用于治疗皮肤失调的含有未分化的胎儿细胞的组合物的制作方法

专利名称：用于治疗皮肤失调的含有未分化的胎儿细胞的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗患有皮肤状况、失调或疾病的患者的方法和组合物。该组合物包括与胶原蛋白基质或载体结合的未分化的胎儿皮肤细胞。
背景技术：
伤口(即破口、裂口或溃疡)可能是急性或慢性的。急性的伤口一般是皮肤受到尖锐的伤害并造成少量组织的损失。大多数急性伤口会闭合，通过伤口边缘的聚合而痊愈。慢性伤口是那些无法或者缓慢完全愈合的伤口。慢性伤口的实例包括褥疮性溃疡(褥疮)、糖尿病性皮肤溃疡、郁血性溃疡、烧伤以及肿瘤切除造成的伤口。
伤口的细胞形态学包括三个不同的区域中心伤口部位、局部缺血的梯度带、和活性胶原蛋白合成的部位。尽管我们需要更加快速地治愈伤口(即严重烧伤，手术切口，破口以及其它损伤)，但是在用药物制剂加速伤口愈合方面仅仅取得了有限的进展。
治疗伤口的主要目标是使伤口闭合。张开的皮肤伤口代表一类主要类型的伤口，包括急性的手术和外伤伤口，例如慢性溃疡、烧伤，以及慢性伤口如神经性溃疡、褥疮、动脉和静脉(淤血)或混合动静脉溃疡、以及糖尿病性溃疡。典型地，这些伤口依照下述过程愈合i)发炎，ii)成纤维细胞增殖，iii)血管增殖，iv)结缔组织的合成，v)上皮形成，vi)伤口收缩。如果这些过程中的任何一步或是整体没有正常发挥作用，就破坏了伤口的愈合。影响伤口愈合的因素包括营养不良、感染、药物制剂(例如毒性药物和皮质类固醇)、糖尿病以及高龄。参见Hunt等，CurrentSurgical Diagnosis & Treatment(Way；Appleton & Lange)，pp.86-98(1988)。
已有许多不同的产品和方案可以用于治疗慢性伤口。参见例如Jones等，British Journal of Plastic Surgery 55185-193，2002，通过在此引述将其全文并入本文。其中包括简单的绷带(特别是压迫性绷带)，泡沫和薄膜，凝胶和胶体，以及药物制剂如生长因子。典型地，伤口的愈合应使用潮湿的封闭敷料，而不是干燥的非封闭敷料。见Winter，Nature 193293-94(1962)。现在已有许多类型的敷料用于伤口愈合上。其中包括薄膜(例如聚氨酯薄膜)，水状胶体(结合于聚氨酯泡沫上的亲水胶体颗粒)，水凝胶(含有大约至少60％水的交联聚合物)，泡沫(亲水或疏水)，藻酸钙(藻酸钙纤维的无纺复合物)和玻璃纸(含有增塑剂的纤维素)。参见Kannon等，Dermatol.Surg.21583-590(1995)；Davies，Burns 1094(1983)。某些类型的伤口(例如糖尿病性溃疡，褥疮)以及某些患者的伤口(例如服用外源皮质类固醇的患者)使用这些伤口敷料并不能及时愈合(或者根本不愈合)。
研究表明大部分溃疡都可以通过持续性的累进的足够水平的压迫而愈合。对于具有静脉疾病的患者，通过自胞间隙回流至血管与淋巴间隔的加压流体进行累进的外部压迫，可以减小或逆转由于静脉系统的阻碍或损伤所造成的皮肤和血管变化。下面是常用的三种类型的绷带
类型I轻可拉伸绷带这种绷带包括那些只具有简单的敷料保持功能的产品，它们可以很好地适应四肢和关节，不会限制活动。
类型II轻支撑绷带这种绷带包括那些用于预防形成水肿并且为轻微扭伤和变形的处理提供支撑的产品。
类型III压迫性绷带这种绷带包括那些依靠压力的应用的产品。它们最常在下肢的静脉失调的治疗中用于控制水肿并减少肿胀。压迫性绷带依据其产生预设压迫水平的能力可以分为四组。
类型IIIa轻压迫性绷带可以提供并维持低水平的压力，在平均尺度的脚踝上可提供达20mmHg的压力。这种类型产品的临床应用包括控制怀孕期间出现的表面或早期的血管曲张和静脉曲张。通常它们不适于控制或减少已经存在的水肿，也不适于在非常大的肢体上应用这么低的压力。
类型IIIb中压迫性绷带用于在平均尺度的脚踝上施加30mmHg左右的压迫。它们用于治疗怀孕期间的静脉曲张，中度血管曲张，预防和治疗溃疡，并控制中度水肿。
类型IIIc高压迫性绷带用于在给平均尺度的脚踝上施加高水平的40mmHg左右的压迫。这种绷带的应用包括治疗总体血管曲张，血栓形成后的静脉不足，并且处理平均周长的肢体上的腿部溃疡以及总体水肿。这种类型的产品对于由水肿的存在导致进一步扩大的巨大肢体可能无法提供这么高的压力。
类型IIId超高压迫性绷带可以提供超过50mmHg的压力。这种绷带的力量使得它们甚至对于最巨大和最水肿的肢体都可以施加并维持这种压力达很长时间。
除此之外，还试图使用几种药物类型(例如施用硫酸锌，维生素A，C和D，钙，镁，铜和铁)促进伤口的愈合。但是，除非是在特定的环境中，这些试剂很少能够成功地促进伤口愈合。
在二十世纪八十年代中期，Dr.Howard Green发明了一种培养人皮肤细胞例如角质化细胞的方法。参见Green等(1979)Proc.Natl.Aced.Sci.765665。EpicelTM，一种基于这些方法的产品，被用于治疗需要移植(皮肤替换)的较深的伤口，例如那些严重烧伤引起的伤口。但是，由于EpicelTM只能替换失去的表皮层，它与能够修复皮肤真皮层的物质一起使用才能最好地发挥效果。实际上EpicelTM并不是一种人造皮肤，而是一种方法，用这种方法可以用取自患者未烧伤部分的皮肤细胞在实验室中“生长”出新的表皮层。因此EpicelTM实际上是一种自体移植。参见美国专利序列号4016036和4304866。
对于非常严重的烧伤患者，只剩下很少的或者没有完整的皮肤，人造皮肤是一种非常有用的材料，它不但可以覆盖和保护受伤的部位，而且也可以促进自然皮肤的再生，而不是促进疤痕组织的生成。
许多新的人造皮肤最初都是使用来自相关供体(例如具有相似遗传标记的家族成员)的皮肤。但是这需要同时使用有效的免疫抑制药物来抑制患者的免疫系统使其不会抗拒移植物。以这种方式降低患者免疫系统的功能会给患者带来其它严重问题。作为替代，经常使用患者自己的未烧伤的皮肤(通常取自头皮，这里很少被烧伤)作为移植物来源。
但是，用这种皮肤移植(或者甚至是用尸体的皮肤)都不能永久地解决问题。仍然需要有一些人工方法使皮肤复原。使用合成产品具有很大优势，因为它没有病毒、细菌和其它病原体，不会传播疾病。
例如，Ethicon Inc.，一个强生的公司，获得了Integra的专有销售权，Integra是一种不含有生命物质的产品，它本身实际上并不是用作替代皮肤。而是它提供了一种保护性覆盖物，这也是一种柔软支架，患者自己的皮肤细胞可在它上面“再生”被烧伤破坏的皮肤上较深的真皮层。参见美国专利序列号5489304。与活皮肤的结构一样，Integra由两层组成。下面一层是用于“再生”真正皮肤的较深的真皮层，是由牛胶原蛋白和粘多糖交织的基质组成，模仿真皮层的纤维结构。然后将这种基质粘贴到临时的上层上，上层是一种医用的模仿表皮层或皮肤表层的弹性柔性硅片。Integra在伤口部位覆盖2到4周，在这段时间内患者自身的细胞长入基质中，生成新的真皮层。然后除去Integra的上层，然后施用一薄层患者自己的表皮细胞。不久表皮层就会在这些细胞上生成。
AlloDermTM，另一种市场上销售的产品，由LifeCellCorporation of The Woodlands，Texas制造并销售。它是通过从尸体皮肤上除去所有可能引起烧伤患者的免疫系统排斥他人移植物的细胞组分而制得的。这种方法的关键点在于最大限度地保持真皮层的“自然的”三维结构。无论是来自真正的真皮层(如AlloDermTM)或者是人造的真皮层(如Integra)，正确地模仿这种结构，对于患者剩余的细胞再生为新的具有功能的皮肤的能力都是至关重要的。
真皮移植(高级组织科学)是在实验室条件下将人基质细胞在称之为支架的生物相容的化学基底上培养出的产品。参见美国专利序列号5460939。典型地，这些支架由聚乙醇酸制成，这是许多“可再吸收”的医用材料，例如医用缝合线和医用胶水的基础。当在身体上使用的时候，该支架分解为羟基乙酸和乳酸，它们可以通过血液运走，代谢成二氧化碳，氧气和水。
