被dna和抗原组合增效的疫苗制剂的制作方法

专利名称：被dna和抗原组合增效的疫苗制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于药学领域的分支，具体来说是一种新的疫苗抗原制剂。本发明的技术目标是开发一种新的疫苗制剂，使成分的数目最小化，其中所述成分能通过相互作用引起加强和多样的免疫应答。另外，开发了组合疫苗制剂以增强其诱导的针对共同施用抗原的免疫应答。
现有技术有效的抗HCV疫苗的获得还存在一些障碍。由于HCV的RNA特性，HCV能够快速突变以适应环境。这导致在世界各地多种已被鉴定的病毒种群的序列存在着高度多变性。在HCV中，最重要的异种性区域是其E2蛋白质的超变区I，在此区可能存在一个中和抗原表位。即使存在活跃的免疫应答，HCV也能引起持续的感染(见Lechmann等人，SeminLiver Dis 2000，20，211-226)。目前并没有病毒有效复制的动物模型和体外培养系统，以及关于中和抗体的研究。与疾病进程和保护相关的免疫模式还没有被定义。对于感染的消退而言，有效的、多特异性的(multispecific)和长效的体液和细胞免疫应答很可能是必需的(见Lechmann等人，Semin Liver Dis 2000，20，211-226)。
人们已经用几种方法去研制抗HCV疫苗，目前最普遍被研究的是重组蛋白质、合成肽、病毒样颗粒、DNA疫苗和活病毒载体。
对于HCV来说，基于蛋白质亚基来研发疫苗是最初被应用的策略之一，因为对几种黄病毒而言，抗表面蛋白质的抗体能够起到保护作用。几种基于HCV结构抗原的变体已经在动物体内起到了有限的抗病毒作用。例如用E1-E2的异二聚体免疫黑猩猩，在7只被免疫的黑猩猩中，5只产生了保护作用而另外2只感染了自限性疾病(见Choo等人，PROC NATL ACAD SCI USES 1994，91，1294-1298)。这种保护作用与能够抑制E2同人细胞结合的抗体(Abs)的存在有关(见Rosa等人，PROC NATL ACAD SCI USES 1996，93，1759-1763)。
来源于基因型1b种群的E1重组蛋白质已经被纯化，是一种直径大约为9纳米的自连接同二聚体颗粒(见Maertens等人，RecordsGastroenterol Belg 2000，63，203)。用50μg的E1重组蛋白质免疫9个剂量后，两只黑猩猩感染慢性HCV。接种疫苗提高了肝脏的组织学功能，使肝脏中的病毒抗原消失。并且接种E1重组蛋白质也降低了丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。尽管在治疗期间血清中的病毒RNA浓度并没有改变，但是在治疗后肝脏炎症反应和病毒抗原的水平都增加了。病情的改善与高水平的抗E1抗体相关(见Maertens等人，Records Gastroenterol Belg 2000，63，203)。
特别是，由重组蛋白质形成病毒样颗粒及它们作为疫苗使用都是非常有吸引力的，因为这些结构常常具有类似病毒的特性。用一种包含HCV结构抗原序列的重组杆状病毒感染昆虫细胞得到了这种颗粒，它能够同时产生抗这些抗原的体液和细胞免疫应答(见Baumert等人，Gastroenterology 1999，117，1397-1407和Lechmann等人，Hepatology 1999，30，423-429)。尽管对基于蛋白质亚基研制的疫苗的测试结果是令人鼓舞的，但是通过这些变体诱导的免疫应答主要为短期的、种群特异性的体液免疫。
另一方面，对不同重组病毒载体进行研究以用于开发抗HCV的重组疫苗。特别是，由于腺病毒有肝脏趋向性，能够同时诱导体液和细胞免疫，且易于口服或全身给药，使得重组腺病毒载体成为令人感兴趣的候选者。包含编码HCV结构蛋白质的DNA序列的腺病毒诱导出抗每种此类蛋白质的抗体反应(见Makimura等人，Vaccine 1996，14，28-36)。此外，用C和E1的重组腺病毒免疫小鼠以后，产生了一种抗这些抗原的特异的CTL反应(见Bruna-Romero等人，Hepatology1997，25，470-477)。尽管这些结果是激动人心的，但是近来重组腺病毒用于基因治疗方面产生了问题，它们是否可以在人体中使用受到质疑。其它包含不同HCV基因的重组病毒(如牛痘、金丝雀痘和鸡痘病毒)在小鼠体内可以诱导强的CTL和T-辅助细胞免疫应答(见Shirai等人，J Virol 1994，68，3334-3342和Large等人，J Immunol 1999，162，931-938)。然而这些重组病毒和其它α病毒的变种(如塞姆利基森林病毒)也由于它们使用时的监管问题和安全问题受到了影响。
