专利名称：蛋白质制剂的稳定化的制作方法
技术领域：
本发明涉及含蛋白质组合物的稳定化，特别是使用高度纯化的重组人血清白蛋白(rHA)来稳定含蛋白质-特别是重组方法获得的蛋白质-的组合物。在特定实施方案中，本发明涉及使用高度纯化的rHA来稳定含重组因子VIII(rF-VIII)的组合物。
背景技术：
因子VIII(F-VIII)是一种血浆蛋白质，参与血液凝固过程并且是该过程中必不可少的成分。F-VIII缺乏导致先天性出血病-A型血友病。F-VIII严重缺乏(例如约为正常水平的1-2％)的患者会遭受自发性出血和严重的创伤后出血。在这些患者中，这种躯体封闭区域内的出血是发病的主要原因。
含F-VIII组合物用以国际单位(IU)表达的F-VIII“活性”来表征。如世界卫生组织关于人凝血因子F-VIII的标准所定义，一个IU约等于1ml新鲜混合的人血浆中F-VIII的活性水平。临床医生将给患者处方施用一定数量的IU，因此当然希望组合物指示的F-VIII活性是实际F-VIII活性的可信赖指标。即，希望F-VIII活性是恒定的，从组合物生产到给患者使用的时间中没有变化。
A型血友病的有效治疗包括针，针对出血或按规律的预防性给药方案，通过输注补偿缺失的凝血因子VIII。替代性因子VIII最初是通过从人血浆中分离获得的。但近期已尝试制备rF-VIII。重组来源的因子VIII的优点在于其避免了血液制品中的潜在污染物，不存在从捐献血液中所分离材料相关的潜在供应限制。
无疑，由于rF-VIII的主要优点是没有从血液分离材料中可能存在的潜在污染物，因此希望含rF-VIII制剂的任何组合物也都不含血液来源的材料。但是，实践中发现rF-VIII有些不稳定，保存期有限。在克服这个问题的尝试中，血清来源的白蛋白被加入rF-VIII组合物中作为稳定剂，但这重新引入了污染的风险。也有人提出不含白蛋白的制剂，含有额外材料例如各种离子盐、糖和氨基酸作为稳定剂。但是，为了获得令人满意的制剂稳定化，这些额外赋形剂需要以相当高的浓度存在，这样就会引起其它缺点例如不适于冷冻干燥和溶液重建。
相似的情况不仅出现在rF-VIII制剂的稳定化中，也见于一般重组蛋白质制剂。
也有人提出rHA作为蛋白质组合物的稳定剂，但目前为止没有开发出足以商业应用并含有rHA作为稳定剂的rF-VIII制剂。
发明简述现发现高度纯化的rHA能够有效地稳定蛋白质、尤其是重组蛋白质、特别是rF-VIII的制剂，并且克服或者实质上减少了现有技术中上述某些或所有缺点或不足或其它缺点或不足。
本发明的第一方面提供了含非白蛋白蛋白质的组合物，该组合物进一步含有足以稳定该蛋白质的量的高度纯化rHA。
将高度纯化的rHA加入含非白蛋白蛋白质组合物中可以稳定该组合物。特别是，高度纯化的rHA可以抑制或防止非白蛋白蛋白质随时间而变化或降解(许多这种蛋白质易分解，当长时间储藏时变得不稳定)。即使rHA的浓度相对低，含有高度纯化的rHA可以使组合物获得满意的稳定性。还发现使用高度纯化的rHA可以保持非白蛋白蛋白质例如F-VIII的活性。
本发明对含重组方法制备的非白蛋白蛋白质组合物的稳定化特别有用。
rHA也可以被加入含有其它已知对重组蛋白质具有稳定效果之材料的制剂中。在这种情况下，rHA的存在可以使得为获得满意稳定性所要求的这些其它材料的浓度降低，有时是相当程度的降低。
因此，本发明的第二方面提供了含非白蛋白蛋白质的组合物，该组合物进一步含有高度纯化的rHA和一种或多种额外的稳定剂。
这些额外的稳定剂可以选自离子盐，尤其是氯化物，例如氯化钾、氯化钠和氯化钙；氨基酸，例如组氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸等；糖，例如甘露醇、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖；去垢剂，尤其是非离子型去垢剂，特别是聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如聚山梨醇酯polysorbates)；聚合物，尤其是合成的聚合物，特别是亲水的合成聚合物，例如聚乙二醇。
虽然本发明使用的高度纯化rHA需要存在于最终组合物中，但在形成最终组合物的加工过程中可以不需要。例如，在重组非白蛋白蛋白质的发酵和/或纯化过程中，可以使用rHA来稳定，但该rHA不一定是高度纯化的rHA。
因此，本发明的第三方面提供了制备含非白蛋白重组蛋白质组合物的方法，该方法包括以下步骤a)使转染了编码非白蛋白重组蛋白质的细胞表达该非白蛋白重组蛋白质；和b)分离和/或纯化该非白蛋白重组蛋白质；其中，步骤a)和/或步骤b)在第一种形式rHA存在下进行，第一种形式rHA的纯度低于第二种形式rHA；c)将步骤b)中获得的分离和/或纯化的非白蛋白蛋白质与第一种形式rHA分离；和d)将分离和/或纯化的非白蛋白重组蛋白质与第二种形式rHA以及任选地与其它赋形剂组合，以形成稳定的组合物。
如上所述，本发明的优点之一是发现在含有F-VIII的组合物中加入高度纯化的rHA可以保持F-VIII的活性。
因此，本发明的第四方面提供一种保存或保持含F-VIII特别是rF-VIII的组合物中F-VIII活性的方法，该方法包括向组合物中加入稳定化量的高度纯化rHA。
发明详述本发明组合物通常以水溶液或悬浮液的形式使用。但该组合物也可以被制成临使前的形式。该组合物可以以粉末的形式供应和储藏，例如通过冷冻干燥制备的粉末，在将组合物施用于患者前用水进行重建(reconstruction)。这种操作是本领域传统做法，为本领域技术人员所熟知。
该组合物典型地以密封小瓶中的冷冻干燥(冻干)粉末的形式提供。用一定量的注射用水重建组合物，最常用为2.5、5或10ml水。
当用水重建时，本发明第一或第二方面的组合物典型地包含从约0.1mg/ml到约20mg/ml的高度纯化rHA，更常见最高约10mg/m典型地可包含最高约7mg/ml、或最高约5mg/ml、或最高约1mg/ml的高度纯化rHA。
除了非白蛋白蛋白质(例如rF-VIII)和高度纯化的rHA，组合物可以任选地包含一种或多种其它稳定剂和其它赋性剂。
如上所述，其它可以被包含的稳定剂是离子盐、氨基酸、糖、去垢剂和聚合物。
如果存在离子盐，这些盐特别优选地选自氯化钾、氯化钠或氯化钙。在这种情况下，在用水重建后氯离子的浓度可以在0.05到2mg/ml的范围内。
如果存在氨基酸，特别优选氨基酸是组氨酸、赖氨酸、甘氨酸和精氨酸中的一种或多种。在重建的组合物中，氨基酸的总浓度可以在很大的范围内变化，例如从0.1到100mg/ml，更优选从0.1到50mg/ml，可以很低，例如浓度可以小于10mg/ml，例如在0.01到10mg/ml的范围内。