另一种组织工程皮肤，Apligraf，由Organogenesis制造，是一种模仿皮肤表皮层和真皮层的有生命的两层皮肤替代物。Apligraf由两种类型的活的人皮肤细胞构成-表皮角质化细胞和真皮成纤维细胞。而且，Apligraf可以释放单独的真皮层无法提供的其它细胞因子和生长因子。参见美国专利序列号4837379。
上述的现有技术和应用都缺乏一些重要的特征。因此本发明的目的就是提供一种能够克服上述提及的一个或多个问题的三维皮肤组织同种异体移植物构建体。
所需要的是能促进伤口愈合的安全有效的方法，而不管伤口是什么类型的，也不管患者人群的特性。
发明简述一方面，本发明公开了含有与胶原蛋白基质结合的未分化的胎儿细胞的三维皮肤组织同种异体移植物构建体。本发明的构建体可以应用于任何方向，这使得它们可以有效用于多种情况下。在一些实施方案中，构建体中的未分化的胎儿细胞可以是胎儿皮肤细胞，例如那些在合适的培养条件下可以分化为真皮成纤维细胞或者表皮角质化细胞的细胞。在不同的实施方案中，可以通过混合，化合，移液操作，接种，平皿培养或者将细胞置于胶原蛋白中实现未分化的胎儿细胞与胶原蛋白的结合。本领域技术人员应当认识到可以使用任何可使它们结合的方法。在一个优选的实施方案中，构建体的胶原蛋白基质是马胶原蛋白基质。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备三维皮肤组织同种异体移植物构建体的方法，其是通过从供体胎儿组织采集活组织；从胎儿组织培育细胞系；培养胎儿组织，使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度，建立从中产生移植物的细胞银行；并使移植物与胶原蛋白基质结合。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备三维皮肤组织同种异体移植物构建体的方法，其是通过获得未分化的胎儿细胞；使未分化的胎儿细胞增殖；并使未分化的胎儿细胞与胶原蛋白基质结合。
除此之外，本发明还提供了将本发明的构建体施用给给需要这种治疗的患者来治疗患有皮肤状况、失调或疾病的患者的方法。例如，患者可选自人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠和小鼠。在一个优选的实施方案中，患者是马。在另一个优选的实施方案中，患者是人。
皮肤状况、失调或疾病的实例包括但不限于伤口和皮肤缺陷。在一个实施方案中，伤口可以是选自小割伤，烧伤，皮肤干燥，皮肤开裂，皮肤撕裂，手术伤口，偶然损伤和肥厚性瘢痕的急性伤口。在另一个实施方案中，伤口可以是选自静脉性溃疡，压力性溃疡，糖尿病性溃疡，动脉性溃疡和烧伤的慢性伤口。在另一个实施方案中，皮肤缺陷可以选自湿疹，牛皮癣，放射性皮炎，皮肤癌，风疹，青斑样血管炎，重度干燥和白色萎缩。
本发明的一个优势在于建立了细胞银行，这使得可以在随时随地需要的时候立刻进行移植，这是由于构建体中使用的细胞始终是可获得的。另一方面，可以通过如下方法建立或得到未分化的胎儿细胞银行从供体胎儿组织中采集活组织；在合适的培养条件下培养胎儿组织并使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度；将得到的培养物中的组织和细胞用胰蛋白酶消化使其悬浮；合并悬浮细胞使培养物中的细胞形成均一的细胞悬液；然后与防冻剂轻轻混合；将细胞悬液等分分装到安瓿瓶中并密封；冷冻等分试样；从而制备得未分化的胎儿细胞银行。在一个实施方案中，未分化的胎儿细胞是胎儿皮肤细胞。细胞银行中的胎儿皮肤细胞可以是p63+。在一些实施方案中，等分试样的冷冻是以1℃/分钟的速度降温至-80℃，然后大约24小时后转至-160℃。
在另一个实施方案中，可以通过如下方法制备未分化的胎儿细胞银行从供体胎儿组织中采集活组织；在合适的培养条件下培养胎儿组织并使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度；将得到的培养物中的组织和细胞用胰蛋白酶消化使其悬浮；合并悬浮细胞使培养物中的细胞形成均一的细胞悬液；将其与防冻剂轻轻混合；将细胞悬液等分分装到安瓿瓶中并密封；冷冻等分试样；从而制备得未分化的胎儿细胞银行。在一个实施方案中，未分化的胎儿细胞是胎儿皮肤细胞。细胞银行中的胎儿皮肤细胞可以是p63+。在一些实施方案中，等分试样的冷冻是以1℃/分钟的速度降温至-80℃，然后大约24小时后转至-160℃。
本发明还提供了含有载体和单独的或与一种或多种胎儿蛋白共同的一种或多种未分化的胎儿细胞的组合物。在不同的实施方案中，载体可选自软膏，洗剂，霜剂，乳剂，微乳剂，凝胶和溶液。在一个优选的实施方案中，载体是霜剂。例如霜剂可以是水包油混合物，或者油包水混合物。在另一个实施方案中，载体含有疏水佐剂和亲水佐剂。可选择地，本发明的组合物可以含有载体和单独的或与一种或多种胎儿蛋白共同的一种或多种未分化的胎儿细胞。本领域技术人员应当认识到任何涉及到本发明的组合物都包括任何含有一种或多种未分化的胎儿细胞和/或一种或多种稳定的胎儿蛋白以及载体的组合物。
这种组合物可以通过下述方法制备从供体胎儿组织中采集活组织；从胎儿组织培育细胞系；培养胎儿组织并使未分化的胚胎细胞增殖到高浓度，建立细胞银行；任选地稳定细胞银行中的胎儿蛋白；使所述胎儿细胞与载体结合。此外，还可以通过这样的方法制备这种组合物获得未分化的胎儿细胞；使未分化的胎儿细胞增殖；任选地稳定细胞银行中的胎儿蛋白；使所述胎儿细胞与载体结合。
本发明还提供了通过给患者皮肤的易受感染或已受感染的部位施用治疗有效量的本发明的组合物来预防或治疗皮肤状况、失调或疾病的方法。
所预防或治疗的皮肤状况、失调或疾病可以是炎性皮肤状况，包括但不限于缺陷，老年斑，疤痕，烧伤，擦伤，胎记，纹身，色素沉着过度，过敏性皮炎，周边溃疡，湿疹，放射性皮炎，溃疡，风疹，重度干燥和白色萎缩。在一个优选的实施方案中，炎性皮肤状况是周边溃疡。在另一个优选的实施方案中，炎性皮肤状况是白色萎缩。在另一个优选的实施方案中炎性皮肤状况是色素沉着过度。
患者可以选自人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠和小鼠。在一个优选的实施方案中，患者是马。在另一个优选的实施方案中，患者是人。
本发明还提供了治疗患有皮肤状况、失调或疾病的患者的方法，其是通过施用含有与胶原蛋白基质结合的未分化的胎儿细胞的三维皮肤组织同种异体移植物，以及施用含有载体和单独的或与一种或多种胎儿蛋白共同的一种或多种未分化的胎儿细胞的组合物，以使皮肤状况、失调或疾病随时间而痊愈。
在一个实施方案中，本发明的同种异体移植物和组合物顺序给药，在另一个实施方案中，同种异体移植物和组合物同时给药。患者可以选自人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠和小鼠。在一个优选的实施方案中，患者是马。在另一个优选的实施方案中，患者是人。
皮肤状况、失调或疾病的实例可选自小割伤，烧伤，皮肤干燥，皮肤开裂，皮肤撕裂，手术伤口，偶然损伤和肥厚性瘢痕，静脉性溃疡，压力性溃疡，糖尿病性溃疡，动脉性溃疡，湿疹，牛皮癣，放射性皮炎，皮肤癌，风疹，青斑样血管炎，白色萎缩，缺陷，老年斑，疤痕，烧伤，擦伤，胎记，纹身，色素沉着过度，过敏性皮炎，周边溃疡，湿疹，放射性皮炎，溃疡和风疹。
在一个实施方案中，未分化的胎儿细胞是胎儿皮肤细胞，例如胎儿皮肤细胞在合适的培养条件下可以分化为真皮成纤维细胞和表皮角质化细胞。在一个优选的实施方案中，胶原蛋白基质由马胶原蛋白制成。同样地，载体可选自软膏，洗剂，霜剂，乳剂，微乳剂，凝胶和溶液。
附图简述

图1是胎儿细胞银行合成的示意图。
图2a显示了胎儿皮肤用p63抗体染色后的免疫组织化学分析结果的显微照片，显示了培养基中的p63+表皮角质化细胞群和真皮成纤维细胞(条形线为50m)。
图2b是胎儿上皮细胞层的免疫组织化学分析结果的显微照片。
图2c是胎儿真皮层的免疫组织化学分析结果的显微照片。
图3显示了在三个单独的胎儿皮肤细胞系(实心标记)以及三个成人皮肤细胞系(空心标记)中，真皮成纤维细胞的生长(细胞数目)随时间变化的函数，每个样品初始都有1000个细胞。
