与cgi-94相互作用促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡的物质及其筛选方法

专利名称：与cgi-94相互作用促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡的物质及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及细胞凋亡抑制物质或促进物质、它们的筛选以及与细胞凋亡有关的疾病的诊断和治疗。更详细地讲，本发明涉及与参与细胞凋亡的Smac/DIABLO相互作用的物质，和通过与引起细胞凋亡的CGI-94直接相互作用或者通过与Smac/DIABLO相互作用抑制或促进细胞凋亡的物质，详细来讲，就是一种细胞凋亡抑制蛋白-p18TFP和它的编码基因。本发明还涉及在诊断由于这些蛋白的表达变化所影响的细胞或组织方面的应用。
背景细胞凋亡不仅仅是在生长阶段所见的生理学变化，例如，包括细胞分化(Bri.J.Cancer，26，239(1972))，同样也是在神经变性性病症，例如早老性痴呆(Acta.Neuropathol.，89，35(1995)；J.Neurol.Sci.，152，73(1997))、癌症和其他疾病(Bri.J.Cancer，26，239(1972))的发病过程中观察到细胞异常的一种现象。详细来讲，异常的细胞凋亡增加(Science，243，535(1989)；Cell，97，395(1999)；Nature，399，263(1991))或者细胞凋亡受抑制(Adv.Immunol.，50，55(1991))可造成机体总体功能持久性的丧失，从而会导致严重疾病。最近，由于分子生物学研究的进展，有关参与细胞凋亡的蛋白及其生理学机制和病理学机制的研究取得了很大进展(Genes Dev.，10，1(1996)；Cell，87，171(1996)；Nature，387，773(1997)；Science，275，1122(1997)；Cancer Res.，62，18(2002))。然而，对于它的详细作用机制仍然存在很多不确定性。阐明细胞凋亡的作用机制和控制细胞凋亡对于包括早老性痴呆和癌症在内的各种疾病的药物治疗很明显是非常有用的，而且是治疗的靶(Science，267，1456(1995)；Ann.Neurol.，38，839(1995)；Trends Pharmacol.Sci.，20，35(1999))。
本发明所解决的问题本发明的发明人已经发现，在从患有早期早老性痴呆的患者得来的脑海马回中发现基因CGI-94的表达受到抑制(Eur.J.Neurosci.15，79(2002))。然而，目前完全不了解由这个基因产生的蛋白的生理学作用和病理学作用(Genome Res.，10，703(2000))。因而，为了阐明所述蛋白(CGI-94)的功能，本发明的发明人开展了广泛的研究，使在C-末端融合了荧光蛋白GFP(绿色荧光蛋白)的蛋白(CGI-94-CT-GFP)在PCl2细胞中表达，利用NGF(神经生长因子)诱导那些细胞的分化。结果，加入NGF后120小时，在表达CGI-94-GFP的细胞中神经突延伸被抑制并且观察到细胞凋亡。另外，两周后，发现所有细胞死亡。另一方面，在未表达细胞中，通过加入NGF观察到神经突延伸和细胞存活。因此，很可能是CGI-94引起神经突延伸被抑制和细胞凋亡。虽然在患有早期早老性痴呆的脑部的早期阶段中CGI-94的表达受到抑制和对所述细胞死亡的促进作用似乎是明显矛盾的事件，但是这样一个事件很可能是由于在患有早老性痴呆的脑部中的细胞凋亡抑制功能引起的。
此外，本发明的发明人利用如双杂交系统(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，9578(1991))的已描述的方法，搜索与这个CGI-94相互作用的蛋白，并因此表明，参与细胞凋亡的蛋白-Smac/DIABLO，显示出与CGI-94强烈的相互作用。已有报道Smac/DIABLO是在细胞凋亡过程中借助细胞色素C从线粒体释放到所述细胞中去的，并通过抑制细胞凋亡蛋白(IAP)，例如XIAP、c-IAP、c-IAP2或survivin的抑制作用并且另外促进caspase-3活性来促进细胞色素C下游的细胞凋亡(Cell，102，33(2000)；Cell，102，43(2000)；Nature，406，406，855(2000))。因此，据信在由NGF诱导分化的PCl2细胞中，CGI-94通过与这个Smac/DIABLO相互作用引起神经突延伸抑制和细胞凋亡。
从上面提到的事实来看，与CGI-94相互作用从而抑制它的功能的物质，导致对神经突延伸抑制和细胞凋亡的抑制，而且被认为抑制与细胞凋亡、特别是神经细胞细胞凋亡有关的疾病(例如早老性痴呆)中神经细胞的死亡，并控制其病程。同样，促进CGI-94功能的物质促进细胞凋亡，并被认为尤其会导致细胞凋亡的快速增进，以及对尤其是由于细胞过度增殖引起的疾病，例如癌症和自身免疫病的治疗是有效的。
此外，抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，导致对神经突延伸抑制的抑制和对细胞凋亡的抑制，而且被认为抑制与细胞凋亡、特别是神经细胞凋亡有关的疾病(例如早老性痴呆)中神经细胞的死亡，并控制它的病程。同样，加速CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质促进细胞凋亡，并被认为会导致细胞凋亡的快速增进，对由于尤其是细胞过度增殖引起的疾病例如癌症和自身免疫病的治疗是特别有效的。
解决所述问题的方法因此，本发明提供(1)一种与CGI-94相互作用从而抑制细胞凋亡的物质；(2)一种抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而抑制细胞凋亡的物质；(3)一种DNA，其特征为(a)包含SEQ ID NO1碱基序列的碱基编号140-601的碱基序列的DNA，(b)在严谨条件下可与包含(a)的序列的DNA杂交的DNA，或(c)与(a)的DNA序列具有不低于60％同源性的DNA；(4)一种蛋白质，其特征为(a)包含SEQ ID