专利名称：一种以微生物克隆载体生产治疗血管疾病基因药物血管内皮生长因子-2裸dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种重组DNA及其构建，并以微生物生产该重组DNA，将其作为DNA药物的方法。具体地说，本发明涉及一种包含有人源性VEGF启动子(hVEGF promoter)，能够在哺乳动物细胞中表达鼠源性VEGF-2 cDNA(mVEGF-2)的真核表达载体的构建，并以微生物生产该血管内皮生长因子-2(VEGF-2)DNA药物的方法。
2.背景技术血管疾病是严重威胁人类健康的常见病、多发病，其中脑血栓、冠心病患者最多，具有“发病率高、复发率高、致死率高、致残率高、并发症多”的特点，是威胁人类健康的“第一杀手”，占总死亡人数的40.72％(吴忠祥.选择健康食品，宜参考专家意见.http//www.cnki.net)。据世界卫生组织保守估计，全球心脑血管疾病患者至少有4500万人，单是美国就有一千多万人患冠状动脉疾病，每年有500万人发生心绞痛，有150万人发生心脏病；在法国，每年死于心肌梗死的就有10万人之多(基因疗法治疗冠心病.http//www.cnki.net)。近年来，我国心脑血管疾病等“现代文明病”发病率正逐年上升，据国家卫生部医学统计结果表明，心脑血管疾病在我国病人死亡原因中也占首位，每年达200万人。危重肢体缺血病是另一种动脉疾病，并且在吸烟者、糖尿病患者和高血压病人中也非常普遍(蔡小惠.台湾首例血管疾病基因治疗开始进入人体实验.http//www.cnki.netelial)，据估计美国50岁以上的老人中有15％的人患有肢体动脉病。因此，开发治疗血管疾病的特效药物，对维护人类健康具有重大意义。
动脉血管狭窄和梗塞引起血流不畅，致使局部组织缺血、缺氧而出现疼痛，严重时产生坏死性病灶，易于导致死亡和致残是血管疾病的共同特征(Harada K，et al，Am J Physiol，1996，270(5 Pt 2)H1791-802)。治疗动脉血管狭窄和梗塞，一般采用药物和外科手术，如采用血管扩展药物和降脂药物、外科冠状动脉搭桥术和皮下植入冠状动脉成型术等。在美国，每年接受外科冠状动脉搭桥术的病人达45万多，皮下植入冠状动脉成型术的病人有35万多(Vascular endothelial growth factor-2 (VEGF-2).http//www.hgsi.com/products/vegf.html)。尽管血管外科手术发展很快，但存在血管修复处狭窄及拆“东墙”补“西墙”和血液循环不能完美重建的问题(肖军，杨庭树，张兆山等.，2001，12(3)S41-S42)。对患有慢性急性下肢缺血的病人，常因血管阻塞的程度与解剖位置侵犯过长，无法接受外科手术与动脉气球扩张式血管再生治疗，因而这些患者病情恶化甚快，迫切需要更有效的治疗方法。目前，临床上使用的一些治疗血管疾病药物总体效果均不理想，且毒、副作用较大。近年来，人们开始利用某些生长因子，将其导入局部缺血组织，促进新血管生成，以改善组织缺血缺氧状态，这对慢性闭塞性血管疾病治疗具有积极的意义。因此，寻找促进血管主动重建的药物成了目前医学研究的热点之一。
血管生成发生着一系列相关事件，包括内皮细胞的分化、管状形成及血管成熟，其发生过程受体内外一系列因子的调控(Risau W，Flamme I，Annu RevCell Dev Biol，1995，1173-91；Risau W，Nature，1997，386(6626)671-674)。目前已知的具有血管生长作用的因子有酸性和碱性成纤维细胞生长因子、血管表皮生长因子、α和β转化生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子以及新近发现的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等(Neufeld G，Cohen T，Gengrinovitch S，et al，FASEB J，1999，13(1)9-12)。根据目前对这几种促血管生成因子的研究，除VEGF外其它均缺乏细胞特异性。VEGF能特异性地作用于血管内皮细胞，强烈促进其增殖，促进血管形成，并具升高血管通透性的作用(Leung DW，Cachianes G，Sanzo WJ，etal，Science，1989，246(4935)1306-1309)。人们对此重要的生物学特异功能产生了极大兴趣，试图将VEGF导入局部缺血部位，以提高血管通透性，诱导新生血管发生，改善病灶区域血液循环和氧气供应状况。这是一种治疗血管疾病的全新方案，为治疗脑动脉梗塞、心肌和肢体缺血疾病开辟了一条新途径。但VEGF的体外生产是其作为一种药物应用于临床的先决条件，必须先行解决。
