专利名称：涉及缺损性间隙连接联系的疾病的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有多酚例如矢车菊苷配质，譬如可可多酚如可可矢车菊苷配质的组合物，及其使用方法，用于心律失常的治疗、预防、减小危险性或降低发生率。本发明还涉及含有多酚例如矢车菊苷配质，譬如可可多酚如可可矢车菊苷配质的组合物，及其使用方法，用于神经变性和其他涉及细胞之间缺损性间隙连接联系的疾病，例如认知机能障碍的治疗、预防、减小危险性、减弱进展。
背景技术：
可可多酚，例如黄烷醇及其相关低聚物，业已被证实对高血压、动脉粥样硬化和心血管疾病具有有益效果。这些效果在例如国际专利申请PCT/US97/05693和该申请报告的实施例中得到证实，该申请公开号为WO97/36497。其中已经证实可可多酚可以用来治疗或预防那些被认为受到施用非甾族抗炎药如阿司匹林影响的疾病。然而，可可多酚而不是阿司匹林在治疗和预防中的应用更有益，因为可可多酚不具有阿司匹林的副作用，例如胃出血。
现在令人惊奇地发现了可可多酚的新用途，例如黄烷醇及其相关低聚物。在此公开的组合物和产品可以用于心律失常的治疗、预防、减小危险性和降低发生率。此外，这些组合物和产品可以用于任何与细胞间间隙连接联系异常有关的病症的治疗、预防、减小危险性或减慢进程，例如癌症，心律失常，以及神经变性和其他涉及细胞间缺损性间隙连接联系的疾病。
发明概述本发明涉及哺乳动物患有心率失常的治疗、预防、降低发生率或减小危险性，或降低人或兽医动物如马、猫或狗所患心率失常危险性的组合物、产品和方法。此外，本发明涉及用于任何与细胞间间隙连接联系异常有关的病症的治疗、预防、减小危险性或减慢进程，例如涉及细胞间缺损性间隙连接联系的癌症、心律失常、神经变性疾病和认知机能障碍。
一方面，本发明涉及含有可可多酚的组合物，例如食品，食品添加剂，食品强化剂或药物。该组合物可以选择性地含有L-精氨酸和/或降胆固醇剂。
用于心律失常、神经变性疾病或任何与细胞的间隙连接联系异常有关的病症的治疗、预防、减小危险性或减慢进程的包含上述组合物和标签和/或说明书的包装产品也属于本发明的范围内。
另一方面，本发明涉及哺乳动物例如人或兽医动物中心率失常的治疗、预防、减小危险性或降低发生率的方法，该方法通过施用含有可可多酚例如可可黄烷醇和/或其相关低聚物的组合物给需要其的哺乳动物。
另一方面，本发明涉及一种在哺乳动物，例如人或兽医动物中与细胞间隙连接联系异常有关的病症的治疗、预防、减慢进程或减小危险性的方法，该方法通过施用含有可可多酚例如可可黄烷醇和/或其相关低聚物的组合物给需要其的哺乳动物。例如，所述病症是神经变性疾病或认知机能障碍并且该哺乳动物患有神经变性疾病或认知机能障碍或存在患有神经变性疾病或认知机能障碍的危险性。
附图简述
图1A-D表示通过荧光黄染料转移分析法测定的WB-F344细胞中间隙连接细胞间联系。A对照(0.2％DMSO)；BTPA 10nM(90min)；C染料木素40μM(72h)；D(-)-表儿茶酸40μM(72h)。
图2A-D表示连接蛋白43的亚细胞分布的免疫荧光分析。A对照(0.2％DMSO)；BTPA 10nM；CTPA 10nM加(-)-表儿茶酸40μM；DTPA 10nM加染料木素40μM。所有处理的培养时间均为90分钟。
图3表示植物甾醇、可可矢车菊苷配质和其组合对表儿茶酸吸收到血浆内的影响。
图4表示植物甾醇、可可矢车菊苷配质和其组合对DNA的氧化损伤的影响。
图5表示植物甾醇、可可矢车菊苷配质和其组合对脂质的氧化损伤的影响。
发明详述所有专利、专利申请和该申请中引用的参考文献在此引入作为参考。在任何不一致的情况中，以本申请内容为准。
本发明涉及含有黄烷醇和/或其相关低聚物，例如至少一种可可黄烷醇和/或其相关矢车菊苷配质低聚物的组合物，给需要其的哺乳动物。该组合物可以任选性地含有降胆固醇剂，例如，甾醇和/或stanol类降胆固醇剂，L-精氨酸，钙，钾，镁，抗氧剂，例如维生素E和维生素C，任何复合维生素B，类胡萝卜素，瓜尔胶，或者一或多不饱和脂肪酸(例如ω-3脂肪酸)，维生素D3，视黄醛，类维生素A(retinoid)，大豆蛋白质和硒。组合物可以含有非可可来源的多酚，例如花生皮，其具有类似于可可多酚的那些性质，或代替可可多酚。
在此使用，术语″可可多酚″(CP)是指存在于可可豆中或提取自可可豆或可可组分的多酚物质，例如黄烷醇及其相关低聚物。术语″黄烷醇″包括单体儿茶素和表儿茶酸。儿茶素和表儿茶酸的低聚物称作矢车菊苷配质。在此任何所谓的可可多酚应当理解为也组合形式和单独适合于可可黄烷醇和矢车菊苷配质。
术语″可可组分″是指得自无壳可可尖例如巧克力液和部分或全脱脂可可固体(例如饼或粉)的含可可固体的物质。
短语″降胆固醇剂″是指任何在给予有效量时具有降低哺乳动物胆固醇水平的性质的天然发现或加工的化合物、化合物的组合、提取物或植物成分。当所述的降胆固醇剂是甾醇或stanol类的化合物或化合物的组合时，即，包括衍生物和异构体形式，该降胆固醇剂称作″甾醇和/或stanol类降胆固醇剂″。当该短语用于组合物中时，例如，″降胆甾醇黑巧克力″，是指该组合物具有降胆甾醇的性质。
可可多酚可以是天然来源，即，衍生自可可豆，或合成制备的。所属领域技术人员可以基于可利用性或成本选择天然或合成可可多酚。可可多酚可以以含可可多酚的可可组分的形式含在所述组合物内，例如，巧克力中含有的巧克力液，或者可以独立地加入可可组分，例如，作为提取物，提取馏分，分离和纯化的各个化合物，合并的提取馏分或合成制备的化合物。
所述可可多酚包括可可黄烷醇和其低聚物。黄烷醇包括(+)-儿茶素，(-)-表儿茶酸和其各自的差向异构体(例如(-)-儿茶素和(+)-表儿茶酸)，并且具有结构
所述矢车菊苷配质低聚物可以具有2-约18，优选2-约12，和最优选2-约10个单体单元。例如，低聚物可以是二聚体，三聚体，四聚体，五聚体，六聚体，七聚体，八聚体，九聚体和十聚体。在所述低聚物中，单体经(4→6)和/或(4→8)的黄烷间键相连。具有唯一(4→8)键的低聚物为直链；同时至少一个(4→6)键的存在得到支链化的低聚物。在花生皮多酚的情况中，还存在键，例如C2→O→C7。
所以，式An的聚合化合物或其药学可接受盐，可以用于本发明的组合物和方法中 其中n是2-18的整数，因此存在至少一个末端单体单元A，和一个或多个附加单体单元；R是3-(α)-OH，3-(β)-OH；相邻单体之间的键存在于选自4、6和8的位置；附加单体单元的4位中的键具有α或β立体化学；X、Y和Z选自单体单元A或氢，条件是对于至少一个末端单体单元，其附加单体单元的键位于4位且选择性地是Y＝Z＝氢。
可可多酚可以通过萃取可可豆、可可尖或可可组分例如巧克力液、部分脱脂的可可固体，和/或完全脱脂的可可固体来制备。优选地，提取物由完全或部分脱脂可可粉制成。可以使用得自Theobroma、Herrania或其之间和内部品种杂交的任何品种的豆。提取物可以由发酵过的、发酵中的或未发酵的豆制备，发酵过的豆具有最小量的可可多酚而未发酵的豆具有最多量的可可多酚。豆的选择可以基于豆的发酵因数而定，例如，可以由具有约275或更小发酵因数的豆进行提取。通过控制发酵的程度使可可组分和其提取物中多酚水平最佳化可以按照国际专利申请No.PCT/US97/15893所述内容进行，其公开号为WO98/09533，其相关部分在此引入作为参考。