图4显示了在三个单独的胎儿皮肤细胞系(实心标记)以及三个成人皮肤细胞系(空心标记)中，真皮纤维原细胞的存活百分率随UVA射线照射的函数。每个数据点都由三个培养皿中的克隆的平均数表示。
图5显示了在三个单独的胎儿皮肤细胞系(实心标记)以及三个成人皮肤细胞系(空心标记)中，真皮纤维原细胞的存活百分率随过氧化氢处理的函数。每个数据点都由三个培养皿中的克隆的平均数表示。
图6a显示了在消除了引起从口腔内部穿透到外表面的齿脓肿的溃疡之后，马下颌的深度脓肿的照片。
图6b显示了放置在马伤口部位的三维皮肤组织同种异体移植物的照片。
图6c显示了放置了三维皮肤组织同种异体移植物一个星期以后马伤口部位的照片。这副图显示出脓肿(溃疡)已完全愈合并消失。
图7a显示了马膝盖上从皮肤和肌肉穿透到骨头的深度伤口的照片。
图7b是马上的在肌肉内(内部)的含有肌肉胎儿细胞，以及在皮肤内(外部)的含有胎儿皮肤细胞的双层三维同种异体移植物的照片。
图7c是放置在马伤口部位的双层三维同种异体移植物的照片。
图7d是在马上放置双层三维同种异体移植物两天以后伤口部位的照片。这幅图显示出只有表面还没有愈合。
图8是患有脊髓灰质炎-关节炎的人患者在踝关节处具有抗性的混合型溃疡的照片。
图9是人患者在左腿下部有四处溃疡的照片，溃疡存在已有两年。用本发明的三维皮肤组织同种异体移植物处理以后，溃疡中的两个在治疗的大约7个月内完全愈合。
图10是人患者具有10年历史的同样的腿部溃疡的照片。在第一次使用三维皮肤组织同种异体移植物后，充血，疼痛和纤维的产生立即明显消失。一年以后，皮肤仍然是萎缩的，但是已经没有疤痕组织。
图11是人患者在脚踝处有溃疡的照片。在用本发明的组合物治疗大约两周以后，结果显示溃疡愈合。
图12是人患者在两条腿下部区域都有白色萎缩的照片。将三维皮肤组织同种异体移植物和组合物以霜剂的形式施用。结果显示溃疡愈合。
发明详述在组织工程和材料科学领域正在迅速产生具有显著生物学功能的新的生物材料。这些新材料的机械特性可以适合特定的应用，这些细胞可以形成真正的组织，以实现功能的维持，复原和改进。因此细胞的来源以及它们和生物材料之间的相互作用对于最终的治疗效果来说是非常重要的。
胎儿和成人皮肤之间的基本差异，以及胎儿和成人皮肤伤口环境之间的基本差异对于诱导无疤痕的组织修复来说是非常重要的。在怀孕早期，真皮层是很薄的，相对几乎没有细胞，细胞外基质也很少。在进一步的发育中，真皮胶原蛋白沉积下来，硫酸化粘多糖(GAG)代替了其它未硫酸化的粘多糖(GAG)之间的透明质酸(HA)。松散的细胞外基质的快速生长为无疤痕的胎儿皮肤修复提供了传导环境。
研究表明胎儿皮肤细胞本身可以进行无疤痕的组织修复，因为子宫内的环境对于无疤痕的胎儿修复既不是必要的也不充分。正如在负鼠模型中所验证的那样，胎儿皮肤在离开了温暖的，无菌的，富含生长因子的羊膜环境后也可以有效进行无疤痕的快速愈合。这种有袋动物是类胎儿生育的，在生理上和解剖学上都很类似，还要吸吮母亲的乳头达4到5周(Armstrong等，Dev.Biol.169242-260，1995)。尽管它们在子宫外，育儿袋早期时候幼儿的伤口会非常快地被上皮组织再次覆盖，合成胶原蛋白并且无疤痕地愈合。相反，育儿袋晚期时候幼儿的伤口愈合的较慢，并且有疤痕形成。
类似地，人类胎儿皮肤在移植到免疫缺陷的小鼠皮下之后保持了其发育特性，能够无疤痕地愈合并能复原毛囊和网状胶原蛋白结构(Lorenz等，Development 114253-259，1992)。人胎儿皮肤的再生能力不会被成人子宫外伤口环境破坏，也不会因为接触了成年小鼠的血液而被破坏，其无疤痕的能力是胎儿组织本身所固有的。
为治疗目的使用胎儿细胞的一个重要的优点在于胎儿组织是预先不具有免疫能力的(preimmunoincompetent)，这降低了它在这种细胞的受体中引发免疫反应的可能性。这种降低的免疫活性可能与怀孕14周以前缺乏胸腺后T淋巴细胞有关(Crombleholme等，Am J Obstet Gynecol 164218-230，1991；Gabbianelli等，J Immunol.1443354-3360，1990)。
胎儿组织工程在对哺乳动物皮肤上的皮肤状况、失调或疾病的治疗上很有潜力。利用胎儿皮肤可在特定的培养条件下和特定的相关生物工程基质上扩张的能力，可以得到大量的冷冻皮肤细胞用于治疗，成百上千名患者都可以用来自同一个组织供体的细胞进行治疗。
本发明的构建体和组合物用于修复、治疗和/或预防皮肤状况、失调或疾病的症状是非常理想的。与自体移植不同，本发明的方法和组合物不需要供体部位的活组织，这对于没有多少皮肤组织可用的小孩或烧伤患者来说是非常重要的。而且，这种构建体和组合物是立即可获得的，不像自体移植方法那样需要花费3到4周来产生。而且，这些构建体和组合物可以立即输送并且不限数量。
在通过细胞培养并与基质或膜结合来扩大胎儿组织方面的研究还很少。用本发明中描述的方法就可以严格控制胎儿皮肤细胞，使它们扩大到非常大的细胞银行(例如一个4cm2的组织供体可以产生达2,400,000个皮肤移植物，每个皮肤移植物可达10cm2)。使用胎儿皮肤细胞的优点包括但不限于1)它们与成人细胞相比抵抗紫外线A(UVA)的能力高出三倍，抵抗过氧化氢的能力高出两倍；2)它们具有能诱导无疤痕组织修复的能力，这是胎儿组织本身的固有性质，似乎和发育的不同阶段的蛋白质组成有关(Lorenz等，Development 114253-259，192)以及3)胎儿组织是预先不具有免疫能力的(preimmunoincompetent)，这降低了它在这种细胞的受体中引发免疫反应的可能性。从前从来没有为组织工程的目的使用或研究过胎儿细胞系。
本发明涉及一种含有未分化的胎儿细胞和胶原蛋白的三维皮肤组织同种异体构建体，用于治疗皮肤状况、失调或疾病。此外，本发明还涉及一种含有一种或多种未分化的胎儿细胞和/或一种或多种胎儿蛋白和载体的组合物。本发明还提供了制备这种组合物和构建体的步骤和方法，以及使用它们的方法。
应当理解这里所使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不是限制本发明的范围。
这里和权利要求中所使用的单数形式“一个”，“和”以及“这”也包括复数形式，除非另有明确规定。
这里所用的术语“未分化的”是指一种未成熟的或原始的细胞。例如，未分化的胎儿皮肤细胞包括那些可以分化为真皮成纤维细胞和表皮角质化细胞的细胞。
术语“结合”或“与......结合”用于描述任何方式的混合，特别是那些涉及将细胞加于基质之上的混合。该术语包括但不限于混合，化合，移液操作，接种，平皿培养或者放置。
术语“合适的培养条件”是指一种含有可促进增殖的营养物质的用于培养细胞的培养基。这种营养培养基可以含有合适浓度的下列物质的任意合适的组合等渗盐水，缓冲液，氨基酸，血清或血清替代物，以及其它外源添加的因子。本领域技术人员应当认识到可以使用任何通常可用的培养条件。
术语“胶原蛋白”是一种多肽化合物，在自然状态下是亲水的，可被细胞外酶降解。由于对这种物质的研究已经非常充分，因此许多关键参数都可以被控制。胶原蛋白是一种弱抗原，因此受到排斥的可能性也较低。本发明的构建体，方法和组合物中优选使用的胶原蛋白是马胶原蛋白。
术语“细胞系”是指一种永久细胞培养物，如果给予合适的新鲜培养基和充分的空间就可以无限增殖。
术语“细胞银行”是指从供体胎儿组织中采集活组织；在合适的培养条件下培养胎儿组织并使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度；将得到的培养物中的组织和细胞用胰蛋白酶消化使其悬浮；合并悬浮细胞使培养物中的细胞形成均一的细胞悬液；将其与防冻剂轻轻混合；将细胞悬液等分分装到安瓿瓶中并密封；冷冻等分试样(例如以1℃/分钟的速度降温至-80℃，然后大约24小时后转至-160℃)。这种超低温的银行可保存细胞使其停止老化，因而也使得它们可以保持有它们在收集之日所具有的功能和活性。
术语“治疗”(如“治疗皮肤状况、失调或疾病”)包括(1)预防疾病，即避免任何这种疾病的临床症状，(2)抑制这种疾病，即阻止临床症状的发展或进展，和/或(3)减轻，修复或使疾病好转，即使临床症状退化。
