内，通常更好为不晚于器官切除的前一天，理想地在器官切除的约12小时内。
被试的一氧化碳生成性化合物可用于各种不同的宿主，特别是灵长类，更好为人类，或用于家养动物等。这些被试的一氧化碳生成性组合物可用于各种器官的移植，如肾、心、肝、脾、骨髓、胰、肺、胰岛等。
一般情况下，移植体存活期将比不用该一氧化碳生成性化合物的正常预期延长至少三天，通常更好为至少延长五天。当使用异种移植体而等待同种异体移植体时，这对减少免疫抑制剂的用量或完全避免使用免疫抑制剂会是有用的。被试化合物既可以用于同种异体，又可以用于异种移植体。
试验下列的实施例是以例证方式而不是以限制方式给出。
实施例1外源性一氧化碳的给药为了检验气态一氧化碳在免疫系统中的效应，首先将C57/BL6小鼠(B6，Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)在脂多糖(LPS)(0.3mg/kg，静脉注射(i.v.)，Sigma，St Louis，MO)的注射之前暴露于含500ppm一氧化碳的空气中(Praxair，Danbury，CT)的封闭密室中1小时。注射之后又将其再暴露于一氧化碳室1小时。注射LPS(通过主动脉)1小时后经主动脉收集血样，并以全血AVOXimeter计4000型(A-VOX Systems，San Antonio，TX)测量全血中COHb水平。将血清样本分离并保存在-80℃待分析。以夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)(Biosource，Camarillo，CA)测量血清中的TNF-α。
该实验结果见图1A-1C。以0.3mg/kg LPS单独处理的小鼠产生了高水平的TNF-α(5090.7±1595pg/ml)。暴露于500ppm的气态一氧化碳的小鼠血清TNF-α水平(3,347±1393pg/ml)明显减少(p＜0.05)(图1A)。也对经处理小鼠的COHb水平进行了测量。如所预期的，暴露于气态一氧化碳的小鼠的COHb百分比(23.83±2.48％，p＜0.01)明显高于暴露于空气的小鼠(3.65±0.43％)(图1B)。随之，暴露于气态一氧化碳的小鼠的COHb水平的增加与O2Hb水平的减少相关(图1C，分别地，在一氧化碳处理的小鼠中为79.18±1.569％，在未经处理的小鼠中为97.53±1.67％)。
实施例2作为一氧化碳生成性化合物的二氯甲烷为了揭示一氧化碳生成性物质的治疗潜力，选择二氯甲烷(MC，Sigma，St.Louis，MO)作为代表化合物。以橄榄油为溶剂配制了不同浓度的MC。在给予LPS1小时之前，小鼠口服5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg的MC。如图2所示，经5mg/kg MC处理的小鼠的TNF-α水平(3720±1666pg/ml)与经LPS处理的对照小鼠的水平(5090.7±1595pg/ml)有小而不显著的差异(p＝0.06)，经50mg/kg和500mg/kg的MC处理的小鼠TNF-α水平显著减少(分别是3124.2±1147pg/ml，p＜0.05和2339±770pg/ml，p＜0.05)。TNF-α的剂量依赖性减少与COHb的剂量依赖性变化存在相关。经5mg/kg的MC处理的小鼠的COHb水平(4.22±1.2％)与未经MC处理的小鼠的水平(3.1±0.6％)相比无显著差别(图3)。然而，经50mg/kg和500mg/kg的MC处理的小鼠的COHb水平(5.48±0.7％COHb、P＜0.05和13.92±1.7％COHb，p＜0.05)与未经处理的小鼠相比有显著增加。
值得注意是经气态一氧化碳处理的小鼠的COHb水平高于经抑制剂量MC处理的小鼠的水平。这可能是因为大部分吸入的一氧化碳为肺部血红蛋白而不是直接被靶组织、肝脏所捕获，所以导致更高的COHb水平。相反地，口服的MC经消化道吸收在肝脏代谢。因此，大部分释出的一氧化碳聚集于肝脏，而不是结合到COHb上。因此，该数据表明一氧化碳生成性化合物可被选为输送有潜在治疗作用的一氧化碳至炎症部位以抑制免疫应答失调的赋形剂。一氧化碳生成性化合物可成为用来控制同种异体移植和自身免疫疾病的的一族免疫抑制药物候选物(candidates)。
实施例3一氧化碳介导的对缺血/再灌注损伤的保护作用缺血/再灌注(I/R)损伤是一种在同位肝脏移植获得性损伤(harvesting injury)中的非依赖性抗原(antigen-independent)组分，并且仍是该过程的主要限制之一。参见Farmer的TransplantationReviews 14(2)106-116(2000)。由I/R引起的肝脏损伤程度范围可从肝脏酶升高的可逆变化到引起细胞死亡和最终的肝脏衰竭的严重损伤程度。以前的研究显示出HO-1的上调可保护肝脏和心脏细胞免于由缺血和再灌注损害引起的氧化应激。参见Kato等的Am.J.Transplant.1121-28(2001)、Katori等的Transplantation(在出版中)。为了更好地理解由HO-1介导的对I/R损伤的保护作用的机制，设计了该研究以在离体中分离灌注大鼠肝模型上测试HO副产物一氧化碳(CO)对冷I/R损伤的影响。
材料和方法动物 使用体重在300-350克(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠。喂给动物任意量的标准啮齿类中国家犬和水，并且根据美国实验动物护理协会批准的指导进行护理。
隔离灌注肝脏的装置 使用隔离灌注肝脏装置，其披露于Amersi等的supra和Maulik等的Circulation 94398-406(1996)中所述。简单地说，由四只供体动物获取的供每次实验用的同源大鼠血，将其使用含有Krebs Ringer Bicarbonate Buffer(Krebs Ringer碳酸氢盐缓冲液)(mMNaCl 118、KH2POF 1、MgSO40.9、CaCl22.5、葡萄糖11.1、和NaHCO225)稀释成15％的血细胞比容(hematocrit)，并保持7.4的pH值。将该灌注液从一个加热器(heated reservoir)中抽吸，该加热器通过连接于可测量门静脉血流量的血流速计的硅橡胶(silastic)管状氧合器(oxygenator)(Cole Palmer Instruments，Chicago，IL)加热到37℃。门静脉压力通过一连接于门静脉的T型装置(T fitting)的压力单测量仪表(monometer)维持恒定。下腔静脉中的流出物插管排液到流出物储存器中。在试验过程中，pH值、温度、和氧合维持恒定。
离体的冷缺血模型 将SD大鼠进行异氟烷麻醉和全身肝素化。在肝脏的骨骼化(skeletonization)后，将导管插入门静脉、下腔静脉、和胆总管，并且将肝脏用10ml的威思康辛大学(UW)溶液冲洗。然后，将这些肝脏储存在4℃的UW溶液中24小时，接着在一个单独的灌注肝脏装置上进行离体再灌注1-2小时。每隔30分钟记录一次门静脉血流量、血压、和胆汁产量。每隔30分钟收集血样，并用来自ANTECH Diagnostics(Irvine，CA)的自动分析仪测量血清谷草转氨酶(sGOT)水平。试验结束时，快速冷冻了一部分肝脏以进行mRNA提取/免疫印迹法(Western blot)分析；剩余的样品用福尔马林固定用于H&E染色。