可可多酚可以自通过传统可可加工方法(例如在《工业巧克力制造和应用》中，Beckett编辑，S.T.，Blackie Acad.&Professional，New York，1997，如1、5和6章所述)或利用Kealey等的美国专利6,015,913所述改进的加工方法加工的可可组分进行提取，该改进的加工方法与传统方法相反保留了可可组分中的多酚(防止其破坏)。改进的可可加工方法省略了传统焙烧步骤。由此，可以使用通过(a)将可可豆加热一段时间且温度足以使可可壳疏松同时不焙烧可可尖；(b)精选使可可尖与可可壳分开；(c)螺旋压榨可可尖和(d)回收可可奶油和部分脱脂的可可固体，其含有保留水平的可可多酚，获得的可可组分。该方法保持了比传统加工方法更高水平的高级矢车菊苷配质低聚物。这种方法制备的可可固体可含有超过20,000μg的总黄烷醇和/或矢车菊苷配质/克无脂肪固体；优选大于25,000μg/g，更优选大于28,000μg/g，和最优选大于30,000μg/g。鉴于本发明的目的，总黄烷醇和/或矢车菊苷配质量按照实施例2所述方法测定。
可可多酚可以用溶解该多酚的溶剂自上述来源提取。适当的溶剂包括水或有机溶剂，例如甲醇，乙醇，丙酮，异丙醇和乙酸乙酯。也可以使用溶剂混合物。当用水作为溶剂时，可以将其轻微酸化，例如用乙酸。某些溶剂的实例是水和有机溶剂的混合物，例如含水的甲醇、乙醇或丙酮。含水有机溶剂可以含有，例如，约50％-约95％的有机溶剂。所以，可以采用含约50％、约60％、约70％、约80％和约90％有机溶剂的水。溶剂还可以含有少量的酸例如乙酸，譬如，含量为约0.5％-约1.0％。提取物的组合物，即，矢车菊苷配质低聚物的表现(即，低聚物性能)和量，将取决于溶剂的选择。例如，水提取物主要含有单体，乙酸乙酯提取物含有单体和低级低聚物，主要是二聚体和三聚体，含水甲醇、乙醇或丙酮提取物含有单体和大量的高级低聚物。提取单体和高级矢车菊苷配质低聚物的一种溶剂是约70％丙酮。然而，任何含有多酚的提取物都适用于本发明。所属领域已知可可多酚的提取方法并描述在，例如，Romanczyk等的美国专利5,554,645和国际专利申请PCT/US97/05693(公开号WO97/36497)中。所以，在一实施方式中，可可提取物通过将可可豆细化为可可粉，对该粉末进行脱脂，提取可可多酚，并且纯化该提取物来制备。可可粉可以由冷冻干燥可可豆和制浆，脱浆和去壳该冻干的可可豆，和研磨该去壳的豆来制备。
可以纯化该可可多酚，例如，通过除去咖啡因和/或可可碱，并且进一步通过凝胶渗透色谱和/或高压液体色谱(HPLC)纯化。凝胶渗透色谱(例如在Sephadex LH-20上)可以用于富集高级矢车菊苷配质低聚物的提取物。譬如，可以直至选择的低聚物开始由柱洗脱出来才收集含有单体和低级低聚物的洗脱物。此类提取物的实例是所属领域已知的且公开在国际专利申请PCT/US97/05693(WO97/36497)的实施例5中，其相关部分由此引入作为参考。通过使用制备HPLC，例如，标准相HPLC，可以将提取物分级为，例如，单体和含有至少50重量％的单体或特定低聚物的低聚馏分。当特定馏分含有单体或任何低级低聚物(例如二聚体，三聚体或四聚体馏分)时，该馏分含有约90-95重量％的特定低聚馏分。所需馏分可以在分离后合并得到所选择的低聚物的组合，例如含有低聚物3-10或5-10。所属领域技术人员可以在本说明书的指导和本领域公知常识，例如，Romanczyk等的美国专利5,554,645和国际专利申请PCT/US97/05693(公开号WO97/36497)的教导下，控制色谱条件以达到所需矢车菊苷配质性能。
单体馏分通常含有单体表儿茶酸和儿茶素的混合物；并且低聚物馏分通常含有二聚体(在二聚体馏分中)、三聚体(在三聚体馏分中)、四聚体(在四聚体馏分中)等的混合物。单体和低聚物的混合物出现在分离的馏分中，因为可可含有不止一种的各种单体、二聚体等。低聚物可变性是由于两种单体和低聚物中连接单体的化学键导致的，两种单体是指表儿茶酸和儿茶素，它们是矢车菊苷配质的结构单元。所以，可可二聚体主要是B2和B5，其各自含有两个表儿茶酸的单体。各单体和低聚物可以利用反相HPLC获得，例如使用C18柱。
可可多酚可以用于本发明的组合物中作为可可提取物，例如溶剂获得的萃取物、可可馏分、分离的化合物或可可组分的形式或含有有效量的可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质的巧克力。可可组分可以利用传统可可加工方法制备，但优选利用Kealey等的美国专利6,015,913所述的方法制备。另外，为了提高可可多酚的水平，可以使用由可可豆制备的具有约275或更小发酵因数的巧克力液和可可固体。这些组分具有的可可多酚含量高于用传统可可加工方法(例如焙烧)和完全发酵的豆获得的含量。巧克力可以利用常规技术由上述组分或利用国际专利申请PCT/US99/05414(公开号WO99/45788)所述的在巧克力制造中保留可可多酚的改进方法来制备，该国际专利申请相关部分在此引入作为参考。通过至少一种的下列非传统方法制备的巧克力在此称作″具有保存量的可可多酚的巧克力″(i)由发酵下的或未发酵的可可豆制备可可组分；(ii)在可可组分制造过程中保留可可多酚；和(iii)在巧克力制造过程中保留可可多酚。
在某些实施方式中，该组合物含有至少一种低聚物，例如二聚体。这种组合物可以另外含有至少一种单体或单体的组合，例如儿茶素和表儿茶酸。在另一实施方式中，还制备和使用了含有单体儿茶素和表儿茶酸的组合的组合物，例如分离自可可的单体馏分的形式。
还可以使用合成的矢车菊苷配质，通过所属领域的已知方法制备，并且描述在例如国际专利申请PCT/US98/21392(公开号WO99/19319)中，其相关部分在此引入作为参考。也可以使用可可多酚衍生物。这些包括没食子酸化的单体和低聚物，葡糖基化的单体和低聚物，和其混合物；矢车菊苷配质单体和低聚物的代谢产物，例如硫酸化的、glucoronidated，和甲基化形式；和结肠微生物区系代谢或哺乳动物内部代谢生成的矢车菊苷配质的酶裂解产物。衍生物可以来自天然来源或合成制备。
组合物可以选择性地含有降胆固醇剂。可以使用任何降胆固醇剂而不考虑其作用方式。适当的制剂可以通过降低哺乳动物的胆汁内胆固醇吸收或通过减少胆固醇合成来发挥作用。适当制剂的实例为植物甾醇、phytostanol及其衍生物和异构体；大豆蛋白质；可溶性纤维，例如β-葡聚糖，例如，得自燕麦和欧车前、坚果、稻麸油，它们各自都特别适合用在食品、食品强化剂和食品添加组合物中。已知的降胆固醇药物也可以使用，但不适宜用于食品和食品添加组合物中，而可以用于药物中。对于所属领域技术人员来说显然降胆固醇剂的选择取决于预期施用载体(例如食品，强化剂，药物)和施用的方式。所以，降低胆汁内胆固醇吸收的制剂对于静脉内给药来说不适宜。同样地，如果施用载体是食品，具有强烈药物味道或气味的降胆固醇剂可能不是所需的。
