专利名称：可溶性p－选择素及炭疽致死毒素的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可溶性血小板-选择素(P-选择素，platelet-selectin，P-selectin)用于治疗全身性出血疾病的新颖用途。
背景技术：
出血性疾病的种类非常多样化且其致病原因相当复杂，例如血管壁或结缔组织结构异常，血小板量或功能异常，凝血因子异常，纤维蛋白溶解过度及循环抗凝物质等等。基于遗传与否，出血性疾病可分类为遗传性及非遗传性出血疾病。遗传性出血疾病如血友病，是由于凝血因子发生突变，使凝血能力丧失或减低所造成。在出血临床病例，则大部分为非遗传性出血疾病，包括内外创伤出血、营养或维生素K摄取不足所造成的出血、肠胃道溃疡出血、传染性疾病所引起的出血、医疗行为所造成的出血、妇女生产过程的出血、造血系统失常、肝脏功能失调、自体免疫疾病造成的出血、出血性登革热、出血性蛇毒攻击、炭疽病、菌血症及癌症造成的出血等等。
除外伤出血外，目前的医疗方法对于大量全身性出血均束手无策。目前已知的血液凝集促进药剂(如抗纤维蛋白溶解剂)仅适用于治疗局部出血。该等血液凝集促进药剂进入体内将迅速形成小血栓，常造成心肌梗塞以及脑中风的副作用。因此，目前并无适当安全且无副作用的全身性止血用药。
P-选择素系选择素家族之一成员，其位于血小板的α-颗粒及内皮细胞的WP小体(Weibel-Palade bodies)内。内皮细胞受到凝血酶或组织胺的刺激后，可快速表现P-选择素。P-选择素的可溶形式(可溶性P-选择素，sP-selectin)可发现于血浆中，为血液循环蛋白质。可溶性P-选择素分子较P-选择素分子小3kDa，在血液中以单体形式存在，而与膜结合的P-选择素则是以寡聚状态存在。健康人的可溶性P-选择素系来自发现于内皮细胞及血小板的选择性剪切形式(Johnston，G.I.等人，1990，J.Biol.Chem.265，21381-21385)。
已有研究认为可溶性P-选择素的血浆量可视为预期血栓消耗血小板疾病(thrombotic consumptive platelet disorder)的有用工具(Smith，A.等人，1999，Throm.Haemost.82，1593-1599)。Blann，A.D.及Lip.G.Y.则指出可溶性P-选择素循环于血液的生物功能并不清楚(J.Clin.Endocrinol.Metab.(2000)85，1745-1747)。后续研究运用测量血浆凝集所耗费时间(Plasma clotting time)实验，发现将可溶性P-选择素打入老鼠体内可促进血液的凝固(Patrick Andre等人，2000，PNAS vol.97，No.25，13835-13840)。该研究仅就分子机转及局部性出血予以描述，并推论可溶性P-选择素可能与凝血病变有关。然而，该研究并未指出可溶性P-选择素可用于全身性出血疾病的治疗。
进一步的研究则指出急性心肌梗死(AMI)患者及不稳定心绞痛患者的血浆可溶性P-选择素量明显升高(Meral Kayikcioglu等人，Int JCardiol 2001，79223；Enver Atalar等人，Int J Cardiol，2001，7869)。然而，该等文献亦未提及任何有关全身性出血疾病治疗的建议。
综上所述，并无任何文献揭示或建议P-选择素于治疗全身性出血疾病的新颖应用。
发明内容
本发明提供一种可溶性P-选择素于制备治疗全身性出血疾病药物的应用。
本发明还提供一种炭疽致死毒素于制造治疗抗血栓疾病药物的应用。
本发明涉及可溶性P-选择素在制备治疗全身性出血疾病的药物中的应用。
所述的可溶性P-选择素选自天然存在的可溶性P-选择素、其遗传工程重组体、多形性(polymorphic)变体、对偶(allelic)变体及其它异构体。
所述的可溶性P-选择素选自天然存在的可溶性P-选择素及其遗传工程重组体。
所述的可溶性P-选择素可经口服或静脉内注射用药。
所述的可溶性P-选择素的用药量为每公斤体重应用药约0.1毫微克至约100毫克。
所述的全身性出血疾病选自出血性登革热、出血性蛇毒及炭疽病。