CO-HO-1通路在肝脏I/R损伤中的作用在五个主要处理组中进行了研究(n＝4.8只大鼠/组)。在组1中，用CO(每百万[ppm]300份；0.03％稳定空气(balanced air))饱和的与置于单独空气(21％O2)中的血液离体灌注的肝脏损伤程度有明显差异。因为NO可能增强HO-1表达(Brouard等的supra.)，然后我们在组2的肝脏中研究了两种气体分子间的联系，该组肝脏经补充以25mM NG-硝基-L-精氨酸甲基盐酸酯(一种可诱导的NO抑制剂)(L-NAME；Sigma Chemicals，St.Louis，MI)的一氧化碳灌注。因为CO的生物功能和cGMP的产生有联系，在组3中尝试以CO加10mM的cGMP类似物6-苯胺基-5，8-奎哪啶酮(LY-83583；Calbiochem，San Diego，CA)灌注肝脏来抑制鸟苷环化酶。为分析外源性CO是否可以替代HO-1来防止I/R损伤，将组4中的大鼠在肝脏切除前24小时用HO-1抑制剂ZnPP(1.5mg/kg/腹腔注射；Porphyrin Products，Logan UT)进行处理，接着用CO进行离体灌注。已经证实CO具有依赖p38MAPK信号转导通路的抗凋亡效应。参见Brouard等的supra。因此，将组5中的大鼠在肝切除前用p38 MAPK抑制剂SB203580(一种嘧啶基咪唑(口服25mg/kg；Sigma))进行了预处理。另外，用CO再灌注之前，在灌注液中加入了SB203580(20μM)。
组织学 肝脏标本以10％缓冲福尔马林溶液固定并包埋在石蜡中。做成4μm切片并用H&E染色。I/R损伤的溶组织严重程度以国际Banff标准分等(Int’l Banff Schema Conference Worksheet，TheThird Int’l Banff Conference on Allograft Pathology，June21-25(1995))。采用这些标准，小叶无序化(lobular disarry)以及气球样变性(ballooning changes)评为1-4分，其中无变化给1分，严重的小叶无序化和气球样变性评为4分。
髓过氧化物酶(MPO)测定MPO 是中性白细胞自然存在的组分并且被用作中性白细胞浸润的标记。将冷冻组织样品进行解冻并悬浮在0.5％十六碳烷基三甲铵(Sigma)冷冻液和50mMol磷酸钾缓冲液(Sigma)中，同时将pH值调至5。将样品进行均质化30秒，在4℃以15,000转/分(rpm)用离心机分离15分钟。然后，将0.1ml上清液与过氧化钠醋酸盐和N-四甲联苯胺(Sigma)溶液混和。使用Beckman DU分光仪(Beckman Institute，Fullerton，CA)测量460nm处的吸光度的变化。一个单位的MPO活性定义为在25℃时每克组织中每分钟降解1μMol过氧化物酶的量。
免疫印迹法(Western Blots) 用PBSTDS缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、0.1％SDS、1％去氧胆酸钠、以及1％三硝基甲苯(Triton)X-100，pH值为7.2)提取出肝脏样品中的蛋白。将十二烷基硫酸钠(SDS)载入缓冲液(50mM三羟甲基氨甲烷(Tris)，pH值为7.6，10％甘油，1％SDS)中的蛋白(30μg/样品)置于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳中并导入(transferred)到硝化纤维膜上(Bio-Rad，Hercules，CA)。将该凝胶用考马斯兰进行染色以证明相同的蛋白载入(loading)。在PBS中将该膜用3％乳粉(dry milk)和0.1％吐温20(Tween 20)(USB，Cleveland，OH)阻断，并以兔抗大鼠HO-1或iNOS多克隆抗体(SangStat，Fremont，CA)孵育。相对蛋白量用光密度计(Kodak Digital Science 1D Analysis Software，Rochester，NY)来确定。
HO-1酶活性 在冰上将肝脏用含有0.5％三硝基甲苯(Triton)X-100和蛋白酶抑制剂的Tris-HCl溶解缓冲液(pH值为7.4)进行均质化(homogenized)。将样品以小试样量进行冷冻直至使用。将匀浆(100μl)与0.8mM的NADPH、0.8mM的6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate)、1.0单位的G-60P脱氢酶、1mM的MgCl2、和10ml纯化的大鼠肝脏胆绿素还原酶在4℃进行混合。通过加入氯化高铁血红素(最终浓度为0.25mM)引发反应。反应混合物在37℃黑暗环境中孵育15分钟。在孵育结束时，通过离心过滤除去任何不溶物质，并分析上清液中的胆红素浓度。将A460-530处40mM-1cm-1的消光系数用于计算形成的胆红素的量。在没有NADPH生成系统情况下对照包括初始的(naive)样品和在没有移植匀浆的情况下反应的所有混合物成分。如Browne和Ultrich的Mol.Pharmacol.32497-504(1987)所述，从大鼠肝脏中提纯胆绿素还原酶。
就HO-1蛋白表达而言的酶联免疫吸附法(ELISA) 在冰上将肝脏用含有0.5％三硝基甲苯(Troton)X-100和蛋白酶抑制剂的Tris-HCl溶解缓冲液(pH值为7.4)进行均质化。将平底微量滴定96孔平板(Nunc)用7μg/ml的抗HO-1单克隆抗体(OSA-111，Stressgen，Canada)在PBS中室温下进行包被(coat)18小时。通过冲洗除去未结合的抗体(冲洗缓冲液在50mM磷酸缓冲液中的0.05％吐温20，pH值为7.5)并通过用5％的BSA/PBS溶液孵育1小时以阻断剩余的结合位点。将重组体HO-1(SPP-730)和组织匀浆在含量测定稀释液(0.5％ BSA/0.05％吐温20/PBS)中进行稀释并在抗HO-1单克隆抗体包被的孔中室温下孵育1小时。接着，用洗涤缓冲液将平板冲洗三次，并且用兔抗HO-1多克隆抗体(SPA-895，Stressgen；在含量测定稀释液(assay diluent)中稀释至1∶1000)在室温下孵育30分钟。用驴抗兔gG-HRP结合物(711-035-152，Jackson Research Laboratories，在含量测定稀释液中稀释至1∶8000)检测了结合的兔IgG。通过清洗除去了未结合的二级抗体，并且在底物的缓冲液中用1mg/ml的OPD(0.1％H2O2、0.1M柠檬酸、0.2M Na2HPO4，pH值为5.0)检测了结合的HRP。用1M HCl终止了颜色反应并在490nm处测量了光密度。
统计 就统计分析而言，使用方差分析(ANOVA)重复测量方法进行了组之间的比较。若有差异，我们即可使用用于判断统计显著性的Tukey-Fisher Least Significance(LSD)，当p值小于0.05时认为在统计上具有显著性。该数值以均值±SEM表示。
结果离体的大鼠肝脏冷缺血继再灌注模型中CO的效应为了确定HO-1对I/R损伤的缓解作用是否是由HO-1-CO下游信号通路所介导，经24小时冷藏保存后，将用补充了CO(300ppm的稳定空气(balanced air))的血，接着进行了离体灌注2小时的大鼠肝脏与仅暴露于空气(21％O2)的大鼠肝脏对照，测量了门静脉阻力、胆汁产生量、和sGOT水平。
门静脉阻力(压力/血流)是受窦状隙淤血和肝细胞损伤影响的。与对照相比，在2小时再灌注的过程中，在灌注液里加入CO可显著地降低(p＜0.001)门静脉阻力(mmH2O/min/ml)(图4)。此外，如图5所示，与用仅暴露于空气中的血液灌注的肝脏相比，用CO处理的肝脏可产生明显更多的胆汁(ml/g组织重量)(p＜0.005)。
其次，通过sGOT释放进行测试，我们确定了CO灌注是否改善肝细胞损伤。与仅用空气灌注的对照肝脏相比，经CO灌注的肝脏显示出明显较低的(p＜0.0001)sGOT水平(IU/L)(分别为1小时79±14与362±51相对；2小时163±27与497±31相对，数据未显示)。
以Banff标准评价了CO对I/R损伤溶组织特征的严重程度的影响。用补充了空气的血液灌注的对照肝脏，证明了在再灌注的1小时(分数为3.6±0.25)和2小时(分数为4.0±0.0)时，与窦状隙和中央静脉淤血有关的大量小叶中心的气球样变性(ballooning)和坏死。形成鲜明对照的是，经辅助CO灌注1小时的肝脏显示出肝脏结构完整保留，而未出现中央静脉或窦状隙静脉淤血，并且没有小叶中心的气球样变性或坏死(分数为1.2±0.31)。经2小时CO灌注的肝脏显示出不完整的小叶中心气球样变性和最小限度的坏死，以及仅有轻度的血管淤血和小叶中心苍白(分数为2.0±0.12)。