NO2氨基酸序列的氨基酸1-153并通过与CGI-94相互作用或者通过抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用来抑制细胞凋亡的蛋白，(b)在(a)的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、取代或增加并通过与CGI-94相互作用或者通过抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用来抑制细胞凋亡的蛋白，或者(c)与(a)的氨基酸序列具有不低于60％同源性的蛋白；(5)编码(4)中所述蛋白的DNA；(6)与(3)或(5)中所述DNA互补的RNA；(7)与CGI-94相互作用促进细胞凋亡的物质；(8)促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而促进细胞凋亡的物质；(9)筛选与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质的方法，该方法包括测定表达CGI-94的细胞神经突在受试物质和分化诱导因子存在下的神经突延伸或者细胞凋亡；(10)筛选与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质的方法，该方法包括测定表达CGI-94的细胞在受试物质和分化诱导因子存在下的神经突延伸或者细胞凋亡；(11)与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质，其中所述物质是借助(9)中所述方法发现的；(12)与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质，其中所述物质是借助(10)中所述方法发现的；(13)筛选抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质的方法，该方法包括测定表达CGI-94和Smac/DIABLO的细胞在受试物质和分化诱导因子存在下的神经突延伸或者细胞凋亡；(14)筛选促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质的方法，该方法包括测定表达CGI-94和Smac/DIABLO的细胞在受试物质和分化诱导因子存在下的神经突延伸或者细胞凋亡；(15)抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，其中所述物质是借助(13)中所述方法发现的；(16)依照(12)或(15)的物质，所述物质是p18TFP蛋白；(17)促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，其中所述物质是借助(14)中所述方法发现的；(18)一种用于治疗与细胞凋亡有关的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含与CGI-94相互作用从而抑制细胞凋亡的物质；(19)一种用于治疗与细胞凋亡有关的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而抑制细胞凋亡的物质；(20)依照(18)或(19)的药用组合物，其中所述物质是p18TFP蛋白或p18TFP DNA；(21)一种用于治疗由于细胞过度增殖导致的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含与CGI-94相互作用从而促进细胞凋亡的物质；(22)一种用于治疗由于细胞过度增殖导致的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而促进细胞凋亡的物质；(23)一种用于诊断与细胞凋亡相关的疾病的方法，所述方法包括测定CGI-94基因或CGI-94蛋白在细胞或组织中表达的水平；和(24)一种用于诊断与细胞凋亡相关的疾病的试剂盒，其包括测定CGI-94基因或CGI-94蛋白在细胞或组织中表达的水平。
附图简述

图1显示表达所述CGI-94-GFP融合蛋白的PCl2细胞的荧光显微照片。图1a显示CGI-94-GFP瞬时表达后48小时拍摄的照片，照片表明所有的PC 12细胞存活，并且表明由于没有加入NGF，在荧光显微镜下没有观察到神经神经突延伸。图1b表明在表达后24小时加入NGF(50ng/ml)并经过了120个小时后，在荧光显微镜下观察到不表达所述蛋白的细胞导致神经突延伸，而表达所述蛋白的细胞(箭头所示)导致神经神经突延伸和细胞凋亡受到抑制。
图2a显示细胞凋亡抑制蛋白p18TFP的ORF的cDNA序列(同样参见，SEQ ID NO1)。图2b显示细胞凋亡抑制蛋白p18TFP的氨基酸序列(同样参见，SEQ ID NO2)。
用于实施本发明的实施方案一方面，本发明涉及一种与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质。如上所述，与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质导致细胞凋亡的抑制，详细地讲，在神经细胞中抑制神经神经突延伸抑制和抑制细胞凋亡，并且可用于预防和/或治疗与细胞、特别是神经细胞的凋亡有关的脑神经变性性疾病，例如早老性痴呆、唐氏综合症和其他痴呆症，以及亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓小脑变性性疾病、帕金森氏病等等。与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质可以是通过下面所描述的筛选方法得到的物质。与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质可以是任何类别的分子，包括蛋白质、多肽、小分子例如其他低分子量的有机化合物。
另一方面，本发明还涉及筛选与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质的方法。筛选与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质的方法的实施例包括这样的方法，所述方法包括在合适的载体中插入编码CGI-94蛋白的基因，用所述载体转化细胞，优选是神经细胞，然后在受试物质存在下以及分化诱导因子(例如NGF)作用下培养所述转化细胞，如果是神经细胞，则检测神经神经突延伸和细胞凋亡，并与无受试物质和/或无所述分化诱导因子(即对照系统)时获得的结果相比较。在给定浓度的分化诱导因子存在下表达CGI-94的细胞抑制神经突延伸(如果是神经细胞)，并可以观察到细胞凋亡。另一方面，与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质的存在，允许细胞的神经突生长(如果是神经细胞)，从而避免细胞凋亡。在这种情况下，有可能所述受试物质是一种与CGI-94相互作用从而抑制其功能并抑制细胞凋亡的细胞凋亡抑制物质。为了评估是否导致了细胞凋亡，通常采用显微镜观察。当细胞凋亡发生时，观察到例如细胞浓缩、空泡形成、表面变光滑、细胞和细胞核碎裂等等。