专利名称：从肥大细胞培养物制备肝素的方法
技术领域：
本发明涉及由细胞培养物制备肝素的方法。
肝素属于糖胺聚糖(GAG)家族，该家族包括含有由氨基糖(D-葡糖胺或半乳糖胺)和糖醛酸(D-葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)组成的二糖序列之重复的线型多糖。
对于和硫酸乙酰肝素一起属于糖胺聚糖亚家族的肝素，氨基糖是D-葡糖胺。糖醛酸既可以是葡糖醛酸(Glc)，也可以是艾杜糖醛(Ido)。葡糖胺可以被N-乙酰化、N-硫酸化或O-硫酸化。
常规地，术语“肝素”指高度硫酸化的多聚糖，其中，80％以上葡糖胺残基是N-硫酸化的，且O-硫酸的数量大于N-硫酸的数量。对于肝素来说，硫酸/二糖的比例一般大于2。然而，实际上肝素的结构是非常不均一的，存在可以包含非常不同比例的链。
如同所有的糖胺聚糖(GAGs)一样，肝素以蛋白聚糖的形式被合成。这样的合成优先地发生在肥大细胞、浆液或结缔组织肥大细胞(CTMCs)的亚群中。这些肥大细胞在皮肤和呼吸粘膜下层很丰富。它们有很长的寿命(至少6个月)。除了肝素以外，它们还包含硫酸乙酰肝素和可观量的组胺(根据动物种类不同，大约10pg/细胞)。
肝素合成的第一步是形成由规则地交替的丝氨酸和甘氨酸残基组成的serglycine蛋白核心。通过连续地增加糖胺(osamine)和糖醛酸，从四糖发生肝素链的延长。
这样形成的蛋白聚糖经历了许多连续的转化N-脱乙酰作用、N-硫酸化作用、D-葡糖醛酸表异构化作用以及O-硫酸化作用。
然而，这一完全的成熟仅仅发生在部分蛋白聚糖上，这所产生的很大结构变异性造成肝素不均匀性。
然后，多糖链由内切葡糖醛酸糖苷酶从serglycine裂开。这些链的分子量在5000到30000Da之间。它们与碱性蛋白酶形成复合体，储存在肥大细胞的颗粒体中。肝素是仅在肥大细胞脱粒时被排出。
肝素具有重要的生物学作用，特别在止血方面，它被广泛地应用在治疗上，尤其是作为抗凝血剂和抗血栓形成剂。
目前，大多数使用的肝素是从猪肠粘膜分离出的，由蛋白水解酶提取后，接着在阴离子交换树脂上纯化(一篇制备肝素不同方法的综述DUCLOS；“L’Héparinefabrication，structure，propriétés，analyse”；Ed.Masson，Paris，1984)。
肝素来源的动物批次的多样性增加了肝素的固有不均匀性。由此导致非常实质性的变异性，尤其反馈在生物活性的水平上。另外，有规律地大量提供原始材料是困难的。
利用来自于哺乳动物的细胞生产GAG或蛋白聚糖已经被提议过。
申请WO 99/26983描述了从大鼠肥大细胞可以得到肝素类型的化合物，它们可以是蛋白聚糖(HEP-PG)或糖胺聚糖(HEP-GAG)。这些化合物并不是肝素。这样分离的细胞不是建立的细胞系。另外，该申请者推荐与成纤维细胞共同培养分离的细胞。
由Wang和Kovanen撰写的文章(Circulation Research，84，1，74-83，1999)也阐述了大鼠浆液肥大细胞的分离以及从这些细胞中进行蛋白聚糖的生产。和申请WO 99/26983中的一样，用于制备蛋白聚糖的细胞不是建立的细胞系，而只是已被分离的细胞，随后刺激这些细胞生产蛋白聚糖。
在检索报告中引用的申请WO 90/14418描述了从小鼠肥大细胞瘤得到细胞系，并用于肝素制备。因此这些细胞的来源是肿瘤性的细胞，这可能会引起健康问题。Montgomery等(Proc Natl Acad Sci USA，89，23，11327-11331，1992)的文章也阐述了小鼠肥大细胞瘤的分离。
本发明意欲克服上述提及的缺点以及避免供应的质量和数量上的问题，使用可方便地获得的具有稳定特性的均匀原始材料，便利质量稳定的肝素制备物的生产。