在HCV聚蛋白中鉴定出来的几个CD4+和CD8+T细胞的抗原表位对清除病毒是十分重要的，这一鉴定结果支持了把合成肽作为抗这种病原体的候选疫苗的评测。包含C、NS4和NS5抗原表位的不同肽，不管是否脂质化，都可在小鼠体内诱导出强的CTL反应(见Shirai等人，J Infect Dis 1996，173，24-31；Hiranuma等人，Hiranuma等人，J Gene Virol 1999，80，187-193；Oseroff等人，Vaccine 1998，16，823-833)。
另一个用于研制抗HCV疫苗的策略基于产生抗线性抗原表位抗体的可能性。这种可供选择的办法主要用于产生抗HCV的HVR-1的抗体，而且在对兔子和黑猩猩的实验中已经有了一些令人鼓舞的结果(见Esumi等人，Arch Virol 1999，144，973-980和Shang等人，Virology1999，258，396-405)。对于选择HVR-1作为抗HCV的疫苗的靶标而言，准种(quasi-species)是一个主要问题。
肽疫苗的主要障碍在于，没有T辅助细胞抗原表位的肽的免疫原性很差。而且，疫苗的效率常常根据诱导出针对大范围不同抗原的特异免疫应答来判断的。这些限制是此种策略的主要缺陷。
DNA免疫是最近在疫苗研制中常用的策略之一。DNA疫苗由纯化的质粒组成，该质粒包含编码目的抗原的序列，该序列位于真核细胞的功能转录单位调控之下。将质粒注射入肌肉或者皮肤以后，质粒被宿主细胞吸收同时在其细胞内表达抗原。在宿主细胞内表达所编码的抗原是此方法的主要优点，因为这与病毒的天然感染类似。DNA的处理简易性及其稳定性是DNA免疫的另一些优点，其中DNA的稳定性使DNA可以被相对便宜的大规模生产。
用编码共同刺激分子(如细胞因子)的分子或者基因共免疫可以调节此类疫苗诱导的免疫应答。遗传构建体可以通过以下方式被修饰插入或者缺失跨膜区、分泌信号序列或影响抗原细胞内运输和加工的其它类型残基。
特别地，在研制抗HCV疫苗过程中，DNA免疫已经被广泛研究。编码HCV衣壳蛋白的全长或截短变体的不同表达载体已经被构建(见Lagging等人，J Virol 1995，69，5859-5863；Chen等人，VaccineRes 1995，4，135-144)。还有包含HCV的5非转录区的构建体(见Tokushige等人，Hepatology 1996，24，14-20)。表达乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原或者其它HBV衣壳抗原的融合变体的构建体也已经被研究(见Major等人，J VIROL 1995，69，5798-5805)。用这些质粒来免疫通常能诱导出阳性CTL和淋巴细胞增殖反应。
HCV的包膜蛋白同样也已成为此类技术的靶标。在HCV E2的情况下，体液免疫应答好像主要针对HVR-1(见Lee等人，Mol Cells 1998，8，444-451)。用表达E1和E2蛋白质的细胞内或者分泌型变体的质粒免疫可以产生类似的免疫应答(见Lee等人，J VIROL 1998，72，8430-8436)。用表达GM-CSF和HCV E1或E2蛋白质的双顺反子质粒接种免疫增加了体液和细胞免疫应答。最近，应用表达E1和E2蛋白质的双顺反子质粒，研究了在体内这两种蛋白质的异二聚体形成对DNA免疫后诱导的免疫应答的影响。当形成异二聚体时，没有得到抗HCV E1和E2蛋白质的抗体反应。明显相反的是，当用表达E1和E2的截短变体的质粒免疫以后，获得了针对线性及构象抗原表位的高水平的抗体滴度。因此，当评估包含这些抗原的构建体时，为了获得强的抗体反应，避免异二聚体的形成似乎是必要的(见Fournillier等人，J VIROL1999，73，497-504)。
一些非结构蛋白质也用此技术评测。在一种载体中插入编码NS3蛋白质的C-末端结构域的区域，并且这个载体允许此结构域和IL-2的表达同时且相互独立的进行，当用这个构建体免疫时，获得了比较好的结果(见Papa等人，Res Virol 1998，149，315-319)。用这种免疫策略，NS4和NS5蛋白质也产生了抗体和CTL反应(见Encke等人，J IMMUNOL 1998，161，4917-4923)。最近，人们用编码GM-CSF和病毒非结构蛋白质(NS3、NS4和NS5)的构建体诱导出抗每一个非结构蛋白质的有效抗体反应和加强的淋巴增殖反应(见Cho等人，Vaccine 1999，17，1136-1144)。
