专利名称：牙鲆淋巴囊肿病毒毒株及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及淡、海水鱼类疾病病原及分离、扩增与鉴定技术，特别涉及海洋养殖鱼类虹彩病毒的体外增殖、检测诊断技术及其材料来源，更具体涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株，同时，还涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株的制备方法和在鱼类淋巴囊肿病毒检测与诊断及在海水鱼虹彩病毒在细胞工程疫苗制备中的用途。
背景技术：
牙鲆(Paralichthys olivaceus，Japanese flounder)是深受消费者欢迎、市场前景非常看好的海水养殖经济鱼类。但随着海水养殖业集约化和快速发展，由淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)引起的牙鲆淋巴囊肿病呈急剧蔓延的态势。在患有这种病的鱼体表、头、躯干、吻、尾鳍的皮肤上，有白色水泡和囊状物形成，淋巴细胞大量聚积而成，呈肿瘤状，病情严重的鱼，在腮乃至肠道中也会出现散在或成群的囊肿。病鱼摄食不便，生长缓慢，使原本名贵的牙鲆丧失其经济和食用价值。
病毒性淋巴囊肿是一种常见于鱼类皮肤和鳍上出现肿瘤样病变的疾病，淡、海水鱼类均可发生。因与患病鱼接触，或当病鱼囊肿破溃时，病毒逸出水中而使正常鱼感染发病。LCDV是虹彩病毒的成员，由虹彩病毒引起的爬行动物、两栖动物和鱼类疾病已在美洲、欧洲、亚洲和澳洲等地普遍流行[Ahne W.Bremont M，Hedrick R P，et al.Special topicreviewiridoviruses associated with epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)in aquacul ture.WorldJ Micro Biotech，1997，13367-373]。淋巴囊肿病毒呈球形，其直径大小为200±50nm。19世纪开始，人们就已知淋巴囊肿病毒在世界各地流行，对淡、海水鱼造成危害。多年来，对淋巴囊肿病的病原学、病理学、流行病学等方面进行了研究，国内也有相关报道[张永嘉等，海洋与湖沼，1997，28(4)406]。近年，又对该病的病原LCDV进行了分子生物学、快速检测、病原分离纯化等研究，并取得了明显的进展[林清龙，陈秀男，养鱼世界，1995，4844；刘允坤等，高技术通讯，2002，692-95]。但该病毒的体外扩增尚未有突破。
尽管关于鱼类淋巴囊肿病毒的分离培养始于20世纪60年代[Wolfet al，1966，Science1511004-1005]，历时约40年，但这种病毒株的体外培养十分困难，仅观察到LCDV可在少数海水鱼细胞中引起病变，而且所需时间较长，多数在一周以上[Walker et al，1980，J Gen.Virol.51385-395；Perez-Prieto et al，1999，Dis Aquar Org 35149-153；Chang et al，2001，Aquaculture 192133-145]。迄今国内外尚未建立牙鲆淋巴囊肿病毒经济实用的生物学检测方法。
发明内容
本发明的目的在提供一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株，通过LCDV011126的体外扩增，建立LCDV复制与感染系统，解决了LCDV在淡水鱼细胞系中增殖的技术问题。
本发明的另一个目的在于提供一种制备牙鲆淋巴囊肿病毒毒株的方法，该方法过程简单，易于人工调节和控制，成本低。
本发明还涉及一种准确有效的牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在鱼类淋巴囊肿病毒检测和诊断中的应用。
本发明还涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在生物学在鉴定鱼类淋巴囊肿病毒中的应用。