本发明人已经注意到从肥大细胞系培养物中生产相当大量的具有可以与从猪肠粘膜提取的肝素相比的特性的肝素是可能的。用细胞培养物作为原始材料也使得控制肝素合成条件，由此得到具有可重复的特点的产物成为可能。
本发明主题是一种制备肝素的方法，其特征在于它包括培养来源于猪的肥大细胞以及从得到的培养物中回收肝素。
优选地，所述肥大细胞培养物是来源于猪的肥大细胞系。
这里，术语“培养物”一般指在体外生长的一个细胞或一组细胞。由从动物取得的细胞或组织试样直接形成的培养物称为“原代培养物”。术语“系”用于在继代培养中已经成功地完成至少一次传代，一般几次连续的传代的情况，并指由此得到的任何培养物(SCHAEFFER，In Vitro Cellular and Developmental Biology，26，91-101，1990)。
有利的是，所述肥大细胞来自猪肥大细胞培养物，尤其是来自按申请FR 0113608以及申请人为INRA和ENVA的在本申请同一天提交的题为“猪肥大细胞培养物以及它们的应用”的PCT申请中所述得到的猪肥大细胞系。其中，实施本发明方法的优选系是-来源于猪胎肝脏的肥大细胞系，由INRA(147 rue deI’Université，75007 Paris，France)于2001年10月17日保存于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes[国立微生物保藏中心]，Pasteur Institute，26，rue du Docteur Roux，75724PARIS CEDEX 15，France)，编号为I-2735；-起源于猪胎肝脏的、被SV40病毒T抗原转染的肥大细胞系，由INRA在2001年10月17日保存于CNCM，编号为I-2736；-起源于猪胎骨骨髓的、被SV40病毒T抗原转染的肥大细胞系，由INRA在2001年10月17日保存于CNCM，编号为I-2734。
优选地，这些肥大细胞是浆液肥大细胞(serous mast cells)。
这些肥大细胞优选地培养在确定成分培养基(MEMα/DMEM，RPMI，IMDM，等)中，所述培养基中添加混合或单独使用的生长因子，比如浓度在1ng/ml和1μg/ml之间的SCF(干细胞生长因子)，和非必需的浓度在0.1ng/ml和100ng/ml之间的IL3(白细胞介素3)，或浓度在1nM和1μM之间的PGE2(前列腺素E2)。
也可以在培养基中添加浓度为0.5％和20％(V/V)之间的牛血清。
在培养基中增加牛血清可以用无血清的培养基如AIMV(INVITROGEN)替代，以降低培养基中的蛋白浓度以及与使用动物来源化合物相关的风险性(KAMBE et al.，J.Immunol.Methods，240，101-10，200)。
通过经转化剂(transformer)和/或无限增殖剂(TSUJIMURA，Pathology International，46，933-8，1996；PIAO and BERNSTEIN，Blood，87(8)，3117-23，1996)的作用而有控制地突变细胞表现型，有可能获得不依赖于血清的加入和/或生长因子的使用的细胞。
肥大细胞可以采用为真核生物细胞大量培养而发展的技术进行培养，如，由GRIFFITHS等(Animal Cell Biology，Eds，Spier andGriffiths，Academic Press，London，Vol.3，179-220，1986)描述的。使用体积大于几个立方的生物反应器是可能的，如PHILIPS等(LargeScale Mammalian Cell Culture，Eds，Feder and Tolbert，AcademicPress，Orlando，USA，1985)或MIZRAHI(Process Biochem，August，9-12，1983)描述的。