对于不同的DNA构建体，已经报道了不同HCV抗原的有效表达，以及根据研究中的组合产生1∶100到1∶100000的抗HCV抗体水平(见Inchauspe等人，Vaccine 1997，15，853-856)。另外，特异的CTL和淋巴细胞增殖反应已经被证实(见Inchauspe等人，DNA AND CELLBIOLOGY 1997，16，185-195)。然而，为了产生更强的抗不同HCV蛋白质的体液和细胞免疫应答，需要更多的努力改善此方法。因此，研究了一些变体，比如脂质体(见Gramzinski等人，Mol Medicine1998，4，109-118)和皂苷QS-21(见Sasaki等人，J Virol 1998，72，4931-4939)，对DNA免疫后诱导的免疫应答的增强作用。并且也研究了在DNA免疫过程中作为生物佐剂的树突细胞。通过使用病毒载体(见Specht等人，J Exp Med 1997，186，1213-1221；Brossart等人，J Immunol 1997，158，3270-3276；Song等人，J Exp Med 1997，186，1247-1256)或者RNA(见Boczkowski等人，J Exp Med 1996，184，465-472)，证明了来源于遗传修饰大鼠骨髓并且表达肿瘤抗原的树突细胞(CD)能够促进T细胞针对肿瘤抗原的特异性反应和在大鼠中由细胞介导的抗肿瘤预防免疫。
目前，DNA免疫载体的改良，包括插入CpG基元来增加对所表达抗原的免疫应答(见Hasan等人，J Immunol Meth 1999，229，1-22)，以及DNA的递送体系对于克服此类技术的局限性是极其重要的。由于HCV感染难于阐明，而且关于针对病原体的保护的免疫学参数缺乏一个清晰的定义，所以一种对于HCV有效的疫苗可能需要能够刺激免疫应答的多个方面的多特异性途径。这一问题的解决依赖于迄今所用的几种疫苗策略的组合。特别是，用DNA疫苗的初次免疫和用重组蛋白或病毒载体的加强免疫相组合的免疫方案已经得到了研究(见Hu等人，Vaccine 1999，17，3160-3170；Pancholi等人，J Infect Dis2000，182，18-27)，尽管这种免疫策略的结果是阳性的，但是，若要证明这种初次免疫-加强免疫策略是否真能诱导针对HCV的保护性免疫，仍需要进一步的研究。
另外，对于乙型肝炎模型，已经对一种疫苗进行了研究，此疫苗包含乙型肝炎表面抗原、此抗原的特异性抗体和表达此种抗原的DNA形成的复合物(见Wen等人，US622 1664，1998)。此制剂允许抗原以不同的方法呈递，并且快速诱导免疫应答，所述免疫应答的效果优于由单个变体所产生的免疫应答。
本发明描述了一种疫苗制剂，其只包含一种抗原蛋白及表达一个或几个蛋白质的质粒作为组分，其中它们中的至少一种作为另一种的佐剂。特别是，还对丙型或乙型肝炎病毒的衣壳抗原和表达单独HCV E1蛋白质或其聚蛋白变体的质粒进行了研究。与前面描述的针对乙型肝炎模型的组合物相反，制剂中的抗体对于免疫应答的增强并不是必需的，因此减少了所需的组分数量。另外，疫苗组合物的极大灵活性也允许对不同抗原的有效免疫应答得以同时产生。
发明详述本发明提供了预防或治疗HCV和HBV及其组合的组合物以及个体免疫方法。首次报道了含有如下组分的疫苗制剂(a)DNA，其表达包括HCV包膜E1抗原区的蛋白质变体；(b)适当比例的HCV或者HBV的蛋白质抗原。本发明的新颖性在于至少一种组分对另一种组分所产生的免疫应答起辅助作用。对于产生抗HCV和HBV的免疫应答来说，疫苗制剂中由遗传构建体编码并由宿主细胞表达的抗原和蛋白质抗原都是令人感兴趣的靶标。从而，免疫应答能够针对大量的重要抗原。
疫苗制剂包括DNA，该DNA能增强针对与其混合的抗原的免疫应答；这一作用依赖于在被免疫宿主体内DNA编码的一种或几种蛋白质的表达。该DNA来源于细菌菌株并按照传统步骤纯化(见Horn等人，H GeneTher 1995，6，565-573)。
在优选实施方案中，疫苗制剂包括至少下列质粒中的至少一种pIDKE1S、pIDKE2和pAEC-ME，其编码所表达的蛋白质变体的DNA序列分别同序列2-4相一致。
pIDKE1S质粒表达包含HCV E1的176-363氨基酸的蛋白质(Sec.Id.No.2)。另一方面，pIDKE2质粒表达包含病毒聚蛋白最初650个氨基酸(C、E1和E2的一部分)的蛋白质(Sec.Id.No.3)。pAEC-ME质粒表达一个嵌合蛋白质(Sec.Id.No.4)，其包含不同HCV抗原的B细胞和T细胞的抗原表位。在这些质粒中，病毒抗原的编码序列由一个古巴HCV病毒株的cDNA得到(见Morales等人，1998，WO 98/25960)。pIDKE1S、pIDKE2和pAEC-ME质粒包含插入到pAEC-K6质粒的多克隆位点当中的HCV抗原编码序列(见Herrera等人，Biochem Biophys ResCommun.2000，279，548-551)。本发明中所用的质粒含有能够在人体细胞内调控抗原表达的调控元件，这些调控元件包括在哺乳动物体内有功能的转录单位，其例如通过人类巨细胞病毒的启动子和猴病毒40的多聚腺苷酸化信号而整合。这些质粒还包括细菌的复制起点和抗卡那霉素的筛选标记。
本制剂的蛋白质组分可以是能够形成颗粒的可溶病毒抗原，其纯度超过90％。在优选实施方案中，疫苗制剂的蛋白质成分是HCV和HBV的衣壳抗原，它们可以增强针对与它们混合在一起的DNA所表达的蛋白质的免疫应答。