VEGF是多基因家族，包括VEGF-A(Neafeld G，et al，Ccancer Metastasis Rev，1996，15(2)153-158)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D(Joukov V，Kaipainen A，JeltschM，et al，J Cell Physiol，1997，173206-210)、VEGF-E(Ogawa S，Oku A，Sawano A，et al，J Biol Chem，1998，27331273-31282)和胎盘生长因子(PLGF)(MaglioneD，Guerriero V，Viglietto G，et al，Proc Natl Sci USA，1991，889267-9271)等，它们均是一种糖基化分泌性多肽因子，以二硫键连接成同源二聚体，分子质量约34～46kD。从人体中分离到的VEGF-A有5种变异体(isoform)，分别含有121、145、165、189和206个氨基酸残基(注所指的氨基酸残基数目不包括N-端26个氨基酸残基构成的疏水信号序列，因为这26个氨基酸残基在各变异体均相同，后面VEGF-1/2/3也如此)，由mRNA的不同剪接而形成(NeafeldG，et al，Ccancer Metastasis Rev，1996，15(2)153-158)。大多数表达VEGF的细胞能同时产生多种VEGF变异体，但以VEGF121、VEGF165最为常见，其次是VEGF189，而VEGF145仅在生殖器官的细胞中表达。各变异体与肝素及硫酸肝素结合力不同，其中四种与肝素及硫酸肝素结合力大小顺序为VEGF189/206＞VEGF165＞VEGF145(Hyder S，Cancer Res，1998，58(2)392-395)，而VEGF121不能连接肝素或硫酸肝素。所以，VEGF121/145/165较易到达靶细胞，VEGF189/206只能保留于细胞外基质。
从小鼠胚胎组织中也分离到VEGF-1、VEGF-2和VEGF-3变异体，分别含有164、120和188个氨基酸残基。与VEGF-3相比，较短的两种变异体(VEGF-2和VEGF-1)缺失的氨基酸位于肽链羧基端(Breier G，et al，Development，1992，114(2))。
由于人VEGF145只在生殖器官细胞特异表达，VEGF189/206则几乎都结合在质膜或基底膜上而保留在细胞外难以到达靶细胞，体内活性不如VEGF121、VEGF165强(Neafeld G，et al，Ccancer Metastasis Rev，1996，15(2)153-158)，只有VEGF121/165为最常见且较易到达靶细胞，故在治疗局部性缺血研究中大多采用的是VEGF121和VEGF165(Yamagishi Si，et al，J Biol Chem，1997，272(13)8723-8730)。来自鼠胚胎的三种VEGF中，用于治疗局部性缺血研究的只有VEGF-2，其余两种未见报道。研究表明，用VEGF治疗外周梗塞性血管病、脑动脉梗塞症及心肌缺血研究均获成功，但究竟那种VEGF的疗效更好尚无定论。目前人VEGF121、VEGF165仍处于临床前试验，只有鼠VEGF-2已进行到临床试验II期(Yeung PK，Curr Opin Investig Drugs，2001，2(6)796-800)。据此推测，VEGF-2在治疗动脉血管疾病上的效果可能更佳。
应用VEGF治疗血管疾病所面临的首要问题是其有效性，这取决于局部VEGF含量、VEGF受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)密度及两者在受体中持续时间。组织缺血后，局部VEGF及其受体密度上调，但VEGF量下降太快，缺血组织依赖自身VEGF无法有效刺激形成侧支血管(Bauters C，et al，J Vasc Surg，1995，21(2)314-325)。将外源VEGF导入局部缺血组织，对缺血具有较好治疗效果，但VEGF蛋白价格昂贵，且在体内不稳定，极易被降解，需反复给药，因而不具备临床应用的可行性。将VEGF基因整合到真核表达质粒或复制缺陷型腺病毒DNA上，提取纯化重组质粒DNA或复制缺陷型腺病毒DNA，将裸DNA直接注射入缺血组织，表达的VEGF蛋白可分泌到胞外与其特异性受体结合发挥生物学效应，即使表达少量VEGF蛋白也能取得理想的生物学效应，这可克服直接注射VEGF蛋白的局限性。研究证明，直接基因转染可在24h后开始表达，有效促进血管形成。其做法是用质粒作为VEGF cDNA载体或复制缺陷型重组腺病毒基因注入人为创造的模拟性缺血肢体、大脑或心脏局部，结果在缺血性肢体、心肌和大脑中内皮细胞重现和同侧血管生成，改善了缺血组织的血流供应，局部导入具有良好的治疗效果(Ono T，Fujino Y，Tsuchiya T，et al，Neurosci Lett，1990，117259-263)。还有人将VEGF DNA和脂质体混合后直接注射入小鼠脑皮质中也获得了基因表达(Mustonen T，Alitalo K，J Cell Biol，1995，129895-898)。就三种形式的VEGF裸DNA导入方式来看，复制缺陷型重组腺病毒表达载体和真核表达质粒载体的裸DNA加脂质体混合导入的方法，不可避免地存在制备过程复杂、病毒扩散可能性、免疫原及潜在的毒副作用等缺点，因此更多的人主张用真核表达质粒载体的裸DNA直接注射的方法。
影响VEGF有效性的第二个方面是受体的量及持续时间，因为VEGF的生物学活性是通过受体介导而发挥作用的。VEGF通过两个结构相关的高亲和力的酪氨酸激酶受体介导(Petrova TV，et al，Exp Cell Res，1999，253(1)117-130)，它们分别是180kD的VEGFR-1(fms-like tyrosine kinase，Flt-1)及200kD的VEGFR-2(kinase insert domain containing receptor/fetal liverkinase，KDR/Flk-1)(Petrova TV，et al，Exp Cell Res，1999，253(1)117-130)。