培养也可以根据VAN MEZEL(Nature，216，64-65，1967)描述的技术在微型支持物(microsupport)上进行或者悬浮地进行。
使用分批培养系统也是可能的，由于这种系统相当简单地以产业规模应用(VOGEL和TODARO，Fermentation and BiochemicalEngineering Handbook，2ndedition，Noyes Publication，Westwood，New Jersey，USA，1997)，所以在真核细胞培养物中应用很普遍。用这样的系统得到的细胞密度一般在106至5×106细胞/ml。
通过从生物反应器中移取一些细胞(70％到90％)用于GAG提取和肝素分离操作并将剩余细胞保留在同一生物反应器中以开始新的培养，分批培养物的生产力可以有利地被增加。在这“反复分批”培养模式中，将那些允许在细胞中GAGs和肝素的更大量累积的参数与细胞生长期的最适参数相区分也是可能的。
也可以使用有或无细胞滞留的连续灌注-进料培养系统(perfusion-fed culture systems)(VELEZ at al.，J.Immunol.Methods，102(2)，275-278，1987；CHAUBARD et al.，Gen.ENG.News，20，18-48，2000)。本发明的上下文中，尤其是可以使用允许细胞保留在反应器中，并导致在生长和生产上比分批培养能够得到的更多的灌注-进料培养系统。滞留可以借助旋转过滤器(spin-filter)、中空纤维或固体基质类型(WANG et al.，Cytotechnology，9，41-49，1992；VELEZ etal.，J.Immunol.Methods，102(2)，275-278，1987)的滞留系统而实现。得到的细胞密度一般在107到5×107细胞/ml之间。通过使用在线测量传感器，生物反应器中的培养允许更好地控制细胞生长的物理化学参数以及也是细胞中GAGs和肝素的积累的参数pH、pO2、Red/Ox、生长基质(growth substrates)如维生素、氨基酸、以碳为基础的基质(如，葡萄糖、果糖、半乳糖)、代谢物如乳酸或水性氨，等。
在这样的条件下培养3-30天以后，一般培养3-10天以后，细胞可以通过一般是离心或过滤从培养基中收获和分离。
可以使用各种不同的离心系统；可参照例如由VOGEL和TODARO所描述的那些(Fermentation and Biochemical EngineeringHandbook，2ndEdition，Noyes Publication，Weaswood，New Jersey，USA)。
作为替代方案，或与离心结合在一起，可以使用孔隙度(porosity)小于细胞平均直径(5-20μm)的膜，经切向微量过滤进行分离，所述膜同时还允许溶液/悬浮液中其它化合物通过。对切向流率(rate of tangential flow)与应用于膜的压力进行选择，使得几乎不产生剪切力(雷诺准数小于5000/秒)，以在分离操作过程中降低膜的堵塞、保持细胞的完整。
可以使用各种不同种类的膜，如，螺旋型膜(AMICON，MILLIPORE)、平膜或中空纤维(AMICON，MILLIPORE，SARTORIUS，PALL，GF)。
有可能对膜进行选择，使得膜的孔隙度、电荷或接枝(grafting)有可能实现分离和相对于可能存在于培养基中的可能污染物(如，细胞蛋白质、DNA、病毒、或其它大分子)的第一次纯化。
可以利用这样的生产和细胞收获方法，这些方法使得将GAGs和肝素保存在细胞内的内含物中成为可能；然而，GAGs和肝素也可以在细胞的溶胞或脱粒后从培养基中获得。