所述的全身性出血疾病为菌血症中的出血病况。
本发明涉及炭疽致死毒素在制造治疗抗血栓疾病药物的应用。
所述的炭疽致死毒素选自天然存在的炭疽致死毒素、其遗传工程重组体、多形性(polymorphic)变体、对偶(allelic)变体及其它异构体。
所述的炭疽致死毒素选自天然存在的炭疽致死毒素及其遗传工程重组体。
所述的炭疽致死毒素可经口服或静脉内注射用药。
所述的炭疽致死毒素的用药量为每公斤体重应用药约0.1毫微克至约100毫克。
所述的抗血栓疾病选自心脏病及脑中风。
根据本发明，可溶性P-选择素提供治疗全身性出血疾病的新颖应用。本发明未预期地发现可溶性P-选择素具有明显促进凝血的功能，但并不会引起血栓，导致心肌梗塞及脑中风。因此，本发明的可溶性P-选择素在治疗全身性出血疾病具有良好效果且无不良副作用。
图1为血浆凝集试验结果的数据；图中的横条由上而下分别代表控制组免疫球蛋白(IgG)，炭疽毒素(LeTx)，重组可溶性P-选择素(rP-sel)，重组可溶性P-选择素(rP-sel)+抗P-选择素抗体(抗-P-sel)，抗登革病毒第一非结构蛋白抗体(抗-NS1抗体)+P-选择素及抗登革病毒第一非结构蛋白抗体(抗-NS1抗体)。
图2为小鼠保护力试验结果的数据；图2A为可溶性P-选择素对施打出血性蛇毒小鼠的保护力数据，图中的---○---代表西部菱背响尾蛇蛇毒+重组可溶性P-选择素(rP-sel)，——代表东部菱背响尾蛇蛇毒+重组可溶性P-选择素(rP-sel)，——代表西部菱背响尾蛇蛇毒，—■—代表东部菱背响尾蛇蛇毒；图2B为为可溶性P-选择素对施打炭疽毒素小鼠的保护力数据，—●—代表炭疽毒素(LeTx)，---○---代表炭疽毒素(LeTx)+重组可溶性P-选择素(rP-sel)，——代表炭疽毒素(LeTx)+控制组免疫球蛋白(IgG)及——代表炭疽毒素(LeTx)+重组可溶性P-选择素(rP-sel)+抗P-选择素抗体(抗-P-sel)。
图3为小鼠血小板凝集时间试验的结果；其中AA代表花生四烯酸；及LeTx代表炭疽毒素。
具体实施例方式
针对全身性出血性疾病，目前尚无有效且不会造成血栓风险的药物。现行的治疗方法大多仅为支持性(supporting)治疗，并无较佳方法可治疗全身性出血。本发明提供可溶性P-选择素治疗全身性出血疾病的新颖用途。该可溶性P-选择素可有效治疗出血性疾病，特别是如炭疽病及出血性登革热，且不会引起血栓形成的副作用。此外，本发明的可溶性P-选择素亦可用于治疗菌血症所引发的出血病况。
可溶性P-选择素的新颖用途本发明提供一种可溶性P-选择素于制备治疗全身性出血疾病药物的应用。
可溶性P-选择素及其医药组合物根据本发明，用语”可溶性P-选择素”包括天然存在的P-选择素的可溶形式及其遗传工程重组体或多形性(polymorphic)或对偶(allelic)变体或其它异构体(isoform)。该用语亦包括修饰及未修饰的可溶性P-选择素，如醣基化及未醣基化形式。研究显示可溶性P-选择素可来自活化的血小板或内皮细胞。然而，一般技艺人士对于可溶性P-选择素的功能及其与血小板间的关系并不十分明了。未预期地，本发明发现可溶性P-选择素在全身性出血疾病的治疗上具有相当良好的效果。根据本发明，适合治疗全身性出血疾病的任何形式的可溶性P-选择素均可用于本发明。较佳地，本发明可溶性P-选择素为天然存在的可溶性P-选择素或可溶性P-选择素的重组体。本发明根据本发明，可溶性P-选择素系一般技艺人士可易于获得者，例如分离自天然来源，购自商业来源或化学合成或藉分子生物学技术合成。
本发明的可溶性P-选择素可与医药上可接受载剂制备成医药组合物。除可溶性P-选择素及载剂外，该组合物可另含有稀释剂，充填剂，盐类，缓冲剂，安定剂，溶解剂及其它该技艺中已知的物质。用语”医药上可接受”系指不会干扰活性成份的生物活性作用的无毒性物质。用于本发明可溶性P-选择素医药组合物的载剂的特性系依用药路线而定。本发明医药组合物亦可含有本技艺中已知的促凝血剂，例如维生素K及抗纤维蛋白溶解剂。