Flt-1广泛表达于胚胎及成人血管内皮细胞，运用基因敲除法(gene knock out)剔除Flt-1基因的小鼠因没有血管生成，而导致小鼠死亡，但有趣的是表达一缺乏酪氨酸激酶的截短Flt-1基因的小鼠能够生成正常血管，这说明Flt-1基因或许是一“诱饵受体”(decoyreceptor)，而并非是一个信号转导分子(Kim KJ，et al，Nature，1993，362(6423)841-888)。KDR主要表达于胚胎发育期的血管内皮细胞，在成人血管内皮细胞则表达下降，虽然它也广泛表达于胚胎发育期的血管内皮细胞，但在成人组织中仅限表达于淋巴管内皮细胞。最近又发现了一个新的VEGF受体neuropilin-1，它是一细胞表面的糖蛋白，为VEGF165特异性的受体。它不仅表达于内皮细胞，而且表达于其他类型细胞中。尽管VEGFR对血管形成是必需的，但加入外源VEGFR却降低了VEGF刺激内皮细胞增殖的作用(马骊，王小宁等，中国生物制品学杂志，2000，13(4)196-200)，其原因被认为是外源VEGFR与血管内皮细胞表面的受体竞争结合VEGF，从而阻断了VEGF的生物学活性，这对抑制肿瘤的生长和转移、视网膜和关节滑膜新血管形成，治疗肿瘤、糖尿病性视网膜病和类风湿关节炎病有潜在的临床药用开发价值，但对血管病治疗上似无益处。
VEGF表达水平还受其他因素的影响，如缺氧/缺血，某些病理状态如皮肤烫伤、牛皮癣、迟发性过敏反应和一氧化氮(NO)等均可促进VEGF合成。缺氧/缺血是胚胎组织、一些病变组织和肿瘤中血管发生的共性，在治疗操作上无法人为控制。NO是血管系统中重要的信号分子(Michell BJ，et al，Curr Biol 1999，9(15)845-848)，当它在动脉血管内皮细胞产生时，迅速穿过细胞膜扩散至下层肌肉细胞，可使VEGF及其受体mRNA水平升高，从而解除肌肉细胞的收缩，使动脉舒展，控制血压及血流的分配，防止血栓形成。在缺氧情况下，对大鼠肺进行离体灌流时发现，在灌流液中加入SNP(一种NO供体)，VEGF及其受体mRNA水平升高，当加入L-NAME(一种NO合成酶抑制剂)后，VEGF及其受体mRNA水平下降(Tsurumi Y，et al，Nat Med，1997，3(8)879-886)。但NO是如何促进VEGF及其受体mRNA水平增加的不得而知，我们推测它们可能受NO诱导的启动子控制之下。NO有如此强的诱导效果，而它又是人为可补给的调节因子，所以分离NO信号驱动的诱导性启动子，构建诱导型VEGF基因表达载体，在注入VEGF DNA的同时，加上产生NO的化学药物，可能对提高VEGF治疗血管病效果有重要作用。
从目前世界各国对VEGF治疗动脉血管疾病的研究进展来看，美国处于领先地位，台湾紧随其后，其他地区仍处于临床前试验阶段。美国人类基因组科学公司(HGS)利用VEGF-2治疗冠状动脉病的研究证明(Vascularendothelial growth factor-2(VEGF-2).http//www.hgsi.com/products/vegf.html)，当注射VEGF-2基因到缺血组织中时，可使邻近细胞产生VEGF-2蛋白质，促进新生血管和淋巴管生长。该公司于1997年10月将VEGF-2基因转让给了血管遗传学股份公司。血管遗传学公司正在冠状动脉病患者身上进行临床I/II期试验，对患各种危重肢体部分缺血症患者的两次试验已完成，对冠状动脉病的四次试验中有3次已完成，第4次临床试验正在由食品医药品局(FDA)进行。据称，给危重冠心病患者注射VEGF基因，使患者的心脏血流量增加，从而使患者的日常生活质量得以改善。在此之前，他们曾接受各种疗法，但都无济于事。在接受这种疗法的16位患者中，9位患者受损的冠心区冠状动脉严重程度部分或全部地恢复了活力。六个月后，任何人都没有再发作过心脏病，也没有出现过较严重的并发症，每周心绞痛的平均次数由治疗前的48次降至目前的2次。据此，他们认定利用血管生长因子治疗心血管疾病的基因疗法是有效和安全的。目前台湾也已完成了VEGF临床前试验，正在进行临床I期试验。从VEGF-2基因药物应用范围来看，它可用于有严重心绞痛、现有治疗法不能治疗的病人，以及冠状动脉疾病严重程度较轻的病人。用VEGF-2基因疗法可取代各种心脏外科手术，或改善已接受外科手术的病人的疗效及减轻充血性心脏障碍的病人的发病。用于治疗肢体动脉疾患时，可以使病人免除某些切除手术，或者减少切除的范围。它也可用以提高由局部缺血引起的皮肤溃疡的治愈率，减轻病人痛苦。此外，还可用于治疗由体育锻炼而引起的小腿肚疼痛和肿胀。因此，VEGF-2基因药物的应用前景非常广阔，具有实际开发价值。
3.发明内容本发明的一个目的是构建含人源性VEGF启动子(人体VEGF-A各变异体共同的启动子，它可驱动VEGF-A各基因的转录)表达鼠源性VEGF-2基因的表达载体，其启动子具有NO和缺氧可诱导调控元件，它既可在微生物中以多拷贝复制生产VEGF基因，又能够在哺乳动物细胞中高效表达，在给予局部缺血性组织VEGF基因裸DNA的同时，辅以NO供体化学物质，便可提高VEGF促进新生血管生成能力，更有力地改善缺血组织的供血状况，达到更有效地治疗血管疾病的目的。
本发明的另一个目的是提供一种包含NO和缺氧诱导特异表达启动子和VEGF-2基因的微生物克隆。
本发明的另一个目的是提供一种将微生物生产的裸DNA注射到局部缺血哺乳动物模型中，对其促进血管生成、改善供血状况的能力以及毒副作用进行鉴定的方法。