植物甾醇是不溶于水并具有与胆固醇类似的分子量和结构的植物甾醇。植物甾醇降低胆汁中胆固醇的吸收(内源性和饮食的胆固醇两者)以及血清胆固醇水平(总量和LDL)，但其本身不被吸收。超过40种植物甾醇已经被鉴定，但β-谷甾醇，菜油甾醇和豆甾醇最丰富。适用甾醇的其他实例是菜子甾醇、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇。各甾醇或甾醇的混合物，分离自天然来源或合成，并且可以使用其异构体和衍生物。特别适用的是甾醇的饱和衍生物，称作stanol，其中环内的全部碳-碳键是饱和的。适宜的stanol具有28或29个碳原子并且包括β-谷甾烷醇(sitostanol)，clionastanol，22，23-dyhydrobrassicastanol和campestenol。植物甾醇可以是固体(例如粉末、颗粒)或液体(例如油)形式。
所述甾醇和stanol在多种植物原料中被发现，如例如国际专利申请PCT/EP96/02344所述。甾醇/stanol的示范性来源是松树树皮、豆油、妥尔油、竹笋提取物(国际专利申请PCT/US98/12556所述，公开号WO98/57545)，可可壳和油，和稻麸油。妥尔油，一种纸浆和造纸工业的副产物，是stanol，即β-stanol的良好来源。
植物甾醇可以得自天然来源，例如植物油、植物油沉淀物、植物油蒸馏物，和其他植物油来源，例如通过相对简单和低成本方法获得的妥尔油。譬如，利用溶剂如甲醇由植物油沉淀物制备甾醇的方法如Hamunen的美国专利4,420,427所述。发现在天然中stanol含量少，但很容易利用所属领域的技术人员已知的多种方法中的任意一种通过氢化甾醇由甾醇制备。当由植物原料制备甾醇原料时，它将含有多种不同甾醇的混合物，由此，在氢化后，所得stanol也是不同stanol的混合物。该混合物适合用于本发明。但是，纯净的特定甾醇制品也可以被氢化以生成可以使用的纯净stanol。
由可可壳提取的可可油是植物甾醇的良好来源。可可植物甾醇是游离和结合甾醇的混合物，并且游离甾醇最多是存在的植物甾醇的约90％。植物甾醇包括菜油甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇，环阿屯甾醇(cycloartenoyl)、24-亚甲基环阿屯甾醇，以及少量的其他植物甾醇。结合的植物甾醇包括植物甾醇的脂肪酸酯或阿魏酸衍生物。可可油还含有母育酚类，其包括生育酚类(它们具有抗氧性质)和tocotrienol类(它们可具有降胆固醇活性)。可可油通过包括下列步骤的方法制备(i)研磨可可壳；(ii)用适于植物甾醇的溶剂提取粉碎的可可壳；(iii)除去溶剂；和(iv)回收可可油。可可壳，可可豆焙烧的一种副产物，可以来自干燥的发酵可可豆、微粉化可可豆、焙烧的可可豆，并且优选得自干燥未发酵的豆，其具有最高的总甾醇含量。优选的可可豆是Theobroma可可。优选的溶剂是石油醚、己烷、戊烷和乙醚。溶剂可以通过真空蒸馏回收。在一实施方式中，用Tekmar Mill(Cincinatti，OH)将冻干的壳研磨为细粉，并且粉碎物用再蒸馏石油醚(b.p.38-39.6□)在Soxtec装置(Fisher Scientific，Springfield，NJ)中提取过夜。次日清晨，通过在氮气流下缓慢蒸发小心除去溶剂，并且所得提取物储存在-40℃下。植物甾醇随后可以通过制备HPLC或柱色谱纯化。
还可以使用甾醇和stanol两者的酯化形式。酯化使甾醇/stanol更加可溶于脂肪和油，在某些情况中，这样有助于其掺混在食品或其他施用载体中。例如，甾醇可以用脂肪酸酯酯化。酯化的甾醇实例包括谷甾醇乙酸酯、谷甾醇油酸酯和豆甾醇油酸酯。stanol酯可以按照现有技术并且例如van Amerongen等的美国专利6,031,118、Higgins的美国专利5,892,068、Miettenen等的美国专利5,502,045，和国际专利申请PCT/CA99/00655(公开号WO00/04887)所述方法制备。在一实施方式中，适用的stanol酯是通过用C2-C22脂肪酸酯按照Miettenen等的美国专利5,958,913所述方法酯化至少一种甾醇来制备。所属领域的其他已知方法可以用来提高甾醇/stanol在给予哺乳动物时的溶解度。一种此类方法如Ostlund的美国专利5,932,562所述，其中甾醇/stanol与卵磷脂混和得到水溶性粉末。
甾醇/stanol可以以粉末形式通过与其他组分混和加入到所述组合物中。在食品组合物的情况中，stanol/甾醇以及其他降胆固醇剂通常是在混和步骤时加入。在制备降胆固醇巧克力的过程中，譬如，甾醇/stanol可以加入到含糖、熔融奶油的干燥混合物；研磨之前的可可尖；或融化的巧克力中，但它们可能不优选。为了便于混和，甾醇/stanol首先可以溶解在增溶剂例如脂肪、植物油、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、生育酚及其混合物中。制备甾醇/stanol的混悬液和乳液的有效载体是水、醇、多元醇、其他可食用化合物例如巧克力液，其中甾醇/stanol至少部分可溶，以及其混合物。
大豆蛋白质可以以任何已知方式加入到所述组合物中，例如，可以是大豆蛋白质分离物、大豆蛋白质浓缩物、textured大豆蛋白质或豆粉、饼和粗粉。也可以使用整颗粒或其碎片，如按照实施例5中所述。不同形式的大豆蛋白质是所属领域公知的且可商购。其性质和获得方法公开在例如Soy Protein and Human Nutrition，Wilcke等编辑，Acad.Press，NY，1979。大豆蛋白质可以与任何甾醇和/或stanol类降胆固醇剂联合使用。
可溶性植物纤维，例如β-葡聚糖，能够降低血浆胆固醇。本发明使用的纤维可以得自任何β-葡聚糖的来源，优选燕麦颗粒和燕麦糠。纤维可以按照该领域的已知方法制备并加入到组合物中。它们特别适合于口服给予的组合物，例如食品和食品强化剂。β-葡聚糖和其他可溶性植物纤维可以与任何甾醇和/或stanol类降胆固醇剂联合使用。
本发明的组合物也可以含有L-精氨酸，其可以提供不同形式的本发明组合物，例如作为纯化的化合物，得自含L-精氨酸植物的提取物，或种子/坚果组分的形式，例如坚果粉，或作为全种/坚果。可以使用任何L-精氨酸来源，合成的或天然的。优选的L-精氨酸来源是大豆和坚果肉，例如花生，胡桃，杏仁和榛实。可以使用脱脂和部分脱脂坚果肉。这些可以是粉碎的并且称作坚果粉。
组合物还可以含有钙，钾，镁，抗氧剂例如维生素E和维生素C，任何维生素B的复合物，类胡萝卜素，瓜尔胶，或者一或多不饱和脂肪酸(例如ω-3脂肪酸)，它们可以按照该领域的已知方法获得。一或多不饱和脂肪酸可以以橄榄油、鱼油或坚果的形式使用。适合这种用途的坚果的实例是花生，杏仁和胡桃。
本发明的组合物用作食品、食品添加剂、食品强化剂或药物。所述组合物可以含有载体、稀释剂或赋形剂。根据预期的用途，可以选择适合人体或兽医、食品、添加剂、强化剂或药物使用的载体、稀释剂或赋形剂。
在此使用的″食品″是基本上由蛋白质、碳水化合物和/或脂肪组成的物质，其用于生物体中来支持生长、修复和生命过程并且供给能量。食品也可以含有补充物质，例如矿物质、维生素和调味品。参见Merriam-Webster的Collegiate Dictionary，第10版，1993。术语食品包括适合人或动物消耗的饮料。在此使用的″食品添加剂″在FDA的21 C.F.R.170.3(e)(1)中作了定义并且包括直接和间接添加剂。在此使用的″药物″是医学药物。参见Merriam-Webster的Collegiate Dictionary，第10版，1993。药物也可以称作医药。在此使用，″食品强化剂″是补充给食物使其带有或含有一种或多种下列营养组分的产品(不是烟草)维生素，矿物质，药草或其他植物性药材，氨基酸，人使用的通过增加全天摄取补充营养的营养物质，或浓缩物，代谢物，组分，提取物或这些组分的联合。