如果存在去垢剂，优选非离子型去垢剂，特别是聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(聚山梨醇酯类，polysorbates)。特别优选聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80，Polysorbate 80)。在重建的组合物中，去垢剂的浓度可以非常低，例如小于1mg/ml，更优选小于0.1mg/ml，例如0.001到0.1mg/ml。
合成聚合物、特别是亲水的合成聚合物也可以被加入组合物中。一类优选的合成聚合物是聚乙二醇。优选聚合物的平均分子量小于10,000道尔顿，更优选小于5,000道尔顿。如果重建的组合物中存在合成聚合物，其浓度可以从0.1到10mg/ml，或更低，例如浓度可以小于1mg/ml，例如0.01到1mg/ml。
如果组合物含有糖类，它们可以选自甘露醇、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖。重建组合物中糖的浓度可以在1到50mg/ml的范围内，更优选1到20mg/ml或5到15mg/ml，但可以非常低，例如0.1到5mg/ml。
其它可以存在于组合物中的赋性剂包括缓冲剂，例如柠檬酸盐，如柠檬酸钠。
由于上述额外的赋性剂和/或其它稳定剂是任选的，应该认识到这些试剂在重建组合物中的浓度可以小于以上所述的低限，并可以是零(或基本为零，即低于可检测限)。因此，浓度可以从零到更高，优选以上引用的范围(或更高)。
还应该认识到，由于存在于例如组合物中使用的rHA中，组合物中还可以(通常以低水平)引入其它赋性剂。rHA制剂可以含有例如一定量的辛酸(或其盐)、N-乙酰色氨酸或去垢剂如聚山梨醇酯80。这种额外的赋性剂通常以非常低的水平存在，其在终组合物(其中rHA的浓度可能仅为0.5％)中的浓度相应地更低。
在本发明第三方面中的(或在第二或第三方面组合物中使用的)非白蛋白重组蛋白质，其表达可以通过本领域技术人员熟知的方法进行。重组细胞可以是真核细胞或原核细胞。重组细胞可以是细菌(例如大肠杆菌或枯草杆菌)、酵母(例如酵母属(如酿酒酵母)、克鲁维酵母菌属(例如乳酸克鲁维酵母)或毕氏酵母属(例如巴斯德毕氏酵母)的酵母)、丝状真菌(例如曲霉属)、植物或植物细胞、动物或动物细胞(可以是转基因细胞)或昆虫细胞。
在一个优选的实施方案中，非白蛋白重组蛋白质可以来源于通过在发酵培养基中培养转染了适宜编码核酸序列的真菌而获得的真菌培养基，所述真菌表达该蛋白质并且将其分泌到培养基中。真菌可以是丝状真菌，例如曲霉属的种。优选该真菌是酵母。更优选该真菌属于酵母属(例如酿酒酵母)、克鲁维酵母菌属(例如乳酸克鲁维酵母)或毕氏酵母属(例如巴斯德毕氏酵母)。
非白蛋白重组蛋白质的分离、纯化和分离也可以通过本领域技术人员已知的技术进行。
虽然以上特别提到了rF-VIII，但用本发明高度纯化的rHA也可以稳定其它蛋白质。这种重组蛋白质的实例包括酶、酶抑制剂、抗原、抗体、激素、血液凝固控制中涉及的因子、干扰素、细胞因子[白细胞介素、及作为其与受体结合的天然拮抗剂的变体，SIS(小量诱导分泌)型细胞因子和例如巨噬细胞炎性蛋白(MIPs)，等]的整体或部分，生长因子和/或细胞分化中涉及的因子[例如转化生长因子(TGFs)、血液细胞分化因子(促红细胞生成素、M-CSF、G-CSF、GM-CSF等)、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGFs)、或者细胞通透因子(VPF/VEGF)等]的整体或部分，骨组织生长/吸收所涉及的因子(例如OIF和骨桥蛋白)的整体或部分，细胞运动或迁移所涉及的因子[例如自分泌运动因子(AMF)，移动刺激因子(MSF)，或者弥散因子(弥散因子/肝细胞生长因子)]的整体或部分，杀菌因子或抗真菌因子的整体或部分，趋化因子[例如血小板因子4(PF4)，或者单核细胞趋化肽(MCP/MCAF)或中性粒细胞趋化肽(NCAF)等]的整体或部分，细胞生长抑制因子(例如与半乳糖苷结合的蛋白质)的整体或部分，细胞外基质形成所涉及的血浆粘附分子或蛋白(例如冯维勒布兰德因子、纤维蛋白原等)或间质粘附分子或蛋白(层粘连蛋白、肌腱蛋白、玻连蛋白等)的整体或部分，或者作为循环和间质区室病理例如动脉和静脉血栓的形成、癌症转移、肿瘤血管生成、炎症性休克、自身免疫疾病、骨和骨关节病理等中所涉及的分子和/或细胞间相互作用的拮抗剂或激动剂的任何肽序列的整体或部分。
本发明中使用的非白蛋白蛋白质最优选为重组产生的。因此，将编码该蛋白质的多核苷酸转染到细胞内并表达。已知有多种表达系统，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。
rHA的来源制备rHA的方法为本领域技术人员所熟知，并在例如WO 96/37515和WO 00/44772中有描述。
在本发明的一个优选实施方案中，最初的rHA溶液来自通过在发酵培养基中培养转染了rHA编码核酸序列的真菌所获得的真菌培养基，所述真菌表达rHA并将其分泌到培养基中。该真菌可以是丝状真菌如曲霉属种类。优选该真菌是酵母。更优选该真菌属于酵母属(例如酿酒酵母)、克鲁维酵母菌属(例如乳酸克鲁维酵母)或毕氏酵母属(例如巴斯德毕氏酵母)。
优选地，至少一些rHA是由含有重组白蛋白编码序列的细胞产生，其中重组白蛋白编码序列的3’端含有两个或多个框内翻译终止密码子、优选三个框内翻译终止密码子，或者用包括以下步骤的方法产生培养表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞并获得rHA，其中该细胞具有遗传修饰使得细胞对重组表达白蛋白甘露糖基化的能力(至少)降低，培养基至少为1,000升，pH值5.5-6.8。
重组细胞可以是真核细胞或原核细胞。重组细胞可以是细菌(例如大肠杆菌或枯草杆菌)、酵母(例如酵母属的酵母(如酿酒酵母)、克鲁维酵母菌属(例如乳酸克鲁维酵母)或毕氏酵母属(例如巴斯德毕氏酵母))、丝状真菌(例如曲霉属)、植物或植物细胞、动物或动物细胞(可以是转基因细胞)或昆虫细胞。
在这里，遗传修饰优选指真菌细胞DNA序列一个或多个碱基或片段的抑制、替换、缺失或添加。这种遗传修饰可以在体外(直接在分离的DNA上进行)或原位获得，例如通过遗传工程技术或将真菌细胞暴露于致突变因素。致突变因素包括例如物理因素如能量射线(X-射线、γ-射线、UV等)或能够与不同DNA功能基团反应的化学试剂，如烷基化试剂(甲磺酸乙酯(EMS)、N-氧-4-硝基喹啉(NQO)等)、双烷基化试剂、嵌入剂等。遗传修饰也可以通过基因破断(geneticdisruption)获得，例如根据Rothstein等公开的方法[Meth.Enzymol.194(1991)，281-301]。根据该方法，通过同源重组用体外修饰的基因替换基因的部分或全部。遗传修饰也可以通过DNA序列上的任何突变插入如转座子、噬菌体等获得。
