用于将系统性免疫应答靶向于特定器官或组织的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于将系统性免疫应答靶向于特定器官或组织的方法和组合物的制作方法
1.发明背景在当今世界上，癌症一直是最具毁灭性的健康问题之一。在美国，每5个人中大约有1个人受到癌症的影响。研究业已导致了很多不同类型治疗方法的发现，包括通常被用于化疗的细胞毒性剂，如抗代谢剂，它能干扰微管形成，烷化剂，基于铂的试剂，蒽环类，抗生素试剂，和拓扑异构酶抑试剂等。另外，业已对更传统的手术和放射疗法进行了改进，同时，切割边缘治疗涉及业已开发的免疫调节和基因治疗。不过，尽管业已评估了数千种潜在的抗癌试剂，人类癌症治疗仍然在与并发症和副作用做斗争，这些副作用通常会提供一系列不是最佳的治疗选择。
一种治疗癌症的引起注意的新型非化学方法是基于这样的发现迅速形成的肿瘤，具有不规则的血管组构，导致了在时间上和空间上不均匀的血液流动，并且产生了缺氧的部位。肿瘤血流的这种不均匀性，妨碍了血液携带的化疗试剂向癌细胞的送递，并且这种状态降低了放疗和化疗试剂的效果，并且倾向于选择更具侵袭性和更容易转移的癌细胞(参见Brown和Giaccia(1998)Cancer Res 581408-1416)。具有讽刺意味的是，所述相同的缺氧的状态导致了非致病性，厌氧细菌的有利的定居，所述细菌定居，并且能够导致从转移的肿瘤内部开始的裂解(例如，参见，Carey等(1967)Eur.J.Cancer 337-46，披露了用梭菌治疗肿瘤)。所述早期努力并不十分成功。最近，Dang等((2001)PNAS USA 98151 55-160；并且由Jain和Forbes进行了评述(2001)PNAS USA 9816748-750)筛选了细菌的大约26种菌株均匀感染并且分布在肿瘤的血管化较差部位的能力。诺氏梭菌的一种菌株是特别有效的，并且进行了遗传学修饰，以便消除它所编码的致命的毒素。所得到的受感染的肿瘤会出现细菌诱导的坏死，不过，不能完全消除外周存活的和血管化的肿瘤细胞——这些细胞必须用常规化疗试剂治疗(化疗/细菌裂解疗法的组合被称为“COBALT”)。在相关的方法中，Lemmon等((1997)Gene Ther 4791-96)业已披露了作为基因送递系统的厌氧细菌的工程产生，它是由肿瘤微环境控制的，以及Theys等((2001)Cancer Gene Ther 8294-97)业已披露了通过用工程产生的丙酮丁醇梭菌，使胞嘧啶脱氨酶特异性靶定实体瘤。
尽管所述细菌裂解疗法和大量抗肿瘤试剂的发展可用于癌症的临床治疗，仍然存在对用于治疗癌症的更有效的方法的需要。因此，存在对改进的癌治疗方法，特别是影响特殊器官或组织的恶性实体瘤以及它们所产生的转移瘤的治疗的需要。
用于癌症和肿瘤化疗的开发中的替代方法一直是使用肿瘤疫苗，所述疫苗是以与佐剂混合的弱免疫原性特异性肿瘤抗原为基础的，以便诱导，恢复或增强针对残余的或转移的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫原性。肿瘤疫苗介导的治疗方法，涉及在靶定的肿瘤细胞中激活细胞毒性(有关综述，参见Nawrocki和Mackiewicz(1999)Cancer Treat Rev 2529-46)。业已表征了由细胞毒性T-细胞识别的若干种HLA-限制性特异性肿瘤抗原。第一代肿瘤疫苗，包括用完整的癌细胞或肿瘤细胞裂解物与非特异性佐剂一起制备的疫苗。新型第二代肿瘤采用了遗传学修饰过的肿瘤细胞，抗原呈递细胞(树突细胞)或重组肿瘤抗原(例如DNA肿瘤疫苗，正如下文所定义的)。可以对肿瘤细胞进行修饰，以便增强它们在诱导抗肿瘤免疫应答方面的效力，包括用编码能提供细胞毒性T-细胞识别和杀伤癌细胞所需要的信号的分子的基因进行遗传学修饰，所述分子如B7共刺激分子，HLA蛋白，以及不同细胞因子的基因(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或GM-CSF)。
另一种肿瘤疫苗方法是基于以下发现，接种含有编码肿瘤蛋白抗原的cDNA的质粒会导致对所述肿瘤抗原的强的和长期的体液和细胞介导的免疫应答。因此，如果可以鉴定有效的肿瘤抗原，就可以将编码所述肿瘤蛋白抗原的DNA序列插入载体基因组(例如质粒或甲病毒)，以便诱导抗肿瘤免疫应答。所述基于特异性肿瘤抗原的DNA疫苗，被称为DNA肿瘤疫苗(或DNA癌症疫苗)。据推测，某些骨髓衍生的专门的抗原呈递细胞(APCs)是由所述质粒转染的，并且，所述cDNA转录并且翻译成能诱导特异性反应的免疫蛋白。在一种相关的方法中，将所谓的裸露DNA直接注射到宿主体内，以便产生免疫应答。裸露的DNA包括直接注射到所述宿主体内的简单的细菌质粒。业已研究了DNA疫苗送递代表编码黑素瘤的诸如ALVAC gp100基因和编码结肠结肠癌的ALVAC CEA-B7.1的靶基因的精确的和特异性的核苷酸序列以及特异性蛋白片段，如存在于乳腺癌细胞中的HER2/Neu肽的能力，作为诱导免疫应答的潜在方法(例如，参见Tartaglia等(2001)Vaccine 192571-5；Knutson等(2001)J Clin Invest 107477-84；Chen等(2001)GeneTher 8316-23；和Sivanandham等(1998)Cancer ImmunolImmunother 46261-7)。不幸的是，肌内注射DNA通常不能产生有效的免疫应答，不过，经皮或皮内送递DNA可能更为有效。例如，经皮送递用乙型肝炎抗原编码DNA包被的微型金珠进行的临床实验，产生了对所述抗原的保护水平的抗体(参见Poland等The Fourth AnnualCconference On Vaccine Research，Arlington，VA(April 23-25，2001(www.nfid.org/conferences/vaccine01/abstracts/abss37-40.pdf))DNA疫苗，当有效时，提供了诱导有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的独特的方法，因为所述DNA编码的蛋白是在转染细胞的细胞质中合成的。另外，细菌质粒富含未甲基化的CpG核苷酸，并且是由巨噬细胞作为外源物质识别的，并且诱导天然免疫应答，它能够增强获得性免疫力。因此，在没有佐剂的情况下施用时，质粒DNA疫苗是有效的。另外，由所述疫苗表达的cDNAs，能够方便地进行操作，以便表达很多不同的抗原，并且提供共表达能增强免疫应答的其他蛋白的能力(例如，细胞因子和共刺激剂)。不过，特异性DNA疫苗必须通过实验和证明效力进行开发。对于用于癌症治疗的DNA疫苗来说尤其如此，因为即使是高水平表达的肿瘤特异性抗原，也不总是DNA癌疫苗免疫治疗的有效目标。因此，作为DNA肿瘤疫苗开发的唯一的第一个步骤，通常必须鉴定表面表达的肿瘤特异性抗原。
所述新型肿瘤疫苗方法业已产生了特异性抗肿瘤免疫应答和目标临床反应。不过，所述肿瘤疫苗方法既不完整，也不是总能成功，因此，需要对癌症的免疫学治疗的改进的方法。
2.发明概述概言之，本发明提供了在受试者体内产生针对器官或组织特异性疾病或状况的系统性免疫应答的方法，包括施用治疗有效量的疫苗，它能产生针对所述器官或组织特异性疾病或状况的免疫应答，并联合施用亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织中产生亲嗜性免疫应答的试剂。在优选实施方案中，所述器官或组织特异性疾病或状况是肿瘤或癌生长，而所述疫苗是肿瘤疫苗。在另一种优选实施方案中，所述疫苗是表达GM-CSF的减毒的肿瘤细胞系。在另一种实施方案中，所述亲嗜性定位于器官或组织中的试剂，是具有对所述特殊器官或组织具有天然亲嗜性的病毒，细菌，酵母或真菌。所述亲嗜性定位的试剂优选是单核细胞增生利斯特氏菌的减毒菌株。更优选的是，所述生物亲嗜性定位于新生血管内皮。
在某些实施方案中，所述试剂是基因工程产生的，以便亲嗜性定位于所述器官或组织，并且它是工程产生的病毒，细菌，酵母或真菌。所述基因工程产生的生物，优选表达用于由所述器官或组织表达的受体的配体。在另一种优选实施方案中，用于所述器官或组织受体的配体业已与所述生物的外被或衣壳蛋白融合。更优选的是，所靶定的组织是新生血管内皮。因此，在优选实施方案中，所述基因工程产生的生物表达由新生血管内皮表达的受体的配体。
在其他实施方案中，所述试剂是没有天然亲嗜性的生物，通过选自下组的物理方法将其直接施用于所述器官或组织直接注射，经皮导管，手术，和闭合回路输注。在优选实施方案中，施用所述试剂的器官或组织是肺，而施用的方法是吸入。在另一种优选实施方案中，靶定的器官或组织是胃肠道，而施用方法是摄取。
在另一种实施方案中，亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织的试剂是基因工程产生的生物，它能产生免疫性或炎症的激活剂，如趋化因子，细胞因子，或粘附分子。所述亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织的试剂是炎性试剂。
在另一种优选实施方案中，本发明提供了定位于受试者体内的组织或器官内的肿瘤或癌生长的方法，包括施用治疗有效量的能产生针对所述肿瘤或癌生长的免疫应答的肿瘤疫苗，并联合施用亲嗜性定位于或者直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织上产生亲嗜性免疫应答的试剂。在本发明这一方面的优选实施方案中，所述肿瘤或癌生长是肝癌，所述肿瘤疫苗是能分泌完整肿瘤细胞疫苗的GM-CSF，并且，所述亲嗜性定位于受影响的器官或组织的试剂是单核细胞增生利斯特氏菌的减毒的菌株。在其他优选实施方案中，所述肿瘤疫苗是DNA肿瘤疫苗。
本发明还提供了用于在受试者体内产生针对器官或组织特异性疾病或状况的系统性免疫应答的制剂，包括治疗有效量的能产生针对所述器官或组织特异性疾病或状况的免疫应答的疫苗；以及亲嗜性定位于或者直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织产生亲嗜性免疫应答的试剂。所述制剂优选是用于治疗位于受试者体内的组织或器官中的肿瘤或癌生长的，包括治疗有效量的能产生针对所述肿瘤或癌生长的免疫应答的肿瘤疫苗；以及亲嗜性定位的或者直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织产生亲嗜性免疫应答的试剂。更优选的是，亲嗜性定位的或者直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织产生亲嗜性免疫应答的试剂是减毒的细菌。最优选的是，所述减毒的细菌是HIV-gag减毒的单核细胞增生利斯特氏菌。
本发明还提供了用于在受试者体内产生针对器官或组织特异性疾病或状况的系统性免疫应答的试剂盒，包括能产生针对所述器官或组织特异性疾病或状况的免疫应答的疫苗；以及亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织产生亲嗜性免疫应答的试剂。所述试剂盒优选被用于治疗位于受试者体内的器官或组织的肿瘤或癌生长，并且包括能产生针对肿瘤或癌生长的免疫应答的病毒疫苗；以及亲嗜性定位于或者直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织上产生亲嗜性免疫应答的试剂。
3.附图简述

图1表示鼠肝转移模型方法的设计，其中，将脾分割成两个二分之一的脾脏。
图2表示将CT26鼠结直肠癌肿瘤细胞注射到所述两个二分之一的脾脏之一中，以便在肝脏中形成肿瘤沉积，并且通过手术方法取出注射过的二分之一的脾脏，以便留下没有肿瘤细胞的功能性二分之一的脾脏。
图3表示所述鼠CT26肝转移模型的组织学。
图4表示对照和鼠CT26肝转移模型中侵袭4周之后的实验大体肝脏标本。
图5表示用辐射过的GM-CSF-表达肿瘤完整细胞疫苗免疫对CT26肝转移模型中小鼠存活的时间作用。
图6表示来自用GM-CSF肿瘤疫苗和减毒的单核细胞增生利斯特氏菌感染组合治疗的肝脏转移的改善了的小鼠存活。
图7表示单核细胞增生利斯特氏菌肿瘤疫苗增强是对肝脏特异的，而不是对肺特异的。
图8表示AH1肿瘤抗原的肝脏浸润CD8 T-细胞特异性的比较。
图9表示用疫苗，利斯特氏菌或疫苗和利斯特氏菌的组合处理过的具有肝脏肿瘤的小鼠的存活的比较。
图10表示单核细胞增生利斯特氏菌肿瘤疫苗的增强作用是对肝脏肿瘤特异的，而不是对肺肿瘤特异的。
图11表示双重CD8淘选，能提高从小鼠肝脏中分离的CD8淋巴细胞的纯度。
图12(A-C)表示分析来自不同处理组中的小鼠的肝脏浸润，肿瘤特异性CD8 T-细胞数量的结果。
图13(A-C)表示分析来自不同处理组中的小鼠的肝脏浸润，肿瘤特异性CD8 T-细胞数量的第二种分析的结果。
图14(A-E)表示分析来自不同处理组中的小鼠的肝脏浸润，肿瘤特异性CD8 T-细胞数量的第三种分析的结果。
图15表示对肝脏浸润，AH1-特异性D8 T-细胞的IFN-γ和IL-10的RT-PCR分析。
4.发明详述4.1.概论概言之，本发明提供了用于分别产生针对靶定特殊器官或组织，例如，受癌症影响的器官或组织的免疫应答的方法和组合物，使用对所述器官或组织有亲嗜性的或者能够特异性地定位于所需要的器官或组织上的一种或多种试剂。当用于产生特异性靶向的免疫应答的方法和组合物与诸如能产生全身性免疫应答的疫苗的第二种免疫学试剂组合使用时，本发明是特别有利的。在优选实施方案中，本发明提供了避免与系统产生的全身性免疫应答，如与疫苗相关的潜在问题的方法。具体地讲，所述免疫应答是不集中的，并且不针对特殊的器官或组织。在某些其他场合下，所述不集中的免疫应答不能进入需要的特殊目标器官或组织。在其他场合下，所述不集中的免疫应答，没有强到足以在特殊的器官或组织中导致需要的影响的程度，即使它能够进入所述组织或者可以集中。本发明提供了能促进对所述免疫应答，例如通过疫苗(如肿瘤疫苗)产生的免疫应答的组织和/或器官特异性亲嗜性的试剂和方法。
在优选实施方案中，本发明提供了具有对特殊器官或组织的亲嗜性的试剂通过有助于将合适的细胞导向正确部位的机制，将所述生物应答集中在特殊器官或组织上；改变局部微环境，以便使所述生物应答能够进入所述部位；以及一旦所述生物应答局部到达所述目标，培养或增强所述生物应答。
在本发明的广义的优选实施方案中，提供了任何方法的组合，以便借助于提供组织或器官特异性免疫应答而产生系统性免疫应答。用于本发明的产生集中的，组织或器官亲嗜性免疫应答的所述方法包括任何感染性试剂，如对特殊器官或组织有天然亲嗜性的病毒，细菌，酵母或真菌；业已通过工程方法产生了对特殊器官或组织的亲嗜性的任何感染试剂(例如，通过将器官或组织特异性受体的配体剪接到所述生物的外被或衣壳蛋白中)；对新生血管内皮具有天然的或工程产生的亲嗜性的任何生物；通过诸如直接注射，经皮导管，手术，或闭合回路输注的物理方法，将一种生物放置到特定器官或组织中，以便靶定没有天然亲嗜性的生物；吸入或摄取靶定肺或胃肠道的生物；或在另一种优选实施方案中，使用所有上述方法，其中，所述生物是基因工程产生的，以便产生趋化因子，细胞因子，粘附分子，或免疫或炎症的其他激活剂。在另一种优选实施方案中，所述亲嗜性试剂是无生命的炎性试剂(例如，小分子)，它能天然地或通过工程方法产生亲嗜性免疫应答。
广义地讲，本发明涉及使用对器官或组织有亲嗜性的或者可以专门放置在有关部位的试剂，针对特殊器官或组织分别产生的免疫应答。在一种特别优选的实施方案中，采用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)增强的肿瘤细胞接种和单核细胞增生利斯特氏菌(LM)感染的组合，治疗来自结直肠癌的肝脏转移瘤。尽管不希望受到特定作用机制的限制，本发明提供了用GM-CSF或等同增强的肿瘤细胞免疫，它能在所述受试者体内产生系统性T细胞介导的免疫应答，并且用减毒的LM感染，它能优先感染肝脏，通过改变局部环境，趋化因子释放，细胞因子释放，粘附分子表达，或肝脏内的血管通透性，将所述系统性疫苗诱导的免疫应答集中在肝脏中。其净效果是增强对肝脏转移瘤的抗肿瘤免疫性。本发明普遍适用于能产生系统性免疫应答的以及由具有选择性归巢特性的生物产生的器官或组织特异性炎性刺激，或通过物理方法产生的局部安装的任何方法的组合。
4.2.定义为了方便起见，下面提供了在说明书，实施例和附图中采用的某些术语和短语的含义。除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语，具有本发明所述技术领域普通技术人员普遍公知的相同的含义。
在本文中冠词“一个”和“一种”被用于表示该冠词的一个或一个以上(即至少一个)语法上的宾语。举例来说，“一种元件”表示一种元件或一种以上元件。
术语“异常活性”在应用于多肽的活性时，表示与野生型或天然多肽的活性不同的活性，或与健康受试者体内的多肽的活性不同。多肽的活性可能因为它的活性比它的天然对应体的活性强而异常。另外，活性可能因为比它的天然对应体的活性弱或不存在活性而异常。异常活性还可以是活性的改变。例如，异常多肽可以与不同的靶肽相互作用。细胞可能因为编码所述多肽的基因的超量表达或表达不足而具有异常多肽活性。
本文所使用的术语“激动剂”被用于表示能模拟或上调(例如加强或补充)生物活性的试剂。多肽激动剂可以是具有所述野生型多肽的至少一种生物活性的野生型蛋白或衍生物。多肽治疗剂还可以是能够上调多肽编码基因的表达或提高多肽的至少一种生物活性的化合物。激动剂还可以是能增强多肽与另一种分子的相互作用从而促进它们的相互作用的化合物。
在本文中与“等位基因变体”交互使用的术语“等位基因”表示基因的其他形式或它的一部分。等位基因在同源染色体上占据相同的基因座或位置。当受试者具有基因的两个相同的等位基因时，该受试者就被说成对于基因或等位基因上是纯合的。当受试者具有两个不同的等位基因时，所述受试者就被说成对于所述基因上是杂合的。特定基因的等位基因，可以在单个核苷酸或若干个核苷酸上彼此不同，并且可以包括核苷酸的取代，缺失和插入。经常出现的序列变异包括转换突变(即嘌呤→嘌呤取代和嘧啶→嘧啶取代，例如，A→G或C→T)，颠换突变(即，嘌呤→嘧啶和嘧啶→嘌呤取代，例如，A→T或C→G)，以及重复DNA序列上的改变(例如，三核苷酸重复和其他串联重复序列的扩增和收缩)。一个基因的等位基因还可以是含有突变的基因形式的。术语“基因的多态性区的等位基因变体”表示具有在某些个体内的所述基因的区域中存在的一个或若干个核苷酸序列差异的基因的区。
本文所使用的“拮抗剂”表示能下调(例如，阻遏或抑制)至少一种生物活性的试剂。拮抗剂可以是能抑制或减弱蛋白和另一种分子之间的相互作用，例如，配体和受体之间的相互作用的化合物。拮抗剂还可以是能下调基因表达的化合物，或者能降低所存在的基因产物蛋白的量。配体拮抗剂可以是显性失活形式的配体多肽，例如，能够与靶肽相互作用的配体多肽的形式。拮抗剂还可以是能干扰蛋白依赖型信号转导途径的化合物。
本文所使用的术语“抗体”表示包括完整抗体，例如，任何同种型的抗体(IgG，IgA，IgM，IgE等)，并且包括它们的片段，它还能与脊椎动物，例如哺乳动物蛋白特异性反应。可以通过常规技术使所述抗体成为片段，并且以与对完整抗体所披露的相同方式筛选片段的用途。因此，该术语包括抗体分子的蛋白水解裂解或重组制备的部分，所述部分能够与某些蛋白选择性地反应。所述蛋白水解和/或重组片段的非限定性例子包括Fab，F(ab′)2，Fab′，Fv，和包括通过肽接头连接的V[L]和/或V[H]结构域的单链抗体(scFv)。所述scFv′s可以是共价连接的或非共价连接的，以便形成具有两个或两个以上结合位点的抗体。本发明包括抗体和重组抗体的多克隆，单克隆或其他纯化制剂。
术语“抗肿瘤活性”或“抗癌活性”表示一种物质或组合物抑制与所述物质或组合物相互作用的肿瘤细胞增殖或诱导它死亡的能力。
与核酸异常表达“相关的”疾病，失调，或状况，或“其特征在于”核酸异常表达的疾病，失调，或状况表示受试者体内由核酸的异常表达水平引起，造成或导致的疾病，失调或状况。
在本文中，术语“多肽的生物活性片段”表示全长多肽的片段，其中，所述片段能特异性地模拟或拮抗野生型多肽的活性。所述生物活性片段优选是能够与所述特异性多肽的受体相互作用的片段。
在本文中可以互换使用的“生物学活性”或“生物活性”或“活性”或“生物学功能”表示通过多肽(它的天然或变性构象)或通过它的任何序列直接或间接实现的效应物或抗原功能。生物学活性包括与靶肽结合。靶多肽生物活性可以通过直接影响所述靶多肽进行调节。另外，靶多肽生物活性可以通过调节所述靶多肽的水平进行调节，例如通过调节所述靶多肽编码基因的表达。
