专利名称：大菱鲆弹状病毒毒株及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产动物疾病病原及分离、体外培养与鉴定技术，特别涉及海洋养殖鱼类病毒的体外增殖、检测诊断技术。更具体涉及一种大菱鮃弹状病毒毒株，还涉及一种大菱鲆弹状病毒毒株的制备方法，同时还涉及一种生物学方法在鉴定海水鱼类弹状病毒和海水鱼弹状病毒在细胞工程疫苗制备中的用途。
背景技术：
大菱鲆(Scophthalmus maximus，turbour)是一种原产于欧洲的冷水性底栖鲽形目海水鱼类，也是当地著名的海水养殖良种。由于大菱鲆口感爽滑细嫩而鲜美、骨刺少，无腥异味、鳍边和皮下有丰富的胶质，可与甲鱼和海参相比美，是理想的保健和美容食品。大菱鲆性格温顺，无互残现象，且生长迅速，容易接受配合饲料，食物转换效率高达1∶1，易于集约化养殖等特点，受到国际海水养殖业的高度重视，且有比目鱼特有身姿，在水体中可营造多姿多彩，轻蝶漫舞的观赏效果，迅速成为全世界水产养殖业的新贵。我国于90年代初引种，目前在工厂化条件下，5cm的鱼苗养殖一年，体重可达800-1000g。但随养殖规模的扩大，大菱鲆的疾病也日益突出，尤其是病毒引起的病害[Angulo等，1994，J.Fish Dis.17163-169；Breton等，1997，J.Fish Dis，20145-152]，已成为大菱鲆养殖业发展的制约因素。
大菱鲆病毒病有些是通过投饵水平传播，如病毒性神经坏死病[Breton等，1997]和传染性胰脏坏死病[Mortensen等，1995，J World Aqacul.Soci.26217-219]。有些疾病是通过水体或与患病鱼直接接触而传播的。还有一种球形病毒粒子，直接攻击大菱鲆的血细胞，通过影响红细胞的功能而造成鱼体缺氧[Lamas等，1995，J.Fish Dis，18425-433]。养殖密度增加，为大菱鲆病毒病传播提供了更多的机会。
已知的水生动物弹状病毒多数是鱼类烈性病原体，如病毒性败血症病毒(VHSV)是鱼类败血症的病原体，它们能引起宿主动物严重的致死性疾病，发病宿主在1周内死亡率可达100％。此外还有梭子鱼弹状病毒(pike fry rhabdovirus)、乌鳢鱼弹状病毒(snakehead rhabdovirus)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp)、蓝点丽鱼弹状病毒(Rio grande cichlid rhabdovirus)和鲈鱼弹状病毒(perch rhabdovirus)多种。这些弹状病毒都能导致鱼类发病和死亡，造成重经济大损失。因此，建立相应的方法，对大菱鲆病毒病原进行分离，尤其是弹状病毒引起的暴发性疾病进行鉴定，可建立相应的早期诊断技术，并了解其流行趋势，结合研制相应的病毒疫苗，从而能对其传播起到有效的监控与预防作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大菱鲆弹状病毒毒株，大菱鲆弹状病毒毒株在CLC0207细胞中高效增殖，增殖效价可达到108TCID50/ml。
本发明的另一个目的还涉及一种制备大菱鲆弹状病毒毒株的制备方法，该方法简单易行，并能在体外大量扩增鲆鱼弹状病毒，解决了大菱鲆病毒的鱼体感染实验条件难以控制，成本高，重复性差的问题。
本发明还涉及一种大菱鲆弹状病毒毒株在生物学方法鉴定海水鱼类弹状病毒中的应用。
本发明还涉及一种大菱鲆弹状病毒毒株在准确有效的鱼类弹状病毒检测与诊断中的应用。