已知某些修饰例如点突变可以被细胞机制逆转或减弱。由于其表型特征不是很稳定，这种修饰可能不能提供最有用的真菌细胞修饰形式。因此，优选遗传修饰能够被稳定遗传并且/或者不会被复原和/或渗漏。这种修饰通常通过缺失或基因破断获得。
通过“渗漏突变”和语法变体(grammatical variant)，我们包括了野生型功能部分而不是完全失活所产生的突变体。
通过真菌细胞进行的遗传修饰可以位于细胞DNA序列的编码区和/或影响基因表达的区域。更具体的，所述修饰通常影响编码区或者负责或参与一个或多个基因(其表达产物是参与甘露糖基化的酶)表达的区域。
真菌细胞对蛋白质进行甘露糖基化的能力降低可能是以下原因造成的由于结构和/或构象改变产生了无活性酶，产生生物特性改变了的酶，不产生所述酶，或者以低水平产生所述酶。
真菌细胞的甘露糖基化途径涉及将第一个甘露糖基残基连接在蛋白质或肽的丝氨酰和/或苏氨酰氨基酸羟基基团上，然后通过随后添加甘露糖基延伸至O-连接的二糖和寡糖。第一个甘露糖基在内质网中从长萜醇单磷酸甘露糖(Dol-P-Man)转移给蛋白质，其它甘露糖基残基是在高尔基体中从GPD-Man转移。
在一个优选的实施方案中，修饰的真菌细胞至少在一个如下的基因中携带遗传修饰该基因的表达产物参与将甘露糖基残基连接于丝氨酰或苏氨酰氨基酸的羟基上。
在另一个优选的实施方案中，修饰的真菌细胞至少在一个如下的基因中携带遗传修饰该基因的表达产物参与将甘露糖基残基从Dol-P-Man前体转移到丝氨酰或苏氨酰氨基酸的羟基上。更优选的，这些基因中的一个是PMT基因(例如PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5、PMT6或PMT7)。优选PMT基因是PMT1、PMT5或PMT7。
在大规模发酵过程中，pH6.0-6.8的培养基对宿主细胞的完整性是有利的。
除了在甘露糖基残基连接于丝氨酰或苏氨酰氨基酸羟基基团所涉及的基因中的修饰外，真菌细胞还可以在参与随后添加甘露糖基残基形成二糖或寡糖、或者参与甘露糖基残基供体(Dol-P-Man)合成的基因上携带修饰。
优选地，真菌细胞在PMT基因或者影响PMT基因表达或产物的基因中有遗传修饰。影响PMT基因表达的基因可以例如影响mRNA的转录水平或PMT产物水平。
真菌细胞可以选自丝状真菌和酵母。优选细胞为酵母，例如酵母属酵母(例如酿酒酵母)、克鲁维酵母菌属酵母(例如乳酸克鲁维酵母)或毕氏酵母属酵母(例如巴斯德毕氏酵母)。
优选在至少5,000升、更优选在至少7,500升培养基中培养表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞。
在一个实施方案中，在pH值保持在6.2-6.7、更优选在pH6.3-6.5的培养基中培养表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞。优选用pH设定在pH6.3和pH6.5之间、更优选pH设定在pH6.35和pH6.4 5之间、更优选pH设定在约pH6.4的pH控制器保持培养基的pH。优选pH控制器被控制在上述任何一个pH范围内的任何pH值的0.20或0.10pH单位内，或者在pH6.4的0.20或0.10pH单位内。
在另一个实施方案中，在pH被保持在pH5.30-pH5.90、优选pH5.50-pH5.90、pH5.40-pH5.90或pH5.40-5.60范围内的培养基中培养真菌细胞。优选低控制点设定在pH5.40和pH5.60之间，优选在pH5.45和pH5.55之间，优选低控制点设定在约pH5.50。
高度纯化rHA的特征本发明使用的高度纯化rHA可具有一个或多个以下特征
(i)极低水平的着色剂。这里所用的术语“着色剂”指任何染色白蛋白的化合物。例如，色素是机体例如用于制备重组白蛋白的酵母产生的着色剂，而染料是纯化白蛋白的层析步骤产生的着色剂。
(ii)极低水平或者基本上没有铝、乳酸、柠檬酸、金属、非白蛋白人蛋白质，例如免疫球蛋白、前激肽释放酶激活剂、运铁蛋白、α1-酸性糖蛋白、血红蛋白和凝血因子、原核蛋白质、白蛋白片段、白蛋白聚集体或聚合体、或者内毒素、胆红素、血红素、酵母蛋白质、动物蛋白质和病毒。“基本上没有”指低于可检测水平。
(iii)至少99.5％单体和二聚体，优选基本上100％单体和二聚体。多达0.5％、优选0.2％的三聚体是容许的，但通常不存在白蛋白的更大形式。
(iv)如WO 00/44772中规定的方法所测量的，对于一克白蛋白，镍离子的水平低于100ng。
(v)如用糖化蛋白质微量分析方法-Amadori产物检测法所测量的，糖化水平低于0.6，优选低于0.10、0.075或0.05摩尔己糖/摩尔蛋白质。微量分析法通过用高碘酸盐氧化AP的C-1羟基基团，测量稳定的糖化蛋白质的Amadori产物(AP)形式。通过与乙酰丙酮在氨水中反应， 转化为发色团二乙酰二氢卢剔啶(diacetyldihydrolutidine，DDL)，对高碘酸盐氧化所释放的甲醛进行定量。然后比色检测DDL。用Pharmacia PD-10(G25 Sephadex)柱脱盐后检测样本，然后通过Bradford法(Bradford，1976，Anal.Biochem.，72，248-254)和10mg已定量分析的白蛋白对样本中的白蛋白进行再定量。包括一个果糖阳性对照，用Shimadzu UV 2101分光光度计在412nm处读取吸收值。对于每摩尔己糖，形成一摩尔Amadori产物。
(vi)至少90％或95％、优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、最优选基本上100％的白蛋白分子具有完整的C-端。
(vii)结合伴刀豆球蛋白A的白蛋白含量低于0.5％(w/w)，优选低于0.3％、0.2％或0.15％。伴刀豆球蛋白A(Con A)结合含α-D-吡喃甘露糖基、α-D-吡喃葡萄糖基和空间上有关的残基的分子。为了确定甘露糖化白蛋白的含量，可以用rHA的Con A琼脂糖(Pharmacia，Cat.No.17-0440-01)亲和层析分析Con A结合。用145mM氯化钠将rHA稀释至5％(w/w)，然后用Con A稀释缓冲液(200mM醋酸钠，85mM氯化钠，2mM氯化镁，2mM氯化锰，2mM氯化钙，pH5.5)进行1∶1稀释。然后将100mg rHA上样到已经平衡的2ml Con A琼脂糖柱，然后用Con A平衡缓冲液(100mM醋酸钠，100mM氯化钠，1mM氯化镁，1mM氯化锰，1mM氯化钙，pH5.5)洗涤(5×4m1)柱子。柱子用6ml Con A洗脱缓冲液(100mM醋酸钠，100mM氯化钠，0.5M甲基-α-D-吡喃甘露糖，pH5.5)洗脱。通过使用0-0.12mg/ml白蛋白标准曲线的Bradford法对洗出液(适当稀释以确保样本落在标准曲线的中间)中的单体白蛋白进行定量，洗出液中回收的Con A结合白蛋白单体用上样百分比表达。