可溶性P-选择素的用药为实施本发明的应用，治疗上有效量的本发明可溶性P-选择素或医药组合物可用药至罹患出血性疾病的哺乳动物，包括人类及非人类哺乳动物。根据本发明，本发明可溶性P-选择素或医药组合物的用药可藉各种一般方式进行，如静脉内注射。当以液体形式用药时，可添加液体载剂，如水、生理食盐液或动植物油。该液体形式的医药组合物包含0.5％至90％以重量计的可溶性P-选择素，较佳为1％至50％以重量计的可溶性P-选择素。
当静脉注射用药治疗上有效量的可溶性P-选择素时，可溶性P-选择素系为非经肠可接受的水溶液形式。制备此种非经肠可接受溶液需考虑的pH、等张性、安定性及类似条件系属本技艺中已知的知试或技术。除可溶性P-选择素外，较佳的静脉注射医药组合物可含有本技艺中已知的等张媒剂。本发明医药组合物亦可含有安定剂、保存剂、缓冲剂、抗氧化剂或其它一般技艺人士已知的添加剂。使用本发明组合物的静脉注射治疗的时间系视欲治疗疾病严重性及各别病患的病况而定。医师将决定使用本发明医药组合物的适当静脉用药时间。
本发明的可溶性P-选择素在医药组合物中的量系依欲治疗病况的性质及严重性及病患已进行的先前治疗的性质而定。医师将以个别病患的情况决定可溶性P-选择素的量。针对各种用于实施本发明用途的医药组合物，预期每公斤体重应用药约0.1毫微克至约100毫克的可溶性P-选择素。
特别是，本发明的可溶性P-选择素可用于治疗出血性登革热、出血性蛇毒及炭疽病并可治疗菌血症中出血病况。较佳地，本发明的可溶性P-选择素可用于治疗出血性登革热、出血性蛇毒及炭疽病。出血性登革热系多次感染登革热后所产生的全身性出血病况。第一次感染登革热时，多半只有感冒症状并没有生命危险。然而，在多次感染登革病毒之后，会有一定比例的病人产生有致命危险的全身性出血病况。登革病毒的第一非结构蛋白(dengue non-structural protein 1，NS1)可诱导宿主自体免疫抗体的产生，其效价将因为多次感染登革热而增高。此等自体免疫抗体可导致凝血速度变慢并产生可能的其它的血管病变。出血性毒蛇咬伤是台湾及其它热带地区常见的户外伤害，唯一有效的治疗方式是注射抗蛇毒血清。然而，毒蛇种类繁多，为治疗蛇毒中毒，必须针对每一种蛇准备特定的抗蛇毒血清；此对偏远地区而言是不易达成的负担。炭疽病则是炭疽杆菌(Bacillus anthracis)感染所引起的疾病，炭疽杆菌所产生的致死毒素(anthrax lethal toxin)是主要的毒力因子(virulence factor)。炭疽病死亡的病例中发现死者均有大量的内出血。本发明惊讶地发现可溶性P-选择素对于出血性登革热、出血性蛇毒及炭疽病具有良好的治疗效果，且不引发任何副作用。
炭疽致死毒素的新颖用途本发明另提供一种炭疽致死毒素于制造治疗抗血栓疾病药物的应用。血栓疾病可能造成心肌梗塞及脑中风等并发症，此等血栓栓塞所造成的心血管疾病在已开发国家的十大死亡原因排行榜中几乎名列前茅。常用的抗血栓药物包括血小板抑制剂、组织型血纤维溶原活化因子(tPA)、尿激酶(uPA)及链霉菌激酶(SK)等。然而，目前仍缺乏非常有效的抗血栓药物。本发明惊讶地发现炭疽致死毒素可有效的抑制血小板凝集，藉此可作为治疗抗血栓疾病的药物。
根据本发明，用语”炭疽致死毒素”包括天然存在的炭疽致死毒素及其遗传工程重组体或多形性(polymorphic)或对偶(allelic)变体或其它异构体(isoform)。根据本发明，适合治疗抗血栓疾病的任何形式的炭疽致死毒素均可用于本发明。较佳地，本发明炭疽致死毒素为天然存在的炭疽致死毒素或炭疽致死毒素的重组体。本发明根据本发明，炭疽致死毒素系一般技艺人士可易于获得者，例如分离自天然来源，购自商业来源或化学合成或藉分子生物学技术合成。
根据本发明，治疗上有效量的本发明炭疽致死毒素或医药组合物可用药至罹患抗血栓疾病的哺乳动物，包括人类及非人类哺乳动物。根据本发明，本发明炭疽致死毒素或医药组合物的用药可藉各种一般方式进行，如口服或静脉内注射；较佳为静脉内用药。较佳地，本发明炭疽致死毒素的有效用药量预期为每公斤体重应用药约0.1毫微克至约100毫克。
本发明炭疽致死毒素可大幅抑制血小板的凝集，并降低产生心肌梗塞及脑中风等并发症的风险。