可以用于插入CGI-94基因来转化神经细胞的载体可以利用文献中描述的各种各样的载体和各种市售载体，例如pIND、pIND/V5-His、pIND/GFP、pcDNA3.1或pcDNA3.1/myc或pcDNA3.1/His或pcDNA3.1/V5-His或pcDNA3.1-CT-GFP-TOPO，或病毒载体例如LNCX2。转化方法是已知的，例如磷酸钙方法、SuperFector试剂方法和利用LipofectAMINE试剂的脂质介导方法等等。用于筛选的细胞可以利用任何细胞，优选神经细胞。优选的神经细胞的实例包括PCl2细胞、NB2a、Neuro-2A、B104、SHSY-5Y、原代培养神经细胞等等。培养细胞的条件取决于相应的细胞，这些条件在本领域技术人员的知识范围内，或者可以很容易确定。CGI-94基因的核苷酸序列和CGI-94蛋白的氨基酸序列是已知的(Eur.J.Neurosci.15，79(2001))。理想的是在要表达的CGI-94蛋白上附一个检测标记，这样可以容易检测到CGI-94蛋白的表达。检测标记包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、myc等等特别是融合绿色荧光蛋白的融合蛋白简单而且敏感，因此推荐这种融合蛋白。
本发明的发明人利用上面所描述的筛选方法已经发现与CGI-94相互作用从而抑制其功能的p18TFP蛋白和它的编码DNA。
因而，在本发明的其中一个方面，提供了一种新的DNA，所述DNA包含SEQ ID NO1的碱基序列中碱基编号140-601的碱基序列。这种DNA编码本发明的一种新蛋白p18TFP，如SEQ ID NO2(氨基酸1-153)所示。因而，所述p18TFP蛋白通常包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
本发明同样包括在严谨条件下与包含SEQ ID NO1的碱基序列中碱基编号140-601的碱基序列的DNA杂交的DNA，因为可能这样一种DNA具有与包含SEQ ID NO1的碱基序列中碱基编号140-601的碱基序列的DNA相似的结构、功能等等。严谨条件以42℃在含有6×SSC、5×Denhardt氏试剂、0.5％SDS和100μg/ml鲑精DNA的溶液中杂交的条件为例。另外，本发明还涉及与包含SEQ ID NO1的碱基序列中碱基编号140-601的碱基序列的DNA序列具有至少60％或更高同源性、优选为70％或更高、更优选为80％或更高、最优选为90％或更高的DNA。这样一种DNA同样包括人p18TFP DNA。上面所描述的DNA/基可以统称为p18TFP DNA/基因。
再一方面，本发明提供一种新的包含SEQ ID NO2的氨基酸序列(氨基酸1-153)的小鼠p18TFP蛋白及其突变蛋白。如上所述，这种蛋白通常是一种包含SEQ ID NO2的氨基酸序列(氨基酸1-153)的蛋白，而所述蛋白可以是一种包含在SEQ ID NO2的氨基酸序列中缺失、取代或增加一个或多个氨基酸的氨基酸序列的突变蛋白。也包括与SEQID NO2的氨基酸序列(氨基酸1-153)具有至少60％或更高、优选为70％或更高、更优选为80％或更高、最优选为90％或更高同源性的突变蛋白，这些蛋白也包括人的p18TFP。在这种情况下，这些突变蛋白具有与包含SEQ ID NO2的氨基酸序列(氨基酸1-153)的新p18TFP基本相同的活性，也就是说，它们具有细胞凋亡抑制活性。在本说明书中，本发明的p18TFP蛋白和具有基本相同活性的突变蛋白可以统称p18TFP或者统称p18TFP蛋白。
一方面，本发明还涉及编码上述p18TFP或其突变蛋白的DNA。另一方面，本发明涉及与上述p18TFP DNA互补的RNA，同样还涉及与编码上述p18TFP或其突变蛋白的DNA互补的RNA。
此外，本发明涉及用于治疗与细胞、优选神经细胞的细胞凋亡有关的疾病的方法，其特征为给予受治疗者与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质。而且，本发明还涉及用于治疗与细胞、优选神经细胞的细胞凋亡有关的疾病的药用组合物，所述组合物包含与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质例如p18TFP蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。生产药用组合物的方法、剂型和药学上可接受的载体或赋形剂根据受治疗者的病症、待治疗的部位、给药途径和其他因素来选择，而且易于由本领域技术人员选择。此外，本发明提供了一种通过基因疗法治疗细胞凋亡的方法，所述方法包括给与受治疗者的细胞编码p18TFP蛋白的DNA来表达所述p18TFP蛋白，从而抑制CGI-94功能。
又一方面，本发明还涉及与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质。如上所述，与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质有意使得细胞凋亡发生，因而可用于建立细胞凋亡系统、研究细胞凋亡机制、与细胞凋亡有关的各种研究和研究与细胞、特别是神经细胞的细胞凋亡有关的疾病，例如对早老性痴呆的研究，例如阐明其发生机制和其他研究。促进CGI-94功能的物质促进细胞凋亡，而且可能所述物质导致细胞凋亡的快速增强并可用于治疗疾病，特别是由于细胞过度增殖、特别是由于快速地促进细胞凋亡导致的疾病，例如癌症和自免疫疾病。与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质可以是通过下面所描述的筛选方法获得的物质。与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质可以是任何类别的分子，包括，例如蛋白质、多肽、小分子例如其他低分子量的有机化合物。