术语“状况”，“失调”和“疾病”在这里可互换使用，指可以通过施用本文描述的活性试剂得到预防或治疗的生理状态。皮肤状况、失调和疾病的实例包括但不限于小割伤，烧伤，皮肤干燥，皮肤开裂，皮肤撕裂，手术伤口，偶然损伤，肥厚性瘢痕，静脉性溃疡，压力性溃疡，糖尿病性溃疡，动脉性溃疡，湿疹，牛皮癣，放射性皮炎，皮肤癌，风疹，青斑样血管炎，白色萎缩，缺陷，老年斑，疤痕，烧伤，擦伤，胎记，纹身，色素沉着过度，过敏性皮炎，周边溃疡，湿疹，放射性皮炎，溃疡和风疹。
术语“伤口”概括性地指以任何方式(例如长期卧床造成的褥疮，由于外伤，割伤，溃疡，烧伤等造成的伤口)造成的具有不同特性的皮肤和皮下组织受到的伤害。伤口依据其深度可以分为四个等级(i)I级只限于上皮细胞的伤口；(ii)II级深至真皮层的伤口；(iii)III级深至皮下组织的伤口；和(iv)IV级(或者说全层伤口)露出骨头的伤口(例如一种骨压点如股骨转子或骶骨)。
术语“急性伤口”是指尖锐的皮肤损伤或伤害，没有组织损失和严重的症状，过程较短。急性伤口的实例包括但不限于小割伤，烧伤，皮肤干燥，皮肤开裂，皮肤撕裂，手术伤口，偶然损伤和肥厚性瘢痕。
术语“慢性伤口”指不会在大约三天内痊愈的伤口。慢性伤口的实例包括但不限于静脉性溃疡，压力性溃疡，糖尿病性溃疡，动脉性溃疡和烧伤。
术语伤口的“愈合”指修复伤口的过程，例如疤痕的形成。
短语“诱导或加速皮肤伤口的愈合过程”指诱导伤口收缩的肉芽组织的形成和/或诱导上皮形成(即在上皮中产生新的细胞)。伤口愈合可以很方面地通过伤口面积的减小来测量。
术语“患者”(如“患者”的治疗)指可能患有或者患有状况、失调或疾病(如本文中所说的)的哺乳动物个体。此术语同时包括人和动物。例如，患者可以是人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠和小鼠。这里所说的野生动物包括任何非家养的哺乳动物，鸟或鱼。这样的野生动物的实例包括但不限于獾，海狸，狮子，老虎，熊，鹰和鹿。
这里所说本发明的“组合物”可以含有一种或多种未分化的胎儿细胞和其它化学组分，包括但不限于传统的药物，生理学适当的载体和赋形剂。可选择地，本发明的“组合物”可以含有一种或多种未分化的胎儿细胞和/或一种或多种通过其它化学组分稳定的胎儿蛋白，所述化学组分包括但不限于传统的药物，生理学适当的载体和赋形剂。这种组分有助于促进蛋白和/或细胞对患者的给药。本发明的组合物可以通过本领域公知的方法制备，例如，通过传统的混合，溶解，粒化，糖衣制作，研粉，乳化，封装，截留或冻干步骤。
活性成分的配制和给药的技术可参见“RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，”Lippincott Williams & WilkinsPublishing Co.，20thedition，通过在此引述将其全文并入本文。
为本发明的目的可使用不同的方法进行活性成分的给药，优选是局部给药，辅以局部载体。局部载体是一种通常适用于活性成分的局部给药的物质，包括任何本领域已知的材料。局部载体的选择是为了为所述组合物提供特定的形式，例如液体或非液体载体，洗剂，霜剂，糊剂，凝胶，粉末，软膏，溶剂，液体稀释剂，液滴等，可以由自然材料或合成材料组成。所选择的载体应当不会影响活性试剂或局部用制剂中其它组分的效果，对局部制剂中的所有组分都是稳定的。这里所用的合适的局部载体的实例包括水，乙醇和其它非毒性有机溶剂，甘油，矿物油，硅酮，凡士林，羊毛脂，脂肪酸，植物油，对羟基苯甲酸酯类，蜡等。
软膏是半固体制剂，一般是基于矿脂或其它矿脂类似物。所使用的特定软膏，如本领域技术人员所知道的，要能够提供最佳的药物递送，并且优选地，还能提供其它所需的特性，例如软化等作用。与其它载体或媒介物一样，软膏基底应当是惰性的，稳定的，不刺激的，不致敏的。如Remington的书中所述，软膏基质可以分为四类油脂性基质；可乳化基质；乳剂基质；和水溶性基质。油脂性软膏基质包括，例如，植物油，动物脂肪，来自石油的半固体碳氢化合物。可乳化基质也是一种可吸收的软膏基质，含有很少量的水或不含水，包括，例如，羟基硬脂酸硫酸盐，无水羊毛脂和亲水矿脂。乳剂基质是油包水(W/O)乳剂或水包油(O/W)乳剂，包括，例如鲸蜡醇，单硬脂酸甘油酯，羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶软膏基质是用不同分子量的聚乙二醇(PEG)制备的。参见Remington的上述文献。
洗剂是无需摩擦就可以应用于皮肤表面的制剂，一般是液体或半液体制剂，其中固体颗粒，包括活性试剂存在于水或乙醇基质中。洗剂通常是固体悬液，优选包含一种水包油类型的液体油状乳剂。洗剂是治疗身体上较大面积的优选制剂，这是由于施用更加液体化的组合物更为方便。通常洗剂中的不溶物质需要能被很好地分离。洗剂通常含有悬浮剂以能更好地分散，还要含有能使活性试剂定位并固定在皮肤上的化合物，例如甲基纤维素，羧甲基纤维素钠等。用于本发明的一种特别优选的洗剂制剂包含丙二醇和亲水矿脂的混合物，例如商标为Aquaphor的产品，可自Beiersdorf，Inc.(Norwalk，Conn.)购得。
如本领域所公知的，含有活性试剂的霜剂是一种粘性液体或半固体乳剂，或者是水包油的或者是油包水的。霜剂基质是可水洗的，含有油相，乳化剂和水相。油相通常由矿脂和脂肪醇如十六烷醇或十八烷醇组成。水相通常，虽然不是必须的，在体积上大于油相，通常含有湿润剂。霜剂制剂中的乳化剂，如Remington的上述文献所述的，通常是非离子的，阴离子的，阳离子的或两性活性剂。
微乳剂是热力学稳定的，其中两种不互溶的液体例如油和水各向同性地完全分散，通过一种界面膜或表面活性分子来稳定(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(New YorkMarcelDekker，2002)，2ndEdition)。要制备微乳剂，需要表面活性剂(乳化剂)，助表面活性剂(助乳化剂)，油相和水相。合适的表面活性剂包括任何可用于制备乳剂的表面活性剂，例如通常用于制备霜剂的乳化剂。助表面活性剂(或者“助乳化剂”)通常选自聚甘油衍生物，甘油衍生物和脂肪醇。优选的乳化剂/助乳化剂组合通常，虽然不是必需的，选自下组单硬脂酸甘油酯和硬脂酸聚氧乙烯；聚乙二醇和棕榈硬脂酸乙二醇；辛酸和癸酸甘油三酯和油酰聚乙二醇甘油酯。水相包括但不只是水，还包括缓冲液，葡萄糖，丙二醇，优选是低分子量的聚乙二醇(例如PEG300和PEG400)，和/或甘油等。油相通常包括，例如脂肪酸酯，改性植物油，硅酮油，单酸甘油酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物，聚乙二醇一酯和二酯的混合物(例如油酰聚乙二醇甘油酯)等。
凝胶制剂是一种半固体体系，由小的无机颗粒组成的悬液(两相体系)或均匀分散在载体液体中的大的有机分子(单相凝胶)组成。单相凝胶可以通过将活性试剂、载体液体和合适的胶凝剂如黄蓍胶(2-5％)，藻酸钠(2-10％)，明胶(2-15％)，甲基纤维素(3-5％)，羧甲基纤维素钠(2-5％)，卡波姆(0.3-5％)或聚乙烯醇(10-20％)混合在一起制备，搅拌直到产生半固体产品。其它合适的胶凝剂包括甲基氧化纤维素，聚氧乙烯-聚氧丙烯，羟乙基纤维素和明胶。虽然凝胶通常是用水相载液，乙醇和油也可以用作载液。
本发明的组合物中还可以包含本领域技术人员公知的不同添加剂。这种添加剂的实例包括但不限于增溶剂，皮肤促渗透剂，遮光剂，防腐剂(例如抗氧化剂)胶凝剂，缓冲剂，表面活性剂(特别是非离子和两性表面活性剂)，乳化剂，软化剂，增稠剂，稳定剂，湿润剂，着色剂，香料等。优选含有增溶剂和/或皮肤促渗透剂，以及乳化剂，软化剂和防腐剂。合适的增溶剂的实例包括但不限于亲水性醚如二甘醇单乙醚(乙氧二甘醇，商品名为Transcutol)和二甘醇单乙醚油酸酯(商品名为Softcutol)；聚乙烯蓖麻油衍生物如聚氧35蓖麻油，聚氧40氢化蓖麻油等；聚乙二醇，特别是低分子量的聚乙二醇如PEG300和PEG400，以及聚乙二醇衍生物如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(商品名为Labrasol)；烷甲基亚砜如DMSO；吡咯烷酮如2-吡咯烷酮和N-甲基-2-吡咯烷酮和DMA。许多增溶剂都可以作为促吸收剂。制剂中可以含有单一的增溶剂，也可以含有不同增溶剂的混合物。合适的乳化剂和助乳化剂包括但不限于那些微乳剂制剂中描述的乳化剂和助乳化剂。软化剂包括，例如，丙二醇，甘油，十四烷酸异丙酯，聚丙二醇-2(PPG-2)肉豆蔻醚丙酸酯等。