术语“生物标记”表示生物分子，例如，核酸，肽，激素等，可以检测它的存在或浓度，并且与诸如疾病状态的已知状况相关。
“细胞”，“宿主细胞”，或“重组宿主细胞”是本文中可交换使用的术语。应当理解的是，所述术语不仅表示特定的受试者细胞，而且还表示所述细胞的后代或潜在的后代。因为某些改变可能因为突变或环境影响而存在于后代中，实际上，所述后代可能与亲代细胞不同，不过仍然包括在本文所使用的术语的范围内。
“嵌合多肽”或“融合多肽”是编码一种主题多肽的第一种氨基酸序列与形成对所述多肽的任何结构域来说是外源的并且明显与它不同源的结构域(例如多肽部分)的第二种氨基酸序列的融合体。嵌合多肽可以提供存在于生物体内的外源结构域(尽管是不同的多肽)，所述生物还能够表达所述第一种多肽，或者它可以是由不同类型生物表达的多肽结构的“种间”，“基因间”等的融合体。一般，融合多肽可以用以下通式表示X-多肽-Y，其中，“多肽”表示感兴趣的蛋白的一部分或全部，而X和Y分别是不存在或表示不与生物中的蛋白序列相关的氨基酸序列，包括天然存在的突变体。
“送递复合物”应当表示靶向装置(例如，能导致基因，蛋白，多肽或肽与靶细胞表面的更高亲和力结合和/或增强靶细胞对细胞或细胞核的摄取的分子)。靶向装置的例子包括甾醇类(例如，胆甾醇)，脂类(例如，阳离子脂类，病毒颗粒或脂质体)，病毒(例如，腺病毒，腺伴随病毒，和逆转录病毒)或靶细胞特异性结合试剂(例如，由靶细胞特异性受体识别的配体)。优选的复合物在体内足够稳定，以便在被所述靶细胞内化之前，能够抑制显著的解偶联。不过，所述复合物在所述细胞内在合适的条件下可以裂解，以便以功能性形式释放所述基因，蛋白，多肽或肽。
术语“树突细胞”表示在诱导免疫应答时起着抗原呈递细胞(APCs)作用的多种辅助细胞的任意一种。本文所使用的术语“树突细胞”包括相互交叉的树突细胞，它存在于大部分器官的间质组织中，并且在淋巴结和脾脏的富含T细胞的部位含量丰富，并且分布于皮肤的所有表皮中，在这里它们又被称为朗氏细胞。所述相互交叉的树突细胞来自骨髓前体细胞，并且在谱系上与单核吞噬细胞相关。
众所周知的是，基因能够在个体基因组中以单一拷贝或多拷贝形式存在。所述重复的基因可能相同或者可能具有某些修饰，包括核苷酸取代，添加或缺失。这些形式都仍然编码具有基本相同的活性的多肽。例如，因此，术语“编码抗原多肽的DNA序列”可以表示特定个体内的一个或多个抗原基因。另外，在个体生物之间可能在核苷酸序列上存在某些差别，这种差别被称为等位基因。所述等位基因差别，可能导致或者不导致所编码的多肽的氨基酸序列的差别，但仍然编码具有相同生物学活性的多肽。
术语“表位”(或抗原决定簇)被定义为一种分子的与抗体分子上的单一抗原结合位点结合的部分。单一表位是由单克隆抗体(mAb)识别的，而多个表位通常是由多克隆抗体(Ab)识别的。
术语“等同物”被理解成包括编码功能性等同多肽的核苷酸序列。等同的核苷酸序列包括具有一个或多个核苷酸取代，添加或缺失的差别的序列，如等位基因变体；因此，还包括由于遗传密码的简并性而与本发明核酸的核苷酸序列不同的序列。
“同源性”或“同一性”或“相似性”表示两种肽之间或两种核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较在每一种序列上的一个位置进行确定，所述序列可以出于比较目的而进行比对。当被比较的序列上的位置被相同的碱基或氨基酸所占据时，这两种分子在该位点上就是相同的。核酸序列之间的同源性或相似性或同一性程度，是所述核酸序列所共同拥有的位置上的相同或匹配核苷酸的数量的函数。氨基酸序列同一性的程度是所述氨基酸序列所共同拥有的位置上的相同氨基酸的函数。氨基酸序列同源性或相似性的程度是在由所述氨基酸序列共同拥有的位置上的氨基酸数量的函数，即在结构上相关。“不相关的”或“非同源的”序列与本发明的序列之一拥有低于40％的同一性，优选低于25％的同一性。
本文所使用的术语“相互作用”表示分子之间的可检测的关系或联系(例如，生物化学相互作用)，如蛋白-蛋白，蛋白-核酸，核酸-核酸，和蛋白-小分子和核酸-小分子之间的天然的相互作用。
本文所使用的与诸如DNA或RNA的核酸相关的术语“分离的”表示分别独立于存在于大分子的天然来源中的其他DNAs或RNAs的分子。例如，编码所述主题多肽的分离的核酸，优选包括不超过10千碱基(kb)的核酸序列，这些序列天然地紧密侧翼于基因组DNA中所述主题基因，更优选不超过所述天然存在的侧翼序列的5kb，最优选少于所述天然存在的侧翼序列的1.5kb。本文所使用的术语分离的还表示在通过重组DNA技术生产时，基本上不含细胞材料，病毒材料，或培养基，或者在通过化学方法合成时不含化学前体或其他化学物质的核酸或肽。另外，“分离的核酸”表示包括不是天然存在的片段，并且不存在于它的天然状态中的核酸片段。本文所使用的术语“分离的”还表示与其他细胞蛋白分离的多肽，并且表示包括纯化的和重组的多肽。
“敲入(knock-in)”转基因动物表示具有导入它的基因组中的修饰过的基因的动物，并且，所述修饰过的基因可以是外源的或内源的。
“剔除”转基因动物表示这样的动物，其中，部分或完全抑制了内源基因的表达(例如，基于所述基因的至少一部分的缺失，所述基因的至少一部分被第二种序列所取代，导入终止密码子，编码关键氨基酸的碱基的突变，或除去了内含子连接等)。在优选实施方案中，所述“剔除”基因座相当于不再编码功能性多肽活性的修饰过的内源基因，并且被称为“无效”等位基因。因此，本发明的剔除转基因动物包括具有一种无效基因突变的动物，以及具有两种无效基因突变的动物。
“剔除构建体”表示可用于减弱或抑制由细胞中的内源DNA序列编码的蛋白表达的核酸序列。在一种简单的例子中，所述剔除构建体包括在基因的关键部分具有缺失的基因，以便不能由它表达活性蛋白。另外，可以在所述天然基因上添加多个终止密码子，以便诱导所述蛋白的提前终止，或者使内含子连接失活。在一种典型的剔除构建体中，所述基因的某些部分被选择标记(如neo基因)所取代，以便所述基因能够以如下形式出现基因5′/neo/基因3′，其中，基因5′和基因3′表示分别位于所述基因一部分的上游和下游的基因组或cDNA序列，并且，其中的neo表示新霉素抗性基因。在另一种剔除构建体上，将第二种选择标记添加在侧翼位置上，以便所述基因能够以如下形式出现基因/neo/基因/TK，其中，TK是胸苷激酶基因，它可以添加在上述构建体的基因5′或基因3′序列上，并且，它还可以用合适的培养基进一步选择(即阴性选择标记)。这种双标记构建体可以对同源重组事件进行选择，它通过通常保留了TK序列的非同源重组事件，消除了所述侧翼TK标记。所述基因缺失和/或取代可来自外显子，内含子，特别是内含子连接，和/或诸如启动于的调控区。
本文所使用的术语“调节”是上调(即，激活或刺激(例如，通过激动或加强))和下调(即，抑制或阻遏(例如，通过拮抗，减弱或抑制))。
术语“突变的基因”表示等位基因形式的基因，相对没有突变基因的受试者而言，它能够改变具有所述突变基因的受试者的表型。如果受试者必须在该突变上纯合以便具有改变了的表型的话，所述突变被称为隐性的。如果一个拷贝的突变基因就足以改变所述受试者的基因型的话，该突变就被称为是显性的。如果受试者具有一个拷贝的所述突变基因，并且具有介于纯合受试者和杂合受试者之间的表型(对所述基因而言)的话，所述突变被称为是共显性的。
本发明的“非人动物”包括哺乳动物，如啮齿类动物，非人灵长类，绵羊，狗，牛，鸡，两栖类动物，爬行动物等。优选的非人动物选自包括大鼠和小鼠的啮齿类，最优选的是小鼠，不过，转基因两栖类动物，如爪蟾属的成员以及转基因鸡，也能提供用于了解和鉴定能够影响诸如胚胎发生和组织形成的重要工具。本文所使用的术语“嵌合动物”表示存在重组基因的动物，或所述重组基因在所述动物的某些而不是所有细胞中表达。术语“组织特异性嵌合动物”表示本发明的重组基因之一在某些组织中存在和/或表达或破坏，而在其他组织中不是这样。
在本文中，术语“核酸”表示多核苷酸或寡核苷酸，如脱氧核糖核苷酸(DNA)，并且如果合适的话，还表示核糖核酸(RNA)。该术语还应当被理解成包括由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的类似物，并且可应用于所披露的实施方案，单链(有义或反义)和双链多核苷酸。
术语“互补于SEQ ID No.x所述核苷酸序列的核苷酸序列”表示具有SEQ ID No.x的核酸链的互补链的核苷酸序列。术语“互补链”在本文中与术语“互补序列”可以交互使用。核酸链的互补序列可以是编码链的互补序列或非编码链的互补序列。在表示双链核酸时，具有SEQ ID No.x的核酸的互补序列，表示具有SEQ ID No.x的链的互补链或表示具有SEQ ID No.x互补链的核苷酸序列的任何核酸。在表示具有核苷酸序列SEQ ID No.x的单链核酸时，该核酸的互补序列是具有互补于SEQ ID No.x的序列的核苷酸序列的核酸。核苷酸序列和它的互补序列总是以5’至3’方向形式提供的。
术语“百分同一性”表示两种氨基酸序列或两种核苷酸序列之间的序列同一性。同一性可以分别通过比较每一个序列上的位置位点确定，可以为了比较目的而对所述序列进行比对。当比较中的序列上的等同位置被相同的碱基或氨基酸所占据时，所述分子在该位点上是相同的；当所述等同位点由相同的或相似的氨基酸残基(例如，在立体和/或电子性质方面类似)占据时，所述分子就可以被称作在所述位置上是同源的(相似)。同源性，相似性或同一性百分比的表述方式，表示由比较中的序列所共有的位置上相同或相似氨基酸的数量的函数。同源性，相似性或同一性百分比的表述方式，表示由比较中的序列所共有的位置上相同或相似氨基酸的数量的函数。可以使用各种比对算法和/或程序，包括FASTA，BLAST，或ENTREZ。FASTA和BLAST可以作为GCG序列分析软件包的一部分提供(University of Wisconsin，Madison，Wis.)，并且能够以诸如预设参数的形式使用。ENTREZ是从以下机构获得的National Center for Biotechnology Information，NationalLibrary of Medicine，National Institutes of Health，Bethesda，Md。在一种实施方案中，两种序列的百分同一性可以通过GCG程序测定，空位权重为1，例如，对每一个氨基酸空位进行加权，就如同它是一个单一氨基酸或者两种序列之间的核苷酸错配。
用于比对的其他技术披露于以下文献中Methods inEnzymology，vol.266Computer Methods for MacromolecularSequence Analysis(1996)，ed.Doolittle，AcademicPress，Inc.，a division of Harcourt Brace&Co.，San Diego，California，USA。比对程序优选允许将所述序列上的空位用于比对所述序列。Smith-Waterman是一种类型的算法，它允许在序列比对中存在空位。参见Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。另外，可以利用使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序比对序列。另一种检索方法使用MPSRCH软件，该软件在MASPAR计算机上运行。MPSRCH使用Smith-Waterman算法在大规模并列计算机上对序列进行评分。该方法提高了选出关系不密切的配对的能力，并且特别能承受小的空位和核苷酸序列错误。核酸编码的氨基酸序列可用于检索蛋白和DNA数据库。
具有各个序列的数据库披露于以下文献中Methods inEnzymology，ed.Doolittle，同上。数据库包括Genbank，EMBL，以及日本的DNA数据库(DDBJ)。
优选的核酸所具有的序列与在本发明的DNA序列之一中所示出的序列的核酸序列的同一性至少为70％，更优选80％，更优选90％，甚至更优选至少95％。当然，与本发明的DNA之一所示的核酸序列的同一性至少为90％，更优选95％，最优选至少大约98-99％的核酸也属于本发明的范围。在优选实施方案中，所述核酸是哺乳动物的。在将新的核酸与已知序列进行比较时，有若干种比对工具可供利用。其例子包括PileUp，它能产生多序列比对，并且披露于以下文献中Feng等，J.Mol.Evol.(1987)25351-360。另一种方法，GAP，采用披露于以下文献中的比对方法Needleman等，J.Mol.Biol.(1970)48443-453。GAP最适用于序列的总体比对。第三种方法，BestFit，通过插入空位，以便增加匹配数量而起作用，它采用了Smith和Waterman的局部同源性程序，Adv.Appl.Math.(1981)2482-489。
术语“多态性”表示一种以上形式的基因或它的部分(例如等位基因变体)的同时存在。存在至少两种不同形式的基因的一部分，即，两种不同的核苷酸序列被称作“基因的多态性区”。多态性区可以是一个核苷酸，它的身份在不同的等位基因之间不同。多态性区还可以具有几个核苷酸的长度。
“多态性基因”表示具有至少一个多态性区的基因。
在本文中，术语“启动子”表示能调控可操作地与所述启动子连接的特定DNA序列的表达的DNA序列，所述启动子能影响所述特定DNA序列在细胞中的表达。该术语包括“组织特异性”启动子，即只能在特殊细胞(例如，特殊组织的细胞)中实现所述特定DNA序列的表达。该术语还包括所谓的“渗露”启动子，它能调控特定DNA主要在一种组织中的表达，不过，也能导致在其他组织中的表达。该术语还包括非组织特异性启动子，以及组成型表达或诱导型表达(即表达水平可以控制)的启动子。
在这里，术语“蛋白”，“多肽”和“肽”，在用于表示基因产物时可以交互使用。
术语“多肽结合配偶体”或“多肽BP”表示与本发明的特定多肽结合的各种细胞蛋白。
术语“重组蛋白”表示通过重组DNA技术生产的本发明的多肽，其中，一般来说，将编码特定多肽的DNA插入合适的表达载体，再将该载体用于转化宿主细胞，以便生产所述异源蛋白。另外，短语“源于”在与特定重组基因组合使用时，表示在“重组蛋白”的含义范围内，所述蛋白具有特定天然多肽的氨基酸序列，或与它类似的氨基酸序列，它是通过天然存在形式的多肽的包括取代和缺失(包括截短)的突变产生的。
本文所使用的短语“肠胃外施用”和“以肠胃外形式施用”表示除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不局限于静脉内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眼眶内，心内，真皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊髓内，和胸骨内注射和输注。
本文所使用的短语“可以药用的”表示属于合理医学判断范围内的化合物，材料，组合物和/或剂型，它适用与人类和动物的组织接触，而又没有过高的毒性，刺激性，过敏反应，或其他问题或并发症，与合理的优点/风险比匹配。
本文所使用的短语“可以药用的载体”表示可以药用的材料，组合物或媒介物，如用于将主题化合物从一种器官，或身体的一部分携带或转移到所述身体的另一种器官或身体的一部分的液体或固体填料，稀释剂，赋形剂，或溶剂胶囊化材料。在与制剂的其他成分相容的含义内，每一种载体必须是“可接受的”，并且不会对患者造成损伤。可以用作可以药用的载体的材料的某些例子包括(1)糖类，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；(10)甘醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)Ringer′s溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)用于药物制剂的其他无毒相容性物质。
本文所使用的“小分子”表示组合物，它的分子量低于大约5kD，最优选低于大约4kD。小分子可以是核酸，肽，多肽，肽模拟物，碳水化合物，脂类，或其他有机(含碳)或无机分子。很多制药公司都具有化学和/或生物学混合物的广泛的文库，通常是真菌，细菌或藻类提取物，可以用本发明的任何测定方法筛选，以便鉴定能调节生物活性的化合物。
术语“干细胞”表示能够分化成多种类型谱系的细胞的多能细胞。
在本文中，术语“特异性杂交”或“特异性检测”表示本发明的核酸分子与脊椎动物基因，优选哺乳动物基因的至少大约6，12，20，30，50，100，150，200，300，350，400或425个连续的核苷酸杂交的能力。
本文所使用的短语“系统性施用”，“系统性地施用”，“外周施用”，和“外周地施用”表示化合物，药物或其他材料的施用不是直接施用到中枢神经系统，以便它能进入患者的系统，并因此进行代谢或其他类似过程，例如，皮下施用。
本文所使用的短语“治疗有效量”表示化合物，材料或包括本发明化合物的组合物的量，能够在动物的至少一个亚群的细胞中有效产生某些需要的治疗效果，所述动物具有适合任何医学治疗的合理的效益/风险比。
术语“转染的干细胞”表示业已通过本领域普通技术人员所熟知的逆转录病毒感染或其他方式，将外源DNA或外源DNA基因导入其中的干细胞。
术语“离体基因治疗”表示干细胞的体外转染或逆转录病毒感染，以便在将转染过的干细胞导入哺乳动物之前，形成转染过的干细胞。
“转录调控序列”是在本说明书中使用的通用名词，用于表示DNA序列，如启动信号，增强子和启动子。它们能诱导或控制可操作地与它们连接的蛋白编码序列的转录。在优选实施方案中，FasL基因之一的转录受启动子序列的控制(或受其他转录调控序列的控制)，它能控制重组基因在希望表达它的细胞类型中的表达。还可以理解的是，所述重组基因可以受转录调控序列的控制，该调控序列可以与控制天然存在形式的多肽的转录的序列相同或不同。
在本文中，术语“转染”表示诸如通过表达载体，以核酸介导的基因转移方式将核酸导入受体细胞。本文所使用的“转化”表示细胞基因型因为外源DNA或RNA的细胞摄取而导致改变的过程，并且，举例来说，转化过的细胞表达本发明的重组形式的多肽(例如，编码抗原或APC免疫刺激活性的基因)，或对于来自所述转移基因的反义表达来说，特定靶多肽的天然存在形式的表达受到破坏。
在本文中，术语“转基因”表示业已导入一种细胞的核酸序列(例如，编码肿瘤抗原或APC免疫刺激多肽，或它的反义转录物中的一种)。转基因可以是部分或完全异源的，即对于导入了所述转基因的转基因动物或细胞来说是外源的，或者与导入了所述转基因的转基因动物或细胞的内源基因同源。不过，它被设计成以如下形式插入动物的基因组，以便改变它插入的细胞的基因组(例如，它被插入与天然基因不同的位点或者它的插入导致了剔除)。转基因还能够以附加体的形式存在于细胞中。转基因可以包括一种或多种转录调控序列，以及任何其他核酸，如内含子，它们可能是特定核酸的最佳表达所必须的。
“转基因动物”表示任何动物，优选非人哺乳动物，鸟类或两栖类动物，其中，所述动物的一个或多个细胞包括通过人类干预方法，如通过本领域所熟知的转基因技术导入的异源核酸。通过精致的遗传学操作，如通过显微注射或用重组病毒感染，通过导入所述细胞的前体，将所述核酸直接或间接导入所述细胞。术语遗传学操作不包括传统的杂交，或者体外受精，相反，它涉及导入重组DNA分子。该分子可以整合在染色体内，或者它可以是染色体外复制的DNA。在本文所披露的典型转基因动物中，所述转基因能导致细胞表达用于本发明的重组形式的多肽之一，例如，激动或拮抗形式。不过，还涉及重组靶基因沉默的转基因动物，例如，下面所披露的FLP或CRE重组酶依赖型构建体。另外，“转基因动物”还包括这样的重组动物，其中，一个或多个靶基因的基因破坏，是通过人类干预引起的，包括重组和反义技术。
本文所使用的术语“治疗”意在包括治愈以及缓解状况或疾病的至少一种症状。
术语“载体”表示能够转运与它连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的优选载体是附加体，即能够进行染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/或表达与它连接的核酸的载体。能够指导与可操作地与它连接的基因表达的载体，在本文中被称作“表达载体”。一般，用于重组DNA技术中的表达载体通常是“质粒”形式的，它一般表示圆形双链DNA环，它们的载体形式不与所述染色体结合。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”是可以交互使用的，因为质粒是最常使用形式的载体。不过，本发明意在包括能够发挥相同作用，并且，随后为本领域所公知的其他形式的表达载体。