实施例实例1 出血性登革热及炭疽毒素的血浆凝集试验血浆凝集实验系将小鼠C57BL/6J的血液在1,500×g的条件离心25分钟以获取小鼠的“血小板缺乏的血浆(platelet-poor plasma，PPP)”。将所得血浆加入等体积20毫莫耳浓度氯化钙(CaCl2)后，在800rpm及37℃，以凝集测定仪(aggregometermodel 600B，Ion-Trace，Stouffville，Canada)计录其因凝集造成的吸光值的变化并测得血浆凝集时间(plasma clotting time)。
本实例使用下列试剂进行血浆凝集试验重组P-选择素-Ig Fc蛋白(购自R & D Systems Inc.，Minneapolis，Minnesota，USA)作为P-选择素来源。登革病毒蛋白则使用登革病毒第一非结构蛋白，其系来自以PCR技术复制合成登革病毒第二型(dengue virus type II)台湾本土分离株(PL046)的第一非结构蛋白基因(Chang等人，2002，J Infect Dis 186，743-51)。炭疽毒素系使用重组炭疽致死毒素，其系得自美国基因库资料中DNA以及蛋白质资料(美国NCBI Gene Bank，AF065404 andNC_001496)以人工合成基因技术结合PCR技术合成的DNA(Chang等人，1993，Biochem Biophys Res Commun 190，242-9)。
将对抗登革病毒第一非结构蛋白抗体(anti-dengue non-structureprotein NS1 antibody)以及炭疽毒素(LeTx)施打于小鼠体内后可造成抑制血浆凝集。如图1所示，将抗-NS1抗体及LeTx进行静脉施打24小时后，血浆凝集时间显著增加，显示凝集速度下降。相反的，将重组可溶性P-选择素(rP-sel)进行静脉施打24小时后，老鼠血浆凝集时间显著减少，显示凝集速度加快。但如添加抗P-选择素抗体(抗-P-sel)后，上述rP-sel的作用可被中和。此外，将抗-NS1抗体及可溶性P-选择素一起进行静脉施打24小时后，相较于施打抗-NS1抗体，血浆凝集时间显著减少。
由上述图1的结果可知，可溶性P-选择素可促进体内凝血机制的活化，且单独施打治疗性剂量的可溶性P选择素并不会造成对实验动物的伤害，却可大幅提升血液凝集效率。因此，可溶性P-选择素为一很有潜力的全身性止血用药选择。
实例2 炭疽毒素及出血性蛇毒的小鼠保护力试验在P-选择素对小鼠的保护力试验中，将小鼠先施打重组P-选择素-Ig蛋白。P-选择素添加中和性单株抗体或对照组人类免疫球蛋白IgG(剂量均为1.2克/克)后4小时，再以静脉施打炭疽毒素及出血性蛇毒。接着观察小鼠死亡时间。重组P-选择素-Ig蛋白及炭疽毒素的来源如实例1所示。出血性蛇毒系使用西部菱背响尾蛇(Crotalus atrox)及东部菱背响尾蛇(Crotalus adamanteus)的毒液(购自Sigma，St.Louis，MissouriUSA)。
如图2A所示，施打西部菱背响尾蛇(Crotalus atrox)及东部菱背响尾蛇(Crotalus adamanteus)的毒液后，各造成六只小鼠(C57BL/6J)全数于1小时内死亡。然而，事先施打重组可溶性P-选择素的小鼠则全数存活超过三个月，证明可溶性P-选择素对出血具有保护能力。上开试验证明出血性蛇毒的毒液伤害可经由可溶性P-选择素的治疗而脱离死亡的威胁(图2A)。因此，可溶性P-选择素有可能开发成为单一广效性的抗出血性蛇毒用药。
另如图2B所示，施打炭疽毒素(LeTx)造成六只小鼠(C57BL/6J)全数于4-5日内死亡。然而，事先施打重组可溶性P-选择素的小鼠则有一只死于第8天，一只死于第18天，而其余四只则存活超过三个月。上该数据证明可溶性P-选择素对出血具有保护能力。此外，由图可知该可溶性P-选择素所提供的保护能力可被P-选择素专一性的抗体所中和。因此，上开试验说明可溶性P-选择素可减少炭疽致死毒素造成的死亡。
实例3 菌血症的小鼠保护力试验小鼠保护力试验的试剂及方法如实例2所示。小鼠菌血症系将1×108菌数/克的大肠杆菌液施打于小鼠(C57BL/6J)的血浆中仿真菌血症。如表1所示，施打大肠杆菌液的6只小鼠于24小时内全数死亡。然而，事先施打重组可溶性P-选择素的小鼠平均多存活2日。因此，可溶性P-选择素对菌血症小鼠确具保护功效。