脱粒可以通过特异配体与在肥大细胞表面存在的受体结合，比如，变态反应原类物质(如，IgE Fc片断或这一片段的类似物)与肥大细胞IgE受体的结合而引起。当肝素通过所有或一些肥大细胞的脱粒或溶胞从细胞内内含物中释放，并在分离步骤时存在于培养基中时，可以设想使用具有较小孔隙度的膜。在这种情况下，细胞分离与由在一个或多个膜上超滤组成的步骤相结合，膜的组构和孔隙度使得浓缩肝素和将它与培养基中存在的其它种类物质作为大小和分子量以及任选的电荷量或生物特性的函数分离开成为可能。
在本实施方案的上下文中，膜的截断阈值优选在1000和5kDa之间。可以使用与用于微量过滤的那些膜系统类似的膜系统，比如，螺旋膜、平膜或中空纤维。可以有利地使用这样的膜，这些膜由于其电荷特性或对肝素有亲和性的配体(如，抗体、ATIII、凝集素、肽、核苷酸、等)的接枝(grafting)特性使分离和纯化肝素成为可能。
其它试剂也可以诱导肥大细胞的脱粒。这些试剂可以被分为若干类，如，细胞毒性剂、酶、多糖、凝集素、过敏毒素、基本的化合物(basic compounds)(化合物48/80、P物质、等)、钙(A23187离子载体、离子霉素、等)[D.Lagunoff和T.W.Martin，1983，Agents thatrelease histamine from mast cells.Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，23331-51]。脱粒剂可以对培养中维持的相同细胞反复使用。在这一制备方法中，通过简化从上清液收获的方法以及在培养中细胞的维持，使生产率明显地增加。
尤其在A23187离子载体的情况下，可以通过例如用浓度在1～100μg/ml的A23187离子载体对2×106肥大细胞/毫升(ml)处理1分钟到4小时，诱导肥大细胞的脱粒。
肥大细胞的溶胞可以通过例如使用低渗透压或高渗透压溶液引起的渗透压休克、热休克(冰冻/解冻)、机械性休克(如超声波处理或压力变化)、化学试剂的作用(NaOH、THESITTM、NP40TM、TWEEN20TM、BRIJ-58TM、TRITON XTM-100等)、或酶裂解(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、等)、或这些方法中的两种或更多种的组合来诱导。
为了从细胞溶胞产物中提取和纯化肝素、从serglycine核心中分离多糖链、和从存在于提取介质中的其它GAGs中分离肝素链，可以使用与那些本身已知的和被描述在基本工具书如由DUCLOS编的手册(如上提及的)中的用于从动物组织中提取和纯化肝素类似的方法。
为了从核酸、细胞蛋白中分离肝素和溶解肝素，即，切断与serglycine核心连接的键，作为非限制性的例子-细胞溶胞产物可以接受一个或更多个酶消化的作用(链霉蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，等)；-肝素-蛋白键可以在硫酸盐或氯化物存在下在碱性介质中水解；-为了破坏细胞起源的核酸和蛋白质，在酸性介质中(如，冷却条件下用三氯乙酸)进行处理也是可能的，应用可能解离GAG-蛋白相互作用的离子溶液加入到酸性介质中；-酶水解以后进行用胍的提取也是可能的；为了纯化溶解的肝素，有可能例如将其用醋酸钾、季铵、丙酮等沉淀。
这些纯化步骤可以有利地增加或代以一个或多个层析步骤，尤其是阴离子交换层析或亲和层析步骤。
本发明的主题也是使用本发明的方法能够从肥大细胞培养物中得到的肝素制备物。
依照本发明的肝素制备具有可以与现有技术中从动物组织中得到的肝素制备物的生物学特性相比较的生物学特性，并可以运用于所有肝素通常的应用中。
从以下有关从肥大细胞培养物中制备肝素和表征所得到的肝素的附加实施例中，将会更清楚地理解本发明。
实施例1从肥大细胞培养物中提取肝素肥大细胞的培养使用猪胎肝脏肥大细胞系和转染SV40病毒T抗原的猪胎肝脏肥大细胞系(分别是CNCM I-2735系和CNCM I-2736系)。