术语“野生型等位基因”表示一种基因的等位基因，当它以双拷贝形式存在于受试者体内时，会产生野生型表型。特定基因可能具有若干种不同的野生型等位基因，因为基因上的某些核苷酸改变可能不会影响具有带有所述核苷酸改变的双拷贝基因的受试者的表型。
4.3.疫苗本发明提供了疫苗，特别是癌(即肿瘤)疫苗，用于产生对组织或器官的普遍的系统性免疫应答(例如，受肿瘤转化影响的、并且表达能够由所述疫苗靶定的肿瘤细胞抗原的组织或器官)。用于疫苗技术的方法和组合物为本领域所公知，并且披露于以下文献中，例如，参见美国专利号6,511,667；6,503,503；6,500,435；6,488,934；6,488,926；6,479,056；6,472,375；6,455,492，6,432,925；和6,416,764，每一件专利的内容都被收作本文参考。当本发明提供了用于产生普遍的抗-肿瘤系统性免疫应答的肿瘤或癌疫苗时，用于肿瘤或癌疫苗技术的方法和组合物为本领域所公知，并且披露于以下文献中，例如，美国专利号6,458,585；6,432,925；6,344,198；6,338,853；6,377,195；6,316,256；6,168,946；6,106,829；6,080,722；5,993,829；5,861,494；5,786,204；5,750,102；5,733,748；5,705,151；5,478,556；5,290,551和5,030,621，每一件专利的内容都以它的全文形式收作本文参考。
一般，癌或肿瘤疫苗能够增强业已建立的肿瘤免疫性，并且与细胞因子治疗相比，对肿瘤具有更高的特异性，并且少有或没有毒性，因此，可以方便地与其他类型的免疫疗法组合(参见。它们还能引起免疫学记忆，它能检测肿瘤的复发。迄今为止，黑素瘤疫苗业已受到了最多的关注。在所使用的若干种癌疫苗中，包括完整细胞裂解物，如Melacine，半抗原处理的自体黑素瘤细胞(M-Vax)和辐射过的同种异体细胞(Cancer Vax)。业已用每一种制剂发现了对转移淋巴结的抑制。Melacine的受控制的实验，表明了患有切除的IIB期疾病的患者的存活时间的延长，特别是具有下面的HLA I类等位基因的一个或多个的患者HLA-A2或-A28(-A6802)，HLA-B12，-44或-45，和HLA-C3。干扰素-α2b和Melacine的组合，似乎能增强在晚期(IV期)疾病中的抗肿瘤反应，并且，在切除的III期疾病中的大型随机化控制实验中测试。辐射过的自体结肠癌疫苗在收控试验的切除的II期疾病(Dukes B)中具有改善了的无复发存活。第二代完整细胞疫苗包括掺入诸如GM-CSF或CD80(B7-1)的基因的疫苗，以便提高免疫原性，以及诸如大多价免疫原(LMI)的免疫原性细胞膜的使用。II类HLA分子的上调以及所述Ii分子的同时抑制，又被用作改善肿瘤相关抗原在疫苗中的呈递的方法。与含有诸如肽或神经结苷脂或明确定性的抗原的疫苗相比，复合的完整细胞衍生的疫苗具有临床上优越的反应；不过，明确定性的疫苗因为它们的可再现性在理论上可能更为理想。
癌治疗的目标是形成能特异性靶定癌细胞的形式，以便避免对正常组织的不必要的副作用。能导致激活专门针对由癌表达的蛋白的免疫系统的疫苗方法，具有为了这种目的而有效治疗的潜力。由我们的研究小组所开发的早期疫苗方法，涉及将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因(例如，参见GenBank保藏号NM000758和美国专利号5,641,663，所述文献的内容以它们的整体形式收作本文参考)插入癌细胞，然后将所述细胞用于对患者进行免疫。所述遗传学修饰过的肿瘤细胞能够在所述肿瘤细胞的局部环境中产生所述免疫激活蛋白GM-CSF，它能特异性地激活患者的T细胞，以便根除转移部位的癌。很多研究都以证实了这种疫苗能够治愈患有癌症的小鼠。该方法还能激活患有肾细胞癌并且有可能患有胰腺癌的患者的免疫应答(例如，参见Jaffee等(1999)Anny NY Acad Sci 88667-72)。
完整细胞肿瘤或癌疫苗的方法和组合物为本领域所公知(例如，有关综述参见Ward等(2002)Cancer Immunol Immunother2002 Sep；51(7)351-7)。简单地讲，完整肿瘤细胞可以产生有效的免疫性，尽管事实是所述免疫系统能够耐受某些肿瘤抗原，因为它们能够由正常组织表达，或者以没有共刺激的微刺激形式出现。肿瘤还可以产生免疫抑制分子，如IL-10，转化生长因子，和CD95L。耐受性的破坏和免疫抑制作用的克服可能需要有效的和特异性的免疫刺激。完整的肿瘤细胞能够提供所述抗原来源，不过诸如由免疫学佐剂提供的刺激的其他刺激，可能是克服肿瘤特异性T细胞无反应性的诱导所必须的。
业已证实了肿瘤细胞死亡，或通过治疗使肿瘤细胞死亡的过程在产生抗肿瘤抗原的免疫应答中是重要的。通常在组织重塑中出现的凋亡细胞死亡，通常被认为是免疫学上沉默的，或者甚至是免疫抑制性的。一种可能的例外是，当细胞程序死亡伴随着病毒感染或其他形式的应激时。相反，与感染相关或其他形式的应激相关的坏死性细胞死亡被认为是免疫刺激性的，能产生强的免疫应答，主要是I型-限制性交叉启动，以及促进Th1细胞。
辐射过的细胞通常是通过细胞程序死亡而死亡，因此，使用辐射过的完整肿瘤细胞作疫苗看上去可能是不理想的。不过，疫苗通常包括超过可以通过清除巨噬细胞处理的细胞数量，因此，疫苗细胞，特别是发生继发性坏死的疫苗细胞能够提供危险信号。因此，抗原能够被DC激发，以便启动T细胞。另外，该信号可以通过免疫学佐剂提供。在基于细胞的疫苗的其他支持证据中，最近的数据表明了细胞相关的抗原能比可溶性抗原高出50,000倍的效率交叉呈递给CD8+T细胞。
在每一位患者生产个性化完整肿瘤细胞疫苗的难度，导致了交叉反应性同种异体(MHC-异种类)细胞疫苗的开发。同种异体细胞疫苗的使用，将所述免疫应答划分成了两个阶段，因为在激发和效应物阶段，存在不同肿瘤细胞。研究业已表明，在鼠黑素瘤模型中，用同种异体K1735黑素瘤细胞对B6小鼠进行免疫，提供了对用同基因B16黑素瘤侵袭的显著的保护作用。这种保护作用不能通过疫苗细胞或某些其他佐剂的细胞因子转染而改善。它与它的同基因小鼠(C3H)模型中的K1735相反，其中，除非用GM-CSF转染，所述疫苗不能提供来自自体刺激的保护作用。因此，尽管作为自体疫苗K1735不是免疫原性的，作为同种异体疫苗它是相对免疫原性的。
同种异体肿瘤细胞作为疫苗可能是有利的，因为所述同种异体分子本身所提供的免疫刺激，能够增强所述免疫应答。这是因为能与同种异体分子(同种异体识别)交叉反应的宿主T细胞的较高的比例，导致了类似于宿主抗移植物相似的反应。因此，在所述免疫接种部位和二级淋巴组织中产生了增强的免疫刺激环境。通过B6脾细胞诱导趋化因子MCP-1可以进一步刺激APC浸润到所述疫苗部位，同时，所产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-)和IL-12具有诱导APC成熟和增强细胞介导的免疫的潜力。来自K1735接种过的小鼠的脾细胞通过产生IFN-对K1735作出反应，表明了Th1记忆反应。另外，同种异体肿瘤细胞能够在体内注射的部位诱导炎性细胞浸润。例如，用K1735细胞对B6小鼠进行皮下注射，导致了具有APC-样表面表型的细胞(II类MHC+，CD80+，CD86+)转运到所述注射部位(制备的原稿)。因此，同种异体分子似乎能提供免疫刺激信号，并且，事实上多种研究业已采用了针对癌的所述反应，例如，通过用编码同种异体MHC分子的基因原位转染肿瘤细胞。
业已提出了同种异体APC可能能够激发T细胞识别自体肿瘤上的抗原，或协助这一过程。不过，临床使用的大部分人类细胞疫苗是用GM-CSF转染的，以便增强肿瘤抗原交叉激发，而无论所述细胞是自体同源的或同种异体来源的。
简单地讲，由于免疫系统所固有的对多种肿瘤抗原的耐受性，需要其他免疫学刺激(例如GM-CSF生产)来克服这一障碍。所述其他刺激可能是免疫学佐剂形式的，或直接消除或克服所述免疫系统所固有的特殊调控限制。不过，人们似乎必须加以小心，并且寻求免疫刺激和对健康组织的潜在损伤之间的平衡。在人体上，所述免疫限制可能是更大的挑战，因为我们设计成防止复杂的自身免疫应答，即战胜复杂的病原体侵袭所需要的副产品。因此，尽管完整的肿瘤细胞似乎可能是活的和实际的人类癌疫苗，所述总体方案可能需要进一步进行免疫调节，以便使对患者的潜在的治疗益处最大。
4.3.1 DNA疫苗和相关的送递系统本发明还提供了将肿瘤抗原编码DNA导入受试者体内，以便产生T-细胞介导的免疫应答的方法。有多种这样的DNA疫苗送递系统为本领域所公知，并且在下文进行说明。免疫接种方法业已得到迅速发展(例如，有关综述参见Poland等(2002)BMJ 3241315-19)。基于DNA的免疫通过直接注射来自理想的靶抗原(例如，诸如肿瘤抗原的肿瘤特异性抗原)的工程产生的序列，提供了保护性免疫应答。将所述抗原插入表达载体(例如基于痘病毒或甲病毒的载体)。一旦送递到所述宿主体内，所插入的DNA可以进行有限的复制，并且产生感兴趣的蛋白，以便所述宿主产生针对所述蛋白的免疫应答。在它的最简单的形式下，裸露的DNA(例如，插入细菌质粒的DNA序列，并且直接注射到所述病毒体内，以便产生免疫应答。所述裸露的DNA疫苗可以通过肌内途径注射到人类肌肉组织中，或者通过经皮或皮内途径送递所述疫苗DNA。经皮送递用编码乙型肝炎表面抗原的DNA包被的微型金珠产生了预防性免疫应答-包括CD8细胞毒性淋巴细胞的产生(参见Poland等(2001)Fourth annual Conference on Vaccine Research，Arlington，VA，April 23-25S3757)(www.nfid.org/conferences/vaccine01-/abstracts/abss 37-40.pdf)。
本发明提供了上述送递系统以及本领域所公知的多种其他DNA疫苗送递系统，并且在下文举例说明。注射编码Ag的“裸露的”质粒DNA(PDNA)，导致了针对Ag的长期细胞和体液免疫应答(Wolff等(1992)Hum.Mol.Genet.1363)。如上文所述，通过肌内，真皮内，静脉内，和皮下途径施用质粒DNA，业已证实了成功的免疫作用。业已可再现性地证实了肌内注射质粒DNA，能引起长期免疫应答，这种免疫应答的特征在于合成特异性IgG Abs，以及有效产生CD8+细胞毒性T细胞和CD4+Th1细胞(参见Pardoll和Beckerleg(1995)Immunity3165)。例如，最新的结果业已表明了质粒DNA能够以附加体形式存在，而不复制，或掺入到宿主细胞基因组中。通过肌内基因送递，Hsu等(Hsu等(1996)Nature Med 2540)最近业已证实了用编码家庭尘螨过敏原(Der p 5)的p DNA肌内注射大鼠和小鼠，能预防IgE合成的诱导，组胺释放，和受到气溶胶化的过敏原侵袭的动物体内的气道高反应性。Raz等(Raz等(1996)PNAS USA 935141)证实了用编码β-gal的pDNA的真皮内免疫的β-半乳糖苷酶(β-gal)/明矾-激发的Balb/c小鼠，在6周时间内表现出β-gal特异性IgE的水平降低了66-75％。另外，该质粒DNA免疫应答，诱导了在β-gal/明矾-激发的小鼠体内的Th细胞分泌的特异性IgG2a，和IFN-γ。不过，尽管最近基于DNA的免疫在改变各种模型中IgE-和Th2-相关免疫应答方面最近取得了成功，所述预防性和/或治疗性潜力还远远没有搞清楚。例如，在针对癌性肿瘤的DNA疫苗的特定场合下，无法预测所述靶定抗原，甚至是肿瘤特异性的并且可用于免疫监督的抗原，在产生理想的抗肿瘤治疗效果方面是否有效。
可以对基因治疗载体进行改良，以便用于本发明中。最新的临床实验表明，可以获得有效的和安全的送递载体。病毒和逆转录病毒载体一直是体内基因转移的最有效的和常用的形式(例如，参见Xiang等(1996)Virology 219220以及下文)。不过，本发明还包括非病毒送递系统。所述系统可能具有诸如容易合成，细胞/组织靶向，低免疫应答，以及不受限制的质粒大小的潜在优点。
因此，在DNA疫苗应用中除了“基因枪”以外的迄今为止的一种有希望的非病毒基因送递系统包括由DNA和聚阳离子脂质体形成的离子复合物(例如，参见Caplen等(1995)Nature Med.139)。通过静电相互作用保持在一起的所述复合物，可能因为聚电解质在所述生物学流体中的电荷筛选作用而分离。一种强碱性脂类组合物能够稳定所述复合物，不过，所述脂类可能具有细胞毒性。
复合物团聚作用是自发的相分离过程，当两种带有相反电荷的聚电解质在水溶液中混合时会发生这种现象。这两种大分子之间的静电相互作用，导致了团聚物(富含聚合物的相)与上清液(少有聚合物的相)分离。可以利用这种现象形成微球体，并且将多种化合物包在里面。所述胶囊化过程可以完全在水溶液中进行，并且在低温下进行，并因此具有保持所述胶囊物质的生物活性的良好机会。在开发可注射的控制释放系统时，业已利用了明胶和硫酸软骨素的复合物团聚作用，以便将多种药物和蛋白胶囊化(参见Truong等(1995)Drug Delivery 2166)，并且业已将细胞因子包在所述微球体中用于癌免疫(参见Golumbek等(1993)Cancer Res 535841)。同样业已掺入了抗炎药物，以便对关节进行关节内送递，用于治疗骨关节炎(Brown等(1994)331290)。美国专利号6,193,970，5,861,159和5,759,582披露了将复合物团聚物用作本发明的DNA疫苗送递系统的组合物和方法。具体地讲，其内容被收作本文参考的美国专利号6,475,995，披露了采用核酸和聚阳离子的纳米颗粒团聚物的DNA疫苗送递系统，它在口服时，能用作有效的疫苗。该口服DNA疫苗送递系统，提供了本发明的特别优选的实施方案。
其他疫苗送递系统为本领域所公知和/或披露于以下美国专利中6,270,795；6,294,378；6,339,068；6,358,933；6,468,984；6,472,375；6,488,926；和6,500,432；所述专利的内容被收作本文参考。
4.4.1.细菌介导的DNA疫苗送递系统在特别优选的实施方案中，本发明提供了基于微生物(例如细菌)的送递系统，用于送递编码由所述DNA癌疫苗靶定的肿瘤抗原或其他肿瘤抗原的DNA。最近，业已对用活的细菌DNA疫苗载体进行抗原送递的用途进行了综述(Medina和Guzman(2001)Vaccine 191573-1580；Weiss和Chakraborty(2001)Current Opinion in Biotechnology12467-72；和Darji等(2000)FEMS Immunol and MedicalMicrobiology 27341-9)。
活的细菌疫苗载体的使用为本领域所公知，并且在本文中进一步地披露。另外，其内容被收作本文参考的美国专利号6,261,568和6,488,926，披露了可用于本发明DNA癌疫苗的特别有用的系统。
重要的是，活的细菌疫苗载体的使用可能是特别有利的。细菌介导的基因转移在通过肌内、真皮内，或口服质粒进行遗传学免疫时特别有利，它能导致在所述哺乳动物宿主中的抗原表达，从而提供抗原修饰以便免疫调节的可能性。另外，所述细菌介导的DNA疫苗提供了佐剂作用，以及靶定所述免疫系统的诱导部位的能力。在优选实施方案中，S.typhimurium，S.typhi，S.flexneri或单核细胞增生利斯特氏菌被用作transkingdom DNA疫苗送递的载体。
另外，活的疫苗载体可以利用细菌质粒的几乎不受限制的编码能力，以及细菌表达载体的广泛的可利用性，以便表达几乎所有的感兴趣的靶肿瘤抗原。细菌载体的使用还与其他重要优点相关，如常见直接粘膜送递的可利用性。其他直接粘膜送递系统(除了活的病毒或细菌疫苗载体之外)包括粘膜佐剂，病毒颗粒，ISCOMs，脂质体，微颗粒和转基因植物。该技术的其他优点是低的批量制备成本，在原型开发之后有利于技术的转化，较长的保质期和相对其他制剂(例如亚单位疫苗)领域的稳定性，容易施用以及低的送递成本。总之，所述优点使得该方法特别适合包括癌DNA疫苗的DNA疫苗项目。所述载体可操作地成为了亚单位重组疫苗的等同物。这又会促进在使用业已表征的载体时，在临床阶段促进抗原相关副作用的重要评估。
业已将减毒的和共生的微生物成功地用作疫苗抗原的载体。可用于本发明中的减毒粘膜病原体包括单核细胞增生利斯特氏菌，沙门氏菌，V.cholorae，志贺氏菌，分支杆菌，Y.enterocolitica，和炭疽杆菌。用于本发明的共生菌株包括S.gordonii，乳酸菌，和葡萄球菌。用于所述制剂中的载体菌株的背景，选择用于获得减毒作用的突变的类型，以及所述免疫原的内在特性可用于优化所引起的免疫应答的程度和质量。优化通过所述细菌载体刺激的免疫应答需要考虑的一般因素包括载体相关的因素，包括，载体的选择；特定的背景菌株，减毒突变和减毒的水平；减毒表型的稳定化和最佳剂量的确定。其他因素包括抗原相关因子，如抗原的内在特性；所述表达系统，抗原展示形式，以及重组表型的稳定化；调节分子的共同表达和免疫方案。对用于本发明的下面的细菌疫苗载体送递系统进行了扼要概述。
单核细胞增生利斯特氏菌除了作为生产组织亲嗜性免疫应答(例如，在肝脏中治疗肝肿瘤)的优选试剂之外，单核细胞增生利斯特氏菌可以被用作本发明DNA肿瘤/癌疫苗的送递工具。格兰氏阳性细菌单核细胞增生利斯特氏菌，能够侵入来自人类在内的多种动物的吞噬细胞和非吞噬细胞，并且能够在从液泡中内化到宿主细胞的细胞质中之后能够逃脱。在所述细胞质中，它通过募集所述宿主细胞细胞骨骼的成分而能够移动，并随后扩散到相邻的细胞中。
目前，有少量的保留了有效入侵宿主细胞的能力的单核细胞增生利斯特氏菌的营养缺陷型菌株可供利用。业已将一种菌株工程产生成包括自溶酶，它是细胞内激活的(Dietrich等(1998)Natur Biotechnol16181-5)。业已证实了用所述细菌可以将若干种报导基因或cDNAs转入鼠巨噬细胞细胞系。另外，证实了转入原代人树突细胞。为了进行体内转移，将具有GFP-编码质粒的细菌注射到小鼠和棉鼠的腹膜中。在几天之后从所述动物体内收获的细胞，产生了表达所述报导基因的巨噬细胞。
可以利用抗生素获得从单核细胞增生利斯特氏菌转移到宿主细胞中的表达质粒(即在合适的感染时间之后，将抗生素添加到所述培养物中，以便杀伤细胞内细菌)。在所述实验中成功地测试了来自各种物种的若干种细胞类型的表皮和内皮来源(参见Hense等(2001)CellMicrobiol 2001 3599-609)。对于某些细胞系来说，可以实现转移到超过10％的细胞中。宿主细胞的入侵以及重组细菌从吞噬体中的逃脱，是有效的质粒转移所必须的。
使用所述转移系统建立了所述质粒业已整合到所述宿主细胞基因组中的稳定转染体。整合率(即从瞬时转染的细胞可以获得多少稳定的克隆)为10-7至10-2(参见Dietrich等(1998)Nature Biotechnol16181-5和Hense等(2001)3599-609)。尽管这种大范围整合率的原因尚不清楚，它可能造成了潜在的安全性问题。附加体载体的使用可能提供了对这一问题的解决方案，并且甚至可能提高转移的效率。
重组大肠杆菌令人吃惊的是，大肠杆菌K12的实验室菌株也可用作哺乳动物细胞的转移载体。正如以前所披露的，对于S.flexneri来说，使用了营养缺陷型dapB突变体。因为野生型大肠杆菌K12不具备入侵性，将它与S.flexneri的有毒力的质粒一起转移。该质粒不仅能够感染上皮来源的哺乳动物，而且还有利于随后逃脱所述吞噬体。这种大肠杆菌能够将DNA转入真核细胞(参见Courvalin等(1995)3181207-12)。另外，业已制备了表达假结核椰尔森氏菌的侵染素基因的大肠杆菌。尽管所述细菌也能够入侵宿主细胞，但是它们不能从液泡中逸出；不过，发生了表达质粒的转移(参见Grillot-Courvalin(1998)NatBiotechnol 16862-66)。所述能同时表达侵染素和细胞内listeriolysin的细菌，在低的感染复数(MOI)下只表现出了中等增强的转移率。在仅获得了侵染素和同时获得了侵染素和listeriolysin的细菌之间，在高MOIs下，在转移率方面检测到很少(如果有的话)差别，这表明，所述实验室大肠杆菌K12具有产生了通过吞噬体膜将表达质粒转移到宿主细胞细胞核中的入口。