为了研究CO介导的对I/R损伤的细胞保护作用机制，用MPO分析测定了在2小时再灌注结束时的肝组织中的中性白细胞的活性。如图6所示，与经CO灌注的肝脏相比，对照肝脏显示出MPO活性的显著升高(4.0U/mg)(1.3±0.2；p＜0.04)。
CO的保护作用与连续测量的COHb水平相关(图7)。暴露于CO 1小时的血中的COHb浓度为3.64±0.32％，在2小时CO灌注后增加至6.79±1.47％。仅用空气灌注1小时(1.27±0.19％COHb；p＜0.01)或2小时(1.59±0.13％COHb；p＜0.002)的肝脏相比，该数值显著增高。
通过非NO依赖性通路外源性CO对肝脏I/R损伤的影响 已经显示出CO可直接结合到NO合成酶的血红素部分中，并且可调节NO的产生。参见Dulkanchainun等的Ann.Surg.227832-840(1998)。因此，我们研究了CO改善肝脏I/R损伤是否由NO介导。再灌注开始时，将25mM的L-NAME(一种选择性iNOS的抑制剂)加入含有CO的灌注液中。就单独用CO处理的组而言(163±27)，在CO存在的情况下，经L-NAME处理的肝脏显示出门静脉阻力的降低(mmH2O/min/ml)和胆汁产生量的增加(ml/g组织重量)(分别见图8和图9)，其类似于经2小时的再灌注后仅暴露于CO的肝脏所显示的影响，而且，还降低了sGOT的释放(IU/L)(191±16)。
通过非cGMP依赖性通路外源性CO对肝脏I/R损伤的影响为了进一步研究通过CO利用其保护效应的可能机制，我们检测了抑制cGMP的效应，已知其对内皮依赖性血管扩张有贡献。参见Suematsu等的J.Clin Invest.962431-37(1994)。将一种干预核苷作用的cGMP类似物LY-83583在再灌注时加入含CO的灌注液。经2小时灌注后，与仅用CO灌注的肝脏相比，附加使用LY-83583引起的cGMP抑制对肝功能没有显著影响。虽然LY-83583灌注组的门静脉压力略微上升(图8；NS)，但是两组之间的胆汁产生量(图9)和sGOT水平(186±21IU/L)相当。
外源性CO可替代内源性HO-1防止肝脏I/R损伤 为研究内源性HO-1活性的抑制是否影响外源性CO对I/R损伤的保护作用，我们在采集(harvest)肝脏前24小时，给予了一种已知HO-1抑制剂ZnPP(1.5mg/kg/i.p.)。如上所述，将肝脏在4℃下保存24小时，并且离体灌注2小时。明显地，经ZnPP预处理的肝脏显示出与仅用CO灌注的组相似的功能特征，即降低了门静脉阻力(图8)、增加了胆汁产生量(图9)、以及改善了肝细胞功能，其通过sGOT水平来测量(202±11IU/L)。实际上，与仅用CO(2.25±0.18；p＜0.01)或仅用空气(1.37±0.11；p＜0.02)的灌注组相比，ZnPP预处理组(0.95±0.06)中的这些细胞保护作用与被抑制的HO-1酶的活性(nmol的胆红素/mg/蛋白质/分钟；n＝3-4/组)有关(数据未显示)。相似地，与仅用CO(7.51±2.13；p＜0.01)或仅用空气(1.28±1.46；p＜0.01)的灌注组相比，肝脏试样中的HO-1蛋白质表达的ELISA辅助检测(ng的HO-1/mg溶解产物；n＝3-4/组)揭示了ZnPP预处理组中的HO-1含量(0.85±0.62)明显减低(数据未显示)。
HO-1和iNOS的表达 Western Blot分析结果显示CO介导的对肝脏I/R损伤的细胞保护效应与HO-1表达上调有关。与仅用空气的对照组和ZnPP处理组相比，在以CO、CO+L-NAME、和CO+LY-83583灌注2小时后，HO-1蛋白增加约3倍(数据未显示)。在经CO、CO+L-NAME、CO+LY-83583、和CO+ZnPP处理组中，用Western Blot检测不到iNOS的表达。然而，单独用空气再灌注2小时后的对照肝脏检出了低密度带。
CO通过激活p38MAPK防止肝脏I/R损伤 因为曾有人表明CO通过激活p38MAPK信号转导通路来防止内皮细胞的凋亡(Brouard等的supra)，我们研究了该机制是否在我们的模型中起作用。在CO存在的情况下，用一种嘧啶咪唑类p38MAPK抑制剂SB203580处理的肝脏与再灌注2小时后仅用CO灌注的肝脏相比，表明其门静脉阻力显著增加(p＜0.025)并且胆汁产生量显著减少(p＜0.01)(分别见图8和图9)。另外，当与单用CO处理的组(163±27IU/L；p＜0.05)相比时，sGOT的释放也显著增加(352±21IU/L)。该数据证明了CO介导的对肝脏I/R损伤的保护效应是通过激活p38MAPK信号通路实现的。
组织学 在2小时的灌注期结束时，通过使用Banff标准对I/R诱导的肝细胞损伤做了评分。用CO+L-NAME处理的肝脏显示出完整的肝结构保留，而未出现中央静脉或窦状隙静脉淤血，以及最低限度的小叶中心的气球样变性同时没有坏死(分数为1.5±0.25)。经cGMP类似物和CO处理的肝脏显示了肝结构的保留，而未出现中央静脉或窦状隙静脉淤血，并且没有小叶中心的气球样变性/坏死(分数为1.25±0.25)。经ZnPP预处理后再经CO灌注的肝脏显示出最低限度的小叶中心的气球样变性、淤血、和坏死(分数为1.5±0.0)。最后，用CO+SB203580处理的肝脏显示出中度气球样变性及窦状隙和中央静脉淤血(分数为3.25±0.25)。
如上述资料所提示，在离体用CO灌注2小时再经24小时冷藏的大鼠肝脏与对照的肝脏相比门静脉阻力显著减少，而胆汁产生量显著增加。该结果与肝功能改善(sGOT水平)、中性白细胞浸润和肝细胞损伤溶组织的特征减少(Banff的评分)相关。CO介导的细胞保护效应不依赖于NO或cGMP，但依赖于p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)。此外，CO可通过激活p38MAPK替代内源性HO-1防止肝脏I/R损伤。因此，服用CO在防止肝脏I/R损伤和扩展为用于移植受体的肝脏供体库中有潜在的治疗性应用。
实施例4服用二氯甲烷防止凋亡并延长肝脏同种异体移植体的存活凋亡、或细胞程序化死亡对免疫系统的内环境稳定是至关重要的，并且在通过细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)进行的同种异体移植的急性排斥反应的破坏相中发挥重要作用。CTLs可利用多种机制以溶解靶细胞，包括CD95/FAS系统。参见Ju等的Proc.Natl Acad.Sci.USA 914185-89(1994)。本试验研究了CO作为HO-1的下游介质(mediator)在防止CD95/FAS介导的凋亡以及延长同种异体OLT存活中的影响。
材料和方法编码Fas配体(Ad-CD95)、血红素氧化酶1(Ad-HO-1)、和β-半乳糖苷酶报道基因(Ad-β-gal)的重组腺病毒(Ad)的产生 如Ad-HO-1按照Shibahara等的Proc.Nat’l Acad.Sci.USA9310393-98(1985)中所披露的方法产生。简而言之，将被Xhol-HindIII位点侧翼包围(flanked)的1.0kbp的大鼠HO-1 cDNA克隆到质粒pAC-CMVpLpA中。所得到的pAC-HO-1质粒与质粒pJM17共转染到911细胞中。同源重组导致一种复制有缺陷的AD-HO-1。将重组体Ad-HO-1的克隆通过Southern blots进行筛选。Ad-CD95和含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(Ad-β-gal)的Ad已经披露于Ke等的Transplantation 691690-94(2000)。以常规方式进行重组Ads的分离、繁殖、和滴定(tittering)。参见Graham等的Virology52456-67(1973)。