本发明首先从受孕小鼠胚胎克隆了鼠源性VEGF-2(mVEGF-2)基因(SEQID NO 1)，然后从新生儿胎盘克隆人源性VEGF启动子(hVEGF promoter)(SEQ ID NO 3)，并使mVEGF-2被hVEGF promoter所驱动，然后插入哺乳动物表达载体pEGSH中，构建出能够在原核细胞中以高拷贝数产生大量DNA、并在原核和哺乳动物细胞中均能表达的载体pEGVPV。用这种载体转化E.coli DH5α后，获得DNA拷贝数有2000个/细胞之多，从细胞培养物中分离的DNA产量能够达到1.5mg/L。缺血型动物模型实验表明，向局部缺血组织显微注射该裸DNA可促进新生血管形成，增强侧枝循环的建立，有效地改善了缺血组织的血液供应。本方法可能提供一种治疗血管疾病的新方案，使血管内皮生长因子能特异性地作用于血管内皮细胞，强烈促进其增殖和血管形成，并有升高血管通透性的作用。
对影响VEGF作用的因素，特别是NO和缺血对VEGF作用发挥的刺激作用人们均有一定的认识，但目前国内外用VEGF基因的裸DNA治疗缺血性血管疾病研究中，都没有考虑如何利用NO这个调控因子来增强VEGF基因治疗的效果，而且构建的载体中大多采用的是一些在哺乳动物细胞中能够启动基因表达的病毒启动子，所启动的是组成型表达，而事实上新生血管生成又是肿瘤细胞生长的一个条件，这样一种无控的表达载体导入人体是否会有诱发肿瘤的潜在危险，仍无法预料。本发明利用具有NO可调控的人源性VEGF启动子和鼠源性VEGF基因，导入缺血组织的同时配合使用释放NO的化学药品，有效地提高了VEGF的治疗效果；同时采用的是具有人源性的启动子，排除了病毒启动子潜在地危险性，对人体会更加安全可靠。这样的VEGF表达载体国内外尚未有报道。
4.
图1 小鼠胚胎RNA RT-PCR产物琼脂糖电泳结果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLanes 2～4不同模扳(cDNA第一链)用量的PCR扩增产物，其中加入的模板量为2#1ul；3#1.5ul；4#2ul图2 Bam HI和Eco RI对两种质粒酶切结果Lane 1DL2000 DNA MarkersLane 2pUC-V450Lane 3pET-28c(+)Lane 4λDNA/EcoR I+Hind III Markers图3 人胎盘DNA作模板PCR扩增产物Lane1PCR扩增产物Lane2λDNA/EcoR I+Hind III Markers图4 转染Hela cells中荧光素酶活性荧光显微观察A.phrGFPVP转染，NO刺激诱导；B.phrGFPVP转染，缺氧刺激；C.phrGFPVP转染，NO+缺氧刺激；D.phrGFPVP转染，正常氧含量；E.空载质粒转染，缺氧刺激；F.空载质粒转染，正常氧供应图5 四种处理的大鼠缺血脑组织中心血管的形成比较图6 具有hVEGF启动子的mVEGF-2哺乳动物表达载体构建示意图
5.具体实施方式
实施例1.鼠源性VEGF-2基因及其在微生物表达系统中的蛋白鉴定根据已知mVEGF-2核苷酸序列(GenBankS38100，gi249860)设计一对特异引物，在这一对引物的5’端分别引入了BamH I和EcoR I位点。
Bam HIVP-15’-GCC TCCGGA TCCATG AAC TTT CTG-3’VP-25’-GAA TTCACC GCC TCG GCT TGT C-3’Eco RI从处死受孕2周的小鼠体内取出胚胎，用总RNA提取试剂盒(GIBCO公司产品-TRIZOLReagent，Cat.No.15596)提取总RNA。以胚胎总RNA为模板，Oligo(dT)15作引物，在AMV Reverase(AMV-RT)作用下合成cDNA第一链。然后，将反转录产物稀释50倍作模板，加入合成的引物(VP-1和VP-2)、dNTP和Taq DNA polymerase，混匀后进行PCR扩增。PCR扩增反应参数为 扩增得到分子量约450bp、580bp和650bp的三个片段(图1)。
由于小鼠胚胎的VEGF有三种变异体(VEGF-1、VEGF-2和VEGF-3)，分别含有164、120和188个氨基酸残基(不包括N端26个氨基酸组成的信号肽)。与VEGF-3相比，较短的两种变异体(VEGF-2和VEGF-1)缺失的氨基酸位于肽链羧基端，在cDNA碱基序列上的差别是近3’端的不同缺失所造成的，它们三者在5’和3’端序列相同，因此，用相同的一对引物扩增出了3条特异带。
用PCR Fragment Recovery Kit回收PCR产物中分子量约为450bp的特异条带(因为编码VEGF-2变异体的cDNA长度为450bp)。在T4 DNA连接酶的作用下，将回收片段与pUCm-T Vector连接，转化感受态E.coli DH5α。挑选白色单菌斑摇菌，采用碱裂解法微量提取质粒。通过滞后质粒筛选、酶切和PCR鉴定，初步确定为重组子，提交上海联合基因科技有限公司进行测序。由于pUCm-T Vector是用于PCR产物插入和克隆的载体(上海生工生物工程技术服务有限公司产品，Cat.No.D0211)，用M13通用引物和T7启动子引物即可对PCR产物进行测序，我们要求上海联众基因公司进行测序时采用M13通用引物。测序结果为SEQ ID NO 1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO2，与GenBank中的VEGF-2序列(S38100，gi249860)进行同源性比较，相同率达到98.5％，确证得到VEGF-2基因，将此重组子命名为pUC-V450。