4.4亲嗜性炎性试剂概言之，本发明提供了免疫刺激剂(例如，诸如感染性细菌，病毒，和真菌的微生物)，它具有对要靶定的器官或组织的亲嗜性(例如，对于本发明的癌治疗剂和相关的方法来说，是受癌影响的器官或组织)。对特定器官或组织具有天然亲嗜性的诸如病毒，细菌，酵母或真菌的感染剂，适用于本发明的这一方面。另外，可以使用能够通过工程方法定位于特定器官或组织中的任何感染剂(例如，通过将存在于所述器官或组织上的受体的配体融合在所述生物的外被，衣壳或膜蛋白上，或者通过表面表达或者偶联在所述器官或组织所特有的抗体上)。工程生产具有组织亲嗜性的生物(例如细菌和病毒)的方法为本领域所公知，并且披露于以下文献中，例如，美国专利号6,514,722；6,475,482；6,472,368；6,462,070；6,440,419；6,428,788；6,428,771，6,416,960；6,410,517；6,399,575；6,379,699；6,339,070；6,331,524；6,329,501；6,261,787；6,261,544；6,252,058；6,251,392；6,221,647；6,214,622；6,080,849；6,071,890；6,004,554；5,965,132；5,863,538；5,855,866；5,851,527；5,820,859；5,776,427；和5,660,827，所述专利的内容被以它们的全文形式收作本文参考。
在特别优选的用途中，所述亲嗜性生物具有或者通过工程方法产生对存在于发展中的肿瘤团块中的新生血管内皮的亲嗜性。
在优选实施方案中，对所述亲嗜性试剂，例如细菌或病毒或真菌生物通过本领域所公知的克隆方法作进一步的基因工程产生，以便生产趋化因子，细胞因子，粘附分子或其他免疫性或炎性的其他激活剂(例如，参见，4.6节)(例如，参见Sanbrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEdition，Cold Spring Harbor Press)。
在本发明的方法中还涉及用于建立亲嗜性的其他方法(例如，通过物理方法将所述生物放入特定器官或组织中，如直接注射，经皮导管，手术，或闭合回路输注，其中，所述试剂具有天然的或工程产生的亲嗜性)，并且在下面作进一步的讨论(参见4.8和4.9节)。例如，所述试剂可以通过吸入送递定位于靶定的肺，以及通过摄取靶定胃肠道。
4.4.1亲嗜性细菌对一种或多种组织或器官具有天然亲嗜性的细菌为本领域所公知。并且，包括，但不局限于以下类型已知能影响血液(即菌血症)的细菌，包括凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，其他链球菌物种，肠球菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，肠杆菌，奇异变形杆菌，其他肠杆菌科，绿脓假单胞菌，其他假单胞菌物种，流感嗜血杆菌，脆弱拟杆菌。已知影响血液的其他细菌包括很多需氧和厌氧细菌。
能影响心脏(心内膜炎)的细菌的例子包括Viridans族链球菌，肠球菌，金黄色链球菌，假单胞菌。已知能影响心脏的其他细菌包括肺炎链球菌，HACEK族(嗜沫嗜血菌，放线杆菌，心杆菌，艾肯氏菌，金氏菌)，贝氏立克次体，鹦鹉热衣原体。
能影响假体瓣膜的细菌的例子包括凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色链球菌，肠球菌，棒状杆菌。已知能影响所述瓣膜的其他细菌是肺炎链球菌，龟分支杆菌。
能影响中枢神经系统(急性脑膜炎)的细菌的例子包括肺炎链球菌，奈瑟氏脑膜炎菌，流感嗜血杆菌，B族链球菌，单核细胞增生利斯特氏菌，大肠杆菌。已知能影响中枢神经系统的其他细菌是钩端螺旋体，金黄色葡萄球菌。能引起慢性脑膜炎的细菌的例子包括结核分支杆菌，诺卡氏菌，苍白密螺旋体。已知能引起慢性脑膜炎的其他细菌包括布氏疏螺旋体，布鲁氏菌，以及其他分支杆菌物种。
能引起脑脓肿的细菌的例子包括Viridans族链球菌，混合的厌氧菌(拟杆菌，梭杆菌，卟啉单胞菌，普雷沃氏菌，消化链球菌)，金黄色葡萄球菌。已知能引起脑脓肿的其他细菌是梭菌，嗜血菌，诺卡氏菌，肠杆菌科。
能引起腹内感染(自发性腹膜炎)的其他细菌的例子是大肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，肺炎链球菌，肠球菌。已知能引起腹内感染的其他细菌是金黄色链球菌，厌氧菌，淋病奈瑟氏菌，沙眼衣原体，结核分枝杆菌。
能引起继发性腹膜炎的其他细菌的例子有大肠杆菌，脆弱拟杆菌，其他肠厌氧菌，肠球菌，绿脓假单胞菌。已知能引起继发性腹膜炎的其他细菌有金黄色葡萄球菌，淋病奈瑟氏菌，结核分枝杆菌。
能引起与透析相关的腹膜炎的细菌的例子有凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，链球菌物种，棒状杆菌物种。已知能引起与透析相关的腹膜炎的其他细菌有大肠杆菌，克氏杆菌，肠杆菌，变形杆菌，假单胞菌。
能引起腹内脓肿的细菌的例子有脆弱拟杆菌类，大肠杆菌，肠球菌。已知能引起腹内脓肿的其他细菌有克氏杆菌，肠杆菌，变形杆菌，假单胞菌，金黄色葡萄球菌。
能影响上呼吸道(咽喉炎)的细菌的例子是A族链球菌。已知能影响上呼吸道的其他细菌有混合的厌氧菌(Vincent′s咽痛)，淋病奈瑟氏菌，白喉杆菌，溃疡棒状杆菌，Archanobacterium haemolyticum，肺炎支原体，小肠结肠耶尔森氏菌。
能引起气管支气管炎的细菌的例子包括肺炎支原体。
能引起外耳炎的细菌的例子有肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，粘膜炎莫拉氏菌，厌氧菌。已知能引起外耳炎/中耳炎的其他细菌是金黄色葡萄球菌，A族链球菌。
能引起鼻窦炎的细菌的例子有肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，粘膜炎莫拉氏菌，厌氧菌。已知能引起鼻窦炎的其他细菌的例子有金黄色链球菌，A族链球菌。
已知能引起会厌炎的细菌的例子有流感嗜血杆菌。已知能引起会厌炎的其他细菌的例子有肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，其他嗜血杆菌。
能感染下呼吸道(支气管炎)细菌的例子有肺炎支原体，百日咳博德特氏菌，衣原体。
能引起急性肺炎的细菌的例子有肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯氏菌，大肠杆菌，军团菌，绿脓假单胞菌，混合的厌氧菌，肺炎支原体，衣原体。已知能引起急性肺炎的其他细菌的例子有不动杆菌，粘膜炎莫拉氏菌，奈瑟氏脑膜炎菌，结核分支杆菌，其他分支杆菌，艾肯氏菌，弗朗西斯氏菌，诺卡氏菌，多杀巴斯德氏菌，类鼻疽假单胞菌，鼠疫耶尔森氏菌，贝氏立克次体，立克次氏体属，炭疽杆菌。
能引起慢性肺炎的细菌的例子有混合的厌氧菌，结核分枝杆菌，诺卡氏菌。已知能引起慢性肺炎的其他细菌的例子有放线菌，类鼻疽假单胞菌，分支杆菌物种。
能影响眼(结膜炎)的细菌的例子有肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌，流感嗜血菌(埃及嗜血菌)，淋病奈瑟氏菌，沙眼性衣原体。
能引起角膜炎的细菌的例子有金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌，摩拉克氏菌。已知能引起角膜炎的其他细菌的例子有Mycobacterium fortuitum-chelonae。
能引起眼内炎的细菌的例子有金黄色葡萄球菌，绿脓假单胞菌，芽孢杆菌物种。
能引起皮肤和软组织感染的细菌的例子有脓疱病-A族链球菌，金黄色葡萄球菌；疔疮和痈-金黄色葡萄球菌；甲沟炎-金黄色葡萄球菌，A族链球菌，绿脓假单胞菌，丹毒-A族链球菌；蜂窝织炎-A族链球菌，金黄色葡萄球菌，流感嗜血杆菌；引起坏死的蜂窝织炎和筋膜炎-A族链球菌，魏氏杆菌，其他梭菌，脆弱拟杆菌，其他革兰氏阴性厌氧菌，消化链球菌，肠杆菌科，绿脓假单胞菌；下疳样病变-苍白密螺旋体，杜氏嗜血菌。已知能引起下疳样病变的其他细菌有炭疽杆菌，土拉热弗朗西斯氏菌，溃疡分枝杆菌，海鱼分枝杆菌；由创伤，烧伤，叮咬等导致的伤口-包括多种生物，其中包括葡萄球菌，链球菌，肠杆菌科，假单胞菌科，和其他环境细菌。
能引起骨骼和关节的关节炎的细菌的例子包括金黄色葡萄球菌，淋病奈瑟氏菌，链球菌物种，流感嗜血杆菌。已知能引起关节炎的其他细菌的例子有布鲁氏菌，诺卡氏菌，分支杆菌物种。骨髓炎-金黄色链球菌，肠杆菌科(沙门氏菌，埃希氏菌，克氏杆菌，变形杆菌)，假单胞菌。已知能引起骨髓炎的其他细菌的例子有结核分枝杆菌，其他分枝杆菌，厌氧菌。与假肢-相关的感染包括金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌，链球菌。已知能引起与假肢-相关的感染的其他细菌有消化链球菌，混合的需氧革兰氏阴性细菌。
能影响尿道的细菌的例子包括引起膀胱炎的生物，如大肠杆菌，奇异变形杆菌，克氏杆菌，肠杆菌，假单胞菌，肠球菌，嗜沫葡萄球菌。已知能引起膀胱炎的其他细菌的例子有金黄色葡萄球菌，解脲棒杆菌，梭菌，脆弱拟杆菌，解脲尿支原体；肾盂肾炎-大肠杆菌，奇异变形杆菌，克氏杆菌，金黄色葡萄球菌。已知能引起肾盂肾炎的其他细菌有肠球菌，解脲棒杆菌。前列腺炎-大肠杆菌，克氏杆菌，肠杆菌，奇异变形菌，肠球菌。已知能引起前列腺炎的其他细菌的例子有淋病奈瑟氏菌。
能影响生殖器的细菌的例子包括能导致尿道炎的细菌-淋病奈瑟氏菌，沙眼衣原体。能引起生殖器尿道炎的其他细菌有解尿尿支原体，生殖道支原体。细菌性阴道炎(阴道炎)，受厌氧菌(例如，动弯杆菌，拟杆菌，消化链球菌)，并且可能受到阴道加德纳氏菌的协同感染。宫颈炎-淋病奈瑟氏菌，沙眼衣原体。已知能引起宫颈炎的其他细菌有放线菌，结核分支杆菌。生殖道溃疡-苍白密螺旋体，杜氏嗜血菌，沙眼衣原体(LGV)。已知能引起生殖道溃疡的其他细菌有放线菌，结核分支杆菌。
能引起胃肠道中毒(由食物中的毒素导致的疾病)细菌的例子金黄色葡萄球菌，蜡状芽孢杆菌，肉毒杆菌。感染-弯曲杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌，魏氏杆菌，肉毒杆菌(婴儿肉毒中毒)，霍乱弧菌，副溶血弧菌，蜡状芽孢杆菌。已知能引起感染的其他细菌有大肠杆菌(产肠毒素的，肠道入侵性的，肠道致病性的，肠道出血性的)。其他产毒素的肠杆菌科)，气单胞菌，邻单胞菌，小肠结肠耶尔森氏菌。胃炎-哈比特属。直肠炎-淋病奈瑟氏菌，沙眼衣原体，苍白密螺旋体。
单核细胞增生利斯特氏菌在本发明的特别优选的例子中，腹膜内注射单核细胞增生利斯特氏菌(优选具有HIV-gag减毒的细菌；参见Lieberman和Frankel(2002)Vaccine 202007-10；和Friedman等(2000)J Virol 749987-93)导致了该细菌对肝脏的亲嗜性定位(例如，用于增强肝脏肿瘤疫苗对肝癌的治疗)。
已知进入血流的大部分细菌，包括利斯特氏菌，通过系统性摄取机制被肝脏吸收并且被消除(有关综述参见Gregory和Wing(2002)JLeukoc Biol 72239-48)。利斯特氏菌在人体上感染的病理学一般是通过受污染的食物以流行和偶发形式发生的-胃肠道被认为是致病性利斯特氏菌生物进入宿主体内的主要部位(有关综述参见Vazquez-Boland等(2001)Clin Microbiol Rev 14584-640)。对于胃肠炎来说，感染的临床过程通常始于摄入受到严重污染的食物之后大约20小时，其中，对于入侵性疾病的温育时间来说通常更长，为大约20-30天。对于胃肠疾病和入侵性疾病来说，在动物上业已报导了类似的温育时间。
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，也是利斯特氏菌病的重大危险因素。在未怀孕的成年人中，AIDS是5-20％利斯特氏菌病的潜在的易染症状。与普通人群相比，据估计AIDS患者发生感染利斯特氏菌病的危险要高出300-1,000倍。不过，利斯特氏菌病仍然是与AIDS相关的感染关系不太密切的疾病，这可能是由于HIV感染患者所采取的预防性饮食措施(避免高危险食物)，他们有规律的接受的治疗或预防偶然感染的抗微生物治疗，以及HIV感染不会明显降低利斯特氏菌免疫的主要效应物的活性这些事实所导致的(先天免疫机制，以及CD8+T-细胞亚型)。
利斯特氏菌进入并且定居在宿主组织中，通常是通过穿过肠道屏障发生的。在到达肠道之前，所摄取的利斯特氏菌生物必须忍受胃的不利的环境。与未处理过的动物相比，对于甲氰咪胍处理过的实验动物来说，口服感染剂量较低，并且业已报导了抗酸试剂和H2-抑试剂的使用，是发生利斯特氏菌病的危险因素。这表明了胃肠的酸度能破坏随污染的食物一起摄入的大部分利斯特氏菌生物。
利斯特氏菌能在肝脏中繁殖。穿过肠道屏障的利斯特氏菌生物由淋巴或血管携带到肠系膜淋巴结，脾脏，和肝脏中。单核细胞增生利斯特氏菌定居在宿主组织中的最初步骤是迅速的。因此，与其他食物携带的病原体相比，在口腔接触之后产生有症状的系统性感染的单核细胞增生利斯特氏菌通常所需要的长的培养时间是令人困惑的，并且表明利斯特氏菌的宿主组织的定居涉及沉默的，亚临床的阶段，很多事件以及这些事件的潜在机制尚不清楚。
通过静脉内途径进行的实验性小鼠感染业已证实单核细胞增生利斯特氏菌能够由定居在脾脏和肝脏中的巨噬细胞迅速从血液中清除。大部分(90％)的细菌负荷积累在肝脏中，有可能被Kupffer细胞以正弦线形式捕获。所述定居的巨噬细胞杀伤了大部分摄取的细菌，正如通过体内消耗实验所证实的，导致了在感染之后前6个小时期间肝脏中活的细菌群体大小的降低。Kupffer细胞被认为通过诱导T细胞的抗原依赖型增殖和细胞因子的分泌，启动了抗利斯特氏菌免疫性的形成。并不是所有利斯特氏菌细胞都被组织巨噬细胞所破坏，并且存活的细菌在小鼠器官中开始生长，再用2-5天时间增加细菌数量。
细菌在肝脏中扩增的主要部位是肝细胞。这一发现业已导致了以下持有的观点的消失，即单核细胞增生利斯特氏菌的寄生性存活的主要宿主位点是巨噬细胞群体。在它的肠道转运并且由门或动脉血液携带之后，存在两种单核细胞增生利斯特氏菌进入肝脏实质的途径，通过Kupffer细胞，通过细胞到细胞的扩散，或通过在穿过窦的带孔的内皮细胞屏障之后直接从窦周隙入侵肝细胞。
实际上，业已证实了单核细胞增生利斯特氏菌能在体外有效入侵肝细胞。
来自受感染小鼠的肝脏组织的电子显微术，表明了单核细胞增生利斯特氏菌通过完整的细胞内感染周期进入肝细胞，包括激动蛋白型细胞间扩散。直接从肝细胞转移到肝细胞，会导致感染病灶的形成，其中，单核细胞增生利斯特氏菌通过肝脏实质扩散，而不会接触免疫系统的体液效应物。这能够解释为什么抗生素不能在抗利斯特氏菌免疫方面发挥主要作用。
利斯特氏菌还可以定居在妊娠的子宫和胚胎中。由利斯特氏菌导致的流产和死胎业已通过静脉内，口服，和呼吸道接种天然易感妊娠动物宿主，如绵羊，牛，兔和豚鼠，以及怀孕的小鼠和大鼠得到了实验性再现。这表明了单核细胞增生利斯特氏菌通过血液穿透胎盘屏障接触所述胚胎。在怀孕的小鼠中，血液携带的细菌首先入侵基蜕膜，然后进展到胎盘绒毛，在这里它们导致扩散性炎性浸润和坏死。巨噬细胞似乎已经从小鼠胚胎中排出，嗜中性粒细胞起着主要抗利斯特氏菌效应细胞群体的作用。使用纯合的突变小鼠，最近业已证实了集落刺激因子-1是嗜中性粒细胞到达基蜕膜上的感染病灶所必须的。这一过程是通过滋养层的嗜中性粒细胞化学引诱物合成诱导进行的。在人体中，胎盘感染的特征是多个小脓肿和局部坏死性绒毛炎。通过内皮屏障转运之后在滋养层中的定居，能使得所述细菌到达胎儿血液中，导致普遍性感染，以及随后胎儿在子宫中死亡或具有栗粒状脓毒肉芽肿损伤的严重感染新生儿的早产(上面所提到的肉芽肿婴儿败血症)。在怀孕期间，细胞介导的免疫性的降低可能在利斯特氏菌病发展中发挥重要作用。
利斯特氏菌还能够入侵脑。在人体中，利斯特氏菌对中枢神经系统的感染主要是以脑膜炎的形式出现的。不过，这种脑膜炎通常与在脑实质，特别是在脑干中感染性病灶的出现相关，这表明了单核细胞增生利斯特氏菌对神经组织具有亲嗜性。单核细胞增生利斯特氏菌对菱脑的神经亲嗜性和特殊的偏好，在反刍动物中表现的最为清楚，其中，与在人体中的情况不同，利斯特氏菌CNS感染主要是以原发性脑炎形式出现的。在这些动物中，感染的病灶局限于脑桥，延髓，和脊髓。尽管存在脑膜的炎性淋巴细胞或单核细胞浸润，这种状况是以脑过程的延长形式出现的，并且宏观损伤甚至可能不会出现，或者可能局限于基底区，中脑，和小脑。在反刍动物中，利斯特氏菌菱脑炎的特征是单侧颅神经麻痹，导致众所周知的转圈病综合症。在人体中，很少观察到原发性非脑膜性脑感染。不过，与在反刍动物中一样，它是以涉及菱脑的脑炎形式出现的。
利斯特氏菌脑膜脑炎中的脑病变在人体和动物中通常是典型的并且是非常相似的。它们包括炎性浸润的血管外周环，它包括单核细胞和分散的嗜中性粒细胞和淋巴细胞。在炎症的所述血管外周部位通常缺少细菌。细菌在这些病变中，在吞噬细胞中的数量相对较大，或者在坏死部位周围的脑实质中没有。在小鼠中用嗜中性粒细胞-特异性单克隆抗体进行的消耗实验，业已证实了嗜中性粒细胞在从脑中的感染病灶中消除单核细胞增生利斯特氏菌方面发挥关键作用。较不常见的是，细菌出现在天然和实验诱导的感染的神经原中。这一结果与培养的神经元的入侵是较为少见的事件这一事实吻合。不过，通过来自受感染的巨噬细胞或小神经胶质细胞的直接的细胞到细胞的扩散，能够在体外更有效地入侵神经原。
除了上文所述的HIV-gag减毒的利斯特氏菌之外，利斯特氏菌的减毒，可以通过用本领域已知的方法使已知的毒粒基因表达失活而实现(有关利斯特氏菌毒粒因子和基因组构和表达的综述参见Vazquez-Boland等(2001)Clin Microbiol Rev 14584-640)。
4.4.2亲嗜性病毒亲嗜性病毒的例子包括甲，乙，丙，丁和戊型肝炎，黄热病，和Epstein-Barr病毒，它们能感染肝脏；巨细胞病毒，单纯疱疹病毒，水痘和风疹病毒，这些病毒能感染新生儿或免疫损伤个体的肝脏；柯萨奇B病毒，它能感染心脏；巨细胞病毒，它能感染肾脏；柯萨奇B病毒(胸膜痛)，它能感染肌肉；巨细胞病毒和腮腺炎病毒，它能感染腺体；单纯疱疹病毒，腺病毒，麻疹，风疹，肠道病毒70和柯萨奇A24病毒，这些病毒能感染眼。
4.4.3.其他亲嗜性试剂本发明还提供了其他试剂，包括自然产生的或通过化学工程方法产生的靶定希望的肿瘤或器官的真菌和寄生生物，甚至是“无生命的”炎性试剂，包括小分子。
能感染特定组织导致表面真菌病的真菌的例子包括能感染皮肤的霉菌包括糠秕马拉色氏霉菌和Exophiala werneckii。
能感染特定组织和器官的寄生性生物的例子包括利什曼虫，它能感染骨髓；Acanthamoeba Naegleria，锥体虫和Angiostrongyluscantonensis，它们能感染中枢神经系统；利什曼虫，它能感染眼睛；痢疾阿米巴，贾第鞭毛虫，Cryptospridium，微粒子虫目，蛲虫和蠕虫，它们能感染肠道；痢疾阿米巴和利什曼虫，它们能感染肝脏和脾脏；卡氏肺囊虫，它能感染肺；旋毛虫和南美洲锥虫，它们能感染肌肉；盘尾丝虫和利什曼虫，它们能感染皮肤；和最后，阴道滴虫和埃及血吸虫，它们能感染泌尿生殖系统。
4.5核酸和多肽本发明提供了肿瘤抗原编码和免疫刺激-刺激因子编码(例如，细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)参见Genebank No.NM_000758和美国专利号5641663，以上文献的内容被收作本文参考)和其他核酸，它们的同源物，以及它们的蛋白，以及它们所编码的多肽。优选的核酸的序列与目标基因的核苷酸序列的同源性至少为大约60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，更优选85％，更优选90％，更优选至少99％，例如，肿瘤抗原编码基因核酸与本发明的主题核酸之一或它的互补序列的核酸序列的同一性至少为90％，更优选95％，最优选至少大约98-99％，所述核酸也属于本发明的范围。在优选实施方案中，所述核酸是哺乳动物的，并且在特别优选的实施方案中，包括相当于与所述主题肿瘤抗原编码DNAs的编码序列相应的核苷酸序列的全部或一部分。
本发明还涉及包括编码肿瘤抗原多肽的核苷酸序列的核酸，所述核酸的变体和/或等同物。术语等同物被理解成包括编码具有诸如本文所披露的肿瘤抗原蛋白活性的功能性等同肿瘤抗原多肽或功能性等同肽的核苷酸序列。等同的核苷酸序列包括相差一个或多个核苷酸取代，添加或缺失的序列，如等位基因变体；并因此包括由于遗传密码的简并性而产生的与诸如相应的肿瘤抗原基因GenBank条目的核苷酸序列不同的序列。