再一方面，本发明还涉及筛选与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质的方法。筛选与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质的方法的实例包括这样的方法，所述方法包括在合适的载体中插入编码CGI-94的基因，用所述载体转化神经细胞，然后在受试物质存在下在分化诱导因子的作用下培养所述转化细胞，检测神经突延伸和细胞凋亡，并与不存在受试物质情况下获得的结果比较。如果在高于筛选与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质中所用的浓度的分化诱导因子存在下，将受试物质加入到有神经突延伸的神经细胞或不引起细胞凋亡的细胞中，因此所述神经突的生长被抑制(如果是神经细胞)或者观察到细胞凋亡，那么有可能所述受试物质是与CGI-94相互作用从而加强其功能并促进细胞凋亡的物质。可以用于插入所述CGI-94基因来转化神经细胞的载体可以利用文献中所描述的各种载体和市售载体，例如pIND、pIND/V5-His、pIND/GFP、pcDNA3.1或pcDNA3.1/myc或pcDNA3.1/His或pcDNA3.1/V5-His或pcDNA3.1-CT-GFP-TOPO，或病毒载体例如LNCX2。转化方法是已知的，例如磷酸钙方法、SuperFector试剂方法和利用LipofectAMINE试剂的脂质介导方法等等。用于筛选的细胞可以利用任何细胞，优选神经细胞。优选的神经细胞的实例包括PCl2细胞、NB2a、Neuro-2A、B104、SHSY-5Y、原代培养神经细胞等等。培养细胞的条件取决于相应的细胞，这些条件是在本领域技术人员的知识范围内，或者可以容易地确定。CGI-94基因的核苷酸序列和CGI-94蛋白的氨基酸序列是已知的(Eur.J.Neurosci.15，79(2001))。理想的是在要表达的CGI-94蛋白上附一个检测标记，这样可以容易检测到CGI-94蛋白的表达。检测标记包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、myc等等特别是融合绿色荧光蛋白的融合蛋白简单而且灵敏，因此推荐使用。
另一方面，本发明涉及抑制CGI-94同Smac/DIABLO相互作用的物质。本发明还涉及筛选抑制CGI-94同Smac/DIABLO相互作用的物质的方法。筛选抑制CGI-94同Smac/DIABLO功能的物质的方法的实例包括这样的方法，所述方法包括在合适的载体中插入编码CGI-94蛋白的基因和编码Smac/DIABLO的基因，用它们转化神经细胞，然后在受试物质存在下在分化诱导因子的作用下培养转化的细胞，检测神经突延伸和细胞凋亡，并与不存在受试物质下得到的结果进行比较。即使在给定的分化诱导因子存在下，表达CGI-94蛋白和Smac/DIABLO蛋白的细胞也抑制所述神经突延伸(如果是神经细胞)，并可以观察到细胞凋亡。另一方面，抑制CGI-94蛋白和Smac/DIABLO蛋白相互作用的物质的存在，容许细胞的神经突生长(如果是神经细胞)，避免细胞凋亡。在这种情况下，有可能所述受试物质是一种抑制CGI-94蛋白和Smac/DIABLO蛋白相互作用从而抑制细胞凋亡的物质。可以用于插入CGI-94基因和Smac/DIABLO基因以转化神经细胞的载体，用于转化的方法和使用的细胞可以利用上述的。培养细胞的条件取决于相应的细胞，这些条件是在本领域技术人员的知识范围内，或者可以容易确定。CGI-94基因的核苷酸序列和CGI-94蛋白的氨基酸序列是已知的(Eur.J.Neurosci.15，79(2001))，Smac/DIABLO基因的核苷酸序列和Smac/DIABLO蛋白的氨基酸序列也是已知的(Cell，102，33(2002)；Cell，102，43(2001))。理想的是在要表达的CGI-94蛋白或Smac/DIABLO蛋白上附一个检测标记，这样可以容易检测到CGI-94蛋白或Smac/DIABLO蛋白的表达。检测标记包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、myc等等特别是融合绿色荧光蛋白的融合蛋白简单而且灵敏，因此推荐使用。
如上所述，抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，导致神经突延伸抑制的抑制和细胞凋亡的抑制，并可用于预防和/或治疗与神经细胞的细胞凋亡有关的脑神经变性性疾病，例如早老性痴呆、唐氏综合症和其他痴呆症，以及亨廷顿舞蹈病、肌萎性缩侧索硬化、脊髓小脑变性性疾病、帕金森氏病等等。抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质可以是通过上述的筛选方法得到的物质。抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质可以是任何类别的分子，包括例如蛋白质、多肽、小分子例如其他低分子量有机化合物。
本发明的发明人利用上述的筛选方法，已经发现p18TFP蛋白和它的编码DNA为抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质。
又一方面，本发明涉及用于治疗与神经细胞的细胞凋亡有关的疾病的方法，其特征在于给予受治疗者抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，例如p18TFP蛋白。另外，本发明还涉及用于治疗与神经细胞的细胞凋亡有关的疾病的药用组合物，所述组合物包含抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质和药学上可接受的载体或赋形剂。生产药用组合物的方法、剂型和药学上可接受的载体或赋形剂根据受治疗者的病症、待治疗的部位、给药途径等等来选择，而且易于由本领域技术人员选择。此外，本发明提供了一种通过基因疗法治疗细胞凋亡的方法，所述方法包括给予受治疗者的细胞编码p18TFP蛋白的DNA来表达所述p18TFP蛋白，从而抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用。
本发明还涉及促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质。另外，本发明同样涉及筛选促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质的方法。筛选促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质的方法的实例包括这样的方法，所述方法包括在合适的载体中插入编码CGI-94蛋白的基因和编码Smac/DIABLO的基因，用所述载体转化神经细胞，然后在受试物质存在下在分化诱导因子的作用下培养转化的细胞，检测神经突延伸和细胞凋亡，并与不存在受试物质下得到的结果进行比较。如果在高于筛选抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质中所用的浓度的分化诱导因子存在下，将受试物质加入到有神经突延伸的神经细胞或不引起细胞凋亡的细胞中，因此所述神经突的生长被抑制(如果是神经细胞)或者观察到细胞凋亡，那么有可能所述受试物质是抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而促进细胞凋亡的物质。可以用于插入CGI-94基因和Smac/DIABLO基因来转化神经细胞的载体，用于转化的方法和使用的细胞可以利用上述的。培养细胞的条件取决于相应的细胞，这些条件是在本领域技术人员的知识范围内，或者可以容易确定。CGI-94基因的核苷酸序列和CGI-94蛋白的氨基酸序列是已知的(Eur.J.Neurosci.15，79(2001))，Smac/DIABLO基因的核苷酸序列和Smac/DIABLO蛋白的氨基酸序列也是已知的(Cell，102，33(2002)；Cell，102，43(2001))。理想的是在要表达的CGI-94蛋白或Smac/DIABLO蛋白上附一个检测标记，这样可以容易而检测到所述CGI-94蛋白或Smac/DIABLO蛋白的表达。检测标记包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、myc等等特别是融合绿色荧光蛋白的融合蛋白简单而且灵敏，因此可以推荐使用。