分别培养pUC-V450/E.coli DH5α和pET-28C/E.coli BL21，提取质粒。根据pUC-V450和pET-28c(+)的酶切位点，选用Bam HI和Eco RI分别对这两种质粒酶切(图2)；从pUC-V450质粒酶切液中回收约470bp(包括酶切位点)片段，pET-28c(+)质粒酶切液中回收5363bp片段；在T4 DNA连接酶作用下，将上述两个回收片段连接，构建成原核表达载体，将此重组质粒命名为pET-V450。然后将pET-V450转化感受态大肠杆菌BL21，涂布到加卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。次日从转化菌涂布平皿上挑取隔离良好的单菌落8个，少量摇菌后提取质粒，PCR鉴定均为阳性。
按照pET-28c(+)Kit试剂盒说明书的方法，用IPTG对克隆菌进行诱导表达，结果预期的20kD蛋白分子得以高水平表达。实施例2.人源性VEGF启动子的克隆和绿色荧光蛋白(GFP)基因瞬时表达载体构建及其功能鉴定人源性VEGF基因(hVEGF)上游序列已有报道(GenBankAF095785，gi4154290)，为3401bp，这样大的片段克隆难度较大。按照真核启动子的一般特点，启动子的主要元件通常在转录起始位点上游1kb左右。根据Hideo等(Hideo K，et al.Blood，2000，95189-197)的研究，我们进一步分析认为，-1041～-1(从转录起始位点排序)的片段包括了启动子的基本元件。但在Hideo等(Hideo K，et al.Blood，2000，95189-197)的研究中并未考虑5’端非翻译区(5’-UTR)(指转录起始位点开始后的+1～+1038片段)，现在人们越来越认识到5’-UTR对基因表达调控起着非常重要的作用。因此，我们将5’-UTR片段也一并克隆，并对其表达调控能力进行了鉴定。
1.hVEGF启动子的克隆根据Brogan等(Brogan IJ，et al，Hum.Immunol.1999，60(12)1245-1249)报道的人源性VEGF基因及启动子序列(GenBankAF095785，gi4154290)，综合分析后设计并合成如下两个引物Not I引物VPP-15’-GCG CGG CCG CCT GTC TGC CCA GCT GCC TCC CCC-3’Bam HI引物VPP-25’-CGCGGA TCCGGT TTC GGA GGC CCG ACC GGG-3’在这一对引物的5’端分别引入了Not I位点和Bam HI位点。
以人胎盘总DNA为模板，通过PCR扩增(94℃，3min；94℃ 40sec，65℃ 40sec，72℃ 2min，循环30次；72℃ 10min补平)得到约2.06kb的产物(图3)，回收纯化后与pUCm-TVector连接，用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并提取重组质粒，进行酶切鉴定和PCR扩增鉴定，初步确定hVEGF启动子片段已插入到T-Vector，提交基因公司进行测序，其测序方法和使用引物如同前述。测序结果如SEQ ID NO 3所示，与GenBank中的人源性VEGF基因(hVEGF)上游序列(AF095785，gi4154290)进行了同源性比较，结果相同率达到98.2％，由此确证该质粒含有hVEGF启动子序列，将此重组质粒命名为pUCVP。
2.hVEGF启动子功能及特性鉴定选用phrGFP Vector(美国STRATAGENE公司产品，德国MERCK公司代理，Cat.No.#240063)作为哺乳动物表达载体，用以鉴定hVEGF启动子功能及特性。此载体具有人性化的绿色荧光蛋白(hrGFP)报告基因，对转导细胞只是低毒，不影响细胞的活性和便于表达水平检测；在hrGFP基因上游具有多克隆位点，便于将启动子或增强子插入，对其功能进行鉴定。用Bam HI和Not I，分别对phrGFPVector和pUCVP酶切，回收3670bp(phrGFP Vector经BamH I和Not I酶切后的大片段)和2078bp片段(包括hVEGF启动子2064bp片段及加入的Not I和BamH I酶切位点的14bp)，混合，在T4 DNA连接酶作用下连接，导入E.coli DH5α，涂布到含有Amp的LB固体培养基的平皿上培养14h。挑选单菌落摇菌，提取质粒，进行PCR鉴定，阳性重组子即为具有hVEG启动子的哺乳动物表达载体，命名为phrGFPVP。
3.瞬时表达的鉴定在Φ10cm组织培养皿中，加入20μl脂质转染物(Life Technologies，Rockville，MD)和浓缩20％-30％的赫拉细胞株(Hela cells)的细胞，用载体质粒(5μg phrGFPVP)进行转染，同时用空载体phrGFP Vector作对照。在37℃下，转染孵育培养15h。转染培养到预订时间后，用正常培养基替换含DNA的培养基，给予有氧(21％O2)、缺氧(1％O2)、NO供体化学试剂S-亚硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺(SNAP)等处理，在37℃下继续培养12h。
刮下细胞，溶于200μl 0.25mol/L Tris-Cl(pH7.5)，在4℃ 270g离心10min收集细胞。用缓冲液重悬沉淀，冰上放置10min，然后用注射器反复抽吸5-8次以便匀质化。用10×的缓冲液(40mmol/L Tris-Cl[pH7.9]，10mmol/LEDTA[pH8.0]，150mmol/L NaCl)收集的细胞，重悬在整体细胞提取缓冲液(10mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸[pH 7.9]；400mmol/L NaCl；0.1mmol/L EDTA；5％[vol/vol]甘油；1mmol/L DTT；and 1mmol/L苯甲基磺酰氟化物)。然后在4℃条件下，16,000g离心30min。上清液贮藏在-70℃备用。