包括由于可可多酚或其衍生物的存在得到改进的饮料在内，如甲基化化合物或代谢分解产物，并且选择性地与降胆固醇剂、L-精氨酸、钙、钾、镁、抗氧剂例如维生素E和维生素C、任何维生素B的复合物、类胡萝卜素、瓜尔胶和/或一或多不饱和脂肪酸(例如ω-3)联合使用的任何常规食品，属于本发明的范围内。
上述改进可以通过下列方法达到(i)将可可多酚或其衍生物加入到不含有可可多酚的食品或(ii)当传统食品可能含有可可多酚时，例如巧克力，通过使多酚水平提高至高于传统制成食品中发现的水平。增强作用可以通过下述方法得到，通过加入附加可可多酚，例如，提取物、馏分或由它们分离和纯化的化合物的形式；通过加入可可多酚与其他含多酚组分(例如坚果皮)；通过按照上述方法控制可可组分的加工和可可豆选择，从而保留用于食品生产中的可可组分中的可可多酚；或通过按照上述方法控制巧克力制造过程。由此，这些食品(包括饮料)与相对的常规食品(包括饮料)相比，含有″升高水平的多酚″(包括可可矢车菊苷配质)。具有升高水平多酚的巧克力的实例是当巧克力制造商加入含可可多酚的可可提取物到其原市售产品中时出现的。该食品也可以称作″高可可多酚食品，″即，它们比其传统相应物具有更高水平的多酚。
含有可可多酚和选择性地含有至少一种降胆固醇剂(例如甾醇和/或stanol类降胆固醇剂)、L-精氨酸、钙、钾、镁、抗氧剂例如维生素E和维生素C、任何维生素B的复合物、类胡萝卜素、瓜尔胶或者一或多不饱和脂肪酸(例如ω-3)的食品可以适合人体或兽医用途，并且包括宠物食品。食品可以不是甜食，然而，优选的降胆固醇食品是甜食例如标准的特性(SOI)和非SOI巧克力，例如牛奶、甜味和半甜味的巧克力(包括黑巧克力)、低脂巧克力和糖果，其可以是巧克力转化的糖果。其他实例包括烘焙产品(例如果仁巧克力饼，烘焙点心，糕点，饼干)调味品，granola棒，太妃糖，粗粉替代棒，spread，糖浆，粉末饮料混合物，可可或巧克力味饮料，布丁，米饼，米混合物，开胃调味汁等。如果需要，食品可以是巧克力或可可矫味的。除含有可可多酚和降胆固醇剂以外还含有L-精氨酸的食品优选是含有坚果的巧克力和糖果棒，例如granola棒，例如，花生，胡桃，杏仁和榛实。应该注意到，向本文所述食品中加入带皮的坚果也可以提高总的多酚含量，因为，例如花生皮含有约17％黄烷醇和矢车菊苷配质，并且杏仁皮含有约30％黄烷醇和矢车菊苷配质。在一实施方式中，将坚果皮加入到含降胆固醇剂的巧克力糖的牛轧糖中。
在某些实施方式中，非巧克力食品含有至少约5微克/g-约10mg/g，并且，例如，至少5微克/g食品，优选至少10微克/g，更优选至少100微克/g的可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质低聚物。如果需要，非巧克力食品可以含有比在下述巧克力食品中发现的高很多的可可矢车菊苷配质水平。
在一实施方式中，巧克力甜食含有有效量的可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质用于心率失常或者一般地任何与间隙连接联系异常有关的病症，例如神经变性疾病的治疗、预防、减小其危险性和降低其发生率。所述的巧克力甜食可以是牛奶或黑巧克力。在某些实施方式中，基于产品中非脂肪可可固体的总量计，所述巧克力含有至少3,600微克，优选至少4,000微克，优选至少4,500微克，更优选至少5,000微克，并且最优选至少5,500微克可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质/克的巧克力。在其他实施方式中，基于产品中非脂肪可可固体计，所述巧克力含有至少6,000微克，优选至少6,500微克，更优选至少7,000微克，和最优选至少8,000微克的可可矢车菊苷配质/克，甚至更优选10,000微克/g。
基于牛奶巧克力产品中非脂肪可可固体的总量计，牛奶巧克力甜食可以具有至少1,000微克，优选至少1,250微克，更优选至少1,500微克，并且最优选至少2,000微克可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质/克牛奶巧克力。在一优选实施方式中，基于牛奶巧克力产品中非脂肪可可固体的总量计，牛奶巧克力含有至少2,500微克，优选至少3,000微克，更优选至少4,000微克，并且最优选至少5,000微克可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质/克的牛奶巧克力。
L-精氨酸在食品中的含量可以变化。通常，可可含有1-1.1克的L-精氨酸/100克部分脱脂的可可固体。每100克可可中可以在0.8-1.5的范围内。本发明的巧克力食品含有含量大于天然存在于可可组分中的L-精氨酸。了解了食品中可可组分和L-精氨酸的用量，所属领域普通技术人员可以很容易确定出最终产品中的L-精氨酸总量。食品一般含有至少5微克/克，优选至少30微克/克，或至少60微克/克，甚至更优选至少200微克/克食品。
当食品中使用降胆固醇剂时，其含量取决于所用制剂的类型并且可以由所属领域技术人员基于本说明书的教导，特别是下面提供的日剂量，和该领域的知识进行确定。食品组合物，例如，可以含有约0.5-约10g/45g供给量，优选约1.5-约5g/45g供给量，最优选约2-约4.5g/45g供给量的甾醇/stanol。对于大豆蛋白质和得自燕麦的可溶性纤维，FDA已经规定了每种食品份(serving)能够符合健康要求的最低量。按照FDA，含有β-葡聚糖的食品份必须含有至少0.75g，并且含有大豆蛋白质的食品份必须含有至少6.25g的大豆蛋白质。这些值也可以用作确定这些降胆固醇剂在食品中的含量的依据。
在单一份中可以提供日有效量的可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质。所以，甜食(例如巧克力)可以含有至少约100mg/份(例如150-200，200-400mg/份)可可矢车菊苷配质。当降胆固醇剂含在组合物中时，可以加入至少1.5(例如1.5-4.5g)/份甾醇/stanol。
含有可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质，选择性地与降胆固醇剂和/或L-精氨酸组合的药物可以以多种方式给药，例如口服、舌下、经颊、经鼻、直肠、静脉内、非肠道和局部给药。所属领域技术人员应能够根据给药方式决定适当的降胆固醇剂。所以，适合各种给药方式的剂型属于本发明的范围内并且包括固体、液体和半固体剂型，例如片剂、胶囊、明胶胶囊(gelcaps)、大量或单位剂量的散剂或颗粒剂、乳剂、混悬剂、糊剂、霜剂、凝胶剂、泡沫剂或果冻。缓释剂型也属于本发明的范围内并且可以按照美国专利5,024,843；5,091,190；5,082,668；4,612,008和4,327,725所述制备，其相关部分在此引入作为参考。适当的药物可接受载体、稀释剂或赋形剂通常是该领域已知的并且可以很容易地由所属领域技术人员确定。譬如，片剂可以含有有效量的含可可多酚组合物和选择性的载体，例如山梨糖醇、乳糖、纤维素或磷酸二钙。
