专利名称：稳定化的固态多肽微粒的制作方法
背景发明领域本发明涉及固态多肽制剂，其中该多肽是稳定化的，能抗升高温度降解较长的时间。更具体地，本发明提供了制备固态多肽微粒的制剂和方法，其中该多肽通过一种或多种稳定条件稳定化。
技术现状本领域已知能持续较长时间地输送理想剂量的活性剂例如多肽的可植入的装置。例如，美国专利5,728,396，5,985,305，6,113,938，6,156,331，6,375,978，和6,395,292教导了可植入的渗透装置，其能输送稳定的活性剂制剂，例如溶液或悬浮液，且以理想的速度持续较长的时间(即从约2周至几个月或更长的时间段)。可植入的药物输送系统还包括贮库型(depot-type)材料，例如在美国专利6,468,961，6,331,311和6,130,200中所述的那些。贮库材料典型地将活性剂隔绝在可生物降解的或可生物侵蚀的贮库材料中，这样活性剂能从植入的贮库材料输送出，基于活性剂的扩散或贮库材料的降解或侵蚀。示例性的贮库材料包括基于PLGA的系统，其典型地能在约2周至6个月的时间内输送活性剂。因为它们可以被设计用于以治疗水平持续较长时间地输送理想的活性剂，所以可植入的输送系统能有利地长期治疗性地施用理想的活性剂，无需经常到医疗机构就诊或重复自己给药。但是，使用可植入的药物输送系统持续较长时间地输送治疗性多肽面临许多技术挑战。
更具体地，一个经证实的挑战是，将装载在用于输送多肽的可植入的输送系统中的治疗性多肽的稳定性维持数周或数月。为了使持续较长时间地输送治疗剂量的多肽的可植入系统具有合适的大小，通常必需给该系统装载含有高浓度的要输送的多肽的溶液或悬浮液。但是，如果这样的溶液或悬浮液被持续较长时间地暴露于接近或超过生理条件的温度(例如，接近或超过37℃的温度)，包含在该溶液或悬浮液中的多肽将会降解，如果该多肽不经稳定的话。暴露于接近或超过生理条件的温度的多肽的降解可以通过多种途径进行，并且可以改变、降低或破坏多肽的生物学活性。因此，为了使可植入的输送系统能成功地持续较长时间地输送治疗性多肽，装载于其中的多肽必须是对降解稳定的，这样该系统才能在可植入系统的功能期限内输送治疗剂量的生物活性多肽。
糖类已经用于多肽制剂中，以稳定包含于其中的多肽，防止随时间的降解。更具体地，糖类已经用作冻干保护剂，用于通过减少冻干过程中的分子解折叠来抑制多肽的聚集。在冻干过程中和之后糖类还通过限制分子流动性和通过使分子相互作用最小化来提供长期稳定性。但是，当使用糖来稳定多肽时，通常必须使用大量的糖才能达到理想的稳定程度。如Andya等的美国专利6,267,958所教导的，为了达到可接受的稳定效果，可能需要多达100～510摩尔比的稳定糖，并且包含如此大量的稳定糖的多肽制剂不适用于装载到可植入的药物输送系统中。
当需要高浓度的稳定糖来实现输送系统中理想的多肽稳定程度时，包含在该系统中的多肽制剂的总体体积会增加，同时可以装载到系统中的多肽的最大浓度会降低。随着装载到可植入系统中的制剂中的多肽浓度的降低，实现理想的给药方案所需的多肽制剂的量和植入系统的最小尺寸会增加。因此，如果能提供稳定治疗性多肽的制剂和方法，且其可以减少或完全消除对稳定糖的需要，这将是本领域的一项改进。如果该制剂和方法能将多肽稳定到一定的程度，使多肽可以高浓度地装载到可植入的输送系统中，且在持续较长时间地暴露于高达或超过生理条件的温度后仍能表现出可接受的稳定性和治疗活性，这又将是本领域的一项改进。