细胞以105到5×105细胞/ml的比例接种在含有猪IL-3(2ng/ml)和猪SCF(80ng/ml)的完全MEMα培养基中。
培养物被准备在培养皿中或以悬浮形式在1升的旋动培养瓶中(spinner flask)。每天监测细胞生长，持续4到12天。通过分析培养物中所产出的糖胺聚糖来平行监测肝素的生产。其结果在
图1-5中给出。
图1、2和3说明在培养皿静止培养中(图1；接种起始◆1×105细胞；■2×105细胞)和在培养瓶悬浮培养中(图2)的肝肥大细胞的生长，以及在培养瓶悬浮培养中的转染的肝肥大细胞的生长(图3)。
这些实验中，培养瓶中悬浮培养物显示出从大约8×105(非转染细胞)到大约1.5×106细胞/ml(转染细胞)的最大细胞密度。在指数生长期被计算的倍增时间是24-48小时。
糖胺聚糖纯化为了裂解蛋白聚糖和避免离子型GAG/蛋白相互作用，在含盐的碱性介质中将细胞进行水解。
该处理包括下列步骤1.用含盐介质中的NaOH处理这一步的目的是破坏细胞和裂解位于肝素与其母体蛋白间的键。
这一步包括在106细胞的沉淀块中加入100μl的1M NaOH和800μl的0.5M NaCl。这样得到的混合物在80℃水浴中加热30分钟，然后超声处理5分钟，之后用1N HCl中和。
2.提取经水解的样品，加样在阴离子交换树脂柱(SAX，Varian)上，该树脂柱可保留肝素。用含有0.5M NaCl的Tris/HCl缓冲液，pH7.4洗柱3次以除去蛋白以及其它的GAGs，尤其是皮肤素(dermatan)。然后，用1ml含有3M NaCl的pH7.4的Tris/HCl缓冲液对肝素进行洗脱。
3.脱盐/冷冻干燥通过在SEPHADEX G10胶上的空间排阻层析和随后的电导测定法进行NaCl的去除(为了能够应用于一些以下描述的分析方法，这是必要的)。然后将收集的肝素级分冷冻干燥，以浓缩样品。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析这一技术能够根据其分子大小和其电荷分离GAGs，且构成了快速检验肝素存在与否的试验。
将如上所描述得到的纯化制备物，以每加样孔中20μl制备物的比例加样到用于分离30到1kDa的分子的Tris/tricine聚丙烯酰胺凝胶(梯度为从10到20％)中。20ng的皮肤素，25ng的SPIM标准猪肝素(从肠粘膜提取的猪肝素第四次国际标准)以及从猪粘膜提取并通过在和上文所述条件相同的条件下用NaOH处理以及在阴离子交换树脂上纯化而纯化的肝素加样在相同凝胶上。
用记载在AL-HAKIM和LINHARDT(Applied and TheoreticalElectrophoresis 1，305-12，1991)的爱茜蓝溶液和然后的硝酸银双重染色可以显示糖胺聚糖(单独用硝酸银只显示蛋白质)。
然后为量化各种GAGs，用扫描仪(BIO-RAD)对凝胶进行分析。肝素定量极限是每条带10ng。
实验的结果汇总在下表1中，其中细胞产生的肝素量表示为μg/106细胞。
表1
这些结果也在图4中说明(曲线＝细胞数；柱形图＝肝素的生产量)。
图4表示在培养皿中静止培养的肝脏肥大细胞生长过程中的肝素的生产量。
在静止培养或悬浮培养中，一般观察到的肝素浓度为2-14μg/106细胞。
实施例2从肥大细胞培养物中得到的肝素制备物的表征用HPLC分析的二糖分布图二糖的成分使肝素与其它糖胺聚糖区分成为可能。
在培养的肥大细胞产生的糖胺聚糖中二糖的分析按照LINHARDT等描述的方法进行(Biomethods，9，183-97，1997)。
用肝素鞘氨醇杆菌(Flavobacterim heparinium)的肝素酶(肝素酶I、II和III，GRAMPIAN ENZYMES)的混合物对在上述实施例1中得到的GAG制备物进行解聚。所使用条件描述在以上提及到的LINHARDT等的发表物中。