本发明还涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在细胞工程疫苗制备中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案将被牙鲆淋巴囊肿病毒株(LCDV011126)侵染鱼的病变组织(如皮肤表面的肿瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍体积的磷酸缓冲液(PBS)进行匀浆，再加入双抗，置冰箱-20℃冰冻过夜，次日取出待其融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获LCDV011126病毒粗提液。将制备好的LCDV011126病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的草鱼肾CO011126细胞(上皮样)和CIK011126细胞(成纤维样)等十多种不同的淡、海水鱼类细胞中。同时设有相应的正常细胞对照，并置温度为20℃的恒温培养箱中继续培养。利用光学显微镜，定时观察已接种了LCDV011126病毒粗提液的细胞变化情况，并与相应的正常细胞作比较。连续传代3次，每次都持续观察2周以上。在接种了LCDV011126病毒粗提液的这些淡、海水鱼类细胞中，多数种类的细胞单层未出现病理变化，这些细胞是LCDV011126病毒不敏感的细胞。
通过光镜可观察到在接种了LCDV011126病毒并继续培养了24-36小时的CO011126细胞和CIK011126细胞单层细胞上出现补疤样病变，病变斑中局部有细胞量增多、堆积，类似烧、烫伤的皮肤表面，凸凹不平。这不同于其它多数水生动物病毒引起的细胞产生裂解、出现脱落，并在单层细胞中形成大小不同的空洞(空斑)样病变。接种了LCDV011126病毒粗提液的CO011126细胞和CIK011126细胞出现了特有的病变斑——补疤样病变，故被确定为对LCDV011126敏感的细胞。
牙鲆淋巴囊肿病毒毒株LCDV011126(Paralichthys olivaceus lymphochsitis disease virus，LCDV011126)，通过电镜观察可见，在病变细胞中有LCDV011126颗粒，呈球形，直径大小130-260nm。宿主细胞也出现了产生空泡、肿胀膨大、细胞器破坏等超微病变。LCDV011126已交中国典型培养物保藏中心(武汉)，保藏号为CCTCC-V202007。
本发明提供的牙鲆淋巴囊肿病毒体外增殖系统和方法能有效进行LCDV的生物学检测与诊断，通过LCDV011126的体外扩增，建立LCDV复制与感染机理研究的体外模型。同时由于体外扩增条件易于人工调节和控制、且经济、省时，制备材料均一。因为并非通过感染鱼体来收集病料，可在不污染水体和环境的前提下，就可提供淋巴囊肿病毒疫苗研制及生产所需的原料。
已知LCDV的生物学鉴定方法是通过鱼体回接感染或海水鱼细胞接种，这两种生物学鉴定LCDV的方法与本发明比较，前者成本较高，后者时间较长。
由于感染了病毒的鱼组织匀浆液中含有LCDV011126，接种到CO011126细胞和CIK011126细胞上，在2-3天内，会引起细胞产生特有的病变斑——补疤样病变，因此本发明可运用于LCDV的检测和诊断。
通过培养细胞扩增病毒的条件易于人工控制、不会受到来自宿主动物机体免疫作用的干扰。扩增出的病毒会直接用于细胞工程疫苗的生产，或通过基因工程的方法，制备病毒核酸疫苗。
其步骤如下A、以患有淋巴囊肿病的牙鲆肿瘤组织作为材料；B、将病鱼组织(如皮肤表面的肿瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍体积的PBS进行匀浆，加入双抗后，置冰箱-20℃冰冻过夜，次日取出待其融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获LCDV011126病毒粗提液。将制备好的LCDV011126病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的草鱼肾CO011126细胞和CIK011126细胞中，同时设有相应的正常细胞对照，并置温度为20℃的恒温培养箱中继续培养。利用光学显微镜，定时观察已接种了LCDV011126的细胞，并与相应的正常细胞作比较。
C、对接种细胞活体或染色后，进行显微观察，证实LCDV011126在2-3天内可引起CO011126病变(图1)和CIK011126细胞病变(图2)。
D、将接种病毒后24小时收集的细胞样品，经固定、超薄切片和染色后进行超微观察，明确病毒引起感染细胞的体积明显膨大，超过未感染细胞的5倍-15倍(图3)。