如上所述，促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，导致神经突延伸抑制的促进和细胞凋亡的促进，并可用于建立细胞凋亡系统、与细胞凋亡有关的各种研究和阐明与神经细胞的细胞凋亡有关的疾病的机制，例如早老性痴呆中的神经细胞死亡等等。促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质促进细胞凋亡，而且可能所述物质导致细胞凋亡的快速增强并可用于治疗疾病，特别是由于细胞过度增殖所导致的疾病，例如癌症和自免疫疾病。促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质可以是通过上述的筛选方法获得的物质。促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质可以是任何类别的分子，包括例如蛋白质、多肽、小分子例如其他低分子量的有机化合物。
本发明同样还涉及用于治疗由于细胞、特别是由于细胞过度增殖引起的疾病例如癌症或自免疫疾病的方法，其特征在于给予受治疗者与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质。此外，本发明还涉及用于治疗由于细胞、特别是由于细胞过度增殖引起的疾病例如癌症或自免疫疾病的药用组合物，所述组合物包含与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质和药学上可接受的载体或赋形剂。生产药用组合物的方法、剂型和药学上可接受的载体或赋形剂根据受治疗者的病症、待治疗的部位、给药途径和其他方面来选择，而且易于由本领域技术人员选择。
再一方面，本发明涉及用于治疗由于细胞、特别是由于细胞过度增殖引起的疾病例如癌症或自免疫疾病的方法，其特征在于给予受治疗者促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质。此外，本发明还涉及用于治疗由于细胞、特别是由于细胞过度增殖引起的疾病例如癌症或自免疫疾病的药用组合物，所述组合物包含促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质和药学上可接受的载体或赋形剂。生产药用组合物的方法、剂型和药学上可接受的载体或赋形剂根据受治疗者的病症、待治疗的部位、给药途径和其他方面来选择，而且易于由本领域技术人员选择。
本发明另外还涉及用于检查细胞、特别是神经细胞的细胞凋亡的方法，以及用于诊断与这些细胞凋亡有关的疾病的方法，所述方法包括测定细胞或组织中所述CGI-94基因或CGI-94蛋白的表达水平。可以检测在从受治疗者获得的样品细胞和样品组织中的所述CGI-94基因，例如在mRNA水平上进行检测，或者检测样品细胞中的所述CGI-94蛋白水平。这种检测可以通过本领域技术人员所熟知的程序完成，例如利用互补于所述CGI-94基因的探针(优选用例如放射性同位素、荧光团、酶等等标记)杂交，或者利用与针对所述CGI-94蛋白的单克隆抗体的结合(优选用例如放射性同位素、荧光团、酶等等标记，)。在这种情况下，有可能通过检查所述标记的信号强度测定所述CGI-94基因表达的强度或者测定所述CGI-94蛋白的表达量。
本发明还涉及检查细胞、特别是神经细胞中的细胞凋亡的试剂盒，和用于诊断与这种细胞凋亡有关的疾病的试剂盒，其中这些试剂盒的特征在于检查所述CGI-94基因或者CGI-94蛋白在细胞和组织中的表达水平。所述试剂盒的成分包括例如互补于所述CGI-94基因的探针(优选用例如放射性同位素、荧光团、酶等等标记)和/或针对所述CGI-94蛋白的单克隆抗体(优选用例如放射性同位素、荧光团、酶等等标记)。所述试剂盒通常附带操作说明。
实施例实施例1CGI-94的作用和与CGI-94相互作用的蛋白的筛选A.方法1.利用GatewayTM技术的ProQUESTTM双杂交系统利用酵母菌株MaV203。将人CGI-94从pENTR/D-TOPO亚克隆到带有一个GAL4 DNA结合域的pDESTTM32载体(Invitrogen)中。利用pEXPAD502作为表达激活域的载体，所述载体具有ProQuestTM双杂交人脑cDNA文库(Invitrogen)。利用三个报告基因HIS3、URA3和lacZ用于进行选择。这些基因的每一个都稳定地整合在酵母基因的不同位点，而且所述HIS3、URA3和lacZ的启动子区除所述GAL4结合位点之外是不同的。有报道所述ProQuestTM双杂交系统使得能够从各自分离的染色体发生三个独立的转录，因而与标准双杂交系统相比减少了假阳性反应的发生。HIS3和UIRA3报告基因依赖于所述双杂交系统被诱导，相应地使得细胞可以在缺乏组氨酸或尿嘧啶的平板上生长，从而可以判别细胞。另一方面，LacZ基因可以利用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-比喃半乳糖苷)诱导，形成蓝色。另外，由于5-氟乳清酸(5-FOA)转化为氟尿嘧啶产生的毒性，URA3的诱导使得细胞可以生长于缺乏尿嘧啶的培养基中并抑制细胞在含有5-FOA的培养基中的生长。因而，这个系统使得可以筛选四种表型，即通过四种表型His(3AT)、β-gal、Ura+和5-FOAs显示实际相互作用的蛋白，并因此排除假阳性反应。利用ARS/CEN载体同样可以降低所述表达水平和所述毒性。可以通过再转化来鉴定阳性克隆。当包含相互作用蛋白时，酵母细胞就会结合到DB-人CGI-94和AD-Y上(其中Y是例如Smac)。可以将来自含有DB-人CGI-94和AD-Y(其中Y是例如Smac)的酵母菌株的质粒DNA通过电传孔引入到大肠杆菌中，含有AD-Y(其中Y是例如Smac)的转化体可以通过阿司匹林进行选择，而含有DB-人CGI-94的转化体可以通过庆大霉素进行选择。来自这些大肠杆菌的质粒DNA-AD-Y(其中Y是例如Smac)可以与pDBleu或者DB-人CGI-94一起引入MaV203，通过DB-人CGI-94诱导所述报告基因可以给出一个真实的阳性反应。