本发明还涉及一种大菱鲆弹状病毒毒株在海水鱼弹状病毒细胞工程疫苗制备中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案从患致死性疾病的大菱鲆中分离到一株弹状病毒，称为大菱鲆弹状病毒(Scophthalmus maximus rahbdovirus，SMRV0207)，CCTCC NOV202006经对多种鱼类细胞的接种实验证明，这种病毒可引起宿主细胞产生裂解性病变。这是一种宿主范围较广的鱼类弹状病毒病原。同其它动物的病毒病一样，迄今尚无药物能有效控制它们，只有通过病毒疫苗进行免疫的途经，才为预防病毒病、保持大菱鲆健康养殖展示希望。本实验室利用具有鱼类细胞库的优势条件，通过培养鱼类细胞对养殖大菱鲆是否被病毒感染进行常规检测时发现我国沿海某养殖场的大菱鲆被一种弹状病毒所感染。进行鱼体攻毒实验和体外培养细胞感染实验，并结合电镜观察、流式细胞技术检测、以及电泳等生化方法分析，显示该病毒可以引起宿主细胞凋亡，证实了这株弹状病毒是大菱鲆的致死性病原。为此，我们经对该病毒进行体外扩增培养、反复分离和筛选、测定病毒结构蛋白和进行PCR扩增等系列研究，获得了毒力较强(效价为108TCID50/ml)、生物遗传性能稳定、可进行纯培养的鱼类弹状病毒株SMRV0207。
患病大菱鲆的病症是在体表、皮肤上出现了许多小泡和出血点，肝脏有深浅不匀花斑，肾组织糜烂，体表病症出现24小时，病鱼就会死亡。取病鱼的组织材料，制备成组织匀浆液，接种到敏感细胞中，进行病毒的分离培养；或取病鱼的组织材料直接用戊二醛固定后，制备超薄切片，用于电镜观察。
对SMRV0207感染CLC0207细胞的超薄切片进行电镜观察，表明与在患病大菱鲆细胞中所观察到的情况一致，大菱鲆弹状病毒形态特征是细胞内有很多大小为110-150×40-60nm、形态是一端尖头、另一端平头的弹状病毒。
以患病或濒死的大菱鲆组织作为材料，从不同方面对其中的弹状病毒进行了体外培养和鉴定。包括A、患病大菱鲆鱼组织制备成匀浆液后，感染不同的鱼类细胞，明确CLC0207细胞对SMRV0207敏感，接种病毒后会产生病变斑，且SMRV0207病毒株在CLC0207细胞中的增殖效价可达到108TCID50/ml。
B直接固定新鲜的病鱼组织样品，经超薄切片、染色后进行超微观察，明确病毒的大小、形态及引起宿主细胞的超微病理变化。
图1、大菱鲆弹状病毒SMRV0207的超微形态，图中显示有大量大小为110-150×40-60nm、形态是一端尖头、另一端平头的弹状病毒。x 30 000图2、(A)、正常的CLC0207细胞和(B)、感染SMRV0207，且出现病变的CLC0207细胞显微照片。x 40图3、SMRV0207感染CLC0207细胞的电镜照片，感染细胞中出现空泡。x 4 000具体实施方式
所有用于细胞培养和病毒扩增的器皿器材、培养基、试剂均要求事先经高压灭菌或过滤除菌等处理，保持无菌。部分常用试剂的配制方法如下磷酸盐缓冲液(PBS，无Ca++、Mg++)NaCl 8.00gKCl0.20gNa2HPO42.31gKH2PO40.31g溶于500ml双蒸水中，加入5ml 0.4％酚红液，搅拌均匀后加双蒸水至1000ml。10磅15分钟灭菌备用。
双抗(青霉素、链霉素)溶液将106单位青霉素G和106μg链霉素溶解于100ml灭菌的三蒸水中，使每ml青霉素104单位，链霉素104μg。
TC119培养基将购置来的TC199培养基粉剂，按说明书要求的量，加入用新鲜的三蒸水稀释，充分溶解后加入血清(10％新生牛血清)、双抗，并加入碳酸轻钠溶液调节pH至7.2-7.4，再用三蒸水定容后，经滤器过滤，分装。
病毒接种和扩增的操作步骤
将患病大菱鲆的肝、肾、心、脾组织取出后，剪碎、加入1-2倍体积的PBS进行匀浆，再加入双抗，置冰箱-20℃冰冻过夜，次日取出待其融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获SMRV0207病毒粗提液。将制备好的SMRV0207病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的CLC0207细胞中。同时设有相应的正常细胞对照，并置温度为20℃的恒温培养箱中继续培养。利用光学显微镜，对接种了病毒的活体细胞定时观察，并与相应的正常细胞作比较。接种病毒后12-24小时，在倒置显微镜下可见到在原本致密的CLC0207细胞单层中，先后出现了病变斑，开始是分散的少量细胞脱落所形成的小空洞，空洞逐渐增大(图2)。对在此时段所取的、SMRV0207感染细胞制备的电镜样品进行观察，显示鳜鱼弹状病毒已在宿主细胞内大量增殖，且细胞出现了明显的病变(图3)。随后细胞单层中尚未脱落的细胞形成网状。