含有可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质和选择性含有至少一种降胆固醇剂和/或L-精氨酸的食品强化剂可以利用所属领域已知的方法制备，并且可以含有，例如，营养素如磷酸二钙、硬脂酸镁、硝酸钙、维生素和矿物质。
进一步属于本发明范围内的是含有本发明组合物的包装(例如食品，食品强化剂，药物)和指示可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质和/或其衍生物的存在或高含量，或指导所述组合物用于心率失常或与细胞间隙连接联系异常有关的任何病症如神经变性疾病的治疗、预防、降低发生率或减小危险性的标签。任选地，标签可以指明降胆固醇剂和/或L-精氨酸含量，组合的多酚、降胆固醇剂和选择性L-精氨酸的有益性质。该包装可以包含所述组合物和用于心率失常或与细胞间隙连接联系异常/缺陷有关的任何病症如神经变性疾病或癌症的治疗、预防、减小危险性、减慢进程或减小发生率的说明书。
在此使用，″治疗″是指改善现有医学病症，例如，心律失常，或与其有关的症状。术语″预防″是指减小与疾病恶化有关的危险性，包括减小疾病的发作。预防或防止可以用于已知处于恶化疾病的高危险性的个体或保持良好健康的人群，譬如，减小心率失常的危险性。该方法可以用于人或兽医动物，例如狗、猫和马。
所述的方法包括给哺乳动物，优选人或兽医动物，施用有效时间阶段(例如，诱发de novo连接蛋白合成)、有效量的含有黄烷醇和/或其相关低聚物的组合物，例如可可黄烷醇和/或其相关低聚物，选择性与降胆固醇剂、L-精氨酸、抗氧剂(例如维生素E，维生素C)组合，该黄烷醇和/或其相关低聚物达到心率失常或任何与间隙连接异常/缺陷有关的病症例如神经变性疾病(例如帕金森和阿耳茨海默氏病)治疗、预防或降低发生率的有效量。此外，与连接蛋白、例如连接蛋白40和/或43有关的认知机能障碍的治疗也属于本发明的范围内。所以，连接蛋白有关的功能可以被治疗或改进。可以通过本发明治疗的认知机能障碍的实例是短期记忆和抑郁。也可以使用其他多酚例如那些分离自花生皮的多酚。
所以，下列用途属于本发明的范围内。可可黄烷醇和/或其低聚物在用于人或兽医动物中涉及缺损性间隙连接联系的疾病的治疗、预防、减小危险性，或减慢进程的药物、食品、nutraceutical或食品强化剂的制备中的用途。
下列用途是某些实施方式的代表。可可黄烷醇和/或其低聚物在用于人或兽医动物中心律失常的治疗、预防、减小危险性，或者降低发生率的药物、食品、nutraceutical或食品强化剂的制备中的用途。可可黄烷醇和/或其低聚物在用于人或兽医动物中认知机能障碍的治疗、预防、减小危险性，或者减慢进程的药物、食品、nutraceutical或食品强化剂的制备中的用途。
式An的聚合化合物或其药学可接受盐，可以用于本发明的组合物和用途。
其中n是2-18的整数，由此存在至少一个末端单体单元A，和一个或多个附加单体单元；R是3-(α)-OH，3-(β)-OH；相邻单体之间的键位于选自4、6和8的位置；附加单体单元位于4位的键具有α或β立体化学；X、Y和Z选自单体单元A或氢，条件是对于至少一个末端单体单元，其附加单体单元的键位于4位并且选择性地为Y＝Z＝氢。
所属领域技术人员可以利用本文提供的教导确定有效量。例如，有效量可以譬如是为了在哺乳动物机体内达到生理相关浓度。此类生理相关浓度可以是至少20纳摩尔(nM)，优选至少约100nM，并且更优选至少约500nM。在一实施方式中，在哺乳动物的血液中达到至少约1微摩尔。
该方法可以进一步包括测定治疗的有效性，通过例如测定心搏，例如利用心电图(ECG)、流动监测器、holter监测器、transtelephonic监测器(选择性地带有记忆回路)、应激试验、超声波心动图、心脏导管插入术、电生理研究和正头倾斜试验(head upright tilt test)。
所述的组合物可以给予健康哺乳动物用于预防目的或给予需要治疗或存在至少一种与心率失常有关的危险因素的哺乳动物。任何具有至少一种与心率失常有关的危险因素的个体都是施用本发明组合物的对象。具有心律失常、高血压、冠状动脉疾病、心脏病发作、甲状腺机能异常家族病史的个体以及那些吸烟、具有酒精、咖啡因或非法物质摄取(例如可卡因)的个体，或者那些由心脏手术恢复的个体，是需要本文所述治疗的易感个体。其他易于发生血管健康问题的哺乳动物群体对所属领域技术人员而言是显而易见的。
兽医动物，例如狗、猫和马，可以施用上述组合物用于心律失常的治疗、预防或降低发生率。
用于心率失常的治疗、预防、减小危险性和/或降低发生率的有效量可以由所属领域技术人员利用本文提供的指导和本领域的公知常识进行确定。可可黄烷醇和/或有关低聚物可以给予约50mg/天-约1000mg/天，优选约100-150mg/天-约900mg/天，并且最优选约300mg/天-约500mg/天。然而，当给予可可多酚无毒时，可以采用高于上述的用量。
为了另外获得降胆固醇效果，利用甾醇/stanol，应该给予多于通常非素食者平均饮食的量。一名北美人的典型饮食是每天消耗约200-400mg。所以，当植物甾醇，例如谷甾醇，用于降低胆固醇水平时，应该给予约至少1g/天，优选至少约3g/天。优选地，采用至少约1g/天，优选至少约4.5g/天-约20g/天。然而，用量应根据植物甾醇的降胆固醇效价变化，例如，如果使用更有效的sitostanol，有效量可以降低至约1-约3g/天。该用量可以利用Roger等，J.Amer.Oil Chem.Soc.70(30)1993和Carpenter等，J.Amer.Oil Chem.Soc.71(8)1994所述的分析方法进行测定。可以给予大豆蛋白质，例如，至少约25g/天。其他指导可以参见Recommended Daily Allowances，第9版，National Res.Council/National Acad.Sci.，Washington，D.C。可以施用可溶性纤维，例如，至少3g/天的量。
当用于组合物和治疗中时，L-精氨酸可以施用约2g/天-约50g/天，优选约3g/天-约10g/天，并且最优选约6g/天-约8g/天。在此，给予食品中天然存在的L-精氨酸时，可以采用高于上述的量。多酚一般可以以所属领域已知的量给药。当确定有效量时，还可以考虑甾醇/stanol存在下吸收的增强。
作为一个方案，可以持续治疗/预防性给药，即有效时间阶段，例如，每天、每月、每月2次、每年2次、每年1次，或者在某些其他方案中，由有经验的医学执业者决定所需要的时间。给药可以持续至少诱发连接蛋白合成所需的时间阶段。优选地，每天施用组合物，首选每天2或3次，例如，清晨和夜晚以保持有效化合物在哺乳动物机体内的水平。为了获得最有益的效果，所述组合物可以给药至少约30-约60天。这些方案可以定期重复。
在下列非限定实施例中进一步说明本发明。