优选的核酸是脊椎动物肿瘤抗原核酸。特别优选的脊椎动物肿瘤抗原核酸是哺乳动物的。无论是什么物种，特别优选的肿瘤抗原核酸编码的多肽与脊椎动物肿瘤抗原蛋白的氨基酸序列具有至少60％，65％，70％，72％，74％，76％，78％，80％，90％，或95％的相似性或同一性。在一种实施方案中，所述核酸是编码具有目标肿瘤抗原多肽或APC-刺激因子的至少一种生物活性的多肽的cDNA。所述核酸优选包括相当于由GenBank提供的所述核酸的核苷酸序列的全部或一部分。
本发明的另一种优选的核酸编码肿瘤抗原编码多肽，它包括至少2，5，10，25，50，100，150或200个氨基酸残基。例如，所述核酸可以包括大约50，60，70，80，90，或100个碱基对。本发明的范围还包括用作探针/引物或反义分子(即非编码核酸分子)的核酸分子，它们的长度可以包括至少大约6，12，20，30，50，60，70，80，90或100个碱基对。
本发明的另一方面提供了能够在严格条件下与由本发明的任意主题核酸所表示的核酸杂交的核酸。能促进DNA杂交的合适的严格条件为本领域技术人员所公知，或者可以从以下文献中查阅到CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，或者Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)，例如，6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，大约45℃，然后在50℃下，用2.0×SSC洗涤。例如，在所述洗涤步骤中的盐的浓度，可以在从50℃下的大约2.0×SSC的低严格性至在50℃下的大约0.2×SSC的高严格性中选择。另外，所述洗涤步骤中的温度，可以从大约22℃的室温下的低严格条件，提高到大约65℃的高严格条件。温度和盐的浓度都可以改变，或者温度或盐的浓度保持稳定，而改变其他变量。在优选实施方案中，本发明的肿瘤抗原核酸，可以在中等严格条件下，例如在大约2.0×SSC和大约40℃的条件下，与主题SEQ ID Nos.之一或它的互补序列结合。在特别优选的实施方案中，本发明的肿瘤抗原编码核酸，能在高严格条件下与图8A或9A的核酸序列之一或它的互补序列结合。在另一种特别优选的实施方案中，本发明的肿瘤抗原编码核酸，能在高严格条件下结合相当于肿瘤抗原编码ORF核酸序列的本发明的核酸之一。
本发明的范围还包括由于遗传密码的简并性而具有不同于在本发明的核酸之一或它的互补序列中所示出的核苷酸序列的序列。所述核酸能编码功能性等同肽(即具有肿瘤抗原-编码多肽的生物学活性的肽)，不过，由于遗传密码的简并性，在序列上与序列表中所示出的序列不同。例如，通过一种以上的三联体设计了多种氨基酸。确定相同的氨基酸的密码子或同义密码子(例如，各自编码组氨酸的CAU和CAC)可以导致“沉默”突变，这种突变不会影响肿瘤抗原多肽的氨基酸序列。不过，预计会导致目标肿瘤抗原多肽的氨基酸序列改变的DNA序列多态性，会存在于哺乳动物中。本领域技术人员可以理解的是，由于天然等位基因变异，编码具有肿瘤抗原编码多肽活性的多肽的核酸的一个或多个核苷酸(例如，高达所述核苷酸的3-5％)的变异可以存在于特定物种的个体中。
4.5.1探针和引物由来自哺乳动物生物的肿瘤抗原基因的克隆确定的核苷酸序列，能够进一步制备探针和引物，设计这些探针和引物是为了用于在其他细胞类型，如来自其它组织的细胞中鉴定和/或克隆其他肿瘤抗原同源物，以及来自其他哺乳动物生物的肿瘤抗原同源物。例如，本发明还提供了包括基本上纯化的寡核苷酸的探针/引物，所述寡核苷酸包括一段核苷酸序列，它能在严格条件下与选自本发明的核酸(例如肿瘤抗原编码核酸)之一的有义或反义序列的至少大约12，优选25，更优选40，50或75个连续的核苷酸杂交。
在优选实施方案中，将所述肿瘤抗原引物设计成能优化特异性，并且避免会影响激发效率的二级结构。本发明的优化的PCR引物被设计成，使“上游”和“下游”引物具有大致相同的解链温度，例如，可以使用以下公式估算Tm＝81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)；或Tm(℃)＝2(A/T)+4(G/C)。优化的肿瘤抗原引物还可以通过使用各种程序设计，如由WhiteheadInstitute for Bi提供的“Primer3”。
同样，可以将基于目标肿瘤抗原序列的探针用于检测编码相同的或同源的蛋白的转录物或基因组序列，以便用于，例如，预后或诊断测定(将在下面进一步说明)。本发明提供了肿瘤抗原转录物的可变剪接变体的通用探针，如相当于与存在于本发明的任何基因序列上的序列互补的至少12个连续核苷酸的探针。另外，本发明提供了能够特异性地与所述肿瘤抗原转录物的可变剪接形式杂交的探针。可以制备并且修饰探针和引物，例如，正如本文前面结合其他类型的核酸所披露的。
4.5.2.抗原本发明提供了用于本发明的抗原和肿瘤抗原以及肿瘤抗原表达基因，正如下文所披露的。
当由转导的表达载体编码的抗原是病原体抗原时，如细菌或病毒肿瘤抗原，本发明可以治疗和预防传染性疾病，即用于传统的DNA疫苗用途。用于本发明这一方面的各种病原体抗原为本领域所公知，并且可以通过使用诸如标准克隆技术和/或由GenBank和其他来源提供的多肽序列信息(例如，参见www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)获得。
用于本发明的典型的病原体抗原包括乙型肝炎肿瘤抗原(例如，HBcAg或乙型肝炎病毒(HBV)的核心蛋白的分泌形式HBeAg，例如，参见Kuhrober(1997)Int Immunol 91203-12)，用于治疗和预防乙型肝炎感染；结核抗原，用于治疗和预防结核(例如，参见Montgomery(2000)Brief Bioinform 1289-96)；用于治疗和预防HIV感染的HIV肿瘤抗原(例如gp160)(例如，参见Schultz等(2000)Intervirology 43197-217)；以及广义的布氏疏螺旋体抗原(例如，其他表面脂蛋白A(OspA))，用于治疗和预防莱姆病(例如，参见Simon等(1999)Zentralbl Bakteriol 289690-5)。另外，细菌基因组的测序以及随后表面暴露的微生物结构的鉴定及它们在致病性物种的天然群体中的保守性，使得能够迅速鉴定用于本发明的很多其他病原体抗原的激发候选物(例如，参见Saunder和Moxon(1998)Curr OpinBiotechnol 9618-23)。
当由转导的表达载体编码的抗原是肿瘤抗原时，本发明可以治疗癌症——例如，转移性肝脏肿瘤。用于本发明这一方面的多种肿瘤抗原为本领域所公知，并且可以通过诸如标准克隆技术和/或在GenBank和其他来源中提供的核酸和多肽序列信息(例如，参见www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)获得。
用于本发明的典型的肿瘤抗原包括前列腺特异性膜肿瘤抗原(PSMA)，用于治疗前列腺癌(例如，参见Mincheff等(2000)Eur Urol38208-17)；用于治疗乳腺癌的HER2/neu基因肿瘤抗原(例如，参见Lachman等(2001)Cancer Gene Ther 8259-68)；用于治疗B-细胞恶性肿瘤的独特型免疫球蛋白序列(例如，参见Stevenson等(2001)Ann Hematol 80 suppl 3B132-4)；用于治疗T细胞恶性肿瘤的独特型T细胞受体肿瘤抗原(例如，参见Reddy等(2001)Ann NY Acad Scie94197-105)；用于治疗SV40表达肿瘤的SV40肿瘤抗原(例如，参见Watts等(2000)Dev Biol(Basel)104143-7)；和用于治疗癌的癌胚肿瘤抗原(CEA)和CD40配体肿瘤抗原(例如，参见Xiang等(2001)JImmunol 1674560-5)。
还包括用于增强对所述肿瘤抗原的免疫应答的所述肿瘤抗原与肿瘤抗原多肽(例如，破伤风毒素多肽，例如，参见Stevenson等(2001)Ann Hematol 80 suppl 3B132-4)的融合体。
4.6.GM-CSF和其他免疫激动剂在某些实施方案中，例如，在与基因工程的完整肿瘤细胞疫苗结合时，本发明提供了用于和本发明的疫苗和亲嗜性试剂组合使用的免疫激动剂。各种细胞因子和其他分子可以刺激树突细胞或其他肿瘤抗原呈递细胞的生长，分化，转移和激活，并且还能加强树突细胞诱导，并且增强T细胞对肿瘤抗原呈递的应答的能力。例如，参见Banchereau J等，“树突细胞和免疫的控制”，Nature(1998)392245-52；YoungJW等，“树突细胞的造血发育骨髓样分化的特殊通道”Stem Cells，(1996)14376-387；Ce11a M等，“树突细胞的起源，成熟和肿瘤抗原呈递功能”，Curr Opin Immunol.(1997)910-16；Curti A等，“来自造血CD34+祖细胞的树突细胞分化”，J.Biol.Regul.Homeost.试剂(2001)1549-52。可以调节树突细胞或其他肿瘤抗原呈递细胞的分化，成熟，扩增或激活的分子的例子包括配体，如CD40配体，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，FMS-样受体酪氨酸激酶3配体(Flt3配体，FL)，白介素(IL)1-α，IL1-β，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12，IL-13，IL-15，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，干细胞因子(SCF，又被称作试剂盒配体，KL，Steel因子，SF，SLF，和肥大细胞生长因子MGF)，肿瘤坏死因子(TNF)-相关的激活-诱导的细胞因子(TRANCE)，以及肿瘤坏死因子-相关的细胞程序死亡诱导的配体(TRAIL)，以及转化生长因子β1。具有由上述任意分子所产生的一种或多种活性的融合蛋白，也可用于调节树突细胞或其他肿瘤抗原呈递细胞的分化，成熟，扩增，或激活。所述任何配体，融合蛋白，或其他分子都能够以载体表达系统中的第二基因表达盒的形式编码。
业已报导了CD40配体能促进树突细胞的诱导，并且有利于免疫应答的发展。例如，参见Borges L等，“fms-样酪氨酸激酶3配体和CD40配体在诱导树突细胞和体内产生抗肿瘤免疫性方面的协同作用”，JImmunol.(1999)1631289-1297；Grewal I，Flavell R.“CD40配体。位于免疫世界的中心？”Immunol Res.(1997)1659-70。以试剂，组合物，和使用方法的形式(授予Armitage等的美国专利号6,290,972)披露了编码CD40配体和等同物的典型核酸(例如，参见Genbank保藏号X65453和L07414)。
业已报导了GM-CSF(有关编码GM-CSF和等同物的典型的核酸参见，例如，Genbank保藏号X03020，X03019，X03221，E02975，E02287，E01817，E00951，E00950，A20083，A11763，和X03021)能调节树突细胞和其他肿瘤抗原呈递细胞的动员，分化，扩增，和激活。例如，参见Arpinati M等，“动员T辅助2-诱导树突细胞的粒细胞-集落刺激因子”，Blood.(2000)95(8)2484-2490；Pulendran B等，“在体内移动独特的人树突细胞亚型的Flt3-配体和粒细胞集落刺激因子”，J Immunol.(2000)165(1)566-572；sallusto F，LanzavecchiaA，“通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4保持培养的人类树突细胞对可溶性肿瘤抗原的有效呈递，并且通过肿瘤坏死因子α下调”，J Exp Med(1994)182389-400；Szabolcs P等，“在用c-试剂盒配体，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，和TNF-α培养的人CD34+骨髓前体的骨髓样后代中免疫刺激树突细胞的扩增”，JImmunol(1995)1545851-61；Caux C等，“肿瘤坏死因子α能有效加强人类CD34+造血祖细胞的白介素-3和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子-诱导的增殖”，Blood(1990)752292-8。披露了编码GM-CSF的典型核酸的组合物，试剂，生产和使用方法，类似物，融合体，以及等同物，例如，参见以下美国专利5,641,663，5,908,763，5,891,429，5,393,870，5,073,627，5,359,035，以及外国专利文献JP1991155798，JP1990076596，JP1989020097，GB2212160，EP0352707，EP0228018和WO8504188)。
业已披露了Flt3配体能调节树突细胞和其他肿瘤抗原呈递细胞的动员，诱导，和增殖。例如，参见Pulendran B等，“能在体内转移独特的人树突细胞亚型的Flt3-配体和粒细胞集落刺激因子”，J Immunol.(2000)165(1)566-572；Borges L等，“FMS-样酪氨酸激酶3配体和CD40配体在诱导树突细胞和在体内产生抗肿瘤免疫性方面的协同作用”，J Immunol(1999)1631289-1297；Lebsack M等，“Flt3配体在健康自愿者体内的安全性”Blood(1997)90(Abstract 751)170a；Lyman SD，Flt3配体的生物学作用和潜在的临床应用。Curr OpinHematol.(1998)5(3)192-196；Maraskovsky E等，“在Flt3配体-处理的小鼠中功能性成熟树突细胞数量的显著增加鉴定的多树突细胞亚群体”，J Exp Med(1996)1841953-62；Strobl H等，“Flt3-配体与转化生长因子β1配合能加强朗氏类型的树突细胞的体外发育，并且，能在无血清条件下形成单细胞树突细胞团”，Blood(1997)1425-34。披露了编码Flt3配体和等同物的典型的核酸，例如，参见Genbank保藏号NM013520，L23636，U04807，U44024，U29875，U03858，U29874，和U04806)。例如，试剂，组合物，和使用方法披露于以下美国专利中6,291,661，5,843,423，和5,554,512。
例如，编码IL-12和等同物的典型核酸披露于Genbank保藏号AF401989，AF411293，AF180563，AF180562，AF101062，AY008847，XM084136，M65271，AF050083，XM004011，M86672，NM008351，M86671，和NM008352中，以及披露于授予Scott等的美国专利号5,723,127中。
业已发现TNF-α能影响树突细胞增殖和发育的多个方面。例如，参见Szabolcs P等，“在用c-试剂盒配体，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，和TNF-α培养的人CD34+骨髓前体的骨髓样后代中免疫刺激树突细胞的扩增”，J Immunol(1995)1545851-61；Caux C等，“肿瘤坏死因子α能有效加强白介素-3和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子-诱导的人CD34+造血祖细胞的增殖”，Blood(1990)752292-8；Chen B等，“肿瘤坏死因子在调节外周血衍生的，细胞因子驱动的人树突细胞的数量方面的作用，及其在提高树突细胞在体外给CD4+T细胞呈递可溶性肿瘤抗原方面的质量方面的作用”，Blood.(1998)91(12)4652-4661。披露了编码TNF-α和等同物的典型的核酸，例如，参见Genbank保藏号X01394，A21522，NM_013693，M20155，M38296和M11731，以及参见美国专利号4,677,063，4,677,064，4,677,197和5,298,407。
业已报导了TRANCE能提高树突细胞存活和免疫刺激特性。例如，参见Josien F等，“TRANCE，能增加DCs在体内的寿命和佐剂特性的肿瘤坏死因子家族成员”，J Exp Med 2000；191(3)495-502。披露了编码TRANCE和等同物的典型的核酸，例如，参见Genbank保藏号NM_011613，AF013170，NM_033012，NM_003701，AF053712，AF013171和AB037599，以及美国专利号6,242,586。
业已证实了TRAIL能促进树突细胞导致肿瘤细胞目标的细胞程序死亡的能力。例如，参见Fanger NA，Malis zewski CR，Schooley K，Griffith TS。通过肿瘤坏死因子相关的细胞程序死亡诱导配体(TRAIL)由人类树突细胞介导的细胞程序死亡，J Exp Med.1999；190(8)1155-1164。披露了编码TRAIL和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号U37518，NM_003810 XM_045049，U37522，NM_009425，和AB052771以及美国专利号5,763,223。
披露了编码GM-CSF和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号M17706，X03655，X03438，X03656，M13926，NM_009971，和X05402，以及美国专利号4,810,643，和以下外国专利文献WO-A-8702060，WO-A-8604605，和WO-A-8604506。
披露了编码IL-4和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号NM_000589，M13982，X81851，AF395008，M23442，NM_021283，M25892，X05064，X05253和X05252，以及美国专利号5,017,691。还可参见Tarte K，Klein B，基于树突细胞的疫苗用于癌免疫治疗的有希望的方法，Leukemia，1999；13653-663。
业已证实了c-试剂盒配体能支持树突细胞的繁殖和长期保持，特别是与其他因子协同作用。例如，参见Szabolcs P等，“用c-试剂盒配体，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，和TNF-α培养的人CD34+骨髓前体的骨髓样后代中免疫刺激树突细胞的扩增”，JImmunol.(1995)154-5851-61。披露了编码试剂盒配体和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号AF400437，AF400436，M59964，M59964，NM_000899，NM_003994，和U44725，以及美国专利号6,001,803和5,525,708。
披露了编码IL-13和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号NM_002188，X69079，L06801，U10307，AF377331，NM_008355，L13028，和M23504，以及美国专利号5,652,123和5,696,234。
披露了编码IL-1a和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号NM_000575，M28983，X02531，M15329，AF010237，NM_013598，M57647和X68989，以及美国专利号5,371,204，5,008,374，5,017,692和5,756,675。
披露了编码IL-1β和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号X02532，M15330，和M15840，以及美国专利号5,286,847和5,047,505。
披露了编码IL-6和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号Y00081，X04602，M54894，M38669，和M14584，以及美国专利号5,338,834。
披露了编码IL-15和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号U14407，NM_000585，X91233，Z38000，X94222，Y09908，U14332，NM_008357，和AF038164，以及美国专利号5,747,024。