据最近对本实验室分离到的牙鲆淋巴囊肿病毒LCDV011126株基因组的序列分析显示，该病毒基因组全长为186.25kb，比目前已知的其它3株水生动物虹彩病毒基因组要大70kb左右，是已知脊椎动物虹彩病毒基因组最大的一个，共有240个开放阅读框，其中与已知淋巴囊肿病毒标准株LCDV-1有同源性的基因超过百个，其中病毒的主要衣壳蛋白基因有较高的同源性。可知，能引起100多种淡海水鱼类出现淋巴囊肿病的病毒病原，虽有不同的毒株，但它们的基因组之间存在同源基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果鱼细胞培养可模拟鱼体生长条件，简化细胞生长环境。在鱼的细胞中增殖和测定病毒，与通过鱼体回接感染实验相比，不仅快速、易于控制实验条件、且可获得直接观测结果，并能明显的降低了检测成本。此外，通过这一途经，可大量扩增淋巴囊肿病毒，提供均一、充足的病毒材料。
图1、(A)正常的CO011126细胞；(B)接种了LCDV011126，并已出现病变的CO011126细胞，示细胞“补疤样”病变。x 20图2、(A)正常的CIK011126细胞；(B)接种了LCDV011126的CIK011126细胞，示细胞“补疤样”病变。x 20图3、接种了LCDV011126细胞的电镜照片，示细胞的超微病变(如细胞内空泡)和在细胞内增殖的病毒粒子。x 20 000具体实施方式
所有用于细胞培养和病毒扩增的器皿器材、培养基、试剂均要求事先经高压灭菌或过滤除菌等处理，保持无菌。部分常用试剂的配制方法如下磷酸盐缓冲液(PBS，无Ca++、Mg++)NaCl8.00gKCl 0.20gNa2HPO42.31gKH2PO40.31g溶于500ml双蒸水中，加入5ml 0.4％酚红液，搅拌均匀后加双蒸水至1000ml。10磅15分钟灭菌备用。
双抗(青霉素、链霉素)溶液将106单位青霉素G和106μg链霉素溶解于100ml灭菌的三蒸水中，使每ml青霉素104单位，链霉素104μg。
TC119培养基将购置来的TC199培养基粉剂，按说明书要求的量，加入用新鲜的三蒸水稀释，充分溶解后加入血清、双抗，并加入碳酸轻钠溶液调节pH至7.2-7.4，再用三蒸水定容后，经滤器过滤，分装。
病毒接种和扩增的操作步骤将病鱼组织(如皮肤表面的肿瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍体积的PBS进行匀浆，再加入双抗，置冰箱-20℃冰冻过夜，次日取出待其融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获LCDV011126病毒粗提液。将制备好的LCDV011126病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的草鱼肾CO011126细胞和CIK011126细胞中。同时没有相应的正常细胞对照，并置温度为20℃的恒温培养箱中继续培养。利用光学显微镜，对接种了病毒的活体细胞定时观察，并与相应的正常细胞作比较。
显微镜下可见到在上皮样细胞CO011126或成纤维样细胞CIK011126单层的表面，局部出现大小不一、形状不规则、细胞堆积并类似补疤样的病变斑。这种病变斑是LCDV011126在CO011126细胞和CIK011126细胞中所引起的特征性病变(图1和图2)，不同于其它水生动物病毒株在这两种细胞中引起的坏死或空斑病变。
将接种病毒后24小时收集的细胞样品，经固定、超薄切片和染色后进行超微观察，明确病毒引起感染细胞的体积明显膨大，超过未感染细胞的5倍-15倍(图3)。
LCDV011126病毒株在鱼类淋巴囊肿病毒检测中的用途取出淡水鱼CO011126细胞，将培养液吸掉，加入PBS缓冲液洗细胞表面，再将PBS完全吸掉。加入0.25％的胰蛋白酶，盖好放入37℃水浴中消化，使单层细胞从瓶面脱落。加入培养液冲洗细胞，在4℃下，以4,000rpm离心1分钟，弃上清液，再将细胞悬浮、计数、分装移至内含培养液的培养瓶中(或培养板中)，于25℃培养，至次日长成单层。将待检样品(鱼的组织匀浆液或血液等)接种到单层细胞中，同时，以LCDV011126病毒液接种的细胞作为阳性对照，未接种病毒的细胞为阴性对照，每日观察和比较，2-3天出现特征性病变的待检样品可判断为被病毒感染。因为利用普通光学显微镜可以见到，LCDV011126在淡水鱼CO011126细胞与CIK011126细胞中，引起补疤样病变出现，局部细胞量增多、堆积，类似烧、烫伤的皮肤表面，凸凹不平，这是一种特征性的病变。而其它水生动物病毒所导致的病变通常是细胞裂解、脱落，并在单层细胞中形成大小不一的空洞(空斑)。由此可见，体外成功扩增LCDV011126病毒株，为运用生物学方法及细胞培养技术检测和鉴定淋巴囊肿不同病毒株提供了新的思路。