实施例实施例1可可黄烷醇/矢车菊苷配质对细胞的间隙连接联系的影响细胞培养物在35mm塑料盘中，WB-F344大鼠肝脏上皮细胞(由Dr.Trosko，East Lansing，MI友情提供)在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中生长，该培养基补充有10％胎牛血清(FCS)，2mM L-谷酰胺和青霉素/链霉素。细胞在37℃下在含5％CO2的加湿气氛中培养。融合细胞在DMEM(无FCS)中培养24小时以降低细胞-细胞联系的基础水平。将(-)-表儿茶酸、染料木素(Sigma)或TPA溶解在DMSO中并且加入到培养基；对照只接受DMSO。培养基中DMSO的终浓度为0.2％。表儿茶酸二聚体按照Adamson等所述(″HPLC Method for theQuantification of Procyanidins in Cocoa and Chocolate Samples andCorrelation to Total Antioxidant Capacity″J.Ag.Food Chem.，Vol.710，4184-4188)制备，其相关部分在此引入作为参考。
间隙连接联系分析细胞用(-)-表儿茶酸(4-40μM)和染料木素(40μM)处理24和72小时并且测定GJIC。对于采用TPA的试验，该培养采用TPA(1，5，10nM)，TPA(1，5，10nM)+表儿茶酸(40μM)，和TPA(1，5，10nM)+染料木素(40μM)进行990分钟；DMSO(0.2％)用作对照。用显微操作器和微量注射系统(Eppendorf)通过微量注射荧光染料荧光黄CH(在0.33MLiCl中10％)到选定的细胞中来测定GJIC。注射后1分钟，计算单细胞四周带有染料的萤光细胞的数量。每盘中注射10个单个细胞并且计算出荧光相邻细胞的平均数。用带有CCD照相机的Zeiss axiovert荧光显微镜(ORCA II，Hamamatsu)采集图像。
蛋白质印迹分析为了获得细胞溶解产物，WB-F344大鼠肝脏上皮细胞用PBS(2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，137mM NaCl，10mM Na2HPO4；pH7.4)洗涤，并用SDS-PAGE溶胞缓冲液(125mM Tris，4％SDS，20％甘油，100mM二硫苏糖醇，0.2％溴酚蓝；pH6.8)处理2次。超声后，该溶解产物在95℃下加热5分钟并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％(w/v)丙烯酰胺)。凝胶印迹在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用多克隆白兔抗-Cx43抗体(Zymed)作为初级抗体和用山羊抗白兔IgG(Dianova)作为二级抗体进行免疫检测。
免疫组织化学对于免疫组织化学，WB-F344细胞在35mm塑料盘内的盖片上于含有FCS的完全培养基中生长，直至它们达到90％的融合。细胞与1、5或10nM TPA，40μM(-)-表儿茶酸或40μM染料木素或40μM(-)-表儿茶酸和(1、5、10nM)TPA的组合或40μM染料木素和(1，5，10nM)TPA的组合一起培养90分钟；DMSO(0，2％)用作对照。处理后，细胞用PBS洗涤且用甲醇在-20℃下固定10分钟。进一步用PBS洗涤后，室温下非特异性结合位点用3％正常山羊血清(NGS)在含0.3％(v/v)Triton-X-100的PBS中封阻45分钟。细胞用多克隆抗-Cx43抗体(Zymed)培养；4℃下在含有1％(v/v)NGS的PBS中1∶1500稀释过夜。细胞用PBS洗涤，并且用Alexa 546-偶联的山羊抗白兔IgG(H+L)二级抗体(分子探针；在PBS中稀释至1∶800)在37℃下培养45分钟。洗涤和镶嵌后，用带有CCD照相机的Zeiss axiovert荧光显微镜(ORCA II，Hamamatsu)采集图像。
结果染料木素在高于10μM的水平下影响细胞培养物中的GJIC[ZhangYW，Morita I，Nishida M，Murota SI.Involvement of tyrosine kinase inthe hypoxia/reoxygenation-induced gap junctional intercellularcommunication abnormality in cultured human umbilical veinendothelial cells.J Cell Physiol 1999；180305-13.]。
在本研究中，使WB-F344大鼠肝脏上皮细胞暴露于染料木素或(-)-表儿茶酸(40μM)下从而诱发GJIC的刺激，该刺激依赖于培养的时间。暴露24小时后，染料木素和(-)-表儿茶酸对GJIC的刺激分别是对照的2.1倍和1.5倍。在培养72小时后，染料木素提高至是对照的2.9倍并且(-)-表儿茶酸是对照的2.1倍。对照是只用DMSO(0.2％)处理；基线联系在24小时下为13.4±1.0细胞并且在72小时下为12.1±1.3细胞。图1显示用染料转移试验测定的联系量度的典型实施例；对照(图1A)，用TPA(10nM)在90分钟后抑制(图1B)，用染料木素(图1C)或(-)-表儿茶酸(图1D)在40μM下处理72小时后刺激。
两种黄酮在90分钟培养后对GJIC均没有显著作用。随着细胞培养基中(-)-表儿茶酸水平的增高(4-40μM)，联系细胞的数量增加(表1)。在用最低浓度(4μM)处理的细胞中，联系仍然是溶剂对照的1.6倍。被测表儿茶酸的二聚体在20μM水平下刺激GJIC达到与40μM单体下的大致相同水平。
表1(-)-表儿茶酸和染料木素对WB-F344大鼠肝脏中的GJIC的影响细胞暴露于不同浓度的(-)-表儿茶酸(4-40μM)。在40μM下测定染料木素。培养72小时后测定联系。GJIC表示为通过染料转移分析测定的联系细胞的数目并表示为对照的％。对照用DMSO(0.2％)处理；基础联系是12.1±1.3细胞，其设定为100％。数据表示3个独立试验的平均值±SD。
化合物 联系细胞数 对照的％对照 (0.2％DMSO) 12.1±1.3 100±11(-)-表儿茶酸 4μM 18.1±2.2*156±18*10μM 20.1±6.8*173±56*40μM 24.2±3.1*209±26*表儿茶酸二聚体20μM 23.4±3.1*202±26*染料木素 40μM 35.4±2.4*293±20**明显不同于对照(p＜0.001)
TPA通过改变Cx43蛋白质影响GJIC。由于Cx43是WB344细胞中的主要间隙连接蛋白质，因而我们调查了TPA在(-)-表儿茶酸和染料木素的存在下对GJIC的影响(表2)。当细胞暴露在单独的TPA下90分钟时，细胞间联系在5和10nM的水平下完全打断(图1B)；当采用1nM TPA时，GJIC减小约40％。采用0.1nM TPA时没有发现这种影响。在全部试验中细胞存活率没有受到影响。细胞与TPA培养72小时对GJIC没有影响；联系细胞的数目相当于对照，即，在90分钟时观察到完全由损失达到恢复。
表2TPA对GJIC的抑制作用；(-)-表儿茶酸和染料木素的对抗作用。
细胞暴露于不同水平的TPA下和不同量TPA与40μM(-)-表儿茶酸或40μM染料木素的组合下。GJIC表示为对照的％。对照用DMSO(0.2％)处理；基础联系为18.6+/-2.9细胞，将其设定为100％。在培养90分钟后测定联系。数据代表3个独立试验的平均值+/-SD。
TPA(nM) TPA TPA+(-)-表儿茶TPA+染料木素(％对照)酸40μM(％对照) 40μM(％对照)0.1 94±14 95±14n.m.