(viii)当用检测游离巯基基团如cys-SH(就rHA而言是Cys-残基34)的特异性试剂-Ellman氏制剂5，5’-二硫双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测量时，游离硫醇的含量至少是0.85、0.8、0.75、0.7、0.65或0.60摩尔SH/摩尔蛋白质。反应释放5-硫-2-硝基苯甲酸根离子TNB2-，其在412nm处有最大吸收。通过测量412nm处吸收的增加，并用TNB2-离子在412nm的摩尔消光系数除，可以计算rHA的游离巯基含量。
(ix)当通过酸性溶剂提取和用C17:0内标准进行游离脂肪酸气相色谱分析时，基本上没有C18或C20脂肪酸。
(x)具有高度的分子量均一性，特别是当使用电喷雾质谱测定法进行质谱分析时的分子量分布为至少50、60、70、80、90、95、98、99、99.9或基本上100％的白蛋白分子分子量变化在不超过2000、1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200或更低道尔顿之内。
用标准方法例如透析或层析法对蛋白质样本进行脱盐，并交换或稀释到通常50％(v/v)有机溶剂中，溶剂可以是例如为了进行阳离子电喷雾而补充了酸如0.1-10％(v/v)甲酸的甲醇或乙腈、或为了进行阴离子电喷雾而补充了碱如0.1-10％(v/v)氢氧化铵的甲醇或乙腈。将浓度最适合所用离子源、通常为1-50μM的蛋白质溶液，通过标准方法例如连续流、回路注射或离线方法，以通常为0.01-100μl/min的适宜流速，分别使用注射泵、HPLC泵或毫微电喷雾小瓶(nanoelectrospray vial)加入电喷雾离子源中。调节该分析装置以获得最佳传送(transmission)和分辨率(如500-501m/z基线分离所限定的，后者应超过500)，并用局部方案和适宜的校准物-通常为蛋白质(例如马肌红蛋白)或表面活性剂(例如PEG)-进行校准。获得光谱，并用本领域已知并可商业获得的软件将其平均和处理以减去基线噪音、平滑信号、质心峰(centroid peak)、测量质量和解卷积数据(deconvolute data)以得到真实的质量数标度。在一个方案实例中(Bertucci et al，2001，Biochimica et Biophysica Acta，1544，386-392)，利用含5％HCOOH的H2O/CH3CN 50∶50稀释至白蛋白终浓度40-50μM，在配有分节的离子喷雾界面的Perkin-ElmerSCIEX API III三联四极质谱分析仪(Sciex，Thomill，Canada)上对稀释液进行离子喷雾质谱分析，使用下述参数操作离子喷雾电压5.5kV；喷嘴电压90V；扫描范围1400-2200质量单位；扫描时间8.42秒；分辨率＞1质量单位。以合计20次扫描的多通道数据采集(Multichannel acquisition，MCA)模式获得质谱图。用Harvard22型注射泵(Harvard Apparatus，South Natick，MA)以5Tl/min的流速连续注入进行分析。所有的测量都在室温进行。例如，这种高度均一的HSA可以具有处于66400到67000道尔顿范围内的上述蛋白质分子百分比之一。在用上述方法中的一种进行分析时，所得高度均一rHA的主峰通常在理论质量的0.05％之内，更常在0.01％之内(对于HAS，理论质量为66,438道尔顿)。在一个实施方案中，用电喷雾质谱分析法(ESI-MS)确定质量曲线，主峰每侧的范围是1000道尔顿。仔细检查曲线，以确定是否存在微小的不均一性，表现为离散解析的成分或者质量峰的半峰宽增宽。被解析成分的相对丰度可以以相对离子计数来测量，表达为百分组成(％)。通常本发明使用的高度均一性rHA的分不与天然(未修饰)主结构组成的相似程度至少是50％、60％、70％、80％、90％或更多。还可以用其它定量技术-包括中性涂层毛细管区带电泳，UV区吸收的检测(Denton & Harris，1995，J.Chromatog.A.，705，335-341)-对高度均一性rHA中的各成分相对丰度进行检测。
rHA分子群的均一性可以通过电泳和层析技术确定。例如，用标准方法进行SDS PAGE。局部方案可以用能够分离分子大小在20-200kDa范围内之蛋白质的PAGE凝胶。优化非变性PAGE产生对不同质量和/或电荷的蛋白质的聚焦和分离。通过化学染色方法(例如考马斯兰染料)使电泳分离的蛋白质成分显现，其检测极限通常大于0.1μg。随后通过光密度吸收扫描、用蛋白质标准进行校准来定量。
通常用分离范围为10-500kDa分子大小、分析规格的柱子进行凝胶渗透层析。用HPLC系统将最佳缓冲的水性流动相泵入，通过在UV区的吸收来检测洗脱成分。通过层析谱积分和与实验rHA标准进行校准对峰定量。
通常，当用SDS PAGE、非变性PAGE和凝胶渗透层析进行分析时，高度均一性rHA制品将显示一个或两个以下特征(a)分子群中至少99％、优选99.9％的蛋白质分子是rHA。
(b)分子群中不超过10、9、8、7、6、5、4、3％、优选不超过2％的白蛋白分子是二聚体。
rHA分子群的均一性也可以通过电喷雾质谱法(ESMS)和肽图分析。在一个优选的实施方案中，当通过ESMS和肽图分析时，高度均一性的r HA制品将具有如上定义的全长HAS或其片段的正确天然一级序列，没有翻译后修饰。
在一个实施方案中，高度均一性的rHA具有如上定义的特征(v)、(viii)和(x)中的两个或三个。特征之一可以是与特征(v)和(viii)结合的特征(x)。
在一个特别优选的实施方案中，高度纯化rHA的特点为以下特征的组合(i)如下的分子量分布当用电喷雾质谱法进行质谱分析测定时，至少90、更优选95、98、99、99.9或基本上100％的白蛋白分子分子量变化在不超过1000道尔顿，或更优选不超过900、800、700、600、500、400、300、200或更小道尔顿之内；(ii)糖化水平低于0.10，更优选低于0.075或0.05摩尔己糖/摩尔蛋白质；和(iii)结合刀豆蛋白A的白蛋白含量小于0.3％(w/w)，更优选小于0.2％或0.15％。