所述制剂中还可以包含其它活性试剂，例如抗炎试剂，镇痛剂，抗微生物试剂，抗真菌剂，抗生素，维生素，抗氧化剂，以及遮光剂中常用的防晒剂，包括但不限于氨基苯甲酸盐，二苯甲酮(特别是二苯甲酮-3)，樟脑衍生物，肉桂酸(例如辛基甲氧基肉桂酸)，二苯甲酰甲烷(例如丁基甲氧二苯甲酰甲烷)，对氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物，以及水杨酸盐(例如辛基水杨酸盐)。
术语组合物的“有效量”或“治疗有效量”指不产生毒性的，但是足以在医药治疗中以合理的收益/风险比率提供所希望的效果的量。所希望的效果可以是减轻或预防疾病的征兆，症状或起因，或者其它所希望的生物体系的改变。
本领域技术人员应当意识到用于制备本发明的三维皮肤组织同种异体移植物和组合物的未分化的胎儿细胞可以含有胎儿皮肤细胞以进行皮肤移植，胎儿肌肉细胞以进行肌肉移植；胎儿骨骼细胞以进行骨骼移植。
一方面，本发明提供了一种含有与胶原蛋白基质(例如马胶原蛋白)结合的未分化的胎儿细胞的三维皮肤组织同种异体移植物构建体。例如，未分化的胎儿细胞可以是胎儿皮肤细胞例如那些在合适的培养条件下能分化为真皮成纤维细胞和表皮角质化细胞的细胞。可以通过本领域移植的任何方式结合，包括但不限于混合，化合，移液操作，接种，平皿培养或放置。这种构建体然后可以用于治疗患有皮肤状况、失调或疾病的患者。
要建立培养的未分化的胎儿细胞的细胞银行，依照CHUV伦理委员会的方法和规定，在妊娠终止后立即从胎儿组织中取出生物活组织。所收集的供体组织是12-16周孕龄的。胎儿组织被分为小碎片，放在多个10cm2的组织培养平皿上，在含有谷酰胺的Dulbecco’s MEM(DMEM)组织培养基中培养。然后向平皿中加入胎儿血清。在细胞生长的过程中，例如大约一周之后，将组织和细胞用胰蛋白酶消化。然后将一些平皿冷冻为单独的单元，例如在液氮中。然后将细胞离心并重悬，使培养物中的细胞成为基本上均一的悬液。
然后将细胞轻轻地与防冻剂(例如DMEM，5ml+胎儿牛血清，4ml+二甲基亚砜，1ml(DMSO))混合。然后将细胞悬液等分封装并冷冻，例如在液氮中。在一个优选的实施方案中，等分试样以1℃/分钟的速度降温至-80℃，然后大约24小时后转至-160℃。均匀的细胞等分试样可用于任何所希望的目的例如制备本发明的三维皮肤组织同种异体移植物构建体和/或组合物，或者用于制备治疗皮肤状况、失调或疾病的药物，方法是开启细胞银行的安瓿瓶，溶解其中的组分，转至普通的细胞培养基中。
本发明的三维皮肤组织同种异体移植物可以通过如下方法制备在移植日之前的三到五天，在9×12cm的马胶原蛋白片上接种得自细胞银行的胎儿皮肤细胞，例如大约1×105个细胞/cm2(所用的细胞为0到3代)，用无菌多孔的移液器吸管对基质进行细微的切割。然后在一段时间(例如大约1小时)以后向培养平皿中加入培养基。定期更换培养基，例如每两天更换一次。
所产生的构建体含有未分化的表皮角质化细胞(大约10％到大约13.5％)以及未分化的真皮成纤维细胞(大约90％到大约86.5％)。由于这种移植物具有三维结构，因此该移植物用于患者的任何方向都非常容易，这一点很有优势，因此许多皮肤状况、失调或疾病在身体上的部位一般都很难用本领域现有的移植物所覆盖。
在不受任何特定机制的限制的情况下，同种异体移植物构建体的细胞通过分泌胎儿细胞中的生长因子，对已存在细胞的粘附、增殖和迁移都具有促进效果。修复的伤口会愈合并不留下疤痕，皮肤的萎缩也更少。这种技术在实践上的优点是它是非侵入性的，因此它也不需要手术设备。这种治疗方法可以很容易地在非固定的地方进行，细胞也是立即可获得的，而不需要像传统的自体移植技术那样需要4-6周。最后，由于这些构建体可以用于处理最具抗性的溃疡并且具有非常高的成功率，因此这种技术也可以有效用于治疗急性伤口以使皮肤修复到“完美的状态”。
本发明还提供了一种含有未分化的胎儿细胞和/或蛋白和载体的组合物。这种组合物可以用于治疗许多皮肤缺陷，包括但不限于缺陷，老年斑，疤痕，烧伤，擦伤，胎记，纹身，色素沉着过度，过敏性皮炎，周边溃疡，湿疹，放射性皮炎，溃疡，风疹，重度干燥和白色萎缩。
要制备这种组合物，如上所述地从胎儿供体组织中获得生物活组织并培育成细胞系。例如，胎儿组织可分为小碎片，置于多个10cm2的组织培养平皿中，平皿是用手术刀进行栅格切割得到。向平皿中加入含有谷酰胺的DMEM组织培养基和10％的胎儿血清。胎儿细胞保持未分化的状态，并扩张到较高的浓度，形成细胞银行，胎儿皮肤移植物就从中产生。然后将细胞与DMSO，DMEM和胎儿血清的混合物冷冻直至需要的时候。
制备浓度为5.3×103个细胞/ml的5-10代的细胞。这种浓度随皮肤缺陷类型的不同以及患者是成人还是儿童而不同。例如，细胞的浓度可以从5.3×102个细胞/ml到5.3×104个细胞/ml。然后将胎儿蛋白稳定化，单独地或与胎儿细胞结合后与载体混合。
上述的组合物可以用于预防或治疗皮肤状况、失调或疾病，其是通过将治疗有效量的该组合物施用在患者皮肤上易受感染或已受感染的部位。例如皮肤状况、失调或疾病包括但不限于炎性皮肤状况。实例包括但不限于缺陷，老年斑，疤痕，烧伤，擦伤，胎记，纹身，色素沉着过度，过敏性皮炎，周边溃疡，湿疹，放射性皮炎，溃疡，风疹，重度干燥和白色萎缩。患者包括人和动物。例如，患者可以是，例如人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠或小鼠。
本领域技术人员应当认识到任何合适的载体和/或稳定剂都可以用于本发明的组合物。例如，在一个优选的实施方案中，载体是一种局部用霜剂。
本发明的三维皮肤组织同种异体移植物可以单独使用或和本发明的组合物同时使用。例如，同种异体移植物构建体和组合物可以同时给药或顺序给药。
表1列出了一些可以可以用本发明的胎儿细胞疗法治疗的状况。该表中还列出了每种受到治疗的疾病的患者数目以及观察到的结果。
下面的实施例是充分举例说明本发明的优选实施方案。这些实施例不应理解为对本发明权利要求所定义范围的限制。
实施例实施例1采集胎儿皮肤依照CHUV伦理委员会的方法和规定，在妊娠终止后立即从胎儿皮肤的供体组织中取出生物活组织。供体组织是12-16周孕龄的。
实施例2胎儿皮肤细胞银行的合成从实施例1所描述的最初的生物活组织中，将所有组织碎片接种到500个10cm的平皿上，大约每个平皿(＜0.5mm3)10个。这些碎片在仅含有10％胎儿牛血清(Hyclone)的DMEM中培养。细胞生长大约一周以后，将平皿培养的组织和细胞用胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶-0.1％乙二胺四乙酸[EDTA])。这时候将490个平皿在液氮中冷冻成单独的单元。将细胞在2000g离心15分出。
如可以理解的，吡罗昔康从通过微波处理所得的包合复合物中溶出较快，并且溶出量较多。
表2
实施例2-酮洛芬∶β-环糊精包合复合物物理混合物的制备精确称取约2g的酮洛芬(keto)和9.960g的β-环糊精，其摩尔比为1∶1。
实施例3放射源，暴露条件和化学治疗为了确定胎儿和成人皮肤细胞对于物理和氧化胁迫的抵抗能力，将UVA辐射和过氧化氢处理作为胁迫源进行了一系列实验。
UVASUN 3000灯(Mutzhas，Munich，Germany)可以在方便的照射位置发出波长在330和450nm之间的，剂量为300W/m2的射线。灯的光谱输出用校准的Optronic model 742分光辐射计(Optronics Laboratories，Penn.，USA)分析，显示出其具有360到410nm的较宽的峰值。UVASUN 3000灯配备了一个红外滤光片和一个可以滤掉335nm以下所有波长的滤光片。除此之外，细胞在塑料组织培养盖中照射，它不会透过UVB或UVC射线。照射剂量用International Light Radiometer，IL 1700的UVA检测探头监测，用分光辐射计校准。