2.基因转移为了在PCl2细胞中瞬时表达在CGI-94的C-末端连接有GFP(绿色荧光蛋白)的蛋白(CGI-94-CT-GFP)的基因，利用SuperFector GeneTransfer试剂(B-Bridge，San Jose，USA)将GFP表达载体或缺乏它的质粒引入到细胞中，在37℃，5％CO2/95％空气下，在含有10％FCS(Gibco)的D-MEM/F12(1/1)/N2培养基中培养所述细胞。在基因转移48小时后，用荧光显微镜(Olympus IX70)观察表达CGI-94-CT-GFP的细胞的存活情况。另外，在基因转移后24小时，加入NGF(50ng/ml)，120小时后，再次在荧光显微镜下观察神经突延伸和细胞存活情况。
3.细胞培养在37℃，5％CO2/95％空气下，在含有N2补充物和10％FCS(Gibco)的Dulbecco氏改进的Eagle氏培养基(D-MEM)/F12(1/1)中培养PCl2细胞。
本领域技术人员可以采用其他方法而不是上述的那些方法开展实验，上面未曾说明的各种流程对于本领域技术人员来说是平常的。
B.结果1.在由NGF诱导分化的PCl2细胞中，CGI-94引起神经突延伸抑制和细胞凋亡。
为了研究神经细胞中CGI-94的功能，采用PCl2细胞表达CGI-94-GFP。结果，加入NGF(50ng/ml)后120小时，在表达CGI-94-GFP的细胞中，可以见到神经突延伸抑制，尽管存在NGF，还是可以见到细胞凋亡，2周后所有的细胞死亡，如图1b所示。相反，不表达所述基因(未呈现荧光)的细胞明显促进神经突延伸并存活下来。图1a显示在表达后48小时未在细胞中加入NGF的细胞由于没有加入NGF，在所述细胞中观察不到神经突延伸。
2.采用所述双杂交系统(它的步骤如上所述)筛选与CGI-94相互作用的蛋白，结果发现这种蛋白与Smac/DIABLO强烈相互作用。
实施例2p18TFP基因的克隆和p18TFP蛋白的氨基酸序列A.方法1.RT-PCR通过5’-RACE-RT-PCR方法利，用大鼠脑cDNA文库(pAP3neo，TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)筛选和发现了p18TFP cDNA。采用RT-PCR方法，分析mRNA的表达和分离p18TFP。依照TRIzol试剂流程(GibcoBRL，Grand Island，NY，USA)制备总RNA。简要来说，用氯仿抽提mRNA后，加入等体积的异丙醇沉淀所述RNA，用75％乙醇漂洗，然后溶解于不含RNA酶的水中，在分光光度计上测量吸光度(260nm)。首先将每个样品的总RNA(0.2μg/ml)逆转录为cDNA(oligo(dT)-primed-SMARTTMcDNA-synthesis(Clontech，Tokyo，Japan)；SuperscriptIITM(Gibco BRL，NY，USA))，然后利用下列引物作为大鼠cDNA/p18TFP特异性引物进行PCR反应(反应体积25μl)，分离用引物，首先是1)有义5’-gcg taa tac gac tca cta tag gga att cga cgt-3’(SEQID NO3)，反义5’-cgc gac gta cga ttt aaa tta acc ctc act aaa-3’(SEQ IDNO4)，其次是2)有义5’-gtg cgt tgt cct cgc taa gga cct gaa cga aac gcgatc ttg aaa-3’(SEQ ID NO5)，反义5’-aag ttc tgt gct tta gtt caa aca act gataac act cta aac aag-3’(SEQ ID NO6)，和3)OFR亚克隆用引物，有义5’-atg gca gtc cca ggt tgc aac aag gac aat gtc c-3’(SEQ ID NO7)，反义5’-tta ctt ttt ggt gac ttc aga acg gtt agg gga aga a-3’(SEQ ID NO8)。扩增每种cDNA所用的反应循环数依照ElongaseTM酶混合方案在线性范围内设置。扩增步骤中的变性在94℃进行0.5分钟，与特异性引物在65℃退火50秒，在68℃延伸1至2分钟(AnnT65℃/24个循环)。利用组成型表达核糖体蛋白S12 cDNA的PCR反应(AnnT60℃/16个循环)来测量引入的RNA。利用使用RNA样品但无逆转录或者无RNA的对照，来确定没有被DNA污染。通过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，分析PCR反应。
2.p18TFP cDNA序列分析和氨基酸分析除了利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blastp2.0程序(Nucleic Acids Res.，25，3389(1997))进行非重叠GenBankCDS翻译和使用UniGene数据库(NCBI)(Nucleic Acids Res.，25，2289(1997))之外，利用PDB、SwissProt、PIF和PRF进行所述p18TFP cDNA序列和氨基酸序列的分析。利用Blast和FASTA(Wisconsin Package10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)算法和BestFit(Eisconsin Package 10.0，GCG)进行同源性搜索。利用PROSITE Profile和BLOCKS、ProDom、PRINTS、Pfam和PSORTII程序，搜索所述氨基酸序列的基序(Nucleic Acids Res.，27，260(1999)；Intellig.Syst.Mol.Biol.，4，109(1996)；Intellig.Syst.Mol.Biol.，5，147(1997))。利用NetPhos2.0(J.Mol.Biol.，294，1351(1999))搜索磷酸化位点，不仅利用ExPASy-www服务器(http//www.expasy.ch)，也利用http//www/softberry.com/index.html和氨基酸组成搜索(AACompIdent)http//kr.expasy.org/tools/aacomp/进行其他分析。