披露了编码TGF-β1和等同物的典型核酸，例如，参见Genbank保藏号M38449，M55656，X05839，Y00112，X02812，J05114，AJ009862，M13177，和BC013738。例如，还可参见Strobl H等，“Flt3-配体与转化生长因子β1配合能加强朗氏型树突细胞的体外发育，并且能在无血清条件下形成单细胞树突细胞团”，Blood(1997)901425-34，Borkowsky TA等，“内源转化生长因子β1在朗氏细胞生物学中的作用转化生长因子β1无效小鼠的皮肤缺乏上皮朗氏细胞”，J.Exp.Med.(1996)1844520-30。
编码能阻断抑制信号的分子的核酸也可以作为基因2包含在表达载体上。可以通过以典型表达载体上的基因2编码的拮抗剂形式阻断的抑制受体的例子是血管内皮细胞生长因子受体。例如，参见Gabrilovich D，“血管内皮细胞生长因子能抑制树突细胞发育并且明显影响多种造血细胞系在体内的分化”，Blood 1998；924150-66。
已知很多上述配体能彼此协同起作用，正如在上面所引用的文献中所披露的。因此，本发明的主题还涉及包括三顺反子构建体的表达载体实施方案，所述构建体具有包括受肿瘤抗原呈递细胞特异性启动子控制的肿瘤抗原基因的第一基因表达盒，包括能刺激肿瘤抗原呈递细胞分化，成熟，扩增，或激活的因子基因的第二基因表达盒，以及包括能刺激肿瘤抗原呈递细胞分化，成熟，扩增或激活的因子基因的第三基因表达盒，其中，所述第二和第三基因表达盒可以是编码能调节树突细胞或其他肿瘤抗原呈递细胞的分化，成熟，扩增或激活的典型分子或它们的等同物的典型核酸或它们的等同物的任意组合。
4.7载体本发明还提供了编码肿瘤抗原或免疫刺激蛋白的质粒和载体，可将它用于在宿主细胞中表达所述肿瘤抗原或免疫刺激蛋白。所述宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。因此，源于哺乳动物肿瘤抗原蛋白克隆的核酸序列编码全长蛋白的全部或特定部分，可以通过微生物或真核细胞方法，将它用于生产重组形式的肿瘤抗原多肽。将所述多核苷酸序列连接到诸如表达载体的基因构建体上，并且转化或转染到宿主中，所述宿主是真核(酵母，鸟类，昆虫或哺乳动物)或原核(细菌)细胞，这种方法是本领域所熟知的标准方法。
通常，用于体内或体外表达肿瘤抗原蛋白的表达载体，包括编码肿瘤抗原多肽的核酸，它可操作地与至少一个转录调控序列连接。调控序列是本领域所公知的，并且进行选择，以便指导所述目标蛋白以需要的方式(时间和地点)表达。转录调控序列披露于以下文献中Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)。
适合肿瘤抗原多肽表达的载体包括以下类型的质粒pBR322-衍生的质粒，pEMBL-衍生的质粒，pEX-衍生的质粒，pBTac-衍生的质粒和pUC-衍生的质粒，用于在诸如大肠杆菌的原核细胞中表达。
优选的哺乳动物表达载体包括两种原核序列，以便有利于所述载体在细菌中繁殖，并且，包括一个或多个在真核细胞中表达的真核转录单位。pcDNAI/amp，pcDNAI/neo，pRc/CMV，pSV2gpt，pSV2neo，pSV2-dhfr，pTk2，pRSVneo，pMSG，pSVT7，pko-neo和pHyg衍生的载体是适合转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。上述某些载体是用来自诸如pBR322的细菌质粒的序列修饰过的，以便有利于在原核和真核细胞中的复制和抗药性筛选。另外，诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)，或Epstein-Barr病毒(pHEBo，pREP-衍生的和p205)的病毒的衍生物可用于在真核细胞中瞬时表达蛋白。用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法为本领域所熟知。有关原核细胞和真核细胞的其他合适的表达系统，以及通用的重组方法可以参见以下文献Molecular Cloning ALaboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)第16和17章。
在优选实施方案中，所述启动子是组成型启动子，例如，强病毒启动子，例如CMV启动子。所述启动子还可以是细胞-或组织-特异性的，它能允许所述DNA只在预定的细胞中显著表达，例如，在专业肿瘤抗原呈递细胞中表达，如对成纤维细胞，或平滑肌细胞，视网膜细胞或RPE细胞特异的启动子。例如，平滑肌特异性启动子是平滑肌细胞标记SM22α的启动子(Akyura等，(2000)Mol Med 6983)。例如，视网膜色素上皮细胞特异性启动子是Rpe65基因的启动子(Boulanger等(2000)J Biol Chem 27531274)。所述启动子还可以是诱导型启动子，例如，金属硫蛋白启动子。其他诱导型启动子包括受转录因子的诱导性结合或激活控制的启动子，例如在Grabtree等的美国专利号5,869,337和5,830,462中所披露的，以上专利披露了小分子诱导型基因表达(遗传学开关)；国际专利申请PCT/US94/01617，PCT/US9510591，PCT/US96/09948等以及在由Bujard等所报导的其他异源转录系统中，如参与基于四环素的调控的系统，一般被称作别构“断开开关”，它披露于以下文献中Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)895547)，以及Bujard等的美国专利5,464,758；5,650,298；和5,589,362。其他诱导型转录系统涉及甾醇或其他基于激素的调控。
本发明的多核苷酸与所有必须的转录和翻译控制序列，在本文被称作“本发明的构建体”或“本发明的转基因”。
本发明的多核苷酸还可以导入所述细胞中，其中，它与编码另一种试剂的另一种DNA序列(它们可以存在于与本发明的多核苷酸相同或不同的DNA分子上)一起表达。下面进一步披露了典型的试剂。在一种实施方案中，所述DNA编码转录所述DNA的聚合酶，并且，可以包括所述聚合酶的识别位点，并且，可注射的制剂可以包括起始数量的所述聚合酶。
在某些场合下，可以将所述多核苷酸翻译有限的时间是优选的，以便所述多肽送递是暂时的。例如，这一目的可以通过使用诱导型启动子实现。
用于本发明的多核苷酸还可以部分或全部通过化学合成生产，例如，通过披露于以下文献中的亚磷酰胺方法Beaucage和Carruthers，Tetra.Letts.，221859-1862(1981)或根据披露于以下文献中的方法的三酯方法Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，1033185(1981)，并且，可以在商业化自动寡核苷酸合成仪上进行。双链片段可以用化学合成的单链产物获得，包括合成所述互补链，并且在合适的条件下让所述链一起退火，或者通过使用DNA聚合酶用合适的引物序列添加所述互补链。
可操作地与必须的转录和翻译调控元件连接的本发明的多核苷酸，能够以裸露DNA的形式注射到受试者体内。在优选实施方案中，本发明的多核苷酸以及必须的调控元件存在于质粒或载体上。因此，本发明的多核苷酸可以是DNA，它本身是非复制的，而是被插入质粒，它还可以包括复制子。所述DNA可以是工程产生的序列，以便不会整合到所述宿主细胞基因组中。
用于本发明的优选载体是表达载体，即能够在细胞载体中表达核酸的载体。优选的表达载体是这样的载体，它包括两种原核序列，以便促进所述载体在细菌中的繁殖，并且包括一个或多个能在真核细胞中表达的真核转录单位。pcDNAI/amp，pcDNAI/neo，pRc/CMV，pSV2gpt，pSV2neo，pSV2-dhfr，pTk2，pRSVneo，pMSG，pSVT7，pko-neo和pHyg衍生的载体是适合转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。用来自诸如pBR322的细菌质粒的序列对上述某些载体进行修饰，以便有利于在原核和真核细胞中的复制和抗药性选择。另外，可将诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)，或Epstein-Barr病毒(pHEBo，pREP-衍生的和p205)的病毒的衍生物，用于在真核细胞中瞬时表达蛋白。用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法为本领域所熟知。有关原核细胞和真核细胞的其他合适的表达系统，以及通用的重组方法可以参见以下文献MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)第16和17章。
用于将多核苷酸导入哺乳动物，即人，或非人哺乳动物的任何方法，都可用于实施本发明，以便将本发明的各种构建体送递到希望的受体内。在本发明的一种实施方案中，所述DNA构建体是通过转染送递的，即，通过送递“裸露的DNA”或与胶体分散系统复合。胶体系统包括大分子复合物，纳米胶囊，微球体，珠，和基于脂类的系统，包括水包油乳液，微胶团，混合的微胶团，以及脂质体。本发明的优选的胶体系统是脂类复合的或脂质体配制的DNA。在前一种方法中，在配制DNA之前，例如，用脂类，首先通过实验优化含有具备需要的DNA构建体的转基因的质粒的表达(例如，在5′非翻译区包括内含子，并且消除不必要的序列(Felgner等，Ann NY Acad Sci 126-139，1995)。DNA的制剂化，例如用各种脂类或脂质体材料进行制剂化，随后可以用已知方法和材料实现，并且送递到受体哺乳动物体内，例如，参见Canonico等，Am J Respir Cell Mol Biol 1024-29，1994；Tsan等，AmJPhysiol268；Alton等，Nat Genet.5135-142，1993和Carson等的美国专利号5,679,647，胶体分散系统。
可以根据解剖的和机械性的因素，对脂质体的靶向进行分类。解剖分类是以选择性水平为基础的，例如器官特异性，细胞特异性，和细胞器特异性。机械性靶向可以根据它是被动或主动的进行区分。被动靶向利用了脂质体的天然倾向，将网状内皮细胞系统(RES)的细胞分配在器官中，所述器官包括窦状毛细管。另一方面，主动靶向涉及通过将脂质体偶联在诸如单克隆抗体，糖，糖脂，或蛋白的特异性配体上改变所述脂质体，或通过改变脂质体的组成或大小以便获得对除了天然存在的定位位点以外的器官和细胞类型的靶向。
可以用多种方法修饰所述靶向送递系统的表面。对于脂质体靶向送递系统来说，可以将脂类基团掺入所述脂质体的脂类双层中，以便保持所述靶向配体与所述脂质体双层的稳定缔合。可以使用各种连接基团将所述脂链结合在所述靶向配体上。可以将裸露的DNA或与诸如脂质体的送递载体缔合的DNA用于受试者的若干部位(参见下文)。例如，平滑肌细胞可以用能特异性结合SM22α的抗体靶向，它是平滑肌细胞标记。视网膜细胞和RPE细胞能够以类似方式靶向。
在本发明的优选方法中，所述DNA构建体是用病毒载体送递的。所述转基因能够整合到可用于基因治疗的多种病毒载体中的任意一种上，如重组逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，和单纯疱疹病毒-1，或重组细菌或真核质粒。尽管可以将各种病毒载体用于实施本发明，AAV-和基于腺病毒的方法是特别感兴趣的。所述载体通常被理解成是被选择用于在体内转移外源基因，特别是转入人体内的重组基因送递系统。对病毒载体的选择和使用的以下其他指导，可能有助于实施者。正如在下面所更详细地披露的，所述受试者表达构建体的实施方案可专门用于各种体内和离体的基因治疗方法。
4.8药物组合物和制剂本发明提供了包括上述疫苗和亲嗜性免疫激动剂的药物组合物。在一方面，本发明提供了可以药用的组合物，它包括治疗有效量的上述一种或多种化合物，它是与一种或多种可以药用的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的。在另一方面，某些实施方案中，本发明的化合物可以直接施用，或者与可以药用的载体混合，并且也可以与其他化疗试剂一起试剂。因此，联合(组合)治疗包括以如下方式序贯，同时和分开，或共同施用所述活性化合物在下一次施用时，第一次施用的化合物的治疗效果没有完全消失。
正如下面所详细披露的，本发明的药物组合物可专门配制成以固体或液体形式施用，包括适应以下形式的制剂(1)口服，例如，灌药(含水或无水溶液或悬浮液)，片剂，例如，针对颊，舌下，和系统吸收的片剂，药团，粉末，颗粒，用于舌的糊剂；(2)肠胃外施用，例如，通过皮下，肌内，静脉内，或硬膜外注射，例如，无菌溶液或悬浮液，或缓释制剂；(3)局部施用，作为霜剂，软膏，或受控制释放的膏贴或喷雾施用在皮肤上；(4)阴道内或直肠内，例如，作为阴道药，霜剂或泡末；(5)舌下施用；(6)眼眶内施用；(7)经皮施用；或(8)鼻腔施用。
在一种实施方案中，将所述药物组合物配制成用于肠胃外施用。在一种实施方案中，将所述药物组合物配制用于动脉内注射。另一种优选实施方案中，将所述药物组合物配制用于系统性施用。
如上文所述，本发明化合物的某些实施方案可以包括碱性官能团，如氨基或烷基氨基，因此能够与可以药用的酸形成可以药用的盐。在这一方面，术语“可以药用的盐”表示本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。所述盐可以在施用载体或剂型生产过程中原位制备，或者让本发明的纯化的化合物以它的无碱形式分别与合适的有机和无机酸起反应，并且在随后的纯化中分离所形成的盐。典型的盐包括氢溴酸，盐酸，硫酸，亚硫酸，磷酸，硝酸，乙酸，戊酸，油酸，棕榈酸，硬脂酸，月桂酸，苯甲酸，乳酸，磷酸，甲苯磺酸盐，柠檬酸，马来酸，延胡索酸盐，琥珀酸，酒石酸，萘酸，甲磺酸盐，葡萄糖酸盐，乳糖酸，和月桂基磺酸盐等(例如，参见Berge等(1977)“药用盐”，J.Pharm.Sci.661-19)。
所述主题化合物的可以药用的盐包括所述化合物的常规无毒盐或季胺盐，例如来自无毒有机或无机酸。例如，所述常规无毒盐包括源于无机酸，如氢氯酸，氢溴酸，硫酸，磺酸，磷酸，和硝酸等；以及用有机酸制备的盐，所述酸如乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，硬脂酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，棕榈酸，马来酸，羟基马来酸，苯乙酸，谷氨酸，苯甲酸，水杨酸，磺胺酸，2-乙氧基苯甲酸，延胡索酸，甲苯磺酸，甲磺酸，二乙磺酸，草酸，和异硫氰酸的盐。
在其他场合下，本发明的化合物可以包括一个或多个酸性官能团，并因此能够与可以药用的碱形成可以药用的盐。在这种情况下，术语“可以药用的盐”表示本发明化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。所述盐同样可以在施用媒介物或剂型生产过程中，在原位制备，或者让纯化的化合物以它的无酸形式与合适的碱分别起反应，如可以药用的金属阳离子的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐，或与氨，或与可以药用的有机伯，仲，或叔胺反应。典型的碱金属或碱土金属盐包括锂，钠，钾，钙，镁和铝盐等。可用于形成碱加成盐的典型的有机胺包括乙胺，二乙胺，亚乙基二胺，乙醇胺，二乙醇胺，和哌嗪等(例如，参见Berge等，同上)。
在所述组合物中还可以添加湿润剂，乳化剂和润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，包被剂，增甜剂，香味剂和芳香剂，防腐剂以及抗氧化剂。
可以药用的抗氧化剂的例子包括(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，和亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸基棕榈酸，丁基化羟基茴香醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，镓酸丙脂，和α-生育酚等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨酸，酒石酸，和磷酸等。
本发明的试剂包括适合口服，鼻，局部(包括面颊和舌下)，直肠，阴道和/或肠胃外施用的制剂。所述制剂通常能够以单位剂型存在，并且可以通过药物学领域的任何公知方法制备。可以与载体材料组合以便生成单一剂型的活性成分的量可以根据要治疗的宿主，特定的施用方式而改变。可以与载体材料组合，以便生产单一剂型的活性成分的量，一般是能产生治疗效果的所述化合物的量。一般，在百分比用量上，该用量为大约1％至大约99％的活性成分，优选大约5％-大约70％，最优选大约10％-大约30％。
在某些实施方案中，本发明的制剂包括选自下组的赋形剂环糊精，脂质体，成微胶团试剂，例如，胆酸，和聚合物载体，例如聚酯和聚酸酐，以及本发明的化合物。在某些实施方案中，上述制剂使得可以口服生物可利用本发明的化合物。
制备所述制剂或组合物的方法包括让本发明的化合物与所述载体缔合，并且任选与一种或多种辅助成分缔合的步骤。一般，所述制剂是通过让本发明的化合物与液体载体，或细碎的固体载体，或这两者均匀地并且紧密地缔合而制备的，然后，如果必要的话使所述产品成型。
本发明化合物的用于口服的液体剂型包括可以药用的乳液，微型乳液，溶液，悬浮液，糖浆和酏剂。除了所述活性成分之外，所述液体剂型可以含有本领域常见的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苯酯，丙二醇，1，3-丁二醇，油类(特别是棉籽油，花生油，玉米油，胚乳油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇，和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
除了惰性稀释剂之外，所述口服组合物还可以包括佐剂，如湿润剂，乳化剂和悬浮剂，增甜剂，香味剂，着色剂，芳香剂和防腐剂。
除了活性化合物之外，悬浮液可以包括悬浮试剂，例如，乙氧基化异硬脂酰醇，聚环氧乙烷山梨醇和山梨聚糖酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂-琼脂和黄芪胶，以及它们的混合物。
适合口服的本发明的制剂可以是以下形式的胶囊，扁胶囊，丸剂，片剂，锭剂(使用有香味的基材，通常是蔗糖和合欢胶或黄芪胶)，粉末，颗粒，或用含水或无水液体配制的溶液或悬浮液，或水包油或油包水液体乳液，或酏剂或糖浆，或锭剂(使用惰性基材，如明胶和甘油，或蔗糖和合欢胶)，和/或漱口水等，它们各自含有预定量的本发明的化合物作为活性成分。本发明的化合物还能够以药团，干药糖剂或糊剂形式施用。
在用于口服的本发明的固体剂型(胶囊，片剂，丸剂，糖衣丸，粉末，颗粒等)中，将所述活性成分与一种或多种可以药用的载体混合，如柠檬酸钠或磷酸氢钙，和/或下列任何成分(1)填料或膨胀剂，如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖，和/或硅酸；(2)粘接剂，如羧甲基纤维素，藻酸，凝胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，和/或合欢胶；(3)湿润剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，藻酸，某些硅酸，以及碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，如石蜡；(6)吸收加速剂，如季铵化合物；(7)湿润剂，如鲸蜡醇，单硬脂酸甘油酯，非离子表面活性剂；(8)吸附剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂基硫酸钠，以及它们的混合物；和(10)着色剂。对于胶囊，片剂和丸剂来说，所述可以药用的组合物还可以包括缓冲剂，还可以将类似形式的固体组合物用作柔软和硬壳凝胶胶囊的填料，使用诸如乳糖或奶糖的赋形剂，以及高分子量聚乙二醇等。