胎儿皮肤的生物活组织是根据CHUV伦理委员会的方法和规定在妊娠终止后立即从供体获得。供体组织大约是12-16周孕龄。
成人供体(SW2，24岁男性；SW12，39岁女性；GT，27岁男性)的皮肤样品得自洛桑大学医院的皮肤学系，是从太阳不能照射到的皮肤部位获得的，这得到了医学院伦理委员会的通知许可和支持。
表皮角质化细胞的培养皮肤样品用含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100g/ml)的PBS冲洗三次，每次10分钟。组织用胰蛋白酶/EDTA处理达15分钟，在解剖显微镜下轻轻将表皮细胞层从真皮组织上剥离。将表皮组织打断为碎片，在2000g离心15分钟。然后将沉淀转至含有-照射(2500rads)的70％汇合的Swiss鼠3T3细胞和角质化细胞完全培养基的小组织培养瓶中，其中角质化细胞完全培养基配方如下Dulbecco’s最低基本培养基∶Hams稀释3∶1(Flow)；10％FCS；1％谷酰胺；0.4g/ml氢化可的松；10-10M霍乱毒素；5.0mg/ml胰岛素；1.2mg/ml腺嘌呤；2.5mg/ml转铁蛋白；0.14mg/ml三碘甲腺原氨酸；10g/ml表皮生长因子。角质化细胞在37℃和含有90％空气/10％CO2的加湿气氛中培养。用于人皮肤移植的细胞在不含血清的培养基(Gibco，keratinocyteSFM)中培养，最初12小时加入5％FCS以确保更好地进行细胞粘附。
真皮成纤维细胞的培养将真皮组织分割为＜0.5mm3的碎片，在含有10％FCS和谷氨酰的DMEM中培养，取0到3代的细胞用于实验。在分裂之前培养至汇合，然后用PBS漂洗两次并计数。
将细胞接种至60或100mm直径的Falcon培养皿上，培养至75％汇合。在对细胞进行照射或化学处理之前倾去培养液，将单层细胞用磷酸盐缓冲液(PBS，0.14M NaCl；2.7mM KCl；8.1mMNa2HPO4，1.5mM KH2PO4)。对于UVA照射，将细胞用PBS覆盖，在25℃照射。照射时间为平均13分钟至最长55分钟。对于过氧化氢处理，将细胞用含有合适浓度的H2O2(0.1-2.4mM)的PBS覆盖，在37℃在5％CO2培养箱中处理30分钟。
存活分析受到过氧化氢或UVA照射处理的细胞培养皿(60mm，～75％汇合)用胰蛋白酶消化，稀释，进行接种，接种量为每个培养皿(60mm，每种处理用三个培养皿)200-5000个细胞。培养皿在37℃保温12到14天，然后用亚甲基蓝进行染色，在解剖显微镜下进行菌落(＞20个细胞)计数。所有实验都在层流净化罩照明系统下进行，同时关闭室内荧光灯。
细胞生长特性和稳定性测量了胎儿和成人皮肤成纤维细胞的细胞生长曲线。对培养瓶中达到75％汇合的细胞进行胰蛋白酶消化并计数。1000个细胞的平皿准备三份，在5到20天中在不同的时间点进行计数。
细胞(胎儿和成人皮肤成纤维细胞)的细胞沉淀也在不同的条件下冷冻，例如在-20℃、-80℃和液氮中等不同温度下并且和不同浓度的DMSO一起。细胞的稳定性通过冷冻细胞沉淀或与胶原蛋白基质结合的细胞确定。
免疫组织化学分析免疫组织化学分析使用5m厚的固定组织切片。所有的保温都在黑暗中在潮湿箱中进行，除非另有说明。
对于p63检测，通过在25℃与含有5％胎儿牛血清(FCS)，7％标准羊血清(NGS)和0.1％Triton X100的PBS一起保温2小时阻断非特异性的结合。然后将组织切片与以1∶2000的比例溶于含有5％FCS，5％NGS和0.1％Triton X100的PBS溶液的p63特异性抗体(p63[p53在3q27-29处的同源物]Ab-1，Clone4A4)一起保温30分钟(Neomarkers，Fremont，Calif.，USA)。在保温(p53)之后，立即将组织切片用PBS洗涤3次，每次10分钟，然后将切片在25℃用以1∶2000的比例溶于含有5％FCS，1％NGS和0.1％Triton X100的PBS的生物素结合的羊抗兔处理。组织切片用PBS洗涤4次，每次5分钟，然后按说明书用VectastainABC(Vector，Burlingame，CA)在25℃处理3小时。这次保温后将组织切片用PBS洗涤3次，每次10分钟，然后用加入了0.32 1 30％H2O2的0.5mg/ml 3，3’-二氨基联苯胺处理，保温1到2分钟。所有的样品都在同一时间处理。p63的抗体染色呈棕色。样品用流动水洗涤5分钟。用Papanicolaou(Harris’苏木精溶液)进行对比染色，脱水并用Merckoglas(Merck，Switzerland)包埋。
结果得到大量细胞群体皮肤与其它许多组织一样，持续地由干细胞产生的新细胞补充。皮肤细胞中一种很重要的用于维持上皮干细胞的基因就是p63，它可以为这些细胞在皮肤表皮层上的定位提供非常好的标记。已经发现，至少是在鼠模型中，在缺乏p63的情况下，四肢的再生性增殖，颅面和上皮的发育也不充分。(Yang等，Nature398714-718，1999)。在胎儿皮肤中，表皮在怀孕12-14周的时候只有1-2层厚，在大约16周的时候有～2-4细胞层。在发育期间皮肤的所有层中，在所有的表皮细胞和发育中的头发毛囊中都可以发现强烈的p63核标记。这些细胞(干细胞，p63+表皮角质化细胞)已经得到了许多关注，这是因为它们能够产生不同的细胞类型，虽然似乎p63对于维持上皮干细胞群非常重要，但是对于它们是如何行使功能以及它们为什么能够不断增殖还几乎一无所知。真皮组织不包含个体p63+细胞，也没有发现可以标识真皮成纤维细胞能够快速再生的标记。
表皮角质化细胞和真皮成纤维细胞是从胎儿皮肤分别培养的。表皮细胞都是p63+(图2a)，纯细胞培养物得自上皮细胞(图2b)和真皮组织(图2c)。角质化细胞与下面的真皮成纤维细胞相比更能够抵抗氧化性胁迫(Applegate等，European Journal ofDermatalogy 7215-219，1997；Applegate等，Landmarks inPhotobiology pp.259-263，1998；以及Applegate等，JID111159-163，1998)。在胎儿细胞中也观察到了这种结果，来自胎儿和老化皮肤的成纤维细胞用于确定对物理和氧化类型胁迫的抵抗力之间的差异。
胎儿与成人皮肤成纤维细胞的细胞生长和稳定性胎儿皮肤成纤维细胞的细胞生长比成人供体的皮肤成纤维细胞快的多。从胎儿皮肤碎片放置于培养皿的第一天开始，就可以观察到成纤维细胞的生长，见图3，胎儿皮肤碎片(由实心圆(FS1)，实心方块(FS2)和实心三角(FS3)表示)。在成人皮肤碎片在同样条件下培养5-6天以后通常也可以观察到同样的结果，见图3，成人皮肤碎片(由空心圆(GT/29)，空心方块(SW2/24)和空心三角(SW12/39)表示)。一旦得到培养物，胎儿细胞就可以以比成人细胞快得多的速度生长(见图3)。通过分析培养物中细胞数目随天数变化的函数，其中细胞起始数目较少(100个或1000个)，发现在12天的培养中存在很大差异。这也许是由于克隆的效率不同所造成的，胎儿细胞的效率大约是83-91％，成人细胞的效率大约是10-22％。
以同样的方式，胎儿细胞甚至是将其细胞沉淀在-20℃冷冻达3个月也能够显示出与正常的用DMSO在液氮中的冷冻条件下同样的生长。成人皮肤的成纤维细胞(三种细胞系中的两个)在用DMSO作为储存试剂在-80℃冷冻的条件下还能显示出有限的细胞生长，但是在-20℃就不能。胎儿皮肤成纤维细胞甚至在冷冻2周以后还能显示出相当的细胞生长。