细胞系 所有的细胞系来自美国菌种收藏(American TypeCulture Collection(ATCC，Rockville，MD))。将Hela细胞保存在Dulbecco的最低要求培养基(DMEM；GIBCO，Grand Island，NY)+10％胎牛血清(FBS)的培养基中，并且将YAC-1细胞保存在RPMI 1640(GIBCO)+10％FBS的培养基中。
体外细胞毒性试验 将以1×105细胞/孔的密度接种的Hela细胞和YAC-1细胞在100μl的含10％FBS的DMEM中培养过夜。在三次洗涤后，加入Ad-CD95(在感染多样性[MOI]＝5、10和20时)和Ad-HO-1或Ad-β-gal(在MOI为10时)，并且用100μl的无血清的DMEM进行孵育1小时。然后，将培养基移除，并且换成100μl的含2％FBS的DMEM以孵育36-48小时。移除培养基并洗涤细胞3次后，将10μl的MTT(5mg/ml，Sigma Chemical，St.Louis，MO)每个孔中并孵育4小时。将培养基移除后，加入100μl的含0.01％HCl的异丙醇。在OD为550处使用酶联免疫吸收剂分析指示仪表。进行细胞毒性百分比计算为试验的1-OD/对照的OD×100％。
体外凋亡检测 将Hela细胞和YAC-1细胞以1×105细胞/孔的密度接种，并在100μl的含10％FBS的DMEM中培养过夜。在三次洗涤后，加入Ad-CD95(在MOI为5、10和20时)和Ad-HO-1或Ad-β-gal(在MOI为10时)并在100μl无血清的DMEM中孵育1小时。然后，将培养基移除，并且换成100μl的含2％FBS的DMEM以孵育36-48小时。将培养移除基并用含1％BSA的PBS三次洗涤后，每孔细胞中加入100μl新鲜的4％多聚甲醛溶液并孵育1小时。然后，每孔加入100μl渗透液(0.1％柠檬酸钠中的0.1％Triton X-100)并在冰上放置2分钟。用PBS洗涤两次后，每孔细胞加入50μl TUNEL(终止脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记，见下)反应混合物(Roche Molecular Biochemicals，Germany)，并在37℃下黑暗中的湿度饱和的环境下孵育1小时。用PBS洗涤两次，然后进行荧光显微镜分析。该结果是在200倍放大时通过每个显微视野中凋亡细胞的平均数目半定量地进行计算。每个样本至少分析6个视野。对每个试验组都重复3次。所有的数据均表示为均值±SD。
OLT模型的Ad-HO-1转导 从Harlan Sprague Dawley，Inc.(SanDiego，CA)购买了10-16周龄的雄性黑豚鼠(DA；RT13)和Lewis(LEW；RT11)大鼠，并在UCLA校长动物研究委员会(Chancellor’sAnimal Research Committee)(CARC)批准的条件下饲养。全部动物被饲养在无病毒设备的微型隔离笼子中，并且随意地喂给试验用的中国家犬(chow)。如前所述，同位肝脏移植在DA供体和LEW大鼠受体之间进行。参见Amersi等的supra、Kato等的Am.J.Transplant 1121-28(2001)。在冷冻保藏(4℃)过程中，通过用2ml含有5×1010pfu(斑块形成的单位)Ad-HO-1凉的林格乳酸溶液(lactated Ringer’s solution)灌注门静脉，将离体基因导入肝脏移植体。将对照移植体用5×1010pfu的Ad-β-gal进行了灌注。跟踪动物以确定存活期。不同组的受体于移植后第3、7和10天处死，取出OLTs以进行组织学评定，同时收集了血样以测定sGOT水平。
OLT模型中的二氯甲烷处理 为研究CO在该系统中是否是一种功能性的下游HO-1介质，将二氯甲烷用作一氧化碳催生物(generator)。如上所提示，已知MC的代谢产生CO2和CO排出物。参见Gargas等的supra。在移植前2小时，接受DA肝脏的LEW大鼠被喂以二氯甲烷(500mg/kg)，在移植后2周内接着喂药(500mg/kg/天)。在第0、5和10天，测定实验动物血中的CoHb水平。对残存动物进行筛选以及对OLTs进行组织学分析。
组织学 在移植后3、7和10天取出了同种异体肝脏移植体。将该组织切成了小块，并保存在10％的中性缓冲福尔马林中，切成了5μm的切片，并用常规方法进行苏木精和伊红(H&E)染色。
凋亡的活体检测 用一种商品原位组织化学试剂盒(Klenow-FragEL，Oncogene Research Products，Cambridge，MA)进行检测在福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中的具有凋亡特征的DNA片段。此在此检测中，Klenow结合到相应于凋亡信号而产生的DNA片段的末端，并催化添加模板依赖性的生物素标记和未标记的脱氧核糖核酸。利用抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(streptavidin-horse radish peroxidase(HRP))来检测生物素标记(Biotinylated)核苷酸。在DNA片段处，二氨基丁酸联苯胺与标记的样本反应以产生不溶性的有色底物。用甲基绿进行的复染可帮助进行形态学评定和正常及凋亡细胞的特征分析。在200倍放大时，计算每个显微视野中凋亡细胞的平均数目并进行半定量分析。每个样本至少分析6个视野。所有的数据表示为均值±SD。
结果在体外Ad-HO-1基因的导入防止CD95/Fas介导的凋亡 细胞毒性试验和TUNEL染色被用来分析体外的基于Ad的HO-1过度表达产生的影响。如图10所示，与Ad-CD95+Ad-β-gal对照组相比，CD-95介导的对含有Fas的YAC-1靶细胞的细胞毒性在Ad-CD95+Ad-HO-1转染组中是一致降低的。实际上，当MOI在5、10和20时，对照组的细胞死亡率为39％、49％和76.5％，明显高于(p＜0.001)Ad-CD95+Ad-HO-1组的4.5％、7％和14％的细胞死亡率。与细胞毒性试验结果一致，Ad-CD95+Ad-β-gal组的TUNEL+凋亡YAC-1细胞(211.5±76)与Ad-CD95+AD-HO-1组(36.5±14)相比有显著增加(p＜0.001)(数据未显示)。
Ad-HO-1基因导入延长同种异体OLT的生存、改善急性排斥组织学症状、以及改善肝功能 未经处理的LEW大鼠进行同位移植DA肝脏后十天内死亡(见下面的表1)。转染了Ad-β-gal的肝脏不影响移植后动物的存活期(平均生存时间[MST]±SD＝9.5±0.5天，n＝6)。然而，转染了Ad-HO-1的OLTs的存活期显著增加到＞32±42天，而且12个肝脏中有2个存活超过120天(表1)。在移植后第3、7和10天，Ad-β-gal转染后的X-gal阳性染色率分别约为90％、80％和70％(平均值，2-3只动物/组)。Ad-β-gal对照组中的OLTs显示出持续性的严重的急性排斥病症，伴随出现了坏死、出血，并且只有不到25％的肝实质移植10天后仍存活。与此对照，转染了Ad-HO-1组的相应OLT样品显示出轻度至中度的排斥反应，出现浓稠炎性液体渗出，但超过90％的肝实质得到存活。然后我们分析了作为OLT功能指标的sGOT水平。与Ad-β-gal对照组(1208±611，p＜0.05)相比，在移植后10天，Ad-HO-1基因转染组的sGOT水平(IU/L)(412±105)显著降低。
在同种异体OLTs中Ad-HO-1基因的导入可防止凋亡以及上调抗凋亡分子的表达 到第10天，Ad-β-gal组的肝脏同种异体移植体显示出了肝细胞凋亡和质密核边缘(64±25的TUNEL+细胞/视野)。与之相反，在经AD-HO-1基因导入的同种异体移植的OLTs中，凋亡细胞的数目维持在本底(background)水平(0.8±0.7的TUNEL+细胞/视野；p＜0.05)。