将100μl细胞提取物和225μl荧光素试剂混合，用以鉴定荧光素酶活性。37℃孵化0.5-1h后，加入50μl 1mol/L Na2CO3终止反应。在荧光显微镜像观察并照像，同时测定A420的吸光度。以β-半乳糖苷酶活性作为荧光素酶活性的标准来测定相对荧光素酶活性(平均值±标准误)，以刺激的细胞相对荧光素酶活性对非刺激对照的比率作为测定折算的诱导活性。
根据观测结果，不同处理的转染细胞中的荧光素酶活性差别非常明显，用空载体转染的细胞中几无荧光素酶表达(图4-E，F)，而在具有hVEGF启动子phrGFPVP转染的细胞中均有荧光素酶表达(图4-A，B，C，D)，缺氧和NO刺激可显著的提高荧光素酶的表达(图4-A，B，C)，说明克隆的hVEGF启动子具有诱导调控的特性。荧光素酶活性的吸光度测定(结果略)也得到同样的结果。
实施例3.hVEGF启动子和VEGF-2哺乳动物表达载体构建和缺血性模型动物实验1.hVEGF启动子和mVEGF-2哺乳动物表达载体的构建选用pEGSH(美国STRATAGENE公司产品，德国MERCK公司代理，Cat.No.#217461)为插入hVEGF启动子和mVEGF-2的表达载体。之所以选择此载体，主要是出于三个方面的考虑①该质粒具有ColE1复制原点和Amp选择标记，为松弛型质粒，可在微生物中以多拷贝形式存在，有利于利用微生物来高效生产hVEGF启动子和mVEGF-2裸DNA；选择标记的存在可防止重组质粒在宿主菌中丢失，有利于维持工程菌稳定性；②具有多克隆位点(MCS)，便于外源基因的插入；③此质粒无病毒启动子，在MCS下游具有猿猴空泡病毒40(SV40)的多聚腺苷化作用区段，可使外源功能基因转录后加上poly(A)，这对维持外源基因转录产物稳定性和提高翻译水平是极为重要的，据产品使用说明书介绍该质粒可使外源基因表达水平提高1200～1700倍。
用Not I和BamH I分别将pUCVP质粒和pEGSH酶切消化，回收2078bp片段(包括hVEGF启动子2064bp片段、并包括加入的Not I和BamH I酶切位点的14bp)和4812bp(pEGSH酶切后的大片段)片段，在T4 DNA连接酶作用下连接，导入感受态E.coli DH5α，涂布在含有Amp的固体培养基进行筛选，挑取隔离良好的单菌落摇菌，提取质粒，进行滞后质粒筛选和PCR鉴定，阳性重组子即是含有hVEGF启动子的质粒，命名为pEGVP。
接着用BamH I和Eco RI分别酶切pEGVP和pUC-V450，回收6890bp(pEGVP经BamH I和Eco RI酶切后的大片段)和474bp(VEGF-2 cDNA及BamH I和Eco RI位点)片段，按上述方法进行连接、转化和鉴定，阳性克隆命名为pEGVPV(图6)。
2.缺血性模型动物实验的结果(1)动物模型制作和分组选用大鼠为实验动物。供试大鼠大脑缺血模型制作按Longa等的线栓法(Longa EZ et al.Stroke，1989，2084-91)进行；缺血动物模型分为四组一组注射裸pEGVPV质粒DNA(含hVEGF启动子和5’UTR及mVEGF-2cDNA)，另一组注射注射裸pEGVPV质粒DNA(含hVEGF启动子和5’UTR及mVEGF-2cDNA)+NO供体化学试剂S-亚硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺(SNAP)，第三组注射裸pEGSH(空载)质粒DNA+S-亚硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺(SNAP)，第四组注射生理盐水(对照，CK)。各组动物均要达到4～6只。
(2)基因转染按照以上四组设计，在制作模型的同时，用微量注射器立即向局部缺血区注射相应的裸质粒DNA(或生理盐水及SNAP)。对大脑缺血动物模型组中，应先用手捻钻在前颅开一小孔，然后注射裸质粒DNA、空载质粒或SNAP，缝合伤口。
(3)VEGF-2基因表达水平检测基因导入5天后，从局部缺血组织提取RNA，逆转录后用VEGF-2的一组扩增引物进行PCR扩增，然后进行电泳分析。
(4)VEGF-2基因蛋白表达检测基因导入7天后，取动物模型组缺血区组织，固定、包埋、速冻后，在冷冻切片机上切片，用多克隆抗体及免疫组织化检测试剂盒进行免疫化学染色，镜检。
(5)血管计数给药后10d，每组取一只动物做血管造影。麻醉下4F导管经左颈总动脉至腹主动脉上3cm处，注射76％复方泛影葡胺，速度3ml/s，4s后用X光片拍照记录。
(6)栓塞体积测定组织经固定、包埋、速冻后，进行冷冻切片、染色，在图象分析系统上测量梗塞面积及总面积，然后折算成体积。
(7)统计资料分析计数资料用相对数表示，用两组独立样本X2(卡)检验进行统计学处理；计量资料用x±s表示，用两组独立样本t检验进行统计学处理。统计软件采用SAS软件包。
实验结果表明，与转移空载质粒和注射生理盐水的对照组相比，转移具有hVEGF启动子驱动的mVEGF-2基因后5天的大鼠脑组织中有mRNA的表达，且同时注射SNAP的实验组大鼠脑组织中mRNA的表达量是仅注射含hVEGF启动子和mVEGF-2基因质粒的2～3倍。VEGF-2免疫组化染色可见VEGF-2蛋白表达水平增高，脑血管数增多(图5)，梗塞体积缩小(表1)，尤以同时注射具有hVEGF启动子的mVEGF-2基因质粒裸DNA和NO释放剂(SNAP)的实验组效果最为明显。