本发明还涉及制备所述DNA和抗原混合物的工艺流程。混合物的制备是将要添加的组分(DNA和抗原)溶解在合适的缓冲液中来完成的。在优选实施方案中，两种成分以10/1(w/w)的比例溶解在磷酸盐溶液中而制备制剂。在对个体施用之前，该混合物要在26-30℃之间至少摇动孵育2小时。此制剂可以通过肌肉内、皮下、腹膜内、粘膜内、静脉内、舌下或者其它的方式给药。免疫接种可以借助于注射器、基因枪、喷雾器或者其它递送设备。根据动物的种类和使用的免疫方法不同，每个个体所接受的每一种组分的剂量为每体积0.001毫克到10毫克。
当疫苗制剂的组分是DNA和蛋白质抗原的混合物时，所得到的产品优于各自的单个组分，原因如下
-可能产生针对大量抗原的比较强和多样的体液和细胞免疫应答。
-因为抗原2同时又是佐剂，这就减少了由佐剂的注射所产生的毒性作用。
-可以将这些制剂用作组合疫苗的核心。
-疫苗制剂的生产方法不需要抗原的吸附作用。
在制剂包含DNA和HCV衣壳蛋白质的情况下，其中所述DNA表达包含HCV E1蛋白质区域的蛋白质变体，所得到的产品优于各自的单个组分，原因如下-可能产生针对大量抗原表位的比较强和多样的体液和细胞免疫应答。
-因为抗原2同时又是佐剂，这就减少了由佐剂的注射所产生的毒性作用。
--可以将DNA和衣壳蛋白质一起作为组合或者多价疫苗的核心。
另一方面，用表达包含HCV E1蛋白区域的蛋白质变体的DNA免疫，提高了制剂中存在的HBV蛋白质抗原的免疫原性。尤其是，同HBsAg或者HBcAg混合得到的混合物，其结果比用这一抗原得到的更好，原因如下a)诱导出的抗HBsAg的IgG水平要优于用氢氧化铝和HbsAg接种所得到的IgG水平。
b)组成一个有力的HBV-HCV组合疫苗。
c)疫苗制剂的生产方法不需要抗原的吸附作用。
附图简述

图1质粒pAEC-ME、pIDKE1S和pIDKE2的示意图。
图2此图为电子显微镜成像结果，其中(A)为HCV衣壳颗粒；(B)为HBV的表面抗原；(C)为HBV衣壳颗粒。
图3此图显示pIDKE2质粒和核心蛋白质的免疫图，动物通过肌肉内注射免疫，剂量为50μg的DNA和5μg蛋白质。
图4此图显示由接种不同质粒和HBcAg蛋白质产生的免疫作用，动物通过肌肉内注射免疫，剂量为50μg的DNA和5μg蛋白质。
图5此图显示由接种不同质粒和HBcAg蛋白质产生的免疫作用，动物通过肌肉内注射免疫，剂量为50μg的DNA和5μg蛋白质。
实施例实施例1含有表达HCV的聚蛋白Capsid-E1-E2的DNA和HCV衣壳蛋白质抗原作为组分的制剂的免疫原性为了证明接种pIDKE2质粒(图1)和重组HCV衣壳颗粒(图2A)的混合物后抗HCV结构抗原的免疫应答的增强，通过肌肉内注射免疫了每组10只8周大的BALB/c雌性小鼠。除了其中一组只研究了在0天单次接种的影响，其余均在0天和21天两次接种。初次免疫后14周采血样。免疫原溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中施用。第1组用50μg的pIDKE2质粒(图1，质粒包含编码病毒聚蛋白最初650个氨基酸的序列，Sec.Id.No3)接种。第2组用5μg的核心蛋白质(包含HCV衣壳蛋白质的最初173个氨基酸)接种。第3组先用5μg的核心蛋白质接种，然后再用50μg的pIDKE2质粒接种(核心蛋白质/pIDKE2)。第4组接种的条件同第三组的一样，只是颠倒了次序(pIDKE2/核心蛋白质)。第5组在0天和21天用50μg pIDKE2和5μg核心蛋白质的混合物接种(核心蛋白质-pIDKE2)。第6组同第5组的接种方式一样，但仅在0天接种(核心蛋白质-pIDKE2(1))。另外第7组为阴性对照，用50μg的pAEC-K6质粒(它不包含编码HCV抗原的序列)免疫。
通过ELISA来检测针对HCV结构蛋白质的抗体免疫反应。实验结果用Student T检验，p＜0.05时认为具有统计学差异。
图3显示，同使用单个组分相比，两次施用pIDKE2和核心蛋白质的混合物能够提高抗HCV结构抗原的免疫应答。此制剂(两次接种)诱导的抗HCV E1和E2包膜蛋白质的抗体效价，在统计学上高于在其它组中所获得的抗体效价(图3A)。这些抗体效价也高于单次接种pIDKE2和核心蛋白质的混合物获得的抗HCV衣壳蛋白质的抗体效价(图3A)。单次接种混合物通常比其它免疫组诱导的抗体效价要低。
抗HCV结构抗原的淋巴细胞增殖反应检测显示(图3B)，两次接种pIDKE2-核心蛋白质所产生的抗衣壳的反应显著优于其它组。结果以被免疫动物脾细胞刺激指数的形式给出。刺激指数由(H3)胸腺嘧啶脱氧核苷的摄取测定。可以得出结论，pIDKE2和核心蛋白质混合物对针对HCV结构抗原的免疫应答产生协同刺激。