片剂可以通过任选与一种或多种辅助成分一起压缩或模制制成。压缩的片剂可以用粘接剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，分散剂(例如，淀粉甘油酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂制备。模制的片剂可以通过在合适的机器中对用惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物的混合物进行模制而制备。
本发明可以药用的组合物的片剂，和其他固体剂型，如糖衣药丸，胶囊，丸剂和颗粒，可任选分级，或者用包衣和外壳制备，如肠衣和制药领域众所周知的其他包衣。还可以将它们配制成能提供其中的活性成分的缓慢的或受控制的释放，例如，各种比例的羟丙基甲基纤维素，以便提供需要的释放特征，其他聚合物基质，脂质体和/或微球体。还可将它们制备成迅速释放，例如冷冻干燥。可以对它们进行消毒，例如，通过保留细菌的滤膜过滤，或通过在即将使用之前掺入无菌固体组合物形式的消毒剂，它们能够溶解在无菌水中，或者某些其他无菌可注射的介质。所述组合物还可任选地含有乳浊化试剂，并且可以是只能释放所述活性成分的组合物，或者优选在胃肠道的某些部分，以缓释的形式释放。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物和蜡。如果合适的话，所述活性成分还可以是微胶囊化形式的，具有一种或多种上述赋形剂。
用于直肠或阴道施用的本发明可以药用的组合物的制剂，能够以栓剂形式存在，它可以通过将本发明的一种或多种化合物与一种或多种合适的无刺激性的赋形剂或载体混合而制备，例如，所述赋形剂包括可可脂，聚乙二醇，栓剂蜡或水杨酸盐，并且它们在室温下是固态，而在体温下是液态的，因此，能够在直肠或阴道腔中溶化，并且释放所述活性化合物。
适合阴道使用的本发明的制剂还包括含有本领域所公知的合适的载体的阴道药，止血垫，霜剂，凝胶，糊剂，泡末或喷雾制剂。
用于局部或经皮施用本发明化合物的剂型包括粉末，喷雾剂，软膏，糊剂，霜剂，洗液，凝胶，溶液，膏贴和吸入剂。所述活性化合物可以在无菌条件下与可以药用的载体混合，并且与任何防腐剂，缓冲剂，或可以需要的助推剂混合。
除了本发明的活性化合物之外，软膏，糊剂，霜剂和凝胶可以包括赋形剂，如动物和植物脂肪，油类，蜡，石蜡，淀粉，黄芪胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅氧烷，膨润土，硅酸，滑石和氧化锌，或它们的混合物。
除了本发明的化合物之外，粉末和喷雾剂可以包括赋形剂，如乳糖，滑石，硅酸，氢氧化铝，水杨酸钙，和聚酰胺粉末，或所述物质的混合物。喷雾剂还可以含有常用助推剂，如氯氟烃以及挥发性的未取代过的烃，如丁烷和丙烷。
经皮膏贴具有提供将本发明的化合物以受控制的方式送递到体内的额外优点。所述剂型可以通过将所述化合物溶解或分散在合适的介质中制备。还可以使用吸附增强剂提高所述化合物穿透皮肤的流量。所述流通的流量可以通过提供流速控制膜或者将所述化合物分散在聚合物或凝胶中进行控制。
眼用制剂，眼膏，粉末，和溶液等也属于本发明的范围。
适合肠胃外施用的本发明的可以药用的组合物包括一种或多种本发明的化合物，它与一种或多种可以药用的无菌等渗含水或无水溶液，分散液，悬浮液或乳液，或可以在使用之前重建成无菌可注射溶液或悬浮液的无菌粉末组合，所述溶液可以含有糖，醇，抗氧化剂，缓冲剂，细菌抑试剂，使得所述制剂与预期使用的受体的血液等渗的溶质或悬浮或增稠剂。
可用于本发明的可以药用的组合物中的合适的含水和无水载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，以及它们的合适的混合物，植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯，如油酸乙酯。可以保持适当的流动性，例如，通过使用包被材料，如卵磷脂，对于分散液来说通过保持需要的粒度，并且通过使用表面活性剂。
所述组合物还可以佐剂，如防腐剂，湿润剂，润滑剂和分散剂。通过添加各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇，和苯酚山梨酸等可以确保防止微生物对所述主题化合物的作用。可能还需要将等渗剂，如糖，和氯化钠等添加到所述组合物中。另外，通过添加能够延缓吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射药物形式的吸收时间。
在某些场合下，为了延长药物的作用，需要延缓对来自皮下或肌内注射的药物的吸收。这一目的可以通过使用具有较低水溶解度的晶体或非晶体材料的液体悬浮液而实现。所述药物的吸收速度取决于它的溶解速度，而它的溶解速度又取决于结晶大小和结晶形式。另外，肠胃外施用的药物形式的延缓的吸收是通过将所述药物溶解或悬浮在油媒介物中而实现的。
可注射的存储形式是通过在诸如聚交酯-聚乙交酯的可生物降解的聚合物中制备主题化合物的微胶囊基质而制备的。根据药物与聚合物的比例，以及所采用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速度。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯和聚酸酐)。储存式可注射制剂还可以通过将所述药物捕获在与身体组织相容的脂质体或微乳液中制备。
当本发明的化合物以药物形式给人和动物施用时，能够以它们本身的形式提供或者以含有与可以药用的载体组合的，例如0.1-99.5％(更优选0.5-90％)的活性成分的药物组合物形式提供。
本发明的制剂可以口服，肠胃外施用，局部施用，或直肠施用。当然，它们是以适合每一种施用途径的形式提供的。例如，它们是以片剂或胶囊形式施用的，通过注射，吸入，滴眼液，软膏，栓剂等，通过注射施用，输注或吸入；以洗液或软膏形式局部施用；并且以栓剂形式直肠施用。口服是优选的。
可以通过任何合适的施用途径给人和其他动物施用所述化合物以便治疗，包括口服，鼻，例如，喷雾，直肠施用，阴道内施用，肠胃外，池内，和局部施用，如以粉末，软膏或滴液形式，包括颊和舌下。
无论选择什么样的施用途径，本发明的化合物能够以合适的水合形式施用，和/或通过本领域技术人员所公知的常规方法将本发明的药物组合物配制成可以药用的剂型。
尽管本发明的化合物可以单独施用，但优选以药物制剂(组合物)形式施用所述化合物。本发明的化合物可以配制成以任何常规方式施用，用于人类或兽医药物中，与其他药物类似。
在某些实施方案中，上述药物组合物包括一种或多种抑制剂，第二种化疗试剂，并且选择性地包括可以药用的载体。
术语传统化疗剂包括，但不局限于基于铂的试剂，如卡铂和顺铂；氮芥烷基化试剂；硝基硫尿烷剂化剂，如卡氮芥(BCNU)和其他烷化剂；抗代谢物，如氨甲喋呤；嘌呤类似物抗代谢物；嘧啶类似物抗代谢物，如氟尿嘧啶(5-FU)和gemcitabine；激素抗肿瘤剂，如戈舍瑞林，leuprolide，和他莫昔芬；天然抗肿瘤剂，如紫杉烷类(例如，docetaxel和紫杉醇)，aldesleukin，白介素-2，足叶乙甙(VP-16)，干扰素α，和维甲酸(ATRA)；抗生素性天然抗肿瘤剂，如伯莱霉素，放线菌素，道诺霉素，阿霉素，和丝裂霉素；以及长春花生物碱天然抗肿瘤剂，如长春碱和长春新碱。
另外，还可以将以下其他药物与上述抗肿瘤剂组合使用，即使是不考虑抗肿瘤剂本身放线菌素；道诺霉素HCl；docetaxel；阿霉素HCl；epoetinα；足叶乙甙(VP-16)；更昔洛伟钠；硫酸庆大霉素；干扰素α；leuprolide acetate；盐酸麦佩里定；盐酸美沙酮；盐酸雷尼替丁；硫酸长春碱；和齐多夫定(AZT)。例如，最近业已将氟尿嘧啶与肾上腺素和牛胶原一起配制，形成了特别有效的组合。
另外，下面列举了还可以使用的氨基酸，肽，多肽，蛋白，多糖，以及其他大分子白介素1-18，包括突变体和类似物；干扰素或细胞因子，如干扰素α，β，和γ；激素，如促黄体生成素释放激素(LHRH)和类似物，以及促性腺激素释放激素(GnRH)；生长因子，如转化生长因子-b(TGF-b)，成纤维细胞生长因子(FGF)，神经生长因子(NGF)，生长激素释放因子(GHRF)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)，肝细胞生长因子(HGF)，和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-a&b(TNF-a&b)；侵染抑制因子-2(IIF-2)；骨形态生成蛋白1-7(BMP 1-7)；生长激素抑制素；胸腺素-a-1；g-球蛋白；过氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗-血管生成因子；肿瘤抗原材料；和药物前体。
在优选实施方案中，本发明的组合物可以包括其他生物学活性物质，优选治疗药物或药物前体，例如其他化疗剂，清除化合物，抗生素，抗病毒剂，抗真菌剂，抗炎剂，血管收缩剂和抗凝剂，可用于癌疫苗用途或相应的药物前体的肿瘤抗原。
典型的清除化合物包括，但不局限于含有硫醇的化合物，如谷胱苷肽，硫脲，和半胱氨酸；醇类，如甘露醇，取代过的苯酚；醌，取代过的苯酚，芳胺和硝基化合物。
可以使用各种使用的化疗剂和/或其他生物学活性剂，其中包括，但不局限于以下形式的试剂不带电荷的分子，分子复合物，盐，醚，酯，和酰胺等。它们在植入，注射或以其他方式插入肿瘤之后具有生物学活性。
4.9治疗方法本发明还提供了治疗癌性肿瘤的新型治疗方法，包括给所述受试者施用有效量的主题药物组合物。本发明的方法还可用于治疗任何癌性肿瘤。在某些实施方案中，所述方法包括给受试者肠胃外施用有效量的主题药物组合物。在一种实施方案中，所述方法包括给受试者动脉内施用主题组合物。在其他实施方案中，所述方法包括直接给受试者体内的癌性肿瘤的动脉血供送递施用有效量的主题组合物。在一种实施方案中，所述方法包括使用导管直接通过动脉血供送递到癌性肿瘤中而施用有效量的主题组合物。在使用导管施用主题组合物的实施方案中，导管的插入可以通过显微镜或本领域已知的其他方法导向或观察，通过所述方法可以观察和/或引导导管的插入。在另一种实施方案中，所述方法包括化学栓塞。例如，化学栓塞方法可以包括用含有与油基(例如，乙碘油中的聚乙烯醇)混合的树脂样材料的组合物和一种或多种化疗剂阻断血管向癌性肿瘤的送递。在其他实施方案中，所述方法包括给受试者系统性施用主题组合物。
在某些实施方案中，治疗癌性肿瘤的方法包括给受试者施用与另一种试剂组合的本发明的一种或多种选择性抑试剂。在某些实施方案中，所述方法包括施用药物组合物，该组合物含有与其他化疗剂或清除化合物组合的一种或多种抑试剂。组合治疗包括以如下形式顺序，同时和分开，或共同施用所述活性化合物在下一次施用时，第一次施用的药物的治疗效果还没有完全消失。在一种实施方案中，所述第二种试剂是化疗试剂。在另一种实施方案中，所述第二种试剂是清除化合物。在某些实施方案中，所述第二种试剂可以配制成独立的药物组合物。在其他实施方案中，所述药物组合物可以同时包括抑试剂和第二种试剂。
在其他实施方案中，治疗癌性肿瘤的方法包括将有效量的主题组合物直接施用于肝脏，头部，颈部，腺体或骨骼的血管中。例如，可以对诸如肝脏，股骨，大脑，颈动脉，或脊椎动脉的血管进行输注，注射，化学栓塞，或插入导管，以便将所述化合物用于癌性肿瘤。在其他实施方案中，所述方法包括将有效量的主题组合物直接施用于头部，颈部或骨骼中的癌性肿瘤里的血管。所述方法是众所周知的，并且被用于本领域中。例如，Gobin，Y.P等(2001)Radiology 218724-732披露了用于脑肿瘤的动脉间化疗的方法。Moser等(2002)Head Neck 24566-74对将动脉内导管用于头部和颈部癌的化疗治疗进行了综述。Wang，M.Q.等(2001)J.Vasc.Interv.Radiol.12731-7披露了注射股骨动脉的方法以及化疗方法，以便治疗骨肉瘤。Kato，T.等(1996)Cancer Chem其他Pharmacol 37(4)289-96对使用微胶囊化抗肿瘤药物的动脉内输注(化学栓塞)治疗肝脏，肾脏，骨盆内器官，肺，头部和颈部，以及骨骼中的癌性肿瘤进行了综述。Hermann，K.等(2000)Radiology 215294-9；Kemeny，N.E.，(1999)BaillieresBest Pract Res Clin Gastroenterol 13593-610披露了用于治疗肝癌的动脉内和栓塞方法的典型方法。
一般，采用本发明药物组合物的化学栓塞或直接动脉内或静脉内注射治疗，通常是以类似方式进行的，而与部位无关。简单地讲，血管造影(血管的分布图)，或更具体地讲，在某些实施方案中，要栓塞的部位的动脉血管造影首先可以通过在进行X光照相时通过插入动脉或静脉的导管(取决于要栓塞或注射的部位)注射不透射线的造影剂进行。所述导管可以是经皮插入的或通过手术插入的。然后可以通过所述导管灌入本发明的药物组合物直到观察到流动停止而栓塞所述血管。可以通过重复的血管照相证实血管闭塞。在使用直接注射的实施方案中，随后以需要的剂量用本发明的药物组合物灌注所述血管。
栓塞治疗通常会导致含有抑试剂的组合物分布在要治疗的肿瘤或血管团的间隙中。所述栓塞颗粒的物理膨胀堵塞了动脉腔，导致血液供应的阻塞。除了这一效果之外，抗血管生成因子的存在抑制了向所述肿瘤或血管团送递血液的新血管的形成，增强了截断血管供应的丧失活力的作用。直接动脉内或静脉内使用，通常会导致含有抑试剂的组合物分布在要治疗的肿瘤或血管物质的间隙中。不过，预计，用这种方法通常不能堵塞血液送递。
在本发明的一个方面，可以利用栓塞或直接动脉内或静脉内注射疗法治疗肝脏或其他组织中的原发性和继发性肿瘤。简单地讲，通过股骨或手臂动脉插入导管，并且通过在荧光显微镜的引导下使它通过所述动脉系统推进到肝脏动脉。根据需要，将所述导管推进到肝脏动脉分支，以便能够完全堵塞向肿瘤供血的血管，同时尽可能多地保留向正常结构供应血液的动脉分支。理想的是，它是肝脏动脉的节段分支，不过，它可以是远离胃十二指肠动脉起点的整个肝脏动脉，或者甚至是多个独立的动脉，可以根据肿瘤的程度及其独立的血液供应必须加以堵塞。一旦获得了理想的导管位置，通过所述动脉导管注射组合物(如上文所述)直到动脉中的血流被阻止以便栓塞所述动脉，优选在观察5分钟之后栓塞。动脉的堵塞可以通过经由所述导管注射不透射线的造影剂，并且通过荧光显微镜或X光胶片证实，以前业已用造影剂填充过的血管不再进行这种处理。在使用直接注射的实施方案中，通过所述动脉导管以需要的剂量注射组合物对所述动脉进行灌注(如上文所述)。对于要堵塞的每一个送递动脉来说，可以重复相同的过程。
为了用于栓塞治疗，本发明的组合物优选是无毒的，血栓生成的，容易向下注射到血管导管中，不透射线的，能够快速并且永久性起作用，无菌，并且能在该方法的任何时间方便地用于不同的形状和尺寸。另外，所述组合物优选能导致抑试剂和/或第二种试剂的缓慢(优选用数周至数月时间)释放。特别优选的组合物在注射到血管系统中之后，应当具有15-200微米的预定大小。在溶液中或者在一旦注射之后，它们优选不会团聚成更大的颗粒。另外，优选的组合物应当不会改变形状或物理特性。
在大部分实施方案中，所述主题药物组合物将掺入能以足够的量送递的物质，以便给患者送递治疗有效量的掺入的治疗剂或其他材料，作为预防性或治疗性治疗的一部分。所述颗粒中活性化合物的理想浓度取决于所述药物的吸收，失活和外泌速度，以及所述化合物的送递速度。应当指出的是，所述剂量值还可以根据药缓解的状况的严重程度而改变。还应当理解的是，对于任何特定受试者来说，具有的用药方案应当根据个体的需要，以及个人施用的专业判断随时进行调整，或监督所述组合物的施用。通常，利用本领域技术人员所公知的技术确定剂量。
对于主题组合物来说，本发明涉及一定范围的剂量。本发明涉及能在3周时间释放所述量的实施方案，在6周时间内释放至少2倍以上数量等。
剂量可以以患者的每千克体重所使用的组合物的量为基础。例如，涉及组合物的一定用量范围，包括每千克患者体重使用大约0.001，0.01，0.1，0.5，1，10，15，20，25，50mg或更多的所述组合物。其他用量为本领域技术人员所公知，并且能方便地确定。
在某些实施方案中，所述主题化合物的剂量通常为每千克体重大约0.001mg-大约10mg，特别是在每千克体重大约0.1mg-大约10mg，更优选为每千克体重大约0.1mg-大约1mg。在一种实施方案中，所述剂量为每千克体重大约0.3mg-大约0.6mg。在一种实施方案中，所述剂量为大约0.4mg-大约0.5mg。
另外，本发明的剂量可以根据所述组合物的血浆浓度确定。例如，可以使用最大血浆浓度(Cmax)和从0时间到无限时间位于血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC(0-4))。本发明使用的剂量包括能够产生上述Cmax和AUC(0-4)的值的剂量，以及会导致所述参数的更大的或更少值的其他剂量。
在本发明药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得能有效获得对特定患者的理想的治疗反应的用量的活性成分，组合物，以及施用方式，而又对所述患者没有毒性。
所述选定的剂量水平取决于多种因素，包括所采用的本发明的特定化合物，或它的酯，盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所施用的特定化合物的外泌或代谢速度，治疗持续时间，与所采用的特定化合物组合使用的其他药物，化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康情况和以前的医学史，以及医学领域所熟知的其他因素。
具有本领域普通技能的医生或兽医能够方便地确定，并且开出所需要的有效量的药物组合物。例如，医生或兽医最初可以采用低于所需剂量的水平使用所述药物组合物，以便获得预期的治疗效果，并逐渐加大剂量，直到获得理想的效果。
一般，本发明化合物的合适的日用剂量是该化合物能有效产生治疗效果的最低剂量。所述有效剂量通常取决于上述因素。
如果需要的话，所述活性化合物的有效的每日剂量能够以合适的间隔用一天时间，任选以单位剂型分成两个，三个，四个，五个，六个或更多个小剂量分别施用。
能在特定患者体内产生最有效的治疗的任何特定化合物的精确施用时间和施用量，取决于特定化合物的活性，药物动力学，和生物利用度，患者的生理学状态(包括年龄，性别，疾病类型和时期，一般身体状况，对特定剂量的反应以及治疗的类型)，和施用途径等。可以将本文所提供的指南用于优化所述治疗，例如，确定施用的最佳时间和/或用量，它将不需要超过常规的实验，包括监测所述受试者，并且调整剂量和/或用药时间。
在所述受试者接受治疗时，可以通过在24小时内的预定时间测定一种或多种相关的指标而监测患者的健康。可以根据所述监测的结果对包括补充，用量，施用时间，和制剂在内的治疗进行优化。可以定期对所述患者进行再次评估，以便通过测定相同的参数确定改变的程度，第一次这样的重新评估通过是在治疗开始之后4周时间结束时进行，并且随后的再次评估在治疗期间每隔4-8周进行1次，随后每隔3月进行一次。治疗可以持续数月或者甚至数年时间，对于人类来说，至少一个月的时间是典型的治疗时间。对施用的试剂的量以及可能的施用时间的调整，可以根据所述重新评估进行。
治疗开始时可以采用比所述化合物的最佳剂量低的较小剂量进行。然后，可以通过以小的增幅加大所述剂量，直到获得所述最佳治疗效果。
本发明若干种化合物，或者其他化疗试剂的组合使用，能够降低任何单独成分的所需剂量，因为不同成分的作用的开始和持续可能是相互补充的。在所述组合治疗中，不同的活性试剂可以同时送递或分别送递，并且在一天的相同或不同时间施用。可以通过标准药理学方法用细胞培养物或实验动物对主题化合物的毒性和治疗效力进行确定，例如，用于确定LD50和ED50。具有大的治疗指数的组合物是优选的。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但必须仔细设计送递系统，使它将所述化合物靶定在预期的部位，以便降低副作用。
通过所述细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于制备用于人类的多种剂量。任何添加剂，或其中的任何其他成分的剂量优选处在循环浓度范围内，包括少有或没有毒性的ED50。所述剂量可以根据所采用的剂型和所使用的施用途径，在该范围内变化。对于本发明的试剂来说，所述治疗有效剂量最初可以根据细胞培养实验估算。可以用动物模型配制一种剂量，以便获得一定的循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养物中确定的IC50(即获得症状的最大抑制作用二分之一的测试化合物的浓度)。可将所述信息用于更精确地确定在人体上的有用剂量。例如，可以通过高效液相层析测定血浆含量。