胎儿和成人皮肤成纤维细胞在UVA照射下的细胞存活包皮组织的新生的成纤维细胞对氧化性胁迫具有更强的抵抗力。(Applegate等，JID 102762-767，1994)。这里所感兴趣的是观察不同孕龄的细胞对氧化性胁迫如何响应，并且将它们的抵抗力与成人皮肤细胞的抵抗力相比较。即使在胎儿细胞和成人细胞对于氧化性胁迫UVA照射的抵抗力之间存在很大差异，但是在孕龄为12-16周之间没有观察到差异。从细胞存活百分率随UVA照射剂量变化的函数可以看出。三种胎儿皮肤细胞系在较早代数的时候，与同样代数的成人皮肤细胞系(由空心圆(GT/29)，空心方块(SW2/24)和空心三角(SW12/39)表示)相比具有极端的抵抗能力(由实心圆(FS1)，实心方块(FS2)和实心三角(FS3)表示)。(见图4)。甚至是在进行了最大剂量的UVA照射(大约50分钟)以后，只有20％的胎儿细胞被杀死。相反，30-50KJ/m2(可在人皮肤上造成可察觉的红斑的剂量)的剂量就可以杀死50％的成人皮肤细胞。
胎儿和成人皮肤成纤维细胞在H2O2处理以后的细胞存活实际上使用过氧化氢作为氧化试剂的时候，成人皮肤成纤维细胞的激活曲线是两阶段的。但是在胎儿皮肤细胞(由实心圆(FS1)，实心方块(FS2)和实心三角(FS3)表示)中没有观察到。随着过氧化氢浓度的增加，细胞的存活逐渐地减少。在相同的培养条件下和使用相同的代数时，胎儿皮肤细胞对这种类型的氧化性胁迫的抵抗能力是成人皮肤细胞(由空心圆(GT/29)，空心方块(SW2/24)和空心三角(SW12/39)表示)的1.5倍。(见图5)。
胎儿细胞已经证明对物理和氧化类型的胁迫具有抵抗力，这似乎为这些细胞提供了很高的稳定性。还不知道为什么胎儿细胞对氧化性胁迫具有更强的抵抗力。不受任何特定机制的限制，有可能它们能够更有效地清除可能产生危害的自由基中间体，或者可能它们能够更有效地处理和修复关键细胞靶的氧化性损伤。有趣的是，在早先对于低代和高代的胎儿细胞的二维蛋白凝胶电泳的研究中，发现有几种蛋白发生了巨大的变化，它们可能在氧化性胁迫中发挥作用。
实施例4三维皮肤组织同种异体移植物构建体在兽医中的应用马由于常用于运动，所以经常会产生皮肤损伤。马皮肤伤口的愈合时间特别长，也特别难处理，它具有几个有意思的方面。考虑到物质的损失和平行的组织损伤，外伤很少缝合。除此之外，马很容易产生过量的皮肤颗粒化，这抑制了组织的修复进程。特别地，会抑制上皮的形成，并且会促进蟹状肿的形成。这种过量组织颗粒化的趋势对感官质量具有严重的后果，它可以导致动物长时间的活动抑制。这些因素都有可能造成动物及其应用的财富价值的消失。这样，对于受伤的赛马，需要4到6个月的活动抑制是很正常的，这会直接导致竞争的损失。因此需要一种能够刺激马的伤口部位在很短时间内表皮再生的组织修复产品。
在一种用马腱制成的胶原蛋白海绵上用胎儿马细胞(未分化的成纤维细胞/角质化细胞)接种，然后在含有马血清的组织培养基中培养。这种制备皮肤同种异体移植物构建体的过程如实施例2中所述，但是用胎儿马细胞代替胎儿人细胞。用根据这种方法制备的三维皮肤组织同种异体移植物构建体检验了两种皮肤缺陷。
患者1是一匹下颌上具有深度脓肿的马。牙齿脓肿从口腔内部穿透到外表面，造成溃疡。准备对马进行手术，将伤口用NaCl清洗。制备同种异体移植物构建体并将其置于图6a所示的脓肿处。然后在同种异体移植物构建体上覆盖绷带，并缝合至图6b所示的部位。第一次手术后一周，伤口完全愈合，脓肿消失。(见图6c)。
患者2是一匹膝盖上具有穿过皮肤，肌肉到达骨头的深度伤口的马。(见图7a)。准备对马进行手术并清洗伤口。使用双层移植物处理这个伤口。一层覆盖在肌肉上(包括未分化的胎儿肌肉细胞)，一层覆盖在皮肤上(包括未分化的胎儿皮肤细胞)。这种同种异体移植物构建体被置于伤口部位(图7b)，上面覆盖上绷带并钉在该部位(图7c)。手术后两天，骨头和肌肉层的伤口都在愈合(图7d)，只有表面的伤口还在。
实施例5三维皮肤组织同种异体移植物构建体在人中的应用使用上述实施例2中所述技术制备细胞系。在患者移植日前大约三到五天，在9×12cm的马胶原蛋白片上接种1×105个细胞/cm2(所用的细胞为0到3代)，用无菌多孔的移液器吸管对基质进行细微的切割。然后在大约1小时以后向培养平皿中加入培养基并且每两天更换培养基。所产生的三维皮肤组织同种异体移植物含有未分化的表皮角质化细胞(10-13.5％)和未分化的真皮成纤维细胞(90-86.5％)。
本研究中进行治疗的患者选自有慢性腿溃疡史，并且用传统的治疗方法(不同包扎，自体移植等)没有治愈的患者。每个患者的评估由Doppler做出，并且没有动脉病理学。然后用生理盐水清洗慢性溃疡，并且用刮匙进行机械准备。用胎儿细胞同种异体移植物构建体覆盖整个伤口表面，然后用一层凡士林纱布和标准纱布绷带包扎。一周使用一次同种异体移植物，然后4天更换绷带。然后每两天更换绷带。
一共有11名患者的21处溃疡用胎儿细胞疗法治疗。其中15处溃疡完全愈合，3处显示出尺寸上有明显的改善(但是没有完全愈合)，3处没有继续，因为患者估计会有很大的改善。2名患者的具体情况如下所述。表3总结了所有用胎儿细胞疗法治疗的患者情况。
患者1是一位患有风湿性关节炎的女性。在踝关节有一处抗性的动脉和静脉溃疡，尺寸为2×4.5cm，已经存在了18个月。用Apligraft进行了两种移植都未成功。患者有多种过敏史，在溃疡损伤处和周围疼痛剧烈。在寻找合适的覆盖物的过程中遇到了许多困难，而且在伤口准备的过程中几个月都不符合条件，最终患者终于同意去除伤口上的纤维障碍层，以便接下来的胎儿移植物的使用能够有效发挥作用。患者的治疗总共用了31个同种异体移植物构建体。在准备好伤口以后，立刻疼痛就有所缓解，并且溃疡的大小不断减小。在治疗末期稍微更换一下纱布的类型(由于医院储备不足)就足以刺激周围的皮肤。结果见图8。
患者2是一位左腿下部有四处溃疡的女性。溃疡大小为4×2.5cm(总共使用了10个同种异体移植物构建体)；3×2cm(总共使用了12个同种异体移植物构建体)；3×2cm(总共使用了24个同种异体移植物构建体)；和2.5×2cm(总共使用了24个同种异体移植物构建体)。溃疡已经有两年了，患者贫血，脱水并且非常瘦。以前用4个自体移植物和4个Apligraft治疗都没有成功。用本发明的胎儿细胞疗法治疗一次以后就立即观察到腿部充血和疼痛状况有好转。其中两处溃疡都观察到逐渐和快速的改善，在几周的时间内就愈合了。其余的两处溃疡也有好转，但是没有完全愈合。然后在其余的两处溃疡处使用自体移植物也没有成功。结果如图9所示。
实施例6霜剂组合物在人中的应用将一种含有未分化的胎儿皮肤细胞的局部组合物和一种载体制备成霜剂的形式。该组合物含有以下成分
使用上述实施例2中所述的技术创建细胞系。制备第5-10代的细胞使终浓度为5.3×103个细胞/ml，胎儿蛋白通过以每小时1度的速度缓慢冷却到-80℃的终温度从而稳定化。霜剂组合物，一种水包油的混合物，被逐渐加热以与胎儿蛋白结合。
患者1是诊断为白色萎缩的女性。患者患有持久的腿部溃疡。用本发明的霜剂组合物治疗两周后，溃疡看来似乎完全愈合，如图11所示。
实施例7在人身上使用组合疗法-三维皮肤组织同种异体移植物和霜剂组合物患者1是双腿下部区域都诊断为白色障碍的女性。右腿下部的溃疡已有20个月，实际上已经极度纤维化。由于双腿下部皮肤都有萎缩现象，因此将本发明的三维皮肤组织同种异体移植物与霜剂组合物一同使用，覆盖在溃疡周围的全部区域上。
在进行这种胎儿细胞疗法之后，充血和瘙痒感立刻消失，最初的溃疡慢慢愈合。虽然初始的溃疡愈合了，但是又形成了一处新的类似的溃疡，这是因为皮肤的不稳定性造成的。为了更好地准备伤口，该患者进行了一周的真空辅助愈合治疗(VAC)，目的是要进行自体移植。令人惊讶的是，溃疡以及伴生的小溃疡在进行了VAC后就愈合了。以前几百名患者都是仅仅进行了一周的VAC治疗，但是没有观察到伤口愈合。随后一年，患者的白色萎缩已经稳定，没有观察到新的溃疡。结果如图12所示。
患者2是一个具有10年的同样的腿部溃疡史的女性。以前的自体移植和不同绷带包扎疗法都没有成功。在第一次使用了胎儿细胞同种异体移植物构建体和霜剂以后，充血、疼痛和纤维的产生立即明显地消失。并且观察到这个较大较深并且疼痛的溃疡快速地进一步愈合。霜剂稳定了周围的皮肤，预防新的溃疡。随后一年，皮肤仍然萎缩，但是已经没有疤痕组织了。结果如图10所示。