实施例2含有表达HCV的聚蛋白Capsid-E1-E2的DNA和HBV衣壳蛋白质抗原作为组分的制剂的免疫原性为了研究pIDKE2质粒和其他病原体蛋白质抗原的混合物诱导的免疫应答，用pIDKE2质粒与HBV衣壳重组颗粒(HBcAg，图2C)的混合物，通过肌肉内注射免疫每组10只8周大的BALB/c雌性小鼠。在0天和21天两次接种，初次免疫后9周和19周采血样。免疫原溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中而制备。质粒施用剂量为50μg，HBV衣壳蛋白质施用剂量为5μg。第1组用pAEC-K6质粒(阴性对照)接种。第2组用HBcAg蛋白质免疫。第3组用pIDKE2质粒接种。第4组和第5组分别用pIDKE2和pAEC-K6与HBcAg的混合物接种。实验结果用Student T检验进行统计分析，p＜0.05时认为有显著性差异。
图4显示初次免疫后19周在小鼠中诱导的抗体反应。由图4A可见，pIDKE2和HbcAg的混合物诱导的抗HBcAg的抗体效价，在统计学上高于其它免疫动物得到的抗体效价。单独免疫HbcAg或与pAEC-K6混合免疫的组之间并没有统计学上的差异。因此可以得出结论，pIDKE2质粒能够增强抗HBcAg的免疫应答。
另一方面，由图4B可见，pIDKE2和HbcAg的混合物诱导的抗HCV结构抗原的抗体效价，比用pIDKE2单独免疫要高。因此，HBcAg也能够增强pIDKE2施用后诱导的抗HCV结构抗原的免疫应答。
实施例3含有表达HCV和HBV变体的质粒以及HBV表面抗原的蛋白质变体作为组分的制剂的免疫原性为证明在联合施用pIDKE2质粒后，产生的抗其它蛋白质抗原的免疫应答的增强，并研究具有相似佐剂特性的其它质粒，用质粒与HBsAg重组颗粒(图2B)的混合物，通过肌肉内注射免疫每组10只8周大的BALB/c雌性小鼠。在0天、21天和50天三次接种，初次免疫后16周采血样。除一组免疫原用氢氧化铝配制外，其他免疫原均溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中制备。第1组用50μg的pIDKCo质粒和5μg HbsAg的混合物(pIDKCo-HBsAg)接种，其中pIDKCo质粒包含编码HCV衣壳蛋白质前176个氨基酸的序列，(见Duenas-Carrera等人，Vaccine2000；19(7)992-997)。第2组到第7组接种相同量的HBsAg与DNA的混合物，但使用下列质粒第2组(pIDKE1S-HBsAg)，pIDKE1S质粒(图1，包括编码HCV聚蛋白176-363氨基酸的序列，Sec.Id.No2)；第3组(pAEC-ME-HBsAg)，pAEC-ME质粒(图1，包括编码含有HCV抗原不同抗原表位的蛋白质的序列，Sec.Id.No4)；第4组(pIDKE2-HBsAg)，pIDKE2质粒(图1，包括编码HCV聚蛋白1-650氨基酸的序列，Sec.Id.No3)；第5组(pIDKE1Sm-HBsAg)，pIDKE1Sm质粒，其与pIDKE1S相同，但在HCV E1编码区插入2个核苷酸片段，从而改变了开放阅读框并阻碍了该蛋白质表达(Sec.Id.No5)；第6组(pAEC-d2-HBsAg-HBsAg)，pAEC-d2-HBsAg质粒，其包含编码HBVHBsAg的序列(见Musacchio等人，Biochem Bioph Res Commun 2001，282，442-446)；第7组(pAEC-K6-HBsAg)，pAEC-K6质粒(为阴性对照，在转录单位控制下没有编码序列)。最后第8组和第9组分别接种5μg用氢氧化铝配制的或者单独的HBsAg。实验结果用Student T检验进行统计分析，p＜0.05时认为有显著性差异。
图5显示初次免疫16周后，产生的抗HBsAg的抗体效价。由单独用溶解在PBS中的HBsAg诱导产生的抗体水平，在统计学上低于除pAEC-K6和HbsAg的混合物外的其它变体所产生的抗体水平。另一方面，质粒pIDKCo、pIDKE1S、pAEC-ME和pIDKE2与HBsAg的混合物诱导的抗HBsAg的抗体效价，在统计学上高于配制在氢氧化铝中的HBsAg或者同质粒pAEC-K6混合的HBsAg制剂。用氢氧化铝配制的或者同pAEC-K6、pIDKE1Sm和pAEC-d2-HBsAg混合的HBsAg制剂来免疫，得到相近的抗HBsAg的抗体效价水平。可以作出一个结论，在宿主细胞中，包含HCV E1抗原的氨基酸区域的蛋白质变体从所施用的质粒中的表达增强了抗蛋白质抗原(同DNA构建体混合的)的免疫应答。
序列表序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>被DNA和抗原组合增效的疫苗制剂<130>HCV List<140>
<141>