155±19 95±19*90±23*50 61±15*83±18*10 0 50±16*72±17**明显不同于用TPA处理的(p＜0.001)平均值±SD(n＝3)n.m.没有测定当TPA与40μM的(-)-表儿茶酸或染料木素共同培养时，90分钟后TPA(5和10nM)作用的GJIC的完全损失被部分抵消。染料木素比(-)-表儿茶酸略微更有效。当与1nm的TPA一起使用时，这两种化合物使GJIC恢复到基础水平。
平行地，Cx43蛋白质在细胞中的分布通过免疫染色法进行调查(图2)。典型对照如图2A所示。细胞融合，并且连接蛋白定位在血浆膜。某些蛋白信号也可以在细胞质内检测到。在用TPA处理90分钟(10nM)后，膜相关的Cx43的信号急剧减小(图2B)，检测不到累积Cx43蛋白质的面积。当(-)-表儿茶酸(图2C)或染料木素(图2D)存在于细胞培养物中时，TPA的作用被衰减。可以在以簇结构组织的膜中检测到与对照相当的Cx43蛋白(图2A)。当采用1和5nM的TPA时，发现同样的(-)-表儿茶酸和染料木素的对抗作用。
实施例2黄烷醇/矢车菊苷配质的测定矢车菊苷配质定量如下使用商购的(-)-表儿茶酸制备组合物标准品，并且纯净状态的二聚体至十聚体是按照Hammerstone，J.F.等J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)490-496；Lazarus，S.A.等J.Ag.FoodChem.；1999；47(9)；3693-3701；和Adamson，G.E.等J.Ag.FoodChem.；1999；47(10)4184-4188所述方法制备得到的。使用这些化合物的标准储备溶液采用上面引用的Adamson参考文献所述的标准相HPLC方法进行分析，并且荧光检测是分别在276nm和316nm的激发和发射波长下进行。将峰分组且加合其面积以包括任意一种低聚物的所有异构体作出的贡献，并且利用二次拟合得到校准曲线。单体和较小的低聚物具有几乎线形的曲线，其与线性回归的现有使用一致，从而得到单体基础的和二聚体基础的校准曲线。
这些校准曲线随后用来计算样本中的矢车菊苷配质水平，样本制备如下首先，可可或巧克力样本(约8克)利用3次己烷提取从而脱脂(每次45mL)。其次，1克的脱脂原料用5mL的丙酮/水/乙酸混合物(70∶29.5∶0.5v/v)提取。随后通过将样本的HPLC数据与上述所得校准曲线(它采用纯的低聚物)进行比较测定出矢车菊苷配质在脱脂原料中的含量。利用标准方法通过Association of Official Analytical Chemists(AOAC Official Method 920.177)测定样本的脂肪百分比(用1克大小的巧克力样品或半克巧克力液样本)。此后计算出总矢车菊苷配质水平在原样本(含脂肪)中的量。在各样本运行之前进行校准从而保护免于柱-柱间的差异。
实施例3可可矢车菊苷配质，植物甾醇和其组合物的口服消耗的作用本试验的结果显示摄食得自妥尔油(″植物甾醇″)和可可粉(CPd)的非脂化植物甾醇和phytostanol的组合物对下列的影响，该组合物含有约70mg/g的总可可矢车菊苷配质，(1)氧化应激和损伤的指标，和(2)胆固醇水平，以及联合给予植物甾醇和可可矢车菊苷配质的协同作用。
纯化的蛋壳食物中补充有植物甾醇(2wt％)和/或CPd(0，.5，1，2wt％)并且用于喂食雄性大鼠达2周。将该大鼠分为8组(每组3只)并且按照下列喂食20-25g/天的对照和试验饲料饲料+2％植物甾醇(440mg/d)饲料-植物甾醇1组 0％CPd(0.0mg/d) 5组0％CPd(0.0mg/d)2组 .5％CPd(110mg/d) 6组.5％CPd(110mg/d)3组 1％CPd(220mg/d) 7组1％CPd(220mg/d)4组 2％CPd(440mg/d) 8组2％CPd(440mg/d)随意进食水并且通过称量残留食物/收集食物杯下撒出的食物来测定消耗量。每天测定食物摄取并且隔天测定大鼠体重。
测定氧化损伤/应激参数、胆固醇水平和吸收到血浆内的表儿茶酸。
利用Yagi所述方法的改进(Biochem Med 15212-6.1976)测定血浆TBARS。将100μL的全血加入到1ml的生理盐水中并且在1700g下离心15分钟。收集上清液且在-70℃下冷冻直至分析。通过磷钨酸/硫酸体系沉淀分离脂质。脂质馏分随后与硫代巴比土酸反应，并且用荧光测量所得加合物，用1，1′，3，3′-四羟基丙烷作为标准。结果表示为每毫升血浆的nM MDA并且是血浆多不饱和脂肪酸浓度的函数。
8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OH2′dG)测定如下。用Wako DNA ExtractorWB试剂盒(Wako Chemical USA，Inc.，Richmond，VA)分离核DNA。组织(100-250mg)或细胞(106细胞)在该试剂盒溶胞缓冲液中匀浆并在10,000g和4℃下离心20秒。颗粒状物用该溶胞缓冲液处理，所得颗粒状物溶于该试剂盒酶反应溶液中。加入RNA酶达到终浓度为20μg/ml，样本在50℃下培养10分钟。加入该试剂盒蛋白酶溶液并且50℃的培养再持续1小时。样本在10,000g和室温下离心5分钟并且上清液用该试剂盒NaI溶液和异丙醇处理以提纯DNA。沉淀在10,000g和室温下收集10分钟并且用该试剂盒溶液A和B洗涤。最终的颗粒状物迅速风干且重新悬浮在200μl的0.1mM desferyl/20mM乙酸Na中，pH4.8。按照Shigenaga等的方法(Methods Enzymol 23416-33，1994)同时进行某些改进来进行DNA消化和分析。简单而言，通过与核酸酶P1在0.1mg/ml的终浓度和65℃下培养15分钟使DNA消化为5′-一磷酸核苷酸。pH用1M Tris-HCl调整，并用pH8.5和小牛肠碱性磷酸酶进一步消化该样本为核苷酸(1小时，37℃)。样本的pH用3M乙酸钠缓冲液调整，并且加入pH5.1和0.1mM EDTA/0.1mM desferyl以防止金属介导的氧化。用30,000MW截止旋转过滤器(cutoff spinfilter)加入样本并置于HPLC注射瓶内。在制备的48小时内分析样本以防止人工制品形成。为了分析，将样本注射到带有电化学检测器的Hewlett Packard 1100 HPLC中(ESA，Coulochem II)。利用SupelcosilLC-18-DB柱(150×4.6mm，3微米粒度)和100mM乙酸Na缓冲液移动相，pH5.2，含5％甲醇，等渗的，在1.0ml/min的流速下进行分离。OH8dG是在450mV下用电化学检测法测定并且2′-脱氧鸟苷(dG)是在248nm下用UV检测法进行测定。OH8dG的水平是相对于样本中dG的量进行表达。
表儿茶酸吸收按照Rein等，J.of Nutr.，2000，130(8S)，2109S-2114S所述测定。
结果结果确立了植物甾醇和多酚的联合给药的意外有益效果。
参考图3，被吸收表儿茶酸的量以剂量依赖性方式增高。令人惊奇地，植物甾醇的给药增强了表儿茶酸的吸收，由此，例如，在2wt％CPd的食物中，表儿茶酸血浆水平比不含植物甾醇的对照食物提高了约30％。所以，植物甾醇增进了表儿茶酸的生物利用度。
参考图4，CPd以剂量依赖性方式抑制对DNA的氧化损伤。令人惊奇地，在较高剂量的CPd(2wt％)下，观察到DNA氧化损伤的意外减轻，由此表明植物甾醇和CPd在防止对DNA的氧化损伤中的协同作用。