发明概述本发明包括固态多肽微粒，其中包含在微粒中的多肽是经稳定的，能抗在高达或超过生理条件的温度的降解。如在本文中所使用的，术语“生理条件”是指具有约37℃的温度的环境，术语“多肽”包括寡肽和蛋白，且包括任何天然的或合成的含有2个或多个氨基酸的化合物，其中一个氨基酸的羧基连接到另一个的氨基。在每个实施方案中，本发明的多肽微粒含有多肽物质，其通过一种或多种稳定条件稳定以对抗降解。更具体地，本发明的多肽微粒被配制为通过控制一种或多种下面的微粒条件而稳定包含于其中的多肽pH、糖含量、表面活性剂含量、缓冲剂含量和金属离子浓度。因为本发明的多肽微粒可配制为结合两种或多种稳定条件的相加效应，当本发明的多肽微粒包含稳定糖时，达到可接受的多肽稳定性所需的稳定糖的量显著减少。在优选的实施方案中，本发明的多肽微粒制剂无需使用稳定糖即可稳定包含于其中的多肽。
本发明还包括水性稳定溶液。为了制备本发明的固态多肽微粒，可以制备含有要稳定的多肽的本发明的水性稳定溶液，并进行合适的微粒形成过程，例如冻干或喷雾干燥过程。因此，本发明的水性稳定溶液的配制使得当对水性稳定溶液进行微粒形成过程后，该水性稳定溶液生成固态多肽微粒，其含有通过一种或多种稳定条件稳定的多肽物质。通过控制本发明的水性稳定溶液的pH、糖含量、表面活性剂含量、缓冲剂含量、金属离子浓度或多肽浓度，可以生产出具有较宽范围的理想的稳定特征的固态多肽微粒。
本发明还包括生产稳定化的固态多肽微粒的方法。本发明的方法包括将要稳定的多肽溶解到本发明的水性稳定溶液，并将多肽重构到固态多肽微粒中。通过本发明的方法生产的固态肽微粒的配制取决于使用的水性稳定溶液。在一个实施方案中，本发明的方法包括将要稳定的多肽溶解到酸性稳定溶液中。在另一个实施方案中，本发明的方法包括在有稳定糖、金属离子、或稳定糖和金属离子二者存在的情况下，将要稳定的多肽溶解到酸性稳定溶液中。在另一个实施方案中，本发明的方法包括在有表面活性剂、稳定糖、金属离子、或稳定糖和金属离子二者存在的情况下，将要稳定的多肽溶解到缓冲的、接近中性的稳定溶液中。在本发明的方法的每个实施方案中，可以通过对水性稳定溶液进行合适的微粒形成过程，例如冻干或喷雾干燥过程，进行固态肽微粒的重构步骤。虽然本发明的方法可以进行变化，以得到具有多种制剂中的任一种的微粒，本发明的方法在每种情况下都适于提供固态多肽微粒，其中该多肽是通过一种或多种稳定条件稳定的。
本发明的固态多肽微粒提供了优越的多肽稳定作用，在60℃储存2个月后仍能回收高达96％的稳定肽。而且，本发明的固态多肽微粒可以以相对较高的浓度(即25％多肽微粒或更多)装载到悬浮制剂中，这可易化配制具有相对更高浓度的稳定多肽的悬浮剂。因此，本发明的固态多肽微粒有利于用足够高浓度的稳定化的治疗性多肽装载可接受尺寸的植入输送系统，所述的浓度能持续较长时间地输送治疗剂量的稳定化的治疗性多肽。
附图简要说明
图1的图解释了冻干的PACAP(醋酸铵，约pH6.4)在40℃储存3个月后的总降解(RP-HPLC)和聚集(SEC)。
图2的图解释了冻干的PACAP在4℃、40℃和60℃储存3个月后的稳定性。
图3的图解释了当使用不同的赋形剂配制PACAP固态微粒时对在40℃形成PACAP聚集体的抑制。
图4的图解释了当使用不同的赋形剂配制PACAP固态微粒时对在60℃形成PACAP聚集体的抑制。
图5的图解释了组氨酸、琥珀酸盐和蔗糖对在40℃总PACAP降解的稳定化作用。
图6的图解释了蔗糖抑制在40℃ BA/PVP悬浮液中PACAP聚集体形成的稳定化作用。