LCDV011126病毒株在海水鱼虹彩病毒细胞工程疫苗制备中的用途众多研究表明，虹彩病毒是各种水生动物，包括鱼、蛙、鳖等的病原病毒，而淋巴囊肿病毒是虹彩病毒家族的成员。经对基因结构和核苷酸序列分析、PCR分析及与GenBank中数据进行比较，证实LCDV011126主要衣壳蛋白基因与其它虹彩病毒的主要衣壳蛋白基因之间存较高的基因同源性，这意味着水生动物虹彩病毒都具备有共同抗原的分子基础。
利用本发明的成果，在CO011126细胞中复制LCDV011126，经PCR扩增淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因，连接到表达载体上，并转入真核细胞中表达，收集表达产物，制备和生产基因工程疫苗。将疫苗注射到鱼体内或浸泡鱼体，就可使之产生抗虹彩病毒感染的能力。利用该途径可获得一种有广谱免疫功能的海水鱼虹彩病毒疫苗，并为不同的水生动物抗御虹彩病毒侵染提供保护和预防作用，这是一个事半功倍的研制和生产海水鱼虹彩病毒疫苗的途径。
在确定CO011126细胞是LCDV011126敏感细胞的基础上，根据病毒疫苗可诱导体外培养的鱼类细胞产生抗病毒物质的原理，就可通过敏感细胞来测定疫苗的免疫效果及安全性。实施过程举例先将CO011126细胞传到三块96孔细胞板中，待其长成单层后，分为三组。其中一组为正常细胞对照；一组接种LCDV011126；另一组先接种疫苗，再用LCDV011126攻毒。经显微观察，就可知细胞病变情况及疫苗的免疫保护率(见表1)。
表1疫苗保护率测试实验实验组编号 实验细胞孔数 出现病变细胞孔数 未出现病变细胞孔数 保护率％第1组(细胞对照组)960 96第2组(直接攻毒组)96933 3.13％第3组(疫苗保护组)966 9093.75％疫苗的安全性也可借助体外培养的细胞来测定。施过程举例先将GCF0208细胞传到96孔细胞板中，待其长成单层后，分为两组。其中一组为正常细胞对照；一组接种LCDV011126疫苗，显微观察细胞是否出现病变，就可知疫苗是否安全(见表2)。
表2疫苗安全性测试实验实验组编号 实验细胞孔数 出现病变细胞孔数 未出现病变细胞孔数 安全率％第1组(对照组) 48 0 48第2组(疫苗组) 48 0 48 100
权利要求
1.一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株，其特征在于牙鲆淋巴囊肿病毒毒株Paralichthysolivaceus lymphochsitis disease virus，LCDV011126，CCTCC NOV202007。
2.一种实现权利要求1所述的一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株的制备方法，包括下列步骤A、以患有淋巴囊肿病的牙鲆肿瘤组织作为材料；B、将病鱼组织取出后，剪碎、加入1-2倍体积的PBS进行匀浆，加入双抗后，置冰箱-20℃冰冻，融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获LCDV011126病毒粗提液，将LCDV011126病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的草鱼肾CO011126细胞和CIK011126细胞中，并置温度为20℃的恒温培养箱中继续培养；C、对接种细胞活体或染色后，观察，证实LCDV011126在2-3天内可引起CO011126病变和CIK011126细胞病变；D、将接种病毒后24小时收集的细胞样品，经固定、超薄切片和染色后进行超微观察，病毒引起感染细胞的体积膨大，超过未感染细胞的5-15倍。
3.权利要求1所述的牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在鱼类淋巴囊肿病毒检测和诊断中的应用。
4.权利要求1所述的牙鲆淋巴囊肿病毒毒株在细胞工程疫苗制备中的应用。
全文摘要
本发明公开一种牙鲆淋巴囊肿病毒毒株及其制备方法和应用，牙鲆淋巴囊肿病毒毒株LCDV
文档编号A61K39/12GK1500865SQ200310116249
公开日2004年6月2日 申请日期2003年11月13日 优先权日2002年11月14日
发明者张奇亚, 李正秋, 袁秀平, 桂建平 申请人:中国科学院水生生物研究所