4.10试剂盒本发明提供了用于治疗各种癌症的试剂盒。例如，试剂盒可以包括如上文所述的一种或多种药物组合物。所述组合物可以是含有可以药用的赋形剂的药物组合物。在涉及试剂盒的其他实施方案中，本发明提供了包括本发明的药物组合物，并且任选包括有关它的使用的说明书的试剂盒。在其他实施方案中，本发明提供了包括一种或多种药物组合物和一种和多种用于实现所述组合物的施用的装置的试剂盒。例如，一种主题试剂盒可以包括药物组合物和用于将所述组合物通过动脉内注射，直接送递到癌性肿瘤中的导管。在一种实施方案中，所述装置是动脉内导管。所述试剂盒可能具有多种用途，例如，包括治疗，诊断和其他用途。
5.实施例下面的实施例给技术人员提供了应用本发明的方法和组合物治疗包括肿瘤和转移肿瘤在内的癌的指南，使用GM-CSF分泌肿瘤细胞疫苗和能够定位或被定位在受影响的癌症部位的减毒的亲嗜性细菌的组合。具体地讲，下面的实施例证实了通过送递定位于肝脏的减毒的细菌菌株可以增强用GM-CSF分泌肿瘤细胞疫苗组合治疗肝脏转移癌的效果，但是，不能增强GM-CSF分泌肿瘤细胞疫苗对所述减毒的细菌菌株不能定位的其他组织的治疗作用。因此，下面的实施例提供了对于治疗疾病，特别是癌的组合方法的广泛支持，它包括系统性癌疫苗和对受疾病影响的器官或组织有亲嗜性的试剂(例如，亲嗜性减毒的细菌或病毒或其他这样的试剂，它能通过直接应用于受所述疾病影响的部位进行定位)。
5.1鼠肝转移模型6-8周龄的雌性BALB/c小鼠是从National Cancer Institute购买的，并且被用于使用CT26的以下实验中。CT26是源于BALB/c小鼠的鼠结直肠癌肿瘤细胞系。用戊巴比妥对所述小鼠进行麻醉(腹膜内注射50mg/kg)。对于每一只小鼠来说，实施腹壁部分切除手术，以便暴露出脾脏。用钛剪子将所述脾脏分割成两个1/2脾脏，留下完整的血管蒂(参见图1)。用27号针头将包含在300μl Hanks平衡的盐溶液(HBSS)中的0，1×104，1×105，1×106CT26细胞注射到以上两个1/2脾脏中的一个中。然后让细胞流入脾脏和门静脉，并且，在所述肝脏中形成肿瘤沉积物。然后通过手术取出受到CT26污染的1/2脾脏，留下没有肿瘤细胞的有功能的1/2脾脏(参见图2)。
然后将所述小鼠缝合好，并且从麻醉状态复苏。在1周和2周时，通过吸入二氧化碳，对来自每一个肿瘤侵袭组的3只小鼠实施安乐死。从小鼠体内取出肝脏。另外，对所述肝脏进行切片，并且进行H+E染色，以便确定显微镜下肿瘤符合的缺乏或存在(参见图3)。以上分析发现了在没有接受肿瘤或接受了1×104CT2 6细胞的小鼠中没有显微镜或肉眼可见的肿瘤结节。在注射1×105CT2 6肿瘤细胞时，在1周时，在显微镜下观察到了小的显微镜下肿瘤病灶，并且在2周时变得更大。在1周时，这些病灶是肉眼不可见的，并且在2周的时候可以看见。在注射1×106CT26肿瘤细胞时，容易在显微镜下观察到肿瘤结节。图4证实了来自在上述肝脏转移模型中用盐水或1×105CT26侵袭之后4周实施安乐死的小鼠的两组肝脏。在CT26侵袭过的小鼠中出现了白色癌结节。
5.2GM-CSF分泌肿瘤细胞疫苗的保护性作用在这类实验中，按照在肝脏转移模型中所披露的方法，通过脾脏用1×105CT26细胞侵袭小鼠。从CT26肿瘤侵袭之前7天开始，每两周用Hanks平衡盐溶液(HBSS)免疫接种或用1×106辐射过的(5000rad)GM-CSF分泌基因修饰的CT26(GM/CT26)细胞进行免疫接种，在肿瘤侵袭的当天，在肿瘤侵袭之后3天或在肿瘤侵袭之后7天进行。在第4周，对小鼠实施安乐死，并且通过肉眼和显微方法分析它们的肝脏中转移性病变的存在。图5归纳了来自两种实验的数据。
没有接受GM/CT26免疫的对照小鼠都出现了肝脏转移。在肿瘤侵袭之前7天开始接受所述免疫的小鼠中没有出现肝脏转移。在肿瘤侵袭当天接受免疫接种的15只小鼠中有9只没有肝脏转移。在肿瘤侵袭之后3天开始接受免疫的15只小鼠中有4只没有肝脏转移。在肿瘤侵袭之后7天开始接受免疫的15只小鼠中有2只没有肝脏转移。
5.3通过减毒的利斯特氏菌增强GM-CSF肿瘤疫苗效力进行了测试与HIV-gag减毒的单核细胞增生利斯特氏菌(LM)的菌株组合的GM-CSF分泌型肿瘤细胞疫苗的效力的实验。在图6所示实验A中，按上述方法用肝脏转移瘤侵袭小鼠。将24只小鼠分成4组，每组6只，并且进行以下处理对照不处理
GM+3从肿瘤侵袭之后3天开始每两周接种1×106辐射过的(5000rad)GM/CT26，进行3周时间。
利斯特氏菌从肿瘤侵袭6天之后开始腹膜内接种1×106集落形成单位(CFU)的LMGM+3/利斯特氏菌如上文所述的GM/CT26疫苗和LM接种的组合治疗。
对照和利斯特氏菌小鼠中的3只在第33天内，其他所有的小鼠分别在第74天和第68天内。GM+3小鼠具有略微改进的存活率，6只小鼠中有3只在第48天死亡，有1只小鼠长期存活。GM+3/利斯特氏菌组具有明显改善了的存活率，6只小鼠中有4只长期存活。
用每组9只或10只小鼠重复了本研究的结果。这些结果归纳在图6的实验B中。对照，利斯特氏菌和GM+3/利斯特氏菌小鼠中的5只在第64天死亡。该组中10只小鼠中有4只能长期存活，而其他3个组仅有1只小鼠长期存活。以上结果表明，LM处理，增强了GM-CSF分泌型肿瘤细胞疫苗针对已形成的肝脏转移瘤的效力。
5.4通过减毒的单核细胞增生利斯特氏菌感染增强GM-CSF肿瘤疫苗效力对肝脏具有特异性，而对肺没有特异性进行了在肺结直肠癌转移模型中检测与HIV-gag减毒的单核细胞增生利斯特氏菌菌株(LM)组合的GM-CSF分泌型肿瘤细胞疫苗效力的实验。在本实验中(图7)，通过从尾静脉注射5×105CT26细胞，用肺转移瘤侵袭小鼠。下面的每组各自具有9或10只小鼠。
对照不处理GM+3从肿瘤侵袭之后3天开始每2周接种1×106辐射过的(5000rad)GM/CT26，持续3周时间。
利斯特氏菌从肿瘤侵袭之后6天开始腹膜内接种1×106集落形成单位(CFU)的LMGM+3/利斯特氏菌如上文所述的GM/CT26疫苗和LM接种的组合治疗。
GM+3/利斯特氏菌小鼠与用GM+3单独治疗的小鼠相比一点也没有更好。GM+3/利斯特氏菌组和对照组的存活曲线十分相似，但是不如GM+3单独组的存活曲线好。
5.5其他利斯特氏菌增强和特异性研究我们重复了通过注射利斯特氏菌而增强肝脏肿瘤免疫的作用的实验。图9表示用疫苗，利斯特氏菌，或肿瘤疫苗和利斯特氏菌组合处理过的长有肝脏肿瘤的小鼠存活率的比较。在第0天对小鼠进行1×105CT26细胞的肝脏肿瘤侵袭。从第3天开始每两周接种处理小鼠，一共进行3周时间。在第6天提供单剂的1×106利斯特氏菌，或组合进行免疫接种和利斯特氏菌感染，并且观察它们的存活。
通过在肺CT26诱导的肿瘤模型中检查利斯特氏菌注射对存活率的影响，我们还证实了利斯特氏菌增强作用影响的特异性。图10表示用疫苗，利斯特氏菌，或免疫接种和利斯特氏菌组合处理的具有肺肿瘤小鼠的存活率比较。在第0天对小鼠提供1×105CT26细胞的肺肿瘤侵袭。然后对小鼠进行以下处理每2周进行1次免疫接种，从第3天开始一共进行3周时间。在第6天提供单一剂量的1×106利斯特氏菌，或组合进行免疫接种和利斯特氏菌感染。然后观察存活率。由于进入血液的大部分细菌被肝脏吸收并且被消除(例如，有关综述参见Gregory(2002)JLeukoc Biol 72239-48)，腹膜内注射利斯特氏菌细菌不能增强肺肿瘤模型的存活。
5.6分析肝脏的AH1肿瘤抗原-特异性CD8 T-细胞浸润为了进一步分析利斯特氏菌-增强的肿瘤疫苗的免疫应答的作用机制，首先，我们比较了各种处理组中肝脏浸润AH1-特异性CD8 T细胞的水平。图8表示在各种处理组中，对AH1肿瘤抗原特异的肝脏浸润CD8 T-细胞。将所述小鼠分成3个处理组。所有小鼠都在第14天处死。第一组只在第0天接受肿瘤侵袭。第2组不接受肿瘤侵袭，并且在第3，7和11天进行免疫接种。第3组在第0天接受肿瘤侵袭，然后在第3，7和11天进行免疫接种。在第14天处死之后，用胶原酶和透明质酸酶消化小鼠肝脏，并且在Ficoll密度梯度上离心，以便分离淋巴细胞。通过用LdIg二聚体染色分析CD8淋巴细胞的肿瘤抗原特异性，所述二聚体加载了AH1肿瘤抗原肽或对照肽B gal。
为了进一步分析利斯特氏菌-增强的肿瘤疫苗的免疫应答的作用的机制，我们进行了双重抗CD8淘选，以便提高从肝脏肿瘤模型中的小鼠肝脏中分离的CD8淋巴细胞的纯度(参见图11)。为了使用AH1加载的四聚体观察肿瘤抗原特异性CD8群体，纯的CD8 T-细胞分离物是必须的，因为多余的肝脏碎片会导致高的背景染色。首先，用50微米的Medicon滤膜处理肝脏，然后，通过100微米和70微米的注射器滤膜顺序过滤。然后将每个处理过的肝脏铺平板到2.43抗-CD8抗体包被的烧瓶中40分钟。吸出上清液，并且用FACS缓冲液洗涤所述烧瓶1次。然后用细胞刮片除去贴壁细胞，将其转移到5ml的FACS缓冲液中，并且转移到第二抗体包被的烧瓶中。在第二次淘选之后，通过FACS分析细胞。然后，进行更有效的分离过程。通过使它们通过100微米的筛网滤膜挤压处理肝脏，然后在33％的Percoll梯度上离心。淋巴细胞以沉淀物形式沉淀。在Percoll离心之后，淋巴细胞沉淀物的纯度是这样的，只用一次淘选就足以除去任何多余的肝脏碎片。
图12表示第一个实验，其中，进行了来自不同处理组的小鼠的肝脏浸润，AH1肿瘤抗原-特异性CD8 T-细胞数量的分析。在第0天对小鼠进行肝脏肿瘤侵袭。对小鼠进行以下处理从第+3天开始仅进行免疫接种，在从+6天开始仅进行利斯特氏菌感染，或者组合进行免疫接种和利斯特氏菌感染。所有用疫苗处理过的小鼠都在第+6天接受强化疫苗。在第14天处死小鼠，并且通过使用Medicon处理器和双重抗-CD8淘选分离肝脏浸润T-细胞。图12(A)表示以下肝脏浸润淋巴细胞的分析该表的第二栏表示在不同处理组中小鼠的每个肝脏的淋巴细胞的绝对数量。所述计数是在双重抗-CD8淘选之后进行的。该表的第3栏表示CD8+淋巴细胞的百分比。该百分比不表示体内绝对百分比，因为FACS染色以便确定相对百分比是在淘选之后进行的。第4栏表示每个肝脏的CD8 T-细胞的计算数量。第5栏表示AH1肿瘤抗原特异性的CD8 T-细胞的百分比。该百分比不能体现实际体内百分比，因为FACS染色是在淘选之后进行的。第6栏表示每个肝脏的AH1特异性T-细胞的计算数量，而第7栏表示AH1特异性细胞相对未处理过的对照小鼠的数量的比例。图12(B)表示脾脏淋巴细胞的分析。图12(C)表示从不同处理组的小鼠中分离的抗CD8淘选的，肝脏浸润的T-细胞的FACS染色。
图13表示第二种实验，其中，对不同来自不同处理组的小鼠的肝脏浸润、肿瘤特异性CD8 T-细胞数量进行了分析。在第0天对小鼠进行肝脏肿瘤侵袭。对小鼠进行以下处理从第+3天开始仅免疫接种，从第+6天开始仅进行利斯特氏菌感染，或者组合进行免疫接种和利斯特氏菌感染。所有用疫苗处理过的小鼠都在第+6天接受加强疫苗。在第14天处死小鼠，并且通过用100微米的筛网挤压并且在Percoll密度梯度上过滤分离肝脏浸润性T-细胞。在淘选之前，该技术产生了更纯的细胞分离物。肝脏浸润细胞群体可以在淘选之前通过FACS染色进行研究。图13(A)是表示在淘选之前每个肝脏的肝脏浸润细胞的绝对数量，以及不同群体的体内百分比的表。图13(B)是表示在每一个处理组中小鼠的每个肝脏的不同细胞类型的计算的绝对数量的表。在图13(C)中，该表的第二栏表示在不同处理组中每个小鼠肝脏的淋巴细胞的绝对数量。所述计数是在双重抗CD8淘选之前进行的。该表的第三栏表示CD8+淋巴细胞的百分比。与实验1(8/21/02)不同，该百分比不代表绝对体内百分比，因为确定相对百分比的FACS染色是在淘选之前进行的。第四栏表示每个肝脏的CD8 T-细胞的计算数量。第五栏表示AH1肿瘤抗原特异性CD8 T-细胞的百分比。第六栏表示每个肝脏的特异性T-细胞的计算数量，而第七栏表示AH1特异性细胞相对未处理过的对照小鼠中的数量的比例。所述计算的比例与来自第一次实验的比例非常接近。
图14表示第三个实验，其中，对来自不同处理组的小鼠的肝脏浸润、肿瘤特异性CD8 T-细胞数量进行了分析。在第0天对小鼠进行肝脏肿瘤侵袭。对小鼠进行以下处理从第+3天开始仅免疫接种，从第6天仅进行利斯特氏菌感染，或组合进行免疫接种和利斯特氏菌感染。所有用疫苗处理过的小鼠都在第+6天接受加强疫苗。在第14天处死小鼠，并且通过100微米的筛网挤压和在Percoll密度梯度上过滤分离肝脏浸润的T-细胞。在淘选之前，该技术得到了更纯的细胞分离物。在淘选之前，可以通过FACS染色研究肝脏浸润细胞群体。图14(A)是表示在淘选之前每个肝脏的肝脏浸润细胞的绝对数量，以及不同群体的体内百分比的表格。图14(B)是表示在每一个处理组中每个小鼠肝脏的不同细胞类型的计算的绝对数量的表格。图14(C)表示在抗CD8淘选之前肝脏浸润细胞的CD4与CD8的FACS分析。图14(D)表示在抗CD8淘选之前肝脏浸润细胞的CD3与DX5的FACS分析。图14(E)表示在抗CD8淘选之前肝脏浸润细胞的B220与CD11c的FACS分析。
为了进一步研究利斯特氏菌在肝脏肿瘤疫苗系统中增强作用的机制，我们分析了干扰素γ(IFN-γ)和白介素-10(IL-10)的表达，它们是能调控免疫街道的炎症的细胞因子。图8表示肝脏浸润、AH1-特异性CD8 T细胞对IFN-γ和IL-10表达的RT-PCR分析的结果。该结果表明利斯特氏菌增强作用似乎与增加了的IFN-γ的生产和减弱了的IL-10的生产相关(应当指出的是，IL-10与单核吞噬细胞的抑制作用相关)。在本实验中，在第0天对小鼠进行肝脏肿瘤侵袭。对小鼠进行以下处理从+3天开始仅进行免疫接种，或者从第+6天开始进行组合免疫接种和利斯特氏菌处理。所有小鼠在第+6天接受加强疫苗。在第14天处死小鼠，并且通过100微米的筛网挤压和在Percoll密度梯度上过滤分离肝脏浸润的T-细胞。用抗CD8抗体包被的淘选装置淘选分离的细胞一次，并且合并从每一个处理组的10只小鼠中分离的贴壁CD8 T细胞。用CD4-FITC，B220-FITC，CD8-cy，和AH1-加载的，PE偶联的Ld-Ig四聚体对所述T-细胞进行染色。然后用细胞分选仪分离AH1特异性CD8T-细胞，并且通过RT-PCR分析IFN-γ和IL-10的表达。
资金资助该研究得到了公共卫生机构(NIH-NCI GI SPORE资金编号5P50 CA62924-08)以及来自Johns Hopkins大学的临床科学家奖金的资助。
等同形式和参考文献的引用本领域技术人员可以理解，或者能够利用不超过常规实验的手段确定的是，本文所披露的特定多肽，核酸，细胞，制剂，方法，测定和试剂的多种等同形式。这些等同形式被认为属于本发明的范围，并且由以下权利要求书所覆盖。
本申请包括对教科书，公开出版物和专利申请以及授权的美国和外国专利的引用。所引用的所有文件的整个内容都被收作本文参考。
权利要求
1.一种在受试者体内产生针对器官或组织特异性疾病或状况的系统性免疫应答的方法，包括施用治疗有效量的疫苗，它能产生针对所述器官或组织特异性疾病或状况的免疫应答；和施用亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织的试剂，它能在所述器官或组织中产生局部的免疫应答，以便产生针对所述器官或组织特异性疾病或状况的系统性免疫应答。
2.如权利要求1的方法，其中，所述器官或组织特异性疾病或状况是肿瘤或癌生长，并且，所述疫苗是肿瘤疫苗。
3.如权利要求2的方法，其中，所述肿瘤或癌生长是肝癌。
4.如权利要求3的方法，其中，所述疫苗是表达GM-CSF的减毒的肿瘤细胞系。
5.如权利要求1-4中任意一项的方法，其中，所述亲嗜性定位于器官或组织的试剂选自对所述特定器官或组织具有天然亲嗜性的病毒，细菌，酵母或真菌。
6.如权利要求1-4中任意一项的方法，其中，所述亲嗜性定位的试剂是单核细胞增生利斯特氏菌的减毒的菌株。
7.如权利要求5的方法，其中，所述生物亲嗜性定位于新生血管内皮。
8.如权利要求1-4中任意一项的方法，其中，所述试剂是通过基因工程方法亲嗜性定位于所述器官或组织的，并且是选自下组的生物病毒，细菌，酵母，或真菌。
9.如权利要求8的方法，其中，所述基因工程产生的生物表达由所述器官或组织表达的受体的配体。
10.如权利要求9的方法，其中，所述器官或组织受体的配体与所述生物的外被或衣壳蛋白融合。
11.如权利要求8的方法，其中，所述器官或组织是新生血管内皮。
12.如权利要求9的方法，其中，所述基因工程产生的生物表达由新生血管内皮表达的受体的配体。
13.如权利要求1的方法，其中，所述试剂是没有天然亲嗜性的生物，它是通过选自下组的物理方法直接施用于所述器官或组织的直接注射，经皮导管，手术，以及闭合回路输注。
14.如权利要求1的方法，其中，所述器官或组织是肺，而所述施用方法是吸入。
15.如权利要求1的方法，其中，所述器官或组织是肺，而所述施用方法是摄取。
16.如权利要求1的方法，其中，所述亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织的试剂是基因工程产生的生物，它能生产选自下组的免疫性或炎症的激活剂趋化因子，细胞因子，和粘附分子。
17.如权利要求1的方法，其中，所述亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织的试剂是炎性试剂。
18.一种治疗定位于受试者体内的组织或器官的肿瘤或癌生长的方法，包括施用治疗有效量的肿瘤疫苗，它能产生针对肿瘤或癌生长的免疫应答；和施用亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织的试剂，它能在所述器官或组织中产生局部免疫应答，以便治疗定位于所述受试者的所述组织或器官的肿瘤或癌生长。
19.如权利要求18的方法，其中，所述肿瘤或癌生长是肝肿瘤，所述肿瘤疫苗是GM-CSF分泌型完整肿瘤细胞疫苗，并且所述亲嗜性定位于受影响的器官或组织的试剂是单核细胞增生利斯特氏菌的减毒菌株。
20.如权利要求18的方法，其中，所述肿瘤疫苗是DNA肿瘤疫苗。
21.一种用于在受试者体内产生针对器官或组织特异性疾病或状况的系统性免疫应答的制剂，包括治疗有效量的疫苗，它能产生针对所述器官或组织特异性疾病或状况的免疫应答；以及亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织的试剂，并且能在所述器官或组织上产生局部免疫应答。
22.一种用于治疗受试者体内的定位于组织或器官的肿瘤或癌生长的制剂，包括治疗有效量的能产生针对所述肿瘤或癌生长的免疫应答的肿瘤疫苗；以及亲嗜性定位或者直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织产生局部免疫应答的试剂。
23.如权利要求21或22的制剂，其中，所述亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织并且在所述器官或组织产生局部免疫应答的试剂是减毒的细菌。
24.如权利要求23的制剂，其中，所述减毒的细菌是HIV-gag减毒的单核细胞增生利斯特氏菌。
25.一种用于在受试者体内产生针对器官或组织特异性疾病或状况的系统性免疫应答的试剂盒，包括能产生针对所述器官或组织特异性疾病或状况的免疫应答的疫苗；亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织产生免疫应答的试剂。
26.一种用于治疗受试者体内的定位于组织或器官的肿瘤或癌生长的试剂盒，包括能产生针对所述肿瘤或癌生长的免疫应答的肿瘤疫苗；和亲嗜性定位于或直接施用于所述器官或组织，并且在所述器官或组织产生免疫应答的试剂。
全文摘要
本发明提供了用于靶定针对特定器官或组织分别产生的免疫应答的方法和组合物；例如，对于受癌症影响的人来说，使用一种或多种具有对可能特异性地定位于所述需要的器官或组织的具有器官或组织亲嗜性的试剂。例如，本发明提供了用于使用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)增强的肿瘤细胞免疫和单核细胞增生利斯特氏菌(LM)感染的组合，治疗来自结直肠癌的肝脏转移瘤的方法和组合物。
文档编号A61P35/04GK1646147SQ03807783
公开日2005年7月27日 申请日期2003年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者R·D·舒利克, D·M·帕多尔, A·雅因 申请人:约翰斯霍普金斯医学院