图7的图解释了蔗糖抑制在40℃ LL/GML/PVP悬浮液中PACAP聚集体形成的稳定化作用。
图8的图解释了不同悬浮介质中的PACAP在40℃储存3个月后的总降解。
图9说明了在表观pH2、表观pH4和表观pH6冻干的微粒中所含的PACAP在60℃储存2个月后通过RP HPLC测得的总降解和通过SEC测得的聚集。
表1说明了评价分散在不同悬浮介质中的PACAP的稳定性的研究结果，所述的PACAP悬浮液在65℃温育4小时。
表2说明了评价在37℃温育了17天后的PACAP的稳定性的研究结果，其中评价的PACAP是单独的冻干的PACAP或分散在3种不同悬浮介质之一中的PACAP。
表3说明了评价在60℃温育了17天后的PACAP的稳定性的研究结果，其中评价的PACAP是单独的冻干的PACAP或分散在3种不同悬浮介质之一中的PACAP。
表4提供了估计的PACAP的降解和聚集速度，其中PACAP包含在含有各种不同赋形剂的固态微粒中，且该微粒在40℃和60℃温育。
表5提供了估计的PACAP的降解和聚集速度，该PACAP包含在固态微粒中，该固态微粒由在pH6的NH4OAc缓冲液中制备的3种不同溶液形成，3种溶液中的每一种含有不同量的蔗糖。
表6说明了评价PACAP的稳定作用的研究结果，所述稳定作用是通过在不同的pH、用3种不同的糖中的一种配制固态PACAP微粒来实现的。
表7说明了评价PACAP的相加稳定作用的研究结果，通过在不同的pH、用一种或多种不同赋形剂配制固态PACAP微粒来实现。
表8说明了评价PACAP的稳定性的研究结果，通过在不同的pH、用CaCl2、组氨酸、以及CaCl2和组氨酸二者配制固态PACAP微粒来实现。
发明详述在第一个实施方案中，本发明的固态多肽微粒包含在酸性pH下稳定的多肽，且配制成表现出酸性重构pH。在微粒形成之前水性稳定溶液的pH(“表观”pH)控制着随后形成的微粒表现出的pH(“重构”pH)，并限定了固态多肽微粒内的多肽的质子化状态。为了本发明的目的，表现出酸性重构pH的微粒包括表现出低于约pH5的重构pH的多肽微粒，表现出低于pH4的重构pH的微粒是优选的，表现出约pH2～约pH4的重构pH的微粒是特别优选的。通过控制本发明的固态多肽微粒表现出的pH，可以控制固态微粒包含的多肽的质子化状态，已经发现，在酸性pH配制本发明的固态多肽微粒可以赋予实质上的稳定化作用。据信，在酸性pH配制本发明的固态多肽微粒会稳定多肽，因为酸性环境有利于多肽中包含的氨基的质子化。多肽中的氨基经常参与反应性中间体的形成，所述的中间体易于发生分子间的或分子内的反应，这会改变肽的化学性质，并且是多肽降解的重要途径。我们认为，通过将多肽维持在有利于多肽中的氨基质子化的环境中，根据第一个实施方案的多肽微粒会限制氨基参与反应性中间体的形成，从而限制分子间的或分子内的反应造成的多肽降解。
向根据第一个实施方案的固态微粒加入金属离子会提供附加的多肽稳定作用。当配制的根据第一个实施方案的固态微粒包含金属离子时，该金属离子优选地由二价金属盐提供，例如CaCl2、MgCl2或ZnCl2。包含在根据第一个实施方案的固态多肽微粒中的金属离子的精确量取决于要稳定的特定肽、微粒的pH和有无稳定糖。但是，当根据第一个实施方案的固态肽微粒包含金属离子时，该微粒通常配制成金属离子与稳定化的多肽的摩尔比为约1/1至10/1，约2/1～约6/1的摩尔比范围是优选的，约4/1的摩尔比是特别优选的。向本发明的固态多肽微粒加入金属离子会减少随时间发生的多肽二聚作用的量，并由此进一步稳定多肽。据信，金属离子通过与多肽分子形成离子键或盐桥来减少多肽二聚作用，其中离子键或盐桥会限制多肽分子之间相互作用的机会。