<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>531<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述pIDKCo<400>1atgagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120ggccccaggt tgggtgtgcg cgcaactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga 180aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgg cccgagggca ggtcctgggc ccagcccggg 240tacccttggc ccctctatgg taacgagggc atgggatggg caggatggct cctgtcaccc 300cgtggctctc ggcctagttg gggccccact gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ctggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac 480ggcgtgaatt atgcaacagg gaatctgccc ggttgctctt tctctctcta a 531<210>2<211>567<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>基因<222>(1)..(1950)<223>包括编码HCV聚蛋白的1-650位氨基酸的核苷酸序列，该段氨基酸序列包括壳、E1和E2蛋白质的一部分。
<220>
<223>人工序列描述pIDKE2<400>3atgagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120ggccccaggt tgggtgtgcg cgcaactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga 180aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgg cccgagggca ggtcctgggc ccagcccggg 240tacccttggc ccctctatgg taacgagggc atgggatggg caggatggct cctgtcaccc 300cgtggctctc ggcctagttg gggccccact gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ctggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac 480ggcgtgaatt atgcaacagg gaatctgccc ggttgctctt tctctctctt ccttttggct 540ttgctgtcct gtttgaccat cccagtttcc gcctatgaag tgcgcaacgc gtccggggtg 600taccatgtca cgaacgactg ctccaactca agcattgtgt atgaggcaga cgacatgatc 660atgcacaccc ccggatgcgt gccctgcgtt cgggaggaca acacctcccg ctgctgggta 720gcgctcaccc ccacactcgc ggccaggaat gccagcgtcc ccaccacgac aatacgacgc 780cacgtcgatt tgctcgttgg ggcggctgct ctctgctccg ctatgtacgt gggggatctc 840tgcggatctg ttttcctcgt ttcccagctg ttcaccttct cgcctcgccg gcatgagaca 900gcacaggact gcaactgctc aatctatccc ggccacgtat caggtcaccg catggcctgg 960gatatgatga tgaactggtc accttcaaca gccctagtgg tatcgcagtt actccggatc 1020ccacaagccg tcgtggacat ggtagcgggg gcccactggg gagtcctagc gggccttgcc 1080tactactcca tggtggggaa ctgggccaag gttttgattg tgatgctact ctttgccggc 1140