rHA着色剂着色剂rHArHArHArHArHA本发明使用的高度纯化rHA可以通过多种方法制备，包括以下方法制备高度纯化rHA的第一种方法制备高度纯化rHA的第一种方法包括，将pH8.0-9.5、电导率在1-75mS/cm范围内的第一rHA溶液进行亲和层析，该层系以对于rHA阴性的模式进行，并利用含固定化二羟基硼烷基基团的亲和基质，获得纯化的rHA溶液。
优选第一rHA溶液的pH值为pH8.0-9.0，更优选为pH8.3-pH8.6。优选第一rHA溶液用pH在上述pH范围内的缓冲液进行缓冲。
优选缓冲液含有浓度为10-500mM、优选25-200mM、更优选50-150mM的氨基酸。优选该氨基酸是甘氨酸。
优选缓冲液含有浓度为0-500mM、优选25-200mM、更优选50-150mM的单价阳离子。优选该单价阳离子是钠，优选NaCl的形式。因此，在一个优选的实施方案中，缓冲液含有浓度为0-500mM、优选25-200mM、更优选50-150mM的NaCl。
优选缓冲液含有浓度为5-250mM、优选10-100mM的二价阳离子。优选该二价阳离子是钙，优选CaCl2的形式。因此，在一个优选实施方案中，缓冲液含有浓度为5-250mM、优选10-100mM的CaCl2。
在一个特别优选的实施方案中，第一rHA溶液和/或缓冲液含有约100mM甘氨酸、约100mM NaCl和约50mM CaCl2。
优选第一rHA溶液和/或缓冲液的电导率是10-50mS/cm，更优选18-22mS/cm。
第一rHA溶液中rHA的浓度在20-120g/l范围内适宜，优选70-120g/l，更优选100±10g/l。优选rHA上样体积小于0.5柱体积，更优选小于0.35柱体积。
基质含有硼酸比较适宜。这里使用的术语“酸”包括其盐。有利的情况是，硼酸通过三嗪或取代三嗪结合，在支持物例如琼脂糖上形成例如单硼三嗪或二硼三嗪。优选硼酸是氨基苯基硼酸。
报道苯基硼酸替代物如脂肪族和取代芳香族配体的出版物包括Adamek，V.等(1992)J.Chrom.625，91-99，Singhal，R.P.等(1991)J.Chrom.543，17-38和Liu，X.等(1994)687，61-69。
在亲和层析步骤之后，纯化的rHA溶液可以被适当地进一步纯化，优选进一步层析纯化。优选用阳离子交换层析和/或阴离子交换层析进一步纯化rHA。阳离子和阴离子交换步骤的顺序可以是互换的，均可以完成其纯化目的。从操作的角度讲，比较好的完整过程是先进行阳离子交换层析，然后进行阴离子交换层析。
根据上述方法纯化的rHA溶液可以适当地进行以下一项或多项操作置换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；用还原剂处理(例如EP 570916中所述)；脱色处理(例如用活性炭)；加热(包括杀菌)；冷却或整理。
制备高度纯化rHA的第二种方法纯化rHA溶液形成适于本发明使用形式的另一种方法包括，阳离子交换层析和阴离子交换层析，其中这样纯化的rHA溶液任选进行下述一项或两项操作置换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；添加还原剂；脱色处理(例如用活性炭)；加热(包括杀菌)；冷却或整理。
阳离子交换层析步骤可以在阴离子交换层析步骤之后，或反之。优选阳离子交换层析步骤在阴离子交换层析步骤之前。
虽然r HA可以进行如上所述的缓冲液置换，优选在阴离子和阳离子交换步骤之间没有进一步的纯化步骤。
对于整理，我们指为进行该方法的下一个步骤或为了最终使用而改善rHA环境或条件的任何非纯化性操作步骤。整理可以包括添加白蛋白稳定剂如辛酸和/或其它脂肪酸如C6或C1-10脂肪酸，或乙酰色氨酸钠或扁桃酸钠。调整还可以包括添加盐等，还可以涉及调节r HA溶液的电导率。
本发明第一和第二方面的阳离子交换步骤可以以相对于rHA的阴性或阳性模式进行。在一个优选的实施方案中，阳离子交换步骤以相对于rHA的阴性模式进行。有利的是，选择条件使得糖基化白蛋白与阳离子交换材料的结合比非糖基化白蛋白强。
本发明第一和第二方面的阳离子交换步骤可以利用商业化阳离子交换基质例如SP-Sepharose FF、SP-Spherosil、CM-Sepharose FF、CM-Cellulose、SE-Cellulose或S-Spheradex。优选阳离子交换步骤利用含有固定化磺丙基取代基作为阳离子交换剂的基质。
优选进行阳离子交换层析的rHA溶液的pH为4.5-6.0，更优选pH为5.0-5.6，更优选pH为5.2-5.4。
优选进行阳离子交换层析的rHA溶液的rHA浓度为10-250g/l，优选20-70g/l，更优选50±10g/l。
优选进行阳离子交换层析的rHA溶液具有浓度为2-15mM，优选5-10mM，更优选6-9mM的辛酸根离子。
在阳离子交换步骤之前，可以方便地对rHA溶液进行一项或多项以下操作(i)pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；(ii)浓缩；(iii)透滤；或(iv)通过加入稳定剂如辛酸和/或其它脂肪酸如C6或C10脂肪酸、或乙酰色氨酸钠或扁桃酸钠进行整理。作为替代或附加操作，可以对rHA溶液进行一项或多项以下操作置换缓冲液；稀释；透析；透滤；用还原剂处理；脱色处理(例如用活性炭)；加热；冷却或整理。
通常，任何改变都涉及添加而不是去除。优选通过添加乙酸来调节rHA溶液的pH值。优选通过超滤浓缩rHA溶液。
本发明第一和第二方面的阴离子交换步骤可以利用商业化阴离子交换基质例如Q-Sepharose-FF、QMA-Spherosil、DEAE-Spherodex、Q-Hyper D、DEAE-纤维素、QAE-纤维素、或TMAE、DMAE、或DEAEFractogel。优选阴离子交换步骤使用含有固定二烷基氨基烷基(例如二乙基氨基乙基)取代基作为阴离子交换剂的基质。
在一个优选的实施方案中，上述方法的阴离子交换层析步骤以相对于rHA的阴性模式进行。
优选进行阴性模式阴离子交换层析的rHA溶液pH值为4.0-5.2，更优选pH4.2-4.9，更优选pH4.5-4.7。
优选进行阴离子交换层析的rHA溶液电导率小于4.0mS/cm，更优选电导率为1.0±0.5mS/cm，更优选1.05±0.1mS/cm。
在进行阴离子交换步骤之前，可以方便地用水对rHA溶液进行pH调整和/或稀释。优选用乙酸调整rHA溶液的pH值。
在另一个优选的实施方案中，上述方法的阴离子交换层析步骤以相对于rHA的阳性模式进行。
进行阳性模式阴离子交换层析的rHA溶液，适宜的pH值为6.0-8.0，优选pH为6.5-7.5，更优选pH为6.8到7.2。优选用正磷酸盐离子对r HA溶液进行pH调整。