参考图5，喂食含植物甾醇的食物令人惊奇地引起比对照食物更高的氧化应激，其中对照食物即植物甾醇与食物(无可可矢车菊苷配质)的共同摄取，这是截止到本申请提交日的现有技术所推荐的，加剧了该氧化应激。可可矢车菊苷配质的摄食逆转或减轻了植物甾醇的这种负面作用。
还测量了总血浆胆甾醇并且结果如表3所示。
表3-总血浆胆甾醇
参考表3，如预期的，植物甾醇降低胆固醇水平。然而，令人惊奇地，当植物甾醇与CPd施用时，胆固醇水平以剂量依赖方式大大降低。譬如，三只喂食含植物甾醇食物的大鼠的平均总胆固醇水平为84mg/dl。该食物中补充2wt％CPd使总胆固醇继续降低至80mg/dl，表明这两种化合物的协同作用。喂食对照食物的大鼠具有的平均胆固醇水平为88.3mg/dl。
实施例4含降胆固醇剂的食品组合物与含可可矢车菊苷配质的可可或巧克力的组合制备含降胆固醇剂的黑巧克力、太妃糖和granola棒。
太妃糖由表4所示的组分、通过预混和糖和可可并且将其与焦糖混合来制成。将游离植物甾醇(本身或粉碎的)加入到糖和可可的混合物中。
表4.含植物甾醇的太妃糖
含游离甾醇的黑巧克力利用市售的黑巧克力(DOVE Dark得自Mars Inc.)制成。为了便于和融化的巧克力混和并避免对巧克力纹理的任何不良影响，颗粒形式的植物甾醇/stanol在Universal Muche M20(IKA制造)上碾磨30-60秒，混和，并且再碾磨30秒直至颗粒大小与巧克力的相当。将黑巧克力融化并通过缓慢混和加入甾醇以确保甾醇颗粒的均匀分布。所得组合物如表5所示。
表5.含植物甾醇的黑巧克力
含降胆固醇燕麦纤维的granola棒由表6和7的组分制备。通过将棕榈核油融化至45℃制备糖浆粘合剂且保持在此温度下直至备用。混和玉米糖浆、甘油、可可粉、红糖、盐、卵磷脂和没食子酸丙酯且加入棕榈核油。保温该混合物。为了制备granola，将燕麦或大豆粉(得自Sovex Food，Collegedale，TN)与巧克力块混和，并向该混合物混和上面制备的热糖浆粘合剂。随后将granola混合物制成胶块，撒上10X糖(62％)、可可粉(33％)和肉桂(5％)的混合物，并且切成块。混合物中使用的可可粉按照Kealey等的美国专利6,015,913的方法制备。
表6.含巧克力和燕麦的granola棒
表7.含巧克力和大豆蛋白的granola棒
权利要求
1.一种包装，包含含有可可黄烷醇和/或其低聚物的组合物，以及将该组合物用于哺乳动物中心率失常的治疗、预防、减小危险性和降低发生率的标签和/或说明书，该哺乳动物为人或兽医动物。
2.权利要求1的包装，其中该组合物含有至少一种低聚物。
3.权利要求2的包装，其中该低聚物为二聚体。
4.权利要求1的包装，其中该组合物含有单体儿茶素和表儿茶酸的混合物。
5.权利要求1的包装，其中该组合物为食品。
6.权利要求1的包装，其中该哺乳动物为人类
7.权利要求1的包装，其中该哺乳动物为兽医动物。
8.权利要求5的包装，其中该食品为甜食。
9.权利要求1的包装，其中该组合物进一步含有降胆固醇剂。
10.权利要求9的包装，其中降胆固醇剂为甾醇和/或stanol类降胆固醇剂。
11.权利要求1的包装，其中组合物进一步含有大豆蛋白质、可溶性纤维和/或L-精氨酸。
12.权利要求1的包装，其中该组合物进一步含有至少一种下列物质钙，钾，镁，维生素E，维生素C，任何维生素B的复合物，类胡萝卜素，瓜尔胶或者一或多不饱和脂肪酸。
13.权利要求1的包装，其中该可可黄烷醇和/或其低聚物是可可组分、可可提取物或含至少一种黄烷醇或其低聚物的可可提取物的馏分的形式。
14.权利要求1的包装，其中该组合物为宠物食品。
15.一种心率失常的治疗或减小危险性或发生率的方法，包括给患有或者处于患心率失常危险的哺乳动物施用一种组合物，该组合物含有有效量的可可黄烷醇和/或其低聚物，其中该哺乳动物为人或兽医动物。
16.权利要求15的方法，其中该组合物含有至少一种低聚物。
17.权利要求16的方法，其中该低聚物为二聚体。
18.权利要求15的方法，其中该组合物含有单体儿茶素和表儿茶酸的混合物。
19.权利要求15的方法，其中该组合物为食品。
20.权利要求15的方法，其中该哺乳动物是人类。
21.权利要求15的方法，其中该哺乳动物是兽医动物。
22.权利要求19的方法，其中该食品为甜食。
23.权利要求15的方法，其中该组合物进一步含有降胆固醇剂。
24.权利要求23的方法，其中该降胆固醇剂为甾醇和/或stanol类降胆固醇剂。
25.权利要求15的方法，其中该组合物进一步含有大豆蛋白质、可溶性纤维和/或L-精氨酸。
26.权利要求15的方法，其中该组合物进一步含有至少一种下列物质钙，钾，镁，维生素E，维生素C，任何维生素B的复合物，类胡萝卜素，瓜尔胶或者一或多不饱和脂肪酸。
27.权利要求15的方法，其中该可可黄烷醇和/或其低聚物是可可组分、可可提取物或含至少一种黄烷醇或其低聚物的可可提取物的馏分的形式。
28.权利要求15的方法，其中该组合物是宠物食品。
29.一种改善认知机能的方法，包括给给需要其的哺乳动物施用一种组合物，该组合物含有有效量的可可黄烷醇和/或其低聚物，其中该哺乳动物为人或兽医动物。
30.权利要求29的方法，其中该认知机能为连接蛋白43相关的。
31.权利要求29的方法，其中该哺乳动物是需要改善短期记忆机能的人。
32.权利要求29的方法，其中该组合物含有至少一种低聚物。
33.权利要求32的方法，其中该低聚物是二聚体。
34.权利要求29的方法，其中该组合物含有单体儿茶素和表儿茶酸的混合物。
35.权利要求29的方法，其中该组合物为食品。
36.权利要求29的方法，其中该哺乳动物是人类。
37.权利要求29的方法，其中该哺乳动物是兽医动物。
38.权利要求35的方法，其中该食品为甜食。
39.权利要求29的方法，其中该组合物进一步含有降胆固醇剂。
40.权利要求39的方法，其中该降胆固醇剂为甾醇和/或stanol类降胆固醇剂。
41.权利要求29的方法，其中该组合物进一步含有大豆蛋白质、可溶性纤维和/或L-精氨酸。
42.权利要求29的方法，其中该组合物进一步含有至少一种下列物质钙，钾，镁，维生素E，维生素C，任何维生素B的复合物，类胡萝卜素，瓜尔胶或者一或多不饱和脂肪酸。
43.权利要求29的方法，其中该可可黄烷醇和/或其低聚物是可可组分、可可提取物或含至少一种黄烷醇或其低聚物的可可提取物的馏分的形式。
44.权利要求29的方法，其中该组合物是宠物食品。
45.可可黄烷醇和/或其低聚物在制备用于人或兽医动物中涉及缺损性间隙连接联系的疾病的治疗、预防、减小危险性或减慢进程的药物、食品、nutraceutical或食品强化剂中的用途。
46.可可黄烷醇和/或其低聚物在制备用于人或兽医动物中心率失常的治疗、预防、减小危险性或降低发生率的药物、食品、nutraceutical或食品强化剂中的用途。
47.可可黄烷醇和/或其低聚物在制备用于人或兽医动物中认知机能障碍的治疗、预防、减小危险性或减慢进程的药物、食品、nutraceutical或食品强化剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及含有多酚例如可可多酚，如黄烷醇及其相关低聚物的组合物，以及治疗细胞的间隙连接联系异常的方法，例如癌症，心率失常，神经变性疾病和认知机能障碍。
文档编号A61P25/28GK1655806SQ03811566
公开日2005年8月17日 申请日期2003年3月21日 优先权日2002年3月21日
发明者H·西斯 申请人:玛尔斯有限公司