表1 四种处理组合对降低大鼠脑梗塞体积缺血脑组织 梗塞体积/大脑体积 (％)X±s(％)注射处理 1 2 3 4裸pEGVPV DNA 11.3 10.7 8.69.4 10.0±1.2*裸pEGVPV 8.26.05.35.7 6.3±1.3**DNA+SNAP裸pEGSH16.3 18.4 14.2 18.816.8±2.0DNA+SNAP生理盐水(CK) 26.1 23.3 21.7 20.522.9±2.4*较对照达到P＜0.05的显著水平；**较对照达到P＜0.01的显著水平。SEQ ID NO 1的信息序列特征(A)(长度)457个碱基(B)类型核酸(C)链性双链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ IDNO 1起始密码↓1 GCCTCCGGAT CCATGAACTT TCTGCTGTCT TGGGTGCACT GGACCCTGGC51TTTACTGCTG TACCTCCACC ATGCCAAGTG GTCCCAGGCT GCACCCACGA101 CAGAAGGAGA GCAGAAGTCC CATGAAGTGA TCAAGTTCAT GGACGTCTAC151 CAGCGAAGCT ACTGCCGTCC AATTGAGACC CTGGTGGACA TCTTCCAGGA201 GTACCCCGAC GAGATAGAGT ACATCTTCAA GCCGTCCTGT GTGCCGCTGA251 TGCGCTGTGC AGGCTGCTGT AACGATGAAG CCCTGGAGTG CGTGCCCACG301 TCAGAGAGCA ACATCACCAT GCAGATCATG CGGATCAAAC CTCACCAAAG351 CCAGCACATA GGAGAGATGA GCTTCCTACA GCACAGCCGA TGTGAATGCA401GACCAAAGAA AGACAGGACA AAGCCAGAAA AATGTGACAA GCCGAGGCGG451TGAATTC↑终止密码SEQ ID NO 2的信息序列特征(A)(长度)146个氨基酸(B)类型多肽(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 2信号肽1 APTT EGEQKSHEVI KFMDVYQRSY51 CRPIETLVDI FQEYPDEIEY IFKPSCVPLM RCAGCCNDEA LECVPTSESN101ITMQIMRIKP HQSQHIGEMS FLQHSRCECR PKKDRTKPEK CDKPRRSEQ ID NO 3的信息序列特征(A)(长度)2064个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 3NF-kB-like序列1 CTGTCTGCCC AG HIF-1结合位点 HIF-1辅助序列AP-1位点51 101151201TGCAGGCC AGATGAGGGC251TCCAGATGGC ACATTGTCAG AGGGACACAC TGTGGCCCCT GTGCCCAGCC301CTGGGCTCTC TGTACATGAA GCAACTCCAG TCCCAAATAT GTAGCTGTTT351GGGAGGTCAG AAATAGGGGG TCCAGGAGCA AACTCCCCCC ACCCCCTTTC401CAAAGCCCAT TCCCTCTTTA GCCAGAGCCG GGGTGTGCAG ACGGCAGTCA451CTAGGGGGCG CTCGGCCACC ACAGGGAAGC TGGGTGAATG GAGCGAGCAG501CGTCTTCGAG AGTGAGGACG TGTGTGTCTG TGTGGGTGAG TGAGTGTGTG551CGTGTGGGGT TGAGGGTGTT GGAGCGGGGA GAAGGCCAGG GGTCACTCCA601GGATTCCAAC AGATCTGTGT GTCCCTCTCC CCACCCGTCC CTGTCCGGCT651CTCCGCCTTC CCCTGCCCCC TTCAATATTC CTAGCAAAGA GGGAACGGCT701CTCAGGCCCT GTCCGCACGT AACCTCACTT TCCTGCTCCC TCCTCGCCAA751TGCCCCGCGG GCGCGTGTCT CTGGACAGAG TTTCCGGGGG CGGATGGGTA801ATTTTCAGGC TGTGAACCTT GGTGGGGGTC GAGCTTCCCC TTCATTGCGG851CGGGCTGCGG GCCAGGCTTC ACTGGGCGTC CGCAGAGCCC GGGCCCGAGC901CGCGTGTGGA GGGGCTGAGG CTCGCCTGTC CCCGCCCCCC GGGGCGGGCC951GGGGGCGGGG TCCCGGCGGG GCGGAGCCAT GCGCCCCCCC CTTTTTTTTT1001 TAAAAGTCGG CTGGTAGCGG GGAGG TCGC GGAGGCTTGG GGCAGCCGGG-1+1(转录起始位点)1051 TAGCTCGGAG GTCGTGGCGC TGGGGGCTAG CACCAGCGCT CTGTCGGGAG1101 GCGCAGCGGT TAGGTGGACC