内源性CO的上调延长异体OLT的存活 为了研究CO是否在排斥级联反应中体现出重要的下游HO-1介质，将OLT同种异体移的受体用二氯甲烷处理(500mg/kg/天×14天)。该用药法(regimen)可被很好地耐受且没有观察到副反应。血中CoHb的水平分别从试验开始时的1.3±0.1％(0天)上升至第5天的5.8±0.2％、和第10天的6.8±0.5％(平均值±SD；n＝2-3测量/组)。所有未经处理的LEW大鼠在进行同位异体移植DA肝脏后的10天内死亡(见下面的表1)。与之相反，移植后喂以二氯甲烷使OLT存活期显著延长(MST±SD＝>47±46天)，7只大鼠中的2只存活超过120天。到第10天，未经处理的受体动物的OLTs显示出严重的急性排斥，伴随出现粘稠炎性液体渗出、门脉/中央静脉坏死性内膜炎，并且仅有小于10％的肝实质存活。与之相反，从经二氯甲烷处理鼠获取的OLTs显示出轻度至中度的炎性液体渗出和中央静脉内膜炎，显示轻度至中度的排斥反应，而且超过80％的肝实质存活良好。移植后10天，在活体中以二氯甲烷为主要成分的CO的释放显著地减少了同种异体OLTs细胞凋亡，从未处理的对照组中61±25的TUNEL+细胞减少到在处理组的4.5±2.3(p＜0.0025)。
表1
如上数据所显示，在体外，Ad-HO-1基因治疗防止CD95/Fas介导的凋亡，同时通过Ad-HO-1基因治疗增加了体内HO-1的表达以显著延长了动物同种异体OLT的存活期，降低了严重急性排斥的组织病症并保持了肝细胞结构，也改善了以sGOT为指标的OLT功能。相应地，每日单独喂以二氯甲烷的OLT受体动物也未给其它免疫抑制反应，且在第10天一致地防止了急性排斥反应并显著地延长了动物的存活期，其中约50％的受体(接受移植鼠)的存活期超过3周。给予二氯甲烷一致地提高了CoHb的水平(从未处理鼠的约1.3％提高至10天处理后的约6.8％)，而且该服法可被很好的耐受。此外，给予二氯甲烷降低了移植部位TUNEL+细胞的频度，此结果与HO-1-CO下游信号通路中的抗凋亡作用在抑制同种异体移植排斥级联反应中发挥了重要作用的观点相一致。
因此，上述对二氯甲烷的研究显示在肝脏同种异体移植体中Ad-HO-1介导的抗炎效应至少部分是依赖于CO的产生。以上数据与其它关于CO可完全替代HO-1介导的细胞保护作用的结果一致(参见Brouard等(2000)的supra、Sato等的supra、和Fujita等的Nat.Med.7598-604(2001))。除了具有抑制细胞凋亡的能力外，CO也可通过抑制纤维蛋白溶解枢椎(fibrynolytic axis)(Fujita等)、抑制血小板聚集(Brune and Ullrich，Mol.Pharmacol.32497-504(1987))、和/或促进血管扩张(Motterlini等的Cir.Res.83568-77(1998))来改善移植体的排斥反应。
实施例5给予二氯甲烷抑制慢性排斥反应慢性排斥反应表现为同种异体移植体的动脉硬化，其是一种由内膜肥大引起的弥散性持续性的血管狭窄。Libby and Roper，Immunity 14387-97(2001)。将I/R损伤和对通过内皮细胞表达的抗不相容性MHC抗原而产生的免疫应答看作是疾病的起因。内皮细胞的破坏和/或激活以及内膜和外膜的白细胞浸润可导致从其中膜的正常位置到内膜的内皮下空间的VSMCs异常增殖和迁移，以及导致异常血管收缩。同样(id.)与急性排斥反应不同，过去数十年中在减少慢性排斥反应方面鲜有进展，从而对新的治疗策略具有一种迫切的需求。
在与慢性排斥有关的病理状况中，诸如缺血/再灌注(I/R)损伤(Amersi et al.，supra)、动脉硬化(Ishikawa et al.，Cir.Res.88506-604(2001))、动脉损伤之后的新内膜形成(Togane et al.，AmJ.Physiol.Heart Circ.Physiol.278623-32(2000))、以及异种异体移植(xenogeneic)(Soares et al.and Sato et al.，supra)和同种异体移植体的排斥反应(Woo et al.and Hancock et al.，supra)，HO-1已经显示出抑制炎症作用，显示HO-1可通过作用于疾病的免疫和非免疫成分对抗慢性排斥反应。近期结果显示CO抑制促炎症症状，伴随着单核巨嗜细胞的激活有关的(Otterbein et al.，supra)，以保护多种类型的细胞防止凋亡发生(Petrache et al.，Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.278L312-319(2000)；Brouard et al.，supra)，而且还抑制异种移植排斥(Sato et al.，supra)并抑制纤维蛋白溶解(Fujita etal.，supra)。本实施例通过应用一氧化碳生成性化合物二氯甲烷，显示CO释放对在具有良好特征的且广泛应用的慢性主动脉同种异体移植排斥(Libby，supra)的模型中的影响。
材料和方法动物和主动脉移植 用250g的雄性Lewis 1W大鼠(LEW.1W，单体型RT1u)作为供体动物，而LEW 1A大鼠(单体型RT1a)作为受体动物(CERJ，Le Genest St.Isle，France)。这些动物整个MHC区完全不相匹配。动物(处理)程序依据欧洲实验动物指南。取胸降主动脉，用盐水灌注并用吻合术接合于受体动物的肾动脉以下和主动脉杈以上的腹部主动脉。吻合术是以末端-侧接的方式进行的，而受体动物的腹部主动脉是通过两次移植吻合术进行结扎的。移植的主动脉在移植30天后被取出。用10％的福尔马林将一主动脉区段进行固定用于形态学评定，而将另一区段包埋在OCT化合物(Tissue Tek，Miles Labortories，Elkhart，IN)中并在液氮中进行冷冻用于免疫组织学分析。
将MC(Sigma，St.Louis，MO)在橄榄油中进行稀释，并按日(从0天到30天)以500mg/kg的剂量口服给药。这个剂量可使细胞色素P-450氧化系统达到饱和，并且在静脉或主动脉血中产生10％COHb的最大COHb值。Gargas等及Andersen等的supra、Wirkner等的Toxicol.App.Pharmacol.14383-88(1997)。之前发表的数据已经证明按照一块骨头(per os)服用500mg/kg的MC可被快速吸收，达到60-70mg/ml的血中平均浓度，以约3小时的半衰期代谢，以及产生10％半衰期约为2小时的HbCO。同样，以前公开发表的出版物还显示了大鼠以500mg/kg的剂量服用MC4周没有引起明显的体重、生化、和组织学变化。Kirschman，Fd.Chem.Toxic.24943-49(1986)、Dhillon and Von Burg，Toxicology Update1329-35(1995)。以更高剂量的和/或更长时间的照射(exposures)MC可表现出肝脏和中枢神经系统的毒性。同样，用VOXimeter传感器(A-VOX Systems，SanAntonio，TX)来测量肝素化的静脉血中COHb的水平，并以其占总血红蛋白的百分比来表示。用标准的临床生化技术(Laboratory of Boichemistry，University Hospital ofNantes)来测量碳酸氢盐、溶解性CO2、总CO2、和pH值。