作为对照，SPIM标准肝素在同样条件下进行解聚反应。
在这样的条件下，解聚完全，从而产生二糖。
图5中显示了总共8个主要的二糖，它们或是N-乙酰化的或是N-硫酸化的。
UV检测这些二糖在LINHARDT等(以上提及的)描述的阴离子交换柱上由HPLC分离和鉴定。
其结果在图6中有说明，该图表示了胎肝脏来源肥大细胞的培养瓶培养物产生的肝素制备物的二糖分布图(■)与标准肝素的二糖分布图(□)的比较。
这些结果显示，所有存在于SPIM参照猪肝素中的二糖也出现在肥大细胞肝素中，虽然具有不同的比例。IS/IIS比例是3.7。
荧光检测一种采用荧光检测的类似方法能够仅定量肝素特有的IS和IIS二糖，并计算其比例。
以上文描述的相同方法进行酶法的解聚以及HPLC分离。分离之后进行后柱衍生化(post-column derivatization)，与胍形成荧光复合物。
将对此技术具有最强反应系数(response factor)的IS三硫酸化二糖相对于已知浓度的标准肝素溶液进行检测和定量。
此方法的检测极限值是每ml细胞培养物样品中约5ng肝素。
以下的表2举例说明了细胞培养物随着时间变化的IS/IIS比例。
表2
实施例3通过测定抗-XA和抗-IIA的活性描述肝素的生物学特征生物学活性凝血因子Xa和IIa的失活是肝素特有的，并有可能将肝素与硫酸乙酰肝素和皮肤素相区别。
所使用的方法描述在第三版的欧洲药典，低分子量的肝素专论中(European Pharmacopoeia，3rdedition(1997))。
该反应包括三个步骤1.ATIII+肝素→[ATIII-肝素]2.[ATIII-肝素]+因子(过剩的)→[ATIII-肝素-因子]+因子(剩余的)3.因子(剩余的)+生色底物→pNA释放出对硝基苯胺(pNA)的量在405nm处测量。它是与肝素的量成反比例的。
抗-Xa或抗-IIa活性参照用SPIM标准建立的校准直线进行评价。
该方法的灵敏度是0.006IU/ml。
得到的结果在以下表3中给出。
表3
分别将从培养的肥大细胞中得到的肝素的抗Xa或抗IIa活性与从猪粘膜获得的肝素或标准肝素的抗Xa或抗IIa活性进行了比较，其结果在以下表4中表示。
表4
ATIII结合的表征肝素与ATIII间的结合采用描述在LEE和LANDER(Proc.Natl.Acad.Sci.，88，2768-72，1991)的电泳技术通过迁移变动(migration shift)得到证实。
电泳是在0.8％琼脂糖凝胶上，pH为3的溶液(醋酸/氢氧化锂)中进行。
将浓度从584μg/ml减到183μg/ml的100μl的ATIII溶液(人类由来的；BIOGENIC)加入到100μl的实验样品中。
点加100μl的样品。在100伏特下移动30分钟。
将凝胶用0.1％溴化十六烷基三甲基铵固定(CETAVLON-SIGMA)。
在Azure A(0.08％溶于水中)进行显影。
将凝胶进行扫描，并用QUANTITY ONE软件(BIO-RAD)进行解读。
结果表示为与ATIII结合的肝素的百分比。
在转染肝脏细胞的培养瓶培养的情况下所得到的结果表示在图7中。
在标准肝素(SPIM)存在时，观察到有31％ATIII结合(理论值为33％)，在由培养肥大细胞培养中得到的肝素(化合物)存在情况下，有27％ATIII结合。
实施例4在重复分批的生物反应器中肥大细胞的培养使用来源于猪胎肝脏的非转染肥大细胞系。将细胞以2.0-4.0×105细胞/ml的比例接种在添加有猪IL3(2ng/ml)和猪SCF(80ng/ml)的完全DMEM/F12培养基中。