一种海水鱼弹状病毒的鉴定方法将待检鱼的组织匀浆液接种到长成单层的CLC0207细胞(为本发明所采用细胞)中，25℃-30℃下培养12小时左右，经光镜观察，可见是否出现贴壁细胞局部脱落的现象。收集扩增了病毒的细胞，再进行电镜制样和观察，就可较容易确定待检鱼是否被弹状病毒感染。
一种海水鱼弹状病毒细胞工程疫苗的制备方法首先获得了病毒株SMRV0207的纯培养物。
其次，筛选到适宜于病毒株SMRV0207高效价增殖的敏感细胞CLC0207细胞。
再者，通过后述方法和步骤，可制备鱼的弹状病毒细胞工程疫苗。CLC0207细胞用199培养基(商品培养基)+10％小牛血清，置25℃-30℃细胞培养箱中培养，长成单层后，接种0.1ml(含105TCID50/ml)的SMRV0207病毒悬液，继续培养12-20小时，收集含扩增病毒的细胞液，用0.1-0.5％的甲醛，在30℃-56℃下处理4-6小时，无菌分装、冻存、就制备出海水鱼多抗原组分的细胞工程弹状病毒疫苗。该疫苗使用安全，且可批量生产。
由于建立了病毒的体外扩增系统，筛选到敏感宿主细胞，因此，疫苗的免疫效果及安全性实验可通过这一系统来测定。实施过程举例先将CLC0207细胞传到96孔细胞板中，待其长成单层后，分为三组。其中一组为正常细胞对照；一组接种SMRV0207病毒；另一组先接种疫苗，再用SMRV0207病毒攻毒。经显微观察，就可知细胞病变情况及疫苗的免疫保护率(见表1)。
表1疫苗保护率测试实验实验组编号 实验细胞孔数 出现病变细胞孔数 末出现病变细胞孔数 保护率％第1组(细胞对照组)32032第2组(直接攻毒组)3232 0 0第3组(疫苗保护组)32131 97％
体外培养的细胞比动物机体对毒性及环境因素的影响更为敏感，因此疫苗的安全性实验也可借助细胞来测定。施过程举例先将CLC0207细胞传到24孔细胞板中，待其长成单层后，分为两组。其中一组为正常细胞对照；一组接种SMRV0207疫苗，显微观察细胞是否出现病变，就可知疫苗是否安全(见表2)。
表2疫苗安全性测试实验实验组编号 实验细胞孔数 出现病变细胞孔数 未出现病变细胞孔数 安全率％第1组(细胞对照组)12012第2组(接种疫苗组)12012 100
权利要求
1.一种大菱鲆弹状病毒毒株，其特征在于大菱弹状病毒毒株Scophthalmus maximusrahbdovirus，SMRV0207，CCTCC NOV202006。
2.根据权利要求1所述的一种大菱鲆弹状病毒毒株，其特征在于大菱鲆弹状病毒是大小为110-150×40-60nm、形态是一端尖头、另一端平头的弹状病毒。
3.一种实现权利要求1所述的一种大菱鲆弹状病毒毒株的制备方法，其特征在于将患病大菱鲆的肝、肾、心、脾组织取出后，剪碎、加入1-2倍体积的PBS进行匀浆，再加入双抗，置冰箱-20℃冰冻，取出融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获SMRV0207病毒粗提液，将SMRV0207病毒粗提液经过滤后，分别接种到已长成单层的CLC0207细胞中，温度为20℃的恒温培养箱中继续培养。
4.权利要求1所述的一种大菱鲆弹状病毒毒株在生物学方法鉴定海水鱼类弹状病毒中的应用。
5.权利要求1所述的一种大菱鲆弹状病毒毒株在鱼类弹状病毒检测与诊断中的应用。
6.权利要求1所述的一种大菱鲆弹状病毒毒株在海水鱼弹状病毒细胞工程疫苗制备中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大菱鲆弹状病毒毒株及其制备方法和应用，大菱鲆弹状病毒毒株Scophthalmus maximusrahbdovirus，SMRV
文档编号A61K39/12GK1500866SQ200310116250
公开日2004年6月2日 申请日期2003年11月13日 优先权日2002年11月14日
发明者张奇亚, 李正秋, 桂建芳 申请人:中国科学院水生生物研究所