gttgacggga cgggaaccta cgtgacaggg gggacggcag cccgcggcgt cagccagttt 1200acgggcctct ttacatctgg gccgagtcag aaaatccagc ttgtaaatac caacggcagc 1260tggcatatta accggactgc cctgaactgc aacgactccc tccagaccgg gttccttgct 1320gcgttgtttt acgtgcacag gttcaactcg tccggatgct cagatcgcat ggccagctgc 1380cgccccattg atacgttcga ccaggggtgg ggccccatta cttacgctga gccgcgcagc 1440ttggaccaga ggccctattg ctggcactac gcacctcaac cgtgtggtat cgtacccgcg 1500gcggaggtgt gtggtccagt gtattgtttc actccaagcc ccgttgtcgt ggggaccacc 1560gatcgttccg gcgtccctac gtataactgg ggggagaatg agacggacgt gctgctcctt 1620aacaacacgc ggccgccgct gggcaactgg tttggctgta catggatgaa tagcactggg 1680ttcaccaaga cgtgcggggg ccctccgtat aacatcggag gggtcggtaa caacaccttg 1740acctgcccta cggattgctt ccgcaagcac cccgaggcca cttacaccaa atgtggtttg 1800gggccttggt tgacacctag gtgcttggtc gactacccat acaggctttg gcattacccc 1860tgcactgtca actttaccat cttcaaggtt cggatgtatg tggggggcgt ggagcacagg 1920cttaccgctg catgcaactg gactcgagga taa 1953<210>4<211>1194<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>基因<222>(1)..(1191)<223>包括编码HCV蛋白质的不同抗原表位的核苷酸序列<220>
<223>人工序列描述pAEC-ME<400>4atgacgggaa cctacgtgac aggggggacg gcagcccgcg gcgtcagcca gtttacgggc 60ctctttacat ctgggccgag tcagaaaatc cagcttgtaa ataccaacgg cagctggcat 120attaaccgga ctgccctgaa ctgcaacgac tccctccaga ccgggttcct tgctgcgttg 180ttttacgtgc acaggttcaa ctcgtccgga tgctcagatc gcatggccag ctgccgcccc 240attgatacgt tcgaccaggg gtggggcccc attacttacg ctgagccgcg cagcttggac 300cagaggccct attgctggca ctacgcacct caaccgtgtg gtatcgtacc cgcggcggag 360gtgtgtggtc cagtgtattg tttcactcca agccccgttg tcgtggggac caccgatcgt 420tccggcgtcc ctacgtataa ctggggggag aatgagacgg acgtgctgct ccttaacaac 480acgcggccgc cgctgggcaa ctggtttggc tgtacatgga tgaatagcac tgggttcacc 540aagacgtgcg ggggccctcc gtataacatc ggaggggtcg gtaacaacac cttgacctgc 600cctacggatt gcttccgcaa gcacggatcc acccacgtga ccggcggcag ccaggcccgc 660accacccaca gcttcacctc cctgctgcgc cagggcgcca agcagaacgt gcagctgatc 720gccgacctga tgggctacat cccactggtg ggcgccccac tgggcaagaa gggccacgtg 780agcggccacc gcatggcctg ggacatgatg atgaactggg ccagcaagaa ggccgccagc 840cgcgccgccg gcttgcagga cagcaccatg ctggtgagcc acacccgcgt gaccggcggc 900gtggccggcc