在一个优选的实施方案中，rHA的浓度为10-100g/l，更优选25-80g/l，最优选30-60g/l。优选rHA溶液的电导率是1.0-2.0mS/cm，优选1.2-1.6mS/cm。
适宜时，用含有20-90mM、优选30-70mM和更优选35-65mM磷酸盐的缓冲液将rHA从阴离子交换剂上洗脱。优选用pH6.0-8.0、优选pH6.5-7.5的缓冲液从阴离子交换剂上洗脱rHA。
特别优选地，在上述方法之前进行一个或多个以下步骤发酵；初步分离；浓缩整理(centrate conditioning)；优选使用磺丙基取代基作为阳离子交换基进行阳离子交换层析；优选使用二乙基氨基烷基取代基作为阴离子交换剂进行阴离子交换层析；或优选使用含有固定化白蛋白特异性染料如Cibacron Blue型染料的亲和基质进行亲和层析。
一种优选的纯化r HA的方法，包括以下步骤(a)将rHA溶液以相对于rHA的阳性模式进行阳离子交换层析；(b)收集含rHA的阳离子交换洗出液；(c)将阳离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行阴离子交换层析；(d)收集含rHA的阴离子交换洗出液；(e)将阴离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行亲和层析步骤；(f)收集含rHA的亲和层析洗出液；(g)将亲和层析洗出液以相对于rHA的阴性模式和以相对于糖缀合物(糖基化白蛋白和/或糖蛋白)的阳性模式进行亲和层析步骤；(h)收集含rHA的亲和层析流出液；(i)将亲和层析流出液以相对于rHA的阴性模式进行阳离子交换层析步骤；(j)收集含rHA的阳离子交换流出液；(k)将阳离子交换流出液以阴性模式或阳性模式进行阴离子层析步骤；(l)阴离子交换步骤以阴性模式进行时，收集含rHA的阴离子交换流出液；或阴离子交换步骤以阳性模式进行时，从阴离子交换基质上洗脱阴离子交换洗出液；其中任选在各个纯化步骤之前或之后进行以下一种或多种操作置换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；用还原剂处理；脱色处理(例如用活性炭)；加热(包括杀菌)；冷却；或整理。
因此，纯化步骤可以被或也可以不被以下一种或多种操作分隔开更换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整；用还原剂处理；脱色处理；加热；冷却；或整理。
当任何步骤以相对于rHA的阴性模式进行时，不仅收集流出液也收集洗涤液。
另一个纯化rHA的优选方法包括以下步骤(a)将rHA溶液以相对于rHA的阳性模式进行阳离子交换层析；(b)收集含rHA的阳离子交换洗出液；(c)将阳离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行阴离子交换层析；(d)收集含rHA的阴离子交换洗出液；(e)将阴离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行亲和层析步骤；(f)收集含rHA的亲和层析洗出液；(g)将亲和层析洗出液以相对于rHA的阴性模式和以相对于糖缀合物的阳性模式进行亲和层析步骤；(h)收集含rHA的亲和层析流出液；(i)将亲和基质的流出液以相对于rHA的阴性或阳性模式进行阴离子交换层析步骤；(j)阴离子交换步骤以阴性模式进行时，收集含rHA的阴离子交换流出液；或阴离子交换步骤以阳性模式进行时，从阴离子交换基质上洗脱阴离子交换洗出液；(k)将阴离子交换层析步骤纯化的rHA溶液以相对于rHA的阴性模式进行阳离子交换层析步骤；(l)收集含rHA的阳离子交换流出液；其中任选在各个纯化步骤之前或之后进行以下一种或多种操作更换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；用还原剂处理；脱色处理(例如用活性炭)；加热(包括杀菌)；冷却；或整理。
因此，纯化步骤可以被或也可以不被以下操作分隔开更换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整；用还原剂处理；脱色处理；加热；冷却；或整理。
优选在进行阳性模式的阳离子交换步骤之前，如上对rHA溶液进行整理。优选加入辛酸至终浓度约110mM，将pH调节至约4.0-5.0。
有利的是，在洗脱前用高盐溶液(例如用10-100mM、优选20-40mM、例如25-30mM醋酸钠在pH3.5-4.5、优选在约pH4.0缓冲的0.5-3.0M NaCl)洗涤保留在阳性阳离子交换步骤中的rHA。
优选在阳离子交换步骤中用含有对白蛋白有特异亲和性的化合物、特别是一种酸如辛酸或另一种脂肪酸如C6或C10的缓冲液洗脱rHA。
rHA可以适当地用含高水平(例如至少50mM、优选50-200mM、例如80-150mM)硼酸盐如四硼酸钠或四硼酸钾的缓冲液从第一阴离子交换步骤的阴离子交换剂上洗脱。
优选阳性模式亲和层析步骤使用含有固定化白蛋白特异性染料的树脂，例如优选通过隔离基如1，4-二氨基丁烷或另一种C1-18、优选C1-6、例如C1-5、最优选C4长、优选具有α，ω-二氨基取代基的隔离基被固定在树脂上的Cibacron Blue型染料。优选基质是如WO96/37515中所述制备的“δ蓝琼脂糖”(DBA)。
制备高度纯化rHA的第三种方法另一种用于纯化rHA溶液、特别是用于降低rHA溶液中镍离子水平的方法包括，将rHA溶液的pH调节至pH2.5-7.5、优选2.5-6.0，并去除镍离子。优选将rHA溶液的pH调节至pH4.0到7.5，优选4.0到6.0，更优选pH4.0到5.5，更优选pH4.0到5.0，最优选pH4.0到4.5。
优选该方法包括用pH2.5-6.0的缓冲液、或者pH在上述pH范围之一内的缓冲液透滤。也可以通过使用pH在上述pH范围之一内的缓冲液的凝胶渗透层析去除镍离子。凝胶渗透层析可以用SephacrylS200HR进行。优选缓冲液含有乙酸根和/或苹果酸根离子。另外，也可以是rHA具有足够强的缓冲能力来调节pH，并用水进行透滤/凝胶渗透层析。
镍离子也可以被螯合并从rHA中去除。这可以通过在低pH值、优选pH4.0到6.0、更优选pH4.0到4.5的条件下，使用螯化剂如被固定于琼脂糖(Chelating Sepharose，Pharmacia)上的亚氨基二乙酸或另一种聚合物(例如Chelex，Bio Rad Laboratories)来实现。
优选当将前述方法所得到的产物立即进行阴性阳离子交换层析时，优选该方法包括调节rHA溶液至pH5.0-5.6。相反，当前述方法所得产物不立即进行阴性阴离子交换层析时，优选该方法包括调节rHA溶液至pH4.3-4.9。