其它实施方案在上述本发明的特定实施方案的详细描述中清楚地描述了特别的方法和组合物。虽然这里详细公开了特定的实施例，但这仅仅是用实施例的方式进行举例说明，并不是限制由权利要求所限定的保护范围。特别是，发明人认为可以对本发明进行各种替代，改变和改进，而不背离权利要求中所定义的本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种三维皮肤组织同种异体移植物构建体，其包括与胶原蛋白基质结合的未分化的胎儿细胞。
2.如权利要求1的构建体，其中未分化的胎儿细胞包括胎儿皮肤细胞。
3.如权利要求2的构建体，其中胎儿皮肤细胞在合适的培养条件下可分化为真皮成纤维细胞或表皮角质化细胞。
4.如权利要求1的构建体，其中结合是通过混合，化合，移液操作，接种，平皿培养或放置实现。
5.如权利要求1的构建体，其中胶原蛋白基质包括马胶原蛋白。
6.一种制备权利要求1的三维皮肤组织同种异体移植物的方法，包括a)从供体胎儿组织采集生物活组织；b)从所述的胎儿组织培育细胞系；c)培养所述的胎儿组织，使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度以建立从中产生移植物的细胞银行；d)使所述移植物与胶原蛋白基质结合。
7.一种制备权利要求1的三维皮肤组织同种异体移植物的方法，包括a)获得未分化的胎儿细胞；b)使未分化的胎儿细胞增殖；c)使未分化的胎儿细胞与胶原蛋白基质结合。
8.一种治疗患有皮肤状况、失调或疾病的患者的方法，包括将权利要求1的构建体给需要这种治疗的患者施用。
9.如权利要求8的方法，其中患者选自人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠和小鼠。
10.如权利要求9的方法，其中患者是马。
11.如权利要求9的方法，其中患者是人。
12.如权利要求8的方法，其中皮肤状况、失调和疾病选自伤口和皮肤缺陷。
13.如权利要求12的方法，其中伤口是急性伤口。
14.如权利要求13的方法，其中急性伤口选自小割伤，烧伤，皮肤干燥，皮肤开裂，皮肤撕裂，手术伤口，偶然损伤和肥厚性瘢痕。
15.如权利要求12的方法，其中伤口是慢性伤口。
16.如权利要求15的方法，其中慢性伤口选自静脉溃疡，压力性溃疡，糖尿病性溃疡，动脉溃疡和烧伤。
17.如权利要求12的方法，其中皮肤缺陷选自湿疹，牛皮癣，放射性皮炎，皮肤癌，风疹，青斑样血管炎，重度干燥和白色萎缩。
18.一种通过下述方法获得的未分化的胎儿细胞银行a)从供体胎儿组织采集生物活组织；b)在合适的培养条件下培养所述胎儿组织，使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度；c)将得到的培养物中的组织和细胞用胰蛋白酶消化，得到它们的悬液；d)合并悬浮细胞使培养物中的细胞形成均一的细胞悬液；e)将其与防冻剂轻轻混合；f)将细胞悬液等分分装到安瓿瓶中并密封；g)冷冻等分试样；从而制备未分化的胎儿细胞银行。
19.如权利要求18的未分化的胎儿细胞银行，其中未分化的胎儿细胞是胎儿皮肤细胞。
20.如权利要求19的未分化的胎儿细胞银行，其中未分化的胎儿细胞是p63+。
21.如权利要求18的未分化的胎儿细胞银行，其中等分试样的冷冻是以1℃/分钟的速度降温至-80℃。
22.一种制备未分化的胎儿细胞银行的方法，包括e)从供体胎儿组织采集生物活组织；f)在合适的培养条件下培养所述胎儿组织，使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度；g)将得到的培养物中的组织和细胞用胰蛋白酶消化，得到它们的悬液；h)合并悬浮细胞使培养物中的细胞形成均一的细胞悬液；i)将其与防冻剂轻轻混合；j)将细胞悬液等分分装到安瓿瓶中并密封；k)冷冻等分试样；从而制备未分化的胎儿细胞银行。
23.如权利要求22的方法，其中等分试样的冷冻是以1℃/分钟的速度降温至-80℃。
24.一种组合物，其包括一种载体和单独的或与一种或多种胎儿蛋白共同的一种或多种未分化的胎儿细胞。
25.如权利要求24的组合物，其中载体选自软膏，洗剂，霜剂，乳剂，微乳剂，凝胶和溶液。
26.如权利要求25的组合物，其中载体是霜剂。
27.如权利要求26的组合物，其中霜剂含有水包油混合物。
28.如权利要求24的组合物，其中载体含有疏水佐剂和亲水佐剂。
29.一种制备权利要求24的组合物的方法，包括a)从供体胎儿组织采集生物活组织；b)从所述的胎儿组织培育细胞系；c)培养所述胎儿组织，使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度，建立细胞银行；d)使胎儿蛋白在细胞银行内稳定；e)使所述胎儿细胞与载体结合。
30.一种制备权利要求24的组合物的方法，包括a)获得未分化的胎儿细胞；b)使未分化的胎儿细胞增殖；c)使胎儿蛋白在胎儿细胞内稳定；d)使所述胎儿细胞与载体结合。
31.一种制备权利要求24的组合物的方法，包括a)从供体胎儿组织采集生物活组织；b)从所述的胎儿组织培育细胞系；c)培养所述胎儿组织，使未分化的胎儿细胞增殖到高浓度，建立细胞银行；d)使所述胎儿细胞与载体结合。
32.一种制备权利要求24的组合物的方法，包括a)获得未分化的胎儿细胞；b)使未分化的胎儿细胞增殖；c)使所述胎儿细胞与载体结合。
33.一种预防或治疗皮肤状况、失调或疾病的方法，包括给患者皮肤的易受感染或已受感染的部位施用治疗有效量的权利要求24的组合物。
34.如权利要求33的方法，其中皮肤状况、失调或疾病是炎性皮肤状况。
35.如权利要求34的方法，其中炎性皮肤状况选自缺陷，老年斑，疤痕，烧伤，擦伤，胎记，纹身，色素沉着过度，过敏性皮炎，周边溃疡，湿疹，放射性皮炎，溃疡，风疹，重度干燥和白色萎缩。
36.如权利要求35的方法，其中炎性皮肤状况是周边溃疡。
37.如权利要求35的方法，其中炎性皮肤状况是白色萎缩。
38.如权利要求35的方法，其中炎性皮肤状况是色素沉着过度。
39.如权利要求33的方法，其中患者选自人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠和小鼠。
40.如权利要求39的方法，其中患者是马。
41.如权利要求39的方法，其中患者是人。
42.一种治疗患有皮肤状况、失调或疾病的患者的方法，该方法包括施用与胶原蛋白基质结合的含有未分化的胎儿细胞的三维皮肤组织同种异体移植物，并且施用一种含有一种载体和单独的或与一种或多种胎儿蛋白共同的一种或多种未分化的胎儿细胞的组合物，使得皮肤状况、失调或疾病随时间痊愈。
43.如权利要求42的方法，其中同种异体移植物和组合物顺序给药。
44.如权利要求42的方法，其中同种异体移植物和组合物同时给药。
45.如权利要求42的方法，其中患者选自人，非人的灵长类动物，野生动物，狗，猫，马，牛，猪，羊，兔，大鼠和小鼠。
46.如权利要求45的方法，其中患者是马。
47.如权利要求45的方法，其中患者是人。
48.如权利要求42的方法，其中皮肤状况、失调或疾病选自小割伤，烧伤，皮肤干燥，皮肤开裂，皮肤撕裂，手术伤口，偶然损伤，肥厚性瘢痕，静脉性溃疡，压力性溃疡，糖尿病性溃疡，动脉性溃疡，湿疹，牛皮癣，放射性皮炎，皮肤癌，风疹，青斑样血管炎，白色萎缩，缺陷，老年斑，疤痕，烧伤，擦伤，胎记，纹身，色素沉着过度，过敏性皮炎，周边溃疡，湿疹，放射性皮炎，溃疡和风疹。
49.如权利要求42的方法，其中未分化的胎儿细胞是胎儿皮肤细胞。
50.如权利要求49的方法，其中胎儿皮肤细胞在合适的培养条件下分化为真皮成纤维细胞或表皮角质化细胞。
51.如权利要求42的方法，其中胶原蛋白基质包含马胶原蛋白。
52.如权利要求42的方法，其中载体选自软膏，洗剂，霜剂，乳剂，微乳剂，凝胶和溶液。
全文摘要
本发明包括用于治疗患有皮肤状况、失调或疾病的患者的方法和组合物。该组合物包括与胶原蛋白基质或载体结合的未分化的胎儿皮肤细胞。
文档编号A61K9/06GK1638822SQ03805560
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月11日 优先权日2002年2月11日
发明者李·劳伦特-阿普盖特, 帕特里克·霍菲尔德 申请人:新科蒂斯公司