向根据第一个实施方案的固态肽微粒加入稳定糖也提供附加的多肽稳定作用。通过限制多肽分子的流动性和减少多肽分子之间的分子间相互作用，加入的稳定糖能进一步稳定多肽。但是，因为本发明的固态多肽微粒可以配制成通过2种或多种相加的稳定条件来稳定多肽，当配制的根据本发明的固态多肽微粒包含稳定糖时，达到可接受水平的稳定性所需的糖量会显著减少。更具体地，当配制的根据第一个实施方案的固态多肽微粒包含稳定糖时，包含的糖的量的范围通常是相对于稳定化的多肽约0.1/1重量/重量～约1/1重量/重量。在优选的实施方案中，包含稳定糖的本发明的固态多肽微粒包含的稳定糖的量的范围是相对于稳定化的多肽约0.1/1重量/重量～约0.5/1重量/重量或约0.1/1重量/重量～约0.25/1重量/重量。当配制的根据第一个实施方案的固态多肽微粒包含稳定糖和金属离子两者时，达到理想的多肽稳定化程度所需的糖和金属离子的量可以相对于只含有稳定糖而无金属离子、或只含有金属离子而无稳定糖的制剂有所减小。这样的潜在优点可以通过糖、金属离子和酸性环境pH的相加稳定效应来实现。
尽管非还原糖通常可用作根据本发明的固态多肽微粒中的稳定糖，已经发现并非所有的糖都适用于稳定根据第一个实施方案的肽微粒。更具体地，已经发现蔗糖(经常用于稳定多肽的糖)不适于在酸性条件下使用。实际上，当蔗糖用在这种条件下时，已经发现会产生去稳定效应。我们认为，这样的去稳定效应的产生是因为蔗糖本身在酸性环境中不是化学稳定的。更具体地，蔗糖在酸性pH会水解成葡萄糖和果糖。尽管海藻糖象蔗糖一样是二糖，但是海藻糖在酸性条件和升高温度下是化学稳定的。单糖甲基-甘露吡喃糖苷(″甲基-MP″)在酸性环境下也是化学稳定的。而且已经发现，当包含在配制成表现出酸性pH的固态多肽微粒中时，海藻糖和甲基-MP都能显著地进一步稳定多肽。因此，当配制的根据第一个实施方案的固态多肽微粒包含稳定糖时，包含在制剂中的糖必须在酸性条件下是稳定的，优选在处于高达和超过生理条件的温度时在酸性条件下是稳定的。
可以从水性稳定溶液制备根据第一个实施方案的固态多肽微粒。为了制备适用于制备根据第一个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液，将要稳定的多肽溶解到酸性溶液中。通过加入合适的酸(例如HCl)，其量能生成具有理想pH的溶液，可以得到酸性的水性稳定溶液。本发明的水性稳定溶液的pH在稳定使用水性稳定溶液生产的固态多肽微粒中所含的多肽方面起关键作用。为了得到根据第一个实施方案的固态多肽微粒(即具有酸性重构pH)，可能必需在显著低于目标重构pH的表观pH下制备水性稳定溶液。适用于制备根据第一个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液还可以包含溶解于其中的金属盐或稳定糖。溶解在适用于生产根据第一个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液中的金属盐或稳定糖的量可以变化。但是，当水性稳定溶液是要用于制备包含稳定糖的固态多肽微粒时，优选地水性稳定溶液包含的理想稳定糖的量为相对于要稳定的多肽约0.1/1重量/重量～约1/1重量/重量。而且，当水性稳定溶液是要用于制备包含金属离子的固态多肽微粒时，制备的水性稳定溶液优选地包含理想的金属离子，且该金属离子与多肽的摩尔比范围是约1/1～约10/1。