3.细胞培养在含有N2并补充了10％胎牛血清(FCS；Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)的Dulbecco氏改进的Eagle氏培养基(D-MEM)/F-12(1∶1)中培养PCl2细胞(例如，可从ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得，ATCCNo.CRL-1721)，在补充了10％FCS的D-MEM中在37℃和5％CO2/95％空气的条件下培养CHO细胞。
4.基因转移入细胞通过将pCGI-94和大鼠脑cDNA文库基因共转移到大鼠PCl2细胞中，发现了pl8TFP cDNA。利用SuperFector Gene Transfer试剂(B-Bridge，San Jose，USA)，对细胞进行瞬时转染，然后在37℃和5％CO2/95％空气条件下培养于含有10％FCS(Gibco)的D-MEM/(F12(1∶1)/N2)培养基中。
B.结果1.p18TFP的分离在pCGI-94和大鼠脑cDNA文库基因共转移后，通过RT-PCR方法，采用死亡陷阱筛选方法(Semin.Immunol.，9，17(1997))，在培养6天后依然存活的细胞中发现与存活有关的基因，将其命名为pl8TFP。由这个基因编码的死亡抑制蛋白也被命名为pl8TFP。
2.pl8TFP的表征图2a显示了pl8TFP cDNA的碱基序列(2240个核苷酸(nt)，nt140-nt 601为一个ORF)，图2b显示由153个氨基酸组成的氨基酸序列(分子量18kDa)。由于pl8TFP的氨基酸序列包含C2HC-锌指和双重核定位信号(NLS)序列基序，pl8TFP已经显示出具有作为转录因子蛋白家族的特性。
依照本发明，提供了细胞凋亡抑制物质或细胞凋亡促进物质、它们的筛选以及用于诊断和治疗与细胞凋亡有关的疾病的方法和试剂盒。更具体地讲，依照本发明提供了与引发细胞凋亡的CGI-94相互作用并抑制其功能的物质、抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质、筛选它们的方法、包含它们用于治疗与细胞凋亡有关的疾病的药用组合物、治疗与细胞凋亡有关的疾病的方法以及用于诊断这些疾病的方法和试剂盒。详细来讲，发现了pl8TFP蛋白为与引发细胞凋亡的CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质，或者为抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质。同样还提供了与引发细胞凋亡的CGI-94相互作用从而促进其功能的物质、促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质和筛选它们的方法，而且这些物质可以用于阐明细胞凋亡的机制、发生与细胞凋亡有关的疾病例如早老性痴呆等等的机制。
序列表<110>Klaus Heese，Yasuo Nagai，Tohru Sawada，株式会社BF研究所(BF Research Institute，Inc.)<120>与CGI-94相互作用促进和抑制细胞凋亡的物质及其筛选方法<130>663697<150>JP2002-041176<151>2002-02-19<160>8<210>1<211>2240<212>DNA<213>大鼠<400>1ttcgccgant ggtccggact cggntcccta gtacggccgc cntgtgctgg attcgccctt 60gtgcgttgtc ctcgctaagg acctgaacga aacgcgatct tgaaagctca ggactccggt 120gaccccactc acctgcatta tggcagtccc aggttgcaac aaggacaatg tccgagcagg 180ctgcagaaaa tgtggctacc ctggtcatct gacttttgag tgccgcaatt ttcttcgggt 240agaccccaaa agggacattg tgttggacgt cagcagcaca agcagtgagg acagtgacga 300agaaagcgag gagctgaaca agcttcaggc tctgcaggag aaaagaataa atgaagaaga 360agagaagaaa aaggaaaaaa gcagggagaa aattaaattg aaaaaaaaga ggaaaaggtc 420taactccagc accactgaag aggactcttc aaaacaaaag aaacagaagt atcagaaaaa 480agaaaagaaa aaggaaaaaa agaacaaatc caaaaaagga aaacatcaca aaaaggaaaa 540aaagaagaga aaaaaggaaa agcgttcttc ccctaaccgt tctgaagtca ccaaaaagta 600acagagtctt gggcctaact caggaaattg aagaattcag tttttttaag tattgaacct 660tccttggaat tgctatataa ttacgctttg cagaaaaatc ccagcctctt ccataaagac 720gtttttcacc tcctggggcc cttccctccc tgcccgtctg tattaaaccc atctccttac 780ttgacagctt gtcccaagtc tagatgtgtg cactcacaga cacatcactt tggctgtttg 840tgtctcggtg tctagctgtc tcggtaagtt aattagcacg aggctttcct gcgatcaaag 900
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Ser Glu Asp Ser Asp Glu Glu Ser Glu Glu Leu Asn Lys Leu Gln Ala50 55 60Leu Gln Glu Lys Arg Ile Asn Glu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys65 70 75 80Ser Arg Glu Lys Ile Lys Leu Lys Lys Lys Arg Lys Arg Ser Asn Ser85 90 95Ser Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ser Lys Gln Lys Lys Gln Lys Tyr Gln100 105 110Lys Lys Glu Lys Lys Lys Glu Lys Lys Asn Lys Ser Lys Lys Gly Lys115 120 125His His Lys Lys Glu Lys Lys Lys Arg Lys Lys Glu Lys Arg Ser Ser130 135 140Pro Asn Arg Ser Glu Val Thr Lys Lys145 150<210>3<211>33<212>DNA<213>