重组腺病毒和基因导入主动脉 用pAdEasy和pAdTrack-CMV系统在293个细胞构建了编码HO-1(AdHO-1)的腺病毒(He等的Proc.Nat’l Acad.Sci.952509-14(1998))。AdHO-1包括含有人CMV启动子和在3`末端融合有Flag序列的人HO-1 cDNA的表达盒。David等的Hum.Gene Ther 91755-68(1998)披露了非编码性腺病毒载体Add1324，按其中所披露的方法提纯重组腺病毒。用Replication Center Assay(RCA)来测定重组腺病毒的滴度。将最初披露的用于与腺病毒相关载体(vectors)滴定的实验设计(Salvetti等的Hum.Gene Ther.96950706(1998))进行改进，用于定量腺病毒颗粒(IP)。简而言之，将293个细胞以每孔8×104个接种到48孔培养板上。第二天，用系列稀释的载体感染这些细胞。36小时之后，将细胞进行胰酶消化并通过Zetaprobe膜进行过滤。然后，将滤过物(filers)浸泡在0.5M的NaOH、1.5M的NaCl中5分钟，在1M pH值为7.0的This-HCl(2×SSC)中进行中和反应，最后用与DNA结合蛋白基因杂交的荧光素标记的核酸探针进行孵育。通过计数感染的293个细胞中斑点个数来定量感染腺病毒颗粒。重要的是，用RCA定量方法得到的滴度与细胞感染个数相同(用抗DBP的抗体免疫荧光测定)。取出供体鼠的主动脉，将重组腺病毒(200μl滴度为1010IP、添加以1％FCS的DMEM)注入内腔，并且结扎两端。然后，将其置于在37℃5％的CO2中孵育45分钟，用DMEM冲洗以除去未结合的腺病毒并移植入受体动物。
组织学和形态测量分析 甲醛固定之后，将主动脉区段(segments)包埋在石蜡中，并且用苏木精-伊红-藏红(HES)对5μm的切片进行染色。将用显微镜可见的图像使用彩色照相机进行采集。利用Scion图像软件(National Institutes of Health)以盲法进行图像分析处理。在每个切片中，将内腔、内部和外部的弹性层的范围内进行手工描划和测量。用如下公式计算内膜厚度内膜/(内膜+中膜)×100并表达为内膜增厚(thickening)的百分比。
内皮细胞(ECs)的基因导入和Western blot分析 初生的大鼠主动脉的ECs在添加了1％FCS的DMEM中同Add1324或AdHO-1(每个细胞50IP)一起进行孵育(在37℃下90分钟)、洗涤并在添加有10％FCS的培养基中培养30小时。在PBS中将细胞进行洗涤，在含有1％的SDS、240μg/ml的AEBSF(Sigma)、和0.71TIU/ml的牛胰蛋白酶抑制剂(Sigma)的缓冲液(10mM TrispH值为7.4)中进行胰酶消化和细胞溶解。将20μg蛋白煮沸，并加样到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶孔中，接着进行电泳并印迹转移(boltting)到硝酸纤维膜上。然后，用含有0.1％的吐温20和5％的脱脂奶粉的PBS将膜进行阻断(4℃，过夜)，用可与人源和大鼠源的HO-1反应的兔抗HO-1(Stressgen，Victoria，BC，Canada)、小鼠单抗抗Flag(clone M2)(Sigma，St.Louis，MO)、或小鼠单抗抗β-微管蛋白(Calbiochem，San Diego，CA)进行孵育(在室温下，2小时)。然后进行洗涤，并且同HRP标记的抗兔或抗小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)一起进行孵育(在室温下，2小时)，并且使用x光胶片利用增强型化学发光法(Amersham，Arlington Heights，IL)进行检测。
免疫组织学分析 正如在先详细描述，在低温检测器中进行免疫组织学分析。参见Guillot等的J.Immunol.1645258-68(2000)。对浸润的白细胞的免疫组织学分析在移植后第30天进行，使用下列的小鼠单克隆抗体(Mab)两种抗白细胞CD45单克隆抗体的混合物、抗单核细胞/巨嗜细胞CD68(EDl)、抗αβTCR(R.7.3)、抗CD4(W3/25)、抗CD8α链(OX8)、抗单态II类MHC抗原(OX6)、抗CD25(OX39)(全部来自ECACC，Wiltshire，UK)、抗CD54(ICAM-1)(Seikagaiku America Inc.，Rockville，MA)、抗CD86(B7.2)(Pharmingen，Franklin Lakes，NJ)、和不相关的小鼠单克隆抗体(3G8，抗人类CD16)。利用小鼠抗人类α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(Sigma，St.Louis，MO)来检测VSMCs。然后，同生物素结合的抗小鼠免疫球蛋白抗体一起进行孵育(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，接着用HRP结合的抗生蛋白链霉素(VectorLaboratories)和VIP底物进行孵育。利用仓鼠单克隆抗体(Genzyme，Cambridge，MA)来分析IFNγ表达。利用山羊抗IP10抗体(SantaCruz，Santa Cruz，CA)来检测IP10化学因子。将兔抗体用于检测iNOS(Transduction Laboratories，Lexington，KY)、HO-1(Stressgen)、和TGFβ1(Promega，Madison，WI)。生物素结合的抗仓鼠、抗山羊和抗兔抗体来自于Jackson Immunoresearch。用HRP结合的抗生蛋白链霉素和VIP底物进行孵育，以检测这些抗体的结合。将组织切片用苏木精和碳酸锂进行复染(counterstained)。
完全按照前面描述的方法，移植前在经Add1324或AdHO-1转导的主动脉的冰冻切片(20μm)上，腺病毒介导的基因导入后，HO-1的表达得到确认，并依据之前所描述的可在腺病毒介导的基因转移之后使内皮保持静止和活性状态的技术，将其在含有10％FCS的DMEM中培养2天。参见Merrick等的Transplantation62(8)1085-1089(1996)、Merrick等的Transplant.Immunol.53-9(1997)。将主动脉的冰冻切片(20μm)用2％的多聚甲醛(室温20分)固定，用0.1％三硝基甲苯(triton)做渗透处理，并用200μl生物素结合的抗Flag或兔抗HO-1抗体(浓度为10μg/ml，在PBS中用含1％BSA、1％大鼠血清、和聚乙二醇辛基苯基醚(triton×100)来稀释)孵育(18小时，4℃)。这些抗体的结合可用上述方法检测。所有免疫组织学试验包括3G8不相关的单克隆抗体、或来自用于检测炎性介质的对照血清作为阴性对照。
同种异体抗体的检测 将供体LEW.1W脾细胞用经PBS连续稀释的来自ELW.1A受体动物的热灭活的血清进行孵育。然后，将细胞进行洗涤，并且同时与FITC偶联的驴抗大鼠IgG(JacksonLaboratories)和生物素标记的抗B细胞单克隆抗体(clone OX33，ECACC)一起进行孵育。在洗涤后，将细胞与藻红蛋白偶联的抗生蛋白链菌素一起进行孵育。用细胞荧光计(FACScalibur，BectonDickinson，San Jose，CA)检测同种异体抗体的血清水平，并用每种稀释血清中的平均荧光值(MCF)来表示。如前所述的在特定耐受模型中(Cuturi等的Eur.J.Immunol.241627-31(1994))，抗供体MHC II类同种异体抗体的优势通过同种抗体仅结合到OX33阳性细胞(B细胞)来检测。抗MHCI类同种异体抗体的存在导致OX33阴性(T细胞)和阳性细胞的标记。结合到OX33阴性细胞的同种抗体的MCF体现了抗MHCI类同种异体抗体的水平。
统计 使用ANOVA方法进行显著性统计分析(P＜0.05)。
结果腺病毒介导的基因导入后HO-1的表达和给予MC后CO的释放 AdHO-1感染后HO-1的表达在培养的大鼠ECs和主动脉中被确认。未处理的大鼠ECs和Add1324转导的细胞显示出低水平的内源HO-1的表达，然而，采用抗HO-1和抗Flag抗体通过Westernblot可检测出Ad-HO-1转导的ECs表现为HO-1的强表达。由于Flag肽的存在，AdHO-1转染后表达的HO-1具有比内源性HO-1更高的分子量(33 vs.32kDa)。尽管在对照细胞中存在非特异性的交叉反应性，但Anti-Flag抗体只在AdHO-1转导的EC中显示了预期的分子量带(band)。与以Add1324转导的细胞相比，HO-1的酶活性(胆红素的产生)比以AdHO-1转导的细胞更强。