如上所述制备的纯化rHA溶液可以被进一步加工。例如，可以通过超滤膜进行超滤，获得rHA浓度至少为约10g、优选至少为40g或更优选约80g rHA每升的超滤渗余物，该超滤渗余物用至少5倍于渗余物量的水进行透滤。
如上所述，本发明使用的高度纯化rHA可以从不纯的rHA溶液中获得。该方法可以包括一个或多个下述步骤在发酵培养基中培养转染了编码人白蛋白氨基酸序列之核酸序列的微生物；优选从发酵培养基中分离该微生物；如果需要，为了进一步纯化而整理培养基；将整理过的培养基进行三个连续的层析步骤；超滤/透滤产物；将超滤产物进行另一层析步骤；超滤/透滤后再进行两个层析步骤；最后进行超滤/透滤。
在上述任一方法步骤之前或之后，对rHA溶液可以进行缓冲液置换、浓缩、稀释、加热(包括杀菌)；冷却或将盐等加入到rHA溶液中例如进行整理或调节溶液pH。任选地，rHA可以用还原剂进行处理，或进行脱色步骤。下面将参考以下实施例和附图通过实例的方式详细描述本发明，其中
图1显示组合物(三批次)测量的F-VIIIC活性，包括在48个月长期稳定性研究中用0.5％w/v高度纯化的rHA稳定的F-VIII(拟合回归线，单侧95％置信限作为虚线)；和图2显示用血清来源的HSA所稳定组合物的相应数据。
实施例1F-VIII制剂的研究批次如下制备将高度纯化的rHA加入F-VIII和其它赋性剂中。将溶液装入含有250 IU F-VIII活性的小瓶中。然后冻干溶液。
样本被储存于5℃，在48个月的时间内间隔地用注射用水重建溶液。重建的溶液含有下列组分高度纯化的rHA 5mg/ml甘氨酸 20mg/ml柠檬酸钠5.35mg/ml氯化钠 3mg/ml在48个月时间内对下列变量进行研究残留水分溶解时间pH蛋白质含量F-VIIIC活性vWFRcoF活性vWF抗原vWF多聚体聚合物和聚集体将观察到的数据与用相同浓度血清来源的HAS替代高度纯化rHA的相应样本在同一条件下获得的相应数据进行比较。
结果在含高度纯化rHA的样本和含血清来源HSA的样本之间没有观察到下述参数的显著差异残留水分溶解时间pH蛋白质含量vWFRcoF活性vWF抗原vWF多聚体聚合物和聚集体但是如图1和2所示，两种产品的F-VIIIC活性显示显著的差异。
在36个月内所观察到的因子VIIIC活性改变对于含高度纯化rHA的样本而言为平均降低了0.2IU/ml(图1)，对含血清来源HAS的样本而言为平均降低了4.4IU/ml(图2)。这种差异是显著的(p＝0.004)。
权利要求
1.一种含非白蛋白蛋白质的组合物，该组合物进一步含有足以稳定该非白蛋白蛋白质的量的高度纯化rHA。
2.一种含非白蛋白蛋白质的组合物，该组合物进一步含有高度纯化的rHA和一种或多种其他稳定剂。
3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中非白蛋白蛋白质是重组蛋白质。
4.权利要求2的组合物，其中其他稳定剂选自离子盐、氨基酸、糖、去垢剂和聚合物。
5.权利要求4的组合物，其以如下水平含有选自氯化钾、氯化钠和氯化钙的离子盐在用水重建组合物后氯离子的浓度在0到2mg/ml的范围内。
6.权利要求2的组合物，其以如下水平含有一种或多种选自组氨酸、赖氨酸、甘氨酸和精氨酸的氨基酸在用水重建组合物后，氨基酸的浓度为从0到100mg/ml。
7.权利要求2的组合物，其以如下水平含有聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯在用水重建组合物后，聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯的浓度不超过1mg/ml。
8.权利要求2的组合物，其以如下水平含有聚乙二醇在用水重建组合物后，聚乙二醇的浓度在0到10mg/ml的范围内。
9.权利要求8的组合物，其中聚乙二醇的平均分子量小于10,000道尔顿，更优选小于5,000道尔顿。
10.权利要求2的组合物，其以如下水平含有选自甘露醇、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖的糖在用水重建组合物后，糖的浓度在0到50mg/ml范围内。
11.上述任一权利要求的组合物，其形式为水溶液或悬浮液。
12.权利要求1或权利要求2的组合物，其形式为冻干粉形式。
13.权利要求12的组合物，当用水重建时，其含有从约0.1mg/ml到约20mg/ml的高度纯化rHA。
14.权利要求13的组合物，当用水重建时，其含有从约0.1mg/ml到约5mg/ml的高度纯化rHA。
15.上述任一权利要求的组合物，其中非白蛋白蛋白质是F-VIII。
16.权利要求15的组合物，其中F-VIII是rF-VIII。
17.上述任一权利要求的组合物，其中非白蛋白蛋白质选自酶、酶抑制剂、抗原、抗体、激素、参与控制凝血的因子、干扰素、细胞因子[白细胞介素、及作为其与受体结合的天然拮抗剂的变体，SIS(小量诱导分泌)型细胞因子和例如巨噬细胞炎性蛋白(MIPs)，等]的整体或部分，生长因子和/或细胞分化中涉及的因子[例如转化生长因子(TGFs)、血液细胞分化因子(促红细胞生成素、M-CSF、G-CSF、GM-CSF等)、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGFs)、或者细胞通透因子(VPF/VEGF)等]的整体或部分，骨组织生长/吸收所涉及的因子(例如OIF和骨桥蛋白)的整体或部分，细胞运动或迁移所涉及的因子[例如自分泌运动因子(AMF)，移动刺激因子(MSF)，或者弥散因子(弥散因子/肝细胞生长因子)]的整体或部分，杀菌因子或抗真菌因子的整体或部分，趋化因子[例如血小板因子4(PF4)，或者单核细胞趋化肽(MCP/MCAF)或中性粒细胞趋化肽(NCAF)等]的整体或部分，细胞生长抑制因子(例如与半乳糖苷结合的蛋白质)的整体或部分，细胞外基质形成所涉及的血浆粘附分子或蛋白(例如冯维勒布兰德因子、纤维蛋白原等)或间质粘附分子或蛋白(层粘连蛋白、肌腱蛋白、玻连蛋白等)的整体或部分，或者作为循环和间质区室病理例如动脉和静脉血栓的形成、癌症转移、肿瘤血管生成、炎症性休克、自身免疫疾病、骨和骨关节病理等中所涉及的分子和/或细胞间相互作用的拮抗剂或激动剂的任何肽序列的整体或部分。