<400>3gcgtaatacg actcac tata gggaattcga cgt33<210>4<211>
<212>DNA<213>
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<212>DNA<213>
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<212>DNA<213>
<400>7atggcagtcc caggttgcaa caaggacaat gtcc34<210>8<211>
<212>DNA<213>
<400>8ttactttttg gtgacttcag aacggttagg ggaagaa 3权利要求
1.一种物质，所述物质与CGI-94相互作用从而抑制细胞凋亡。
2.一种物质，所述物质抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而抑制细胞凋亡。
3.一种DNA，其特征为(a)包含SEQ ID NO1碱基序列的碱基编号140-601的碱基序列的DNA，(b)在严谨条件下可与包含(a)的序列的DNA杂交的DNA，或(c)与(a)的DNA序列具有不低于60％同源性的DNA。
4.一种蛋白质，其特征为(a)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的氨基酸1-153，并且通过与CGI-94相互作用抑制细胞凋亡或者通过抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用抑制细胞凋亡的蛋白质，(b)在(a)的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、取代或增加，并且通过与CGI-94相互作用抑制细胞凋亡或者通过抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用抑制细胞凋亡的蛋白质，或(c)与(a)的氨基酸序列具有不低于60％同源性的蛋白质。
5.一种DNA，所述DNA编码依照权利要求4的所述蛋白质。
6.一种RNA，所述RNA与依照权利要求3或5的所述DNA互补。
7.一种物质，所述物质与CGI-94相互作用从而促进细胞凋亡。
8.一种物质，所述物质促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而促进细胞凋亡。
9.一种筛选与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质的方法，所述方法包括在存在受试物质和分化诱导因子的情况下，测定表达CGI-94的细胞的神经突延伸或细胞凋亡。
10.一种筛选与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质的方法，所述方法包括在存在受试物质和分化诱导因子的情况下，测定表达CGI-94的细胞的神经突延伸或细胞凋亡。
11.一种与CGI-94相互作用从而抑制其功能的物质，其中所述物质通过权利要求9所述方法发现。
12.一种与CGI-94相互作用从而促进其功能的物质，其中所述物质通过权利要求10所述方法发现。
13.一种筛选抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质的方法，所述方法包括在存在受试物质和分化诱导因子的情况下，测定表达CGI-94和Smac/DIABLO的细胞的神经突延伸或细胞凋亡。
14.一种筛选促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质的方法，所述方法包括在存在受试物质和分化诱导因子的情况下，测定表达CGI-94和Smac/DIABLO的细胞的神经突延伸或细胞凋亡。
15.一种抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，其中所述物质通过权利要求13所述方法发现。
16.一种依照权利要求12或15的物质，所述物质是p18TFP蛋白。
17.一种促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用的物质，其中所述物质通过权利要求14所述方法发现。
18.一种用于治疗与细胞凋亡有关的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含与CGI-94相互作用从而抑制细胞凋亡的物质。
19.一种用于治疗与细胞凋亡有关的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含抑制CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而抑制细胞凋亡的物质。
20.一种依照权利要求18或19的药用组合物，其中所述物质是p18TFP蛋白或p18TFP DNA。
21.一种用于治疗由于细胞过度增殖导致的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含与CGI-94相互作用从而促进细胞凋亡的物质。
22.一种用于治疗由于细胞过度增殖导致的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含促进CGI-94与Smac/DIABLO相互作用从而促进细胞凋亡的物质。
23.一种诊断与细胞凋亡有关的疾病的方法，所述方法包括测定细胞或组织中所述CGI-94基因或所述CGI-94蛋白的表达水平。
24.一种用于诊断与细胞凋亡有关的疾病的试剂盒，所述试剂盒包括测定细胞或组织中所述CGI-94基因或所述CGI-94蛋白的表达水平。
全文摘要
本发明提供抑制或促进神经细胞凋亡的物质、筛选它们的方法以及诊断和治疗与细胞凋亡有关的疾病的方法和试剂盒。具体地讲，本发明提供抑制或促进CGI－94蛋白的功能或者抑制或促进CGI－94蛋白与Smac/DIABLO相互作用从而抑制或促进细胞凋亡的物质。另外，本发明还提供作为细胞凋亡抑制物质的p18TFP蛋白和它的编码DNA，和包含所述蛋白或DNA的用于治疗与细胞凋亡有关的疾病的药用组合物。
文档编号A61P25/02GK1507491SQ0380015
公开日2004年6月23日 申请日期2003年2月19日 优先权日2002年2月19日
发明者K·希塞, 山田孝, 永井康雄, 泽田彻, K 希塞, 雄 申请人:株式会社Bf研究所