HO-1的表达采用抗HO-1和抗Flag抗体的免疫组织学方法在以AdHO-1转导的主动脉中被确认。在对照腺病毒处理的组织和抗Flag抗体中不存在HO-1 Flag分子的表达。使用以前描述过的技术(Merrick等的supra)，通过免疫组织学方法在整个主动脉片断上用AdHO-1转导的而不是在Add1324转导的主动脉中，检测出内皮中HO-1的表达。直到第10天才在移植的主动脉中检测出HO-1的表达，而15天时又检测不到了。这些结果显示随基因导入ECs和主动脉，由AdHO-1携带的HO-1被表达。
随着口服MC代谢而产生的CO通过在不同的时间点检测血液中COHb的水平而得到确认(图11)。服用MC后，COHb的水平(总Hb的均值±SEM，n＝4)10小时内从0.8±0.3上升至10.6±1并在服用MC 24小时后下降到正常水平。与服药前的值相比，对服用MC(500mg/kg，n＝5)的动物在4、8、10、12、16、20和24小时进行分析，未显示出血液中的碳酸氢盐、可溶性CO、总CO2和pH值的显著变化(数据未显示)。因此，由MC产生的CO2被碳酸盐系统有效地缓冲并经呼吸消除而未引起生理上的改变。与以前发表的数据相一致(Kirschman and Dhillon等的supra)，MC处理的大鼠表现出正常的行为、饮食而无明显的全尸体剖检(gross necropsyalterations)改变。这些结果表明服用MC的效应是由CO的释放而不是由CO2的释放引起的。
基因转入和CO释放后HO-1的表达减少内膜增厚 在被慢性排斥的未经处理和以对照腺病毒处理的主动脉显示出近似的程度和表现(均值±SEM；分别为21.2±5.6％，n＝4和21.1±1.2，n＝5)(图12)。同源移植体中内膜的厚度(4.8±0.7％，n＝4)与非移植的主动脉相似(数据未显示)。以AdHO-1进行的基因转移引起了内膜厚度的显著减少，也在MC处理的受体中观察到(8.3±4.5％，n＝5)。
对未处理的或对照腺病毒处理的主动脉的HES染色的显微检查揭示出内膜增厚是细胞浸润和细胞外基质沉淀的结果。被慢性排斥的主动脉的中膜细胞密度降低，而动脉外膜被内膜的细胞外基质沉淀严重入侵。AdHO-1处理的主动脉的外膜显示出渗入细胞的显著减少，而由MC处理的主动脉则中度减少。
这些结果表明HO-1基因导入或服用CO(CO也是一种HO-1降解血红素的产物)可降低慢性排斥损伤的发展。
HO-1基因导入和CO释放减少内膜的细胞浸润 对同源移植体的免疫组织学分析揭示出内膜或外膜没有白细胞浸润。VSMCs仅局限于中膜，而VSMCs密度没有任何降低(表2)。在非编码腺病毒处理的同种移植体中，在内膜和外膜中观察到了大量浸润的白细胞(表2)。大部分浸润的CD45+白细胞为CD68+巨嗜细胞及较少量的T淋巴细胞(表2)。T淋巴细胞中群中包含多于CD8+细胞的CD4+细胞(表2)。与其中VSMCs均匀地分布于中膜的同源主动脉相反，非编码腺病毒处理的同种异体主动脉显示出内膜中的VSMCs和在中膜的减少的数目(表2)。
表2
染色细胞频率评分为-未显；+低；++中；+++频繁正如上表所显示，与对照腺病毒处理的主动脉相比，经AdHO-1处理的主动脉在内膜和外膜中的总CD45+白细胞、巨噬细胞、T细胞、和CD4+细胞的浸润明显减少。AdHO-1处理的主动脉内膜VSMCs减少，但是中膜的某些区域的VSMCs密度降低。
与在AdHO-1转导的主动脉中的效应类似，通过MC处理的CO的释放减少了内膜总CD45+白细胞、巨噬细胞、T细胞、和CD4+细胞浸润。然而，这种效应显得不如在AdHO-1处理的主动脉中那么明显。另外，CO处理没有影响外膜的白细胞浸润(表2)。另一方面，CO对VSMCs的影响比经AdHO-1处理的主动脉的影响更为显著，因为MC处理的受体动物的主动脉中的VSMC分布与在同源移植的大动脉中的分布相同在内膜中检测不到VSMCs，而中膜则显示了正常的VSMC密度。(表2)。
HO-1基因导入和CO释放可减少激活标志和细胞因子的表达同源主动脉显示出在内皮上只有微弱的ICAM-1标记，没有B7.2和MHC II类抗原标记、和中膜和外膜中的低至中度的IP10、TGFβ1、和iNOS标记(表3)。对照腺病毒处理的同种异体主动脉显示出在内膜和外膜中大量的细胞强表达ICAM-I、B7.2、和MHC II类抗原(表3)。如下面的表3所示，IP10、TGFβ1和iNOS的表达在对照腺病毒处理的主动脉的内膜和外膜、以及中膜中也有增加。
表3
染色细胞频率评分为-未显；+低；++中；+++频繁AdHO-1处理的主动脉显示出表达ICAM-1、B7.2和MHC II类抗原的减少的细胞数目。与对照腺病毒处理的主动脉相比，IP10、TGFβ1和iNOS的表达强度变弱(表3)。通过服用MC的CO处理适度地减少了ICAM-1、B7.2和MHC II类分子的表达(表3)。在中膜和外膜中IP10的表达减少而在内膜中没有减少，然而，内膜中而不是中膜或外膜中的TGFβ1和iNOS表达减少(表3)。IL-2受体(CD25)和IFNγ只在极少的和分散的同种移植体中检测到在实验组之间没有差别，而在同源移植体中未检测到(数据未显示)。
总而言之，对白细胞和炎性介质的分析显示AdHO-1处理的主动脉表现出内膜和外膜炎症的减轻，然而经CO处理的主动脉显示出这些炎性标记在内膜的较不显著的减少，而在外膜没有减少。与此相反，VSMCs内膜减少和中膜增加的效应在CO组比在Ad-HO-1处理的主动脉更为显著。
Ad-HO-1的效应可以通过在Ad-HO-1转导的EC中的胆绿素和胆红素的产生，以及铁的排除，从而抑制EC的激活及因此而来的白细胞粘附和组织浸润来进行解释。同时，从Ad-HO-1转导的EC中弥散出的CO不仅可作用于邻近的EC和巨噬细胞，也能作用在VSMCs上，从而抑制它们的凋亡、增殖和激活。在移植后第15天没有检测得到而在Ad-HO-1介导的HO-1的短暂表达可解释为对早期白细胞浸润阶段更有效，而对晚期VSMC的增殖没有显著的效果。与此相反，二氯甲烷的治疗贯穿整个试验连续进行给药，并可能比抑制白细胞浸润更有效地抑制VSMC的增殖。另外，与Ad-HO-1基因导入相比，CO释放可在动脉壁还可产生更高水平的CO。
经AdHO-1处理和CO释放后的具有移植体的受体动物中的同种异体抗体水平的分析 同种抗体在次级(secondary)淋巴器官产生并且反映CD4依赖性同种异体活性(alloreactivity)。在某些不是所有模型中，同种异体抗体已经体现了慢性排斥的发展(Libby andPober，supra)。前人详细描述了与长期同种异体移植体的存活相关的抗供体动物MHC II类同种异体抗体的重要性(Cuturi等的Eur.J.Immunol.241627-31(1994))。经Ad-HO-1处理的主动脉或接受MC治疗的受体动物表现出一个与移植了对照腺病毒处理的大动脉的受体动物相同的能结合到T和B供体细胞的同种异体抗体的特征，显示出没有优先(preferential)产生的抗MHC II类同种异体抗体(数据未显示)。那些移植了对照或AdHO-1处理的主动脉或那些服用MC后释放CO的受体动物之间的抗MHC I类同种异体抗体水平显示出无统计意义上的差异(图13)。
移植了经Ad-HO-1处理的或经CO处理的主动脉的受体动物内同种异体抗体的水平没有下降的事实说明在该模型中同种抗体在慢性排斥反应中不起重要作用或HO-1和CO抑制同种异体抗体的下调效应。这些结果同白细胞浸润和前炎症介质产生的减少联系起来，提示HO-1基因导入或CO治疗主要通过对效应器的局部免疫抑制效应来起作用。