18.任一上述权利要求的组合物，其中高度纯化的rHA具有一个或多个以下特征(i)极低水平的着色剂；(ii)极低水平或者基本上没有铝、乳酸、柠檬酸、金属、非白蛋白人蛋白质，例如免疫球蛋白、前激肽释放酶激活剂、运铁蛋白、α1-酸性糖蛋白、血红蛋白和凝血因子、原核蛋白质、白蛋白片段、白蛋白聚集体或聚合体、或者内毒素、胆红素、血红素、酵母蛋白质、动物蛋白质和病毒；(iii)至少99.5％单体和二聚体，优选基本上100％单体和二聚体；(iv)对于一克白蛋白，镍离子的水平低于100ng；(v)如用Amadori产物检测方法所测量的，糖基化水平低于0.6，优选低于0.10、0.075或0.05摩尔己糖/摩尔蛋白质；(vi)至少90％或95％、优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、最优选基本上100％的白蛋白分子具有完整的C-端；(vii)结合伴刀豆球蛋白A的白蛋白含量低于0.5％(w/w)，优选低于0.3％、0.2％或0.15％；(viii)当用Ellman氏试剂测量时，游离硫醇的含量至少是0.85、0.8、0.75、0.7、0.65或0.60摩尔SH/摩尔蛋白质；(ix)当通过酸性溶剂提取和使用C17∶0内标准的游离脂肪酸气相色谱分析时，基本上没有C18或C20脂肪酸；(x)具有高度的分子量均一性，特别是当使用电喷雾质谱测定法进行质谱分析时，分子量分布为至少50、60、70、80、90、95、98、99、99.9或实质上100％的白蛋白分子分子量变化在不超过2000、1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200或更低道尔顿之内。
19.任一上述权利要求的组合物，其中高度纯化的rHA的特点为以下特征的组合(i)分子量分布为当用电喷雾质谱法进行质谱分析测定时，至少90、更优选95、98、99、99.9或基本上100％的白蛋白分子分子量变化在不超过1000道尔顿，或更优选不超过900、800、700、600、500、400、300、200或更小道尔顿之内；(ii)糖基化水平低于0.10，更优选低于0.075或0.05摩尔已糖/摩尔蛋白质；和(iii)结合刀豆蛋白A的白蛋白含量小于0.3％(w/w)，更优选小于0.2％或0.15％。
20.任一上述权利要求的组合物，其中高度纯化的rHA如下制备利用含固定化二羟基硼烷基基团的亲和基质、在对于rHA阴性的模式下，对pH8.0-9.5、电导率在1到75mS·cm-1范围内的第一rHA溶液进行亲和层析，获得纯化的rHA溶液。
21.权利要求1到19任一项的组合物，其中通过对rHA溶液进行阳离子交换层析和阴离子交换层析来制备高度纯化rHA，其中这样纯化的rHA溶液任选进行下述一项或两项操作置换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；添加还原剂；脱色处理(例如用活性炭)；加热(包括杀菌)；冷却或整理。
22.权利要求1到19任一项的组合物，其中高度纯化的rHA是通过包括以下步骤的方法制备(a)将rHA溶液以相对于rHA的阳性模式进行阳离子交换层析；(b)收集含rHA的阳离子交换洗出液；(c)将阳离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行阴离子交换层析；(d)收集含rHA的阴离子交换洗出液；(e)将阴离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行亲和层析步骤；(f)收集含rHA的亲和层析洗出液；(g)将亲和层析洗出液以相对于rHA的阴性模式和相对于糖缀合物(糖基化白蛋白和/或糖蛋白)的阳性模式进行亲和层析步骤；(h)收集含rHA的亲和层析流出液；(i)将亲和层析流出液以相对于rHA的阴性模式进行阳离子交换层析步骤；(j)收集含rHA的阳离子交换流出液；(k)将阳离子交换流出液以阴性模式或阳性模式进行阴离子交换层析步骤；(l)当阴离子交换步骤以阴性模式进行时收集含rHA的阴离子交换流出液；或者当阴离子交换步骤以阳性模式进行时从阴离子交换基质上洗脱阴离子交换洗出液；其中任选在各个纯化步骤之前或之后进行以下一种或多种操作置换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；用还原剂处理；脱色处理(例如用活性炭)；加热(包括杀菌)；冷却；或整理。
23.权利要求1到19任一项的组合物，其中高度纯化的rHA是通过包括以下步骤的方法制备(a)将rHA溶液以相对于rHA的阳性模式进行阳离子交换层析；(b)收集含rHA的阳离子交换洗出液；(c)将阳离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行阴离子交换层析；(d)收集含rHA的阴离子交换洗出液；(e)将阴离子交换洗出液以相对于rHA的阳性模式进行亲和层析步骤；(f)收集含rHA的亲和层析洗出液；(g)将亲和层析洗出液以相对于rHA的阴性模式和相对于糖缀合物的阳性模式进行亲和层析步骤；(h)收集含rHA的亲和层析流出液；(i)将亲和基质的流出液以相对于rHA的阴性或阳性模式进行阴离子交换层析步骤；(j)当阴离子交换步骤以阴性模式进行时收集含rHA的阴离子交换流出液；或者当阴离子交换步骤以阳性模式进行时从阴离子交换基质上洗脱阴离子交换洗出液；(k)将阴离子交换层析步骤纯化的rHA溶液以相对于rHA的阴性模式进行阳离子交换层析步骤；(l)收集含rHA的阳离子交换流出液；其中任选在各个纯化步骤之前或之后进行以下一种或多种操作置换缓冲液；浓缩；稀释；透析；透滤；pH调整(优选将pH调至大于pH2.0或pH4.0，优选至pH小于pH10.0)；用还原剂处理；脱色处理(例如用活性炭)；加热(包括杀菌)；冷却；或整理。
24.权利要求1到19任一项的组合物，其中高度纯化的rHA是通过调节rHA溶液的pH至pH2.5-7.5、优选2.5-6.0，并去除镍离子而制备。
25.一种制备含非白蛋白重组蛋白质的组合物的方法，其包括以下步骤a)使转染了编码非白蛋白重组蛋白质的细胞表达该非白蛋白重组蛋白质；和b)分离和/或纯化该非白蛋白重组蛋白质；其中步骤(a)和/或步骤(b)在rHA第一种形式存在下进行，rHA第一种形式的纯度小于rHA第二种形式；c)将步骤(b)中所得分离和/或纯化的非白蛋白蛋白质与rHA第一形式离析；和d)将分离和/或纯化的非白蛋白重组蛋白质与rHA第二种形式以及任选的与其它赋性剂组合，以提供稳定的组合物。
26.一种保存或保持含F-VIII组合物的F-VIII活性的方法，该方法包括向该组合物中加入稳定化量的高度纯化rHA。
27.权利要求26的方法，其中F-VIII是rF-VIII。
全文摘要
通过添加高度纯化的重组人血清白蛋白来稳定一种含非白蛋白蛋白质的组合物。非白蛋白蛋白质可以是因子VIII。
文档编号A61K9/19GK1628129SQ03803340
公开日2005年6月15日 申请日期2003年2月5日 优先权日2002年2月5日
发明者沃纳·默克里 申请人:达尔塔生物技术有限公司