表1
实例4 炭疽致死毒素的抑制血小板凝集试验炭疽致死毒素对抑制凝血的效果系以血小板凝集试验测试。炭疽毒素系使用重组炭疽致死毒素，其系得自美国基因库资料中DNA以及蛋白质资料(美国NCBI Gene Bank，AF065404 and NC_001496)以人工合成基因技术结合PCR技术合成的DNA(Chang等人，1993，BiochemBiophys Res Commun 190，242-9)。
采取小鼠(C57BL/6J)的血液，并在500×g的条件下离心10分钟获得富含血小板的血浆(platelet-rich plasma，PRP)。将所得血浆加入血小板激活剂花生四烯酸(arachidonic acid)，在搅拌(800rpm)及37℃的条件下以凝集测定仪(aggregometermodel 600B，Ion-Trace，Stouffville，Canada)计录其因凝集造成的吸光值的变化并测得血小板凝集时间(platelet aggregation time)。如图3所示，经血小板激活剂处理后，纯化的血小板进行正常的凝集反应。然而，添加炭疽致死毒素的实验组则出现抑制反应。因此，炭疽致死毒素可大幅抑制血小板凝集。
权利要求
1.可溶性P-选择素在制备治疗全身性出血疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的可溶性P-选择素选自天然存在的可溶性P-选择素、其遗传工程重组体、多形性(polymorphic)变体、对偶(allelic)变体及其它异构体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的可溶性P-选择素选自天然存在的可溶性P-选择素及其遗传工程重组体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的可溶性P-选择素可经口服或静脉内注射用药。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的可溶性P-选择素的用药量为每公斤体重应用药约0.1毫微克至约100毫克。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的全身性出血疾病选自出血性登革热、出血性蛇毒及炭疽病。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的全身性出血疾病为菌血症中的出血病况。
8.一种炭疽致死毒素在制造治疗抗血栓疾病药物的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的炭疽致死毒素选自天然存在的炭疽致死毒素、其遗传工程重组体、多形性(polymorphic)变体、对偶(allelic)变体及其它异构体。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的炭疽致死毒素选自天然存在的炭疽致死毒素及其遗传工程重组体。
11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的炭疽致死毒素可经口服或静脉内注射用药。
12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的炭疽致死毒素的用药量为每公斤体重应用药约0.1毫微克至约100毫克。
13.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的抗血栓疾病选自心脏病及脑中风。
全文摘要
本发明提供一种可溶性P－选择素在制备治疗全身性出血疾病药物的应用。本发明另提供一种炭疽致死毒素在制造治疗抗血栓疾病药物的应用。
文档编号A61P7/00GK1565619SQ0314654
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月7日 优先权日2003年7月7日
发明者张新侯, 孙德珊 申请人:张新侯