如上面的数据所示，与对照非编码腺病毒处理的主动脉相比，腺病毒介导的HO-1基因导入主动脉的内皮，并且CO释放导致了内膜厚度显著减小。Ad-HO-1转导的或CO处理的主动脉显示出巨噬细胞、T细胞和CD4+细胞的数目减少，以及粘附分子、辅助激活分子、和细胞因子的表达减少，而且基因导入比CO处理具有更明显的效应。相反地，CO比Ad-HO-1处理更有效地抑制了内膜VSMC聚集以及更有效地保护血管的中膜。根据对周二氯甲烷进行的CO治疗的观察，揭示了对慢性排斥的抑制作用与从Ad-HO-1处理获得的结果相似，以上结果表明CO可以介导与增加的HO-1表达有关的保护效应。
实施例6二氯甲烷对大鼠胶原性关节炎模型的治疗作用胶原诱导的关节炎是一种T细胞依赖性的类风湿性关节炎动物模型。Trentham等的J.Exp.Med.146857-68(1977)、Brahn等的Arthritis and Rheumatism 37(6)839-45(1994)。在用II型胶原对弗氏不完全辅助的易感大鼠进行免疫后的两周内，发生了有血管翳形成和骨/软骨侵蚀的组织学改变的多发性关节炎。另外，对II型胶原的体液和细胞反应发生于CIA和类风湿性关节炎。因此，CIA是一个可用于在体内探查炎性关节膜炎的病因和研究潜在新治疗方法的有用和可接受的类风湿性关节炎的动物模型。
为了评估二氯甲烷作为一种一氧化碳生成性化合物在该疾病模型上的治疗潜力，体重在120至150克的雌性Lewis大鼠皮内注射0.5mg溶于0.1M乙酸并且在弗氏不完全佐剂中乳化的天然(native)鸡II型胶原。疾病发作时(大约10天)，将动物分为三组。一组每天使用赋形剂(vehicle)进行处理，第二和第三组每天分别给予100mg/kg/天和500mg/kg/天的二氯甲烷(口服)。根据标准化的肿胀和关节周围红斑的水平来评定疾病的严重程度。第28天将动物处死。如图14所示，在研究结束时，各关节治疗方法的得分分别为经赋形剂处理的动物组为6.8+/-0.7(均值+/-标准误差)、用100mg/kg/天处理的动物组为3.8+/-1.0、用500mg/kg/天处理的动物组为2.75。与对照动物相比，这些差异在统计学上是显著的(p＜0.02)。
通过X射线用盲法分析骨侵蚀确认了二氯甲烷治疗的疗效。来自赋形剂处理的动物的肢X射线得分为4.8+/-0.7。用100mg/kg/天二氯甲烷的治疗组得分为2.7+/-0.8，用500mg/kg/天的治疗组得分为1.8+/-0.7。这种差异在统计学上是显著的(p＜0.05)。
实施例7二氯甲烷治疗对导致动脉粥样化的ApoE-/-小鼠颈动脉线(wire)损伤后新生内膜生长的影响由于内皮损伤反应而产生的中膜VSMCs的迁移和增殖导致的新生内膜的VSMCs聚集，被认为是动脉硬化起始的主要事件之一。以前，由血红素氧化酶产生的一氧化碳显示出可用于抑制由丝裂原诱导的(mitogen-induced)血管平滑肌细胞的增殖(Togane等的supra、Duckers等的Nat.Med.7(6)693-98(2001))。
在动脉粥样硬化的小鼠裸露的颈动脉模型中，研究二氯甲烷分解代谢所产生CO的效应。雌性C57BL/6 ApoE(-/-)小鼠(10-12周，n＝12/组)在损伤前1周及其损伤后4周用西式食物喂养。在第0天用氯氨酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)腹腔内注射麻醉小鼠。将左颈动脉进行分离并用两条结扎线(6-O丝线)颈外动脉周围进行结扎，还用结扎线在颈总动脉和颈内动脉周围进行结扎。在将远端的颈动脉结扎线系住之后，在最接近结扎线的地方用Vannas剪刀剪断。将弯曲的弹性线(直径为0.35mm/0.014)引入颈外动脉并且沿颈总动脉壁旋绕三次。取出该线时将近端的颈动脉结扎线系住，并将皮肤用6-O丝线对合。
从第1天开始到第28天为止，腹腔内或口服给予二氯甲烷(25，100，400mg/kg/天)。将对照组喂以赋形剂。第28天处死动物，切开后将左右的颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉进行结扎。在胸骨切开术后，将颈总动脉进一步进行解剖到主动脉弓(arch)。将一只27标准规格(27-gauge)的针置于左心室，并在100mmHg的压力下通过左室插管(cannula)用磷酸缓冲的多聚甲醛(100mM，4％wt/vol，pH值为7.3)进行全身灌注。随后，将颈总动脉、颈内动脉、和颈外动脉进行横切并除去。标本经乙醇和二甲苯脱水后用石蜡包埋。将组织进行切片染色，并在显微镜下通过组织形态分析来评估VSMC的增殖效应。以每天400、100和25mg/kg的二氯甲烷进行治疗分别在90％、75％和30％的程度上抑制了新生内膜的形成。
所有在本说明书中提到的出版物和专利申请均结合于此作为参考，每项被引用于此的特定独立的出版物和专利申请在本文具有相同的含义。
目前对本发明进行全面描述，其对于本领域中的普通技术人员来说是明了的，在不偏离所附权利要求的精神或范围的情况下，可做出许多改变和变更。
权利要求
1.一种用于治疗哺乳动物血管性、炎性和免疫疾病的药物组合物，所述药物组合物包括能够在所述哺乳动物中增加碳氧血红蛋白水平的一氧化碳生成性化合物。
2.根据权利要求1中所述的药物组合物，其中所述一氧化碳生成性化合物包括二氯甲烷。
3.一种用于提高哺乳动物中的碳氧血红蛋白水平的药物组合物，所述组合物包括在制药上可接受的赋形剂中的二氯甲烷。
4.一种用于提高哺乳动物中的碳氧血红蛋白水平的方法，包括将足量的一氧化碳生成性化合物给予所述哺乳动物以将所述碳氧血红蛋白水平提高到约1-10％之间。
5.根据权利要求4中所述方法，其中所述一氧化碳生成性化合物包括二氯甲烷。
6.根据权利要求5中所述方法，其中所述二氯甲烷是经口服给药的。
7.一种延长器官移植体在受体中存活时间的方法，所述方法包括将治疗剂量的一氧化碳生成性化合物给予所述受体，以延长所述器官移植体的存活时间。
8.一种用于抑制由能够产生所述炎性细胞因子蛋白的细胞产生的炎性细胞因子蛋白的方法，所述方法包括将所述细胞与治疗剂量的一氧化碳生成性化合物结合；其中由所述细胞产生的所述炎性细胞因子被抑制。
9.一种用于抑制哺乳动物炎性反应的方法，所述方法包括将所述哺乳动物与治疗剂量的一氧化碳生成性化合物接触；其中所述炎性反应被抑制。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述炎性反应与感染性休克、类风湿性关节炎、克隆氏症、结肠炎、或缺血/再灌注损伤有关。
11.一种用于抑制血管平滑肌细胞增殖的方法，所述方法包括将所述哺乳动物与治疗剂量的一氧化碳生成性化合物接触；其中所述血管平滑肌细胞增殖被抑制。
12.一种用于在血管损伤后抑制新生内膜形成的方法，所述方法包括将所述哺乳动物与治疗剂量的一氧化碳生成性化合物接触；其中所述新生内膜形成被抑制。
13.根据权利要求7-12中任何之一所述的方法，其中所述一氧化碳生成性化合物为二氯甲烷。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗剂量在约1-100mg/kg的范围内。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗剂量足以使所述哺乳动物的血中碳氧血红蛋白水平提高到约1-10％之间。
全文摘要
本发明提供了用包括二氯甲烷在内的一氧化碳生成性化合物治疗血管性疾病以及调节炎性和免疫应答的方法和组合物。所述化合物能够抑制血管平滑肌细胞的增殖，保护血管结构免受氧化应激和损伤，调节各种免疫系统细胞的活性，抑制促炎性细胞因子的产生并增强抗炎性细胞因子的产生，因此在治疗与不良增殖性和炎性反应相关的疾病时有效。本发明还提供了延长器官移植体的存活期和抑制慢性排斥反应的方法。
文档编号A61P19/02GK1507348SQ02809432
公开日2004年6月23日 申请日期2002年4月1日 优先权日2001年3月30日
发明者罗兰·比洛, 雅基·伍, 伍, 罗兰 比洛 申请人:桑查特医药公司