所使用的生物反应器具有体积为2升的培养基，培养物的氧压保持在20％-40％的饱和度，pH保持在7.0-7.4，通过生物反应器套中的恒温水循环，使温度维持在37℃+/-0.5℃。使用转速在80-150rpm的船用螺旋桨(marine propeller)，对培养物进行搅拌。
培养4天后，细胞密度达到1.3×106细胞/ml，相应于24-48小时的倍增时间。在收获这一天，取出80％的培养物用于提取肝素，剩余的培养物保持在生物反应器中，用新鲜培养基将其稀释到浓度为2.0-3.0×105细胞/ml，如同重复-批量生产操作所描述的。用重复-批量模式稀释3天以后，所得到的细胞密度为9.0×105细胞/ml，相当于24-48小时的倍增时间，可以与第一次培养的相比(图8)。
如实施例1中所描述的，纯化肝素。
然后如实施例2所述，用HPLC对纯化的肝素进行分析，用SPIM标准肝素作为对照。
表5和图9表示了与SPIM标准肝素(□)得到的分布比较，通过对起源于猪胎肝脏(■)的肥大细胞进行悬浮培养产生的肝素制备物的serglycine(Gly-Ser)蛋白核心的比例以及二糖分布。
表6表示了与SPIM标准肝素中的二糖比较，通过对来源于猪胎肝脏肥大细胞进行悬浮培养产生的肝素制备物中二糖的N-乙酰化、N-硫酸化以及O-硫酸化分布。
表5
表6
当使用转染有SV40病毒T抗原的肥大细胞系时，得到相似的结果。
实施例5使用脱粒剂在培养物上清中生产肝素该实验是在非转染胎肝脏肥大细胞系中进行的。
在第762天(从第一次培养开始计算)，将肥大细胞浓度调整到2×106细胞/ml，将培养物培育在包含4μg/ml的可诱导肥大细胞脱粒的离子载体A23187的MEM培养基中1小时。
通过PAGE对细胞所产生的总GAGs和分泌性GAGs进行定量。图10显示，经离子载体A23187处理以后在上清液中发现70-75％的GAGs，而在非处理细胞(0μg/ml A23187)中大约有10％的GAGs。
将在培养第762天进行了GAG收获的肥大细胞再次培养。发现并没有丧失其生长速率或成活力。
21天以后，这些肥大细胞被再一次脱粒，如上所述进行GAGs测定。在第762天没有进行脱粒的同龄肥大细胞培养物作为对照。
结果显示在图10中，该图显示，分泌的GAGs的百分比与第一次脱粒中所得到的相当，并与同龄的对照细胞中所得到的相当。
当使用转染了SV40病毒T抗原的肥大细胞系时，得到类似的结果。
权利要求
1.生产肝素的方法，其特征在于，该方法包括培养来源于猪的肥大细胞和从得到的培养物中回收肝素。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述肥大细胞培养物是来源于猪的肥大细胞系。
3.权利要求1和2中任一项的方法，其特征在于，所述肥大细胞来自于猪胎骨髓或猪胎肝脏。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于，所述肥大细胞是浆液肥大细胞。
5.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述肥大细胞来自于肥大细胞系，所述肥大细胞系选自-于2001年10月17日保藏在CNCM[国立微生物保藏中心]的、编号为I-2735的细胞系；-于2001年10月17日保藏在CNCM的、编号为I-2736的细胞系；-于2001年10月17日保藏在CNCM的、编号为I-2734的细胞系。
6.能够通过权利要求1-5任意一项的方法得到的肝素制品。
全文摘要
本发明涉及从肥大细胞培养物，特别是猪肥大细胞生产肝素。
文档编号A61P7/00GK1575341SQ02821016
公开日2005年2月2日 申请日期2002年10月22日 优先权日2001年10月22日
发明者P·康斯, J－M·吉洛姆, H·M·M·里加尔 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司