acgtgaccag cggcctggtg tccctgttca gccctggcgc cagccagaag 960atccagctgg tgggctccag cttcagcctg ttcctgttgg ccctcctgag cagcttgacc 1020atcaagaaga tgagctactc ctggaccggc gccctggtga ccccaagcgc cgccgagaag 1080aagctgttgt tcaacatcct gggcggctgg gtgaagaaga gcatggtggg caactgggcc 1140aaggtgaaga agtacaccgg cgacttcgac agcgtgatcg actccaggcc ttaa1194
<210>5<211>569<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述pIDKE1Sm<220>
<221>基因<222>(1)..(566)<223>包括编码HCV E1的核苷酸序列，该核苷酸具有两个核苷酸插入片段，从而改变了ORF并产生了不相关的小蛋白质<400>5attgttcctt ttggctttgc tgtcctgttt gaccatccca gtttccgcct atgaagtgcg 60caacgcgtcc ggggtgtacc atgtcacgaa cgactgactc caactcaagc attgtgtatg 120aggcagacga catgatcatg cacacccccg gatgcgtgcc ctgcgttcgg gaggacaaca 180cctcccgctg ctgggtagcg ctcaccccca cactcgcggc caggaatgcc agcgtcccca 240ccacgacaat acgacgccac gtcgatttgc tcgttggggc ggctgctctc tgctccgcta 300tgtacgtggg ggatctctgc ggatctgttt tcctcgtttc ccagctgttc accttctcgc 360ctcgccggca tgagacagca caggactgca actgctcaat ctatcccggc cacgtatcag 420gtcaccgcat ggcctgggat atgatgatga actggtcacc ttcaacagcc ctagtggtat 480cgcagttact ccggatccca caagccgtcg tggacatggt agcgggggcc cactggggag 540tcctagcggg ccttgcctac tactcctaa569权利要求
1.一种疫苗制剂，其具有表达蛋白质的DNA和蛋白质抗原作为组分，其中该制剂中所述组分的至少一种作为另一种组分的佐剂。
2.权利要求1中的疫苗制剂，其具有DNA和病毒蛋白作为组分，其中所述DNA表达包含丙型肝炎病毒E1抗原的区域的蛋白质变体。
3.权利要求1和2中的疫苗制剂，其具有由SEQ ID No.3序列鉴定的DNA和丙型肝炎病毒衣壳蛋白质作为组分。
4.权利要求1和2中的疫苗制剂，其具有由SEQ ID No.3序列鉴定的DNA和乙型肝炎病毒衣壳蛋白质作为组分。
5.权利要求1和2中的疫苗制剂，其具有由SEQ ID No.2-4序列鉴定的DNA和乙型肝炎病毒表面抗原作为组分。
6.权利要求1至5中的疫苗制剂，用作针对丙型肝炎病毒的治疗和/或预防剂。
7.权利要求4和5中的疫苗制剂，用作针对乙型肝炎病毒的治疗和/或预防剂。
8.权利要求4和5中的疫苗制剂，用作针对丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的治疗和/或预防剂。
全文摘要
本发明涉及一种疫苗抗原制剂，包含以下主要组分a)一种或者多种DNA，其可以在被免疫的个体内表达一种或者多种蛋白质；b)适当比例的病毒抗原。本发明的新颖性在于至少一种组分对另一种组分所引起的免疫应答起增强作用。本发明还涉及到新制剂的研制，该制剂使能够扩大和加强抗不同病原体的免疫应答的成分的数目最小化，并且还产生抗病原体的组合疫苗。所述制剂适用于以针对个体预防和/或治疗为目的的工业制药。
文档编号A61K39/29GK1529616SQ02814282
公开日2004年9月15日 申请日期2002年7月12日 优先权日2001年7月16日
发明者S·杜纳斯卡里拉, J·默拉尔斯格里洛, L·阿尔瓦里兹－拉乔切尔庞斯德里昂, A·穆萨奇奥拉萨, R·帕乔佩特, A·维纳罗德里奎兹, J·C·阿尔瓦里兹奥博里宫, N·阿克斯塔里维罗, G·马提尼兹多纳托, S 杜纳斯卡里拉, 呃镒 拉乔切尔庞斯德里昂, 垢窭锫, 姘吕, 崮嶙榷嗄赏, 怂顾 镂 , 桥逄, 阿尔瓦里兹奥博里宫, 陕薜吕锟 申请人:遗传工程与生物技术中心