GGTCAGCGGA CTCACCGGCC AGGGCGCTCG1151 GTGCTGGAAT TTGATATTCA TTGATCCGGG TTTTATCCCT CTTCTTTTTT1201 CTTAAACATT TTTTTTTAAA ACTGTATTGT TTCTCGTTTT AATTTATTTT1251 TGCTTGCCAT TCCCCACTTG AATCGGGCCG ACGGCTTGGG GAGATTGCTC1301 TACTTCCCCA AATCACTGTG GATTTTGGAA ACCAGCAGAA AGAGGAAAGA1351 GGTAGCAAGA GCTCCAGAGA GAAGTCGAGG AAGAGAGAGA CGGGGTCAGA1401 GAGAGCGCGC GGGCGTGCGA GCAGCGAAAG CGACAGGGGC AAAGTGAGTG1451 ACCTGCTTTT GGGGGTGACC GCCGGAGCGC GGCGTGAGCC CTCCCCCTTG1501 GGATCCCGCA GCTGACCAGT CGCGCTGACG GACAGACAGA CAGACACCGC1551 CCCCAGCCCC AGCTACCACC TCCTCCCCGG CCGGCGGCGG ACAGTGGACG1601 CGGCGGCGAG CCGCGGGCAG GGGCCGGAGC CCGCGCCCGG AGGCGGGGTG1651 GAGGGGGTCG GGGCTCGCGG CGTCGCACTG AAACTTTTCG TCCAACTTCT1701 GGGCTGTTCT CGCTTCGGAG GAGCCGTGGT CCGCGCGGGG GAAGCCGAGC1751 CGAGCGGAGC CGCGAGAAGT GCTAGCTCGG GCCGGGAGGA GCCGCAGCCG1801 GAGGAGGGGG AGGAGGAAGA AGAGAAGGAA GAGGAGAGGG GGCCGCAGTG1851 GCGACTCGGC GCTCGGAAGC CGGGCTCATG GACGGGTGAG GCGGCGGTGT1901 GCGCAGACAG TGCTCCAGCC GCGCGCGCTC CCCAGGCCCT GGCCCGGGCC1951 TCGGGCCGGG GAGGAAGAGT AGCTCGCCGA GGCGCCGAGG AGAGCGGGCC2001 GCCCCACAGC CCGAGCCGGA GAGGGAGCGC GAGCCGCGCC GGCCCCGGTC2051 GGGCCTCCGA AACC
权利要求
1.一种包含有人源性VEGF启动子(hVEGF promoter)和鼠源性VEGF-2cDNA(mVEGF-2)的载体，其特征在于该载体的hVEGF启动子和mVEGF-2定向连接在一起，hVEGF启动子位于mVEGF-2上游，使mVEGF-2基因被hVEGF启动子所驱动。
2.一种如权利要求1所述的载体，其中鼠源性VEGF-2基因核苷酸序列为SEQ ID NO 1。
3.一种如权利要求1所述的载体，其中人源性VEGF启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO 3。
4.一种构建如权利要求1-3所述任一载体的方法。
5.一种含有如权利要求1-3所述任一载体的微生物克隆。
6.一种生产权利要求1-3所述任一载体的方法，其特征在于，将权利要求1-3所述的载体转化入受体菌，将受体菌摇菌活化后，从中大量提取纯化质粒DNA。
7.一种权利要求1-3所述任一载体的用途，其特征在于该载体作为治疗血管疾病的基因药物。
8.一种权利要求1-3所述任一载体的用途，其特征在于该载体以裸DNA的方式作为治疗血管疾病的基因药物。
9.一种检测权利要求1-3所述任一载体的以裸DNA方式作用效果的方法，其特征在于，将微生物生产的权利要求1-3所述任一载体的裸DNA注射到局部缺血哺乳动物模型中。
10.权利要求9所述的方法包括局部缺血模型制作，向缺血组织注射裸DNA的剂量的确定、NO供体化学试剂及用量的确定。
全文摘要
本方法从受孕小鼠胚胎克隆了鼠源性VEGF－2(mVEGF－2)基因，然后从新生儿胎盘克隆人源性VEGF启动子(hVEGF promoter)，并使mVEGF－2被hVEGF promoter所驱动，插入哺乳动物表达载体pEGSH中，构建出能够在原核细胞中以高拷贝数产生大量DNA、并能在原核和哺乳动物细胞中均能表达的载体pEGVPV。用这载体转化E.coli DH5α后，获得的DNA拷贝数有2000个/细胞之多，从细胞培养物中分离的DNA产量能够达到1.5mg/L。本发明还提供了一种以微生物生产血管内皮生长因子－2(vascular endothelial growth factor2，VEGF－2)DNA药物的方法。血管内皮生长因子能特异性地作用于血管内皮细胞，强烈促进其增殖和血管形成，并有升高血管通透性的作用。缺血型动物模型实验表明，向局部缺血组织显微注射该裸DNA可促进新生血管形成，增强侧枝循环的建立，有效地改善了缺血组织的血液供应。本方法可提供一种治疗血管疾病的新方案。
文档编号A61K48/00GK1467295SQ03100580
公开日2004年1月14日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者周长生, 张金文, 陈正华 申请人:甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司