为了从酸性的水性稳定溶液制备根据第一个实施方案的固态多肽微粒，对该稳定溶液进行已知的微粒形成过程。例如，可以使用冻干或喷雾干燥过程加工本发明的水性稳定溶液，得到固态肽微粒。在一个具体实施方案中，通过冻干循环从本发明的水性稳定溶液制备了根据本发明的固态多肽微粒，该冻干循环包括将稳定溶液在4℃冷冻30分钟，并在-50℃冷冻3小时(冷却速度为2.5℃/分钟)。如所述冷冻水性稳定溶液后，进行的初级干燥循环是在50mT的腔压下，在-30℃进行10分钟，然后在0℃进行10小时。初级干燥循环后的次级干燥循环是在200mT的腔压下，在0℃进行3小时，然后在20℃进行12小时，在30℃进行6小时，所有温度水平的升高是0.5℃/分钟。但是，本发明不限于通过这里所述的精确冻干过程生产的固态多肽微粒。在蛋白微粒形成领域已知若干合适的冻干和喷雾干燥过程，可以用于制备根据本发明的固态多肽微粒。
在第二个实施方案中，配制的本发明的固态多肽微粒表现出接近中性的重构pH。如本文所使用的，术语“接近中性的”是指pH5～约pH8的pH范围。优选地，配制的根据第二个实施方案的固态多肽微粒表现出约pH5～pH7的重构pH。根据本发明的第二个实施方案的多肽微粒包含缓冲剂，还包含表面活性剂、稳定糖、金属离子、或稳定糖和金属离子二者。已经发现，通过使配制的固态多肽微粒表现出接近中性的重构pH且包含缓冲赋形剂，可以显著地稳定包含在固态微粒中的多肽物质。我们认为，在接近中性的pH，缓冲剂可以通过抗衡离子作用稳定固态微粒中所含的多肽。更具体地，我们认为缓冲物质可以与容易发生分子间的或分子内的反应的包含在多肽中的一个或多个位点相互作用或与之结合，由此这些位点不能再发生反应。
适用于配制根据第二个实施方案的固态多肽微粒的缓冲剂是能在接近中性的pH进行缓冲的那些。可以用于根据第二个实施方案的固态多肽微粒的缓冲剂的具体实例包括氨基酸或肽缓冲剂，例如组氨酸缓冲剂(His-6)或组氨酸-谷氨酸(His-Glu)缓冲剂，和无机缓冲剂，例如琥珀酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。根据第二个实施方案的固态多肽微粒通常配制有至多约20％重量的缓冲剂，包含至多约15％重量的缓冲剂的多肽微粒是优选的。但是，包含在根据第二个实施方案的固态多肽微粒中的缓冲剂的精确量可以根据包含在微粒中的多肽的量和类型而变。而且，用于配制根据第二个实施方案的固态多肽微粒的缓冲剂的量和类型还可以调节以获得表现出理想的重构pH的固态多肽微粒。
通过使配制的根据第二个实施方案的固态微粒包含稳定糖、金属离子、或稳定糖和金属离子二者，包含在微粒中的多肽的稳定化会提高到超过通过简单地在有缓冲剂存在下、在接近中性的环境中配制多肽所得到的稳定作用。当根据第二个实施方案配制固态多肽微粒且其包含稳定糖、金属离子、或稳定糖和金属离子二者时，包含在微粒中的糖和金属离子的量优选地在关于第一个实施方案的固态肽微粒所详述的范围内。更具体地，如果配制的根据第二个实施方案的固态多肽微粒包含稳定糖，包含在微粒中的稳定糖的量优选地为相对于要稳定的多肽约0.1/1重量/重量～约1/1重量/重量。同样，非还原糖通常可用作根据本发明的固态多肽微粒中的稳定糖，但是因为它们是在接近中性的pH配制的，根据第二个实施方案的固态多肽微粒可以包含在酸性环境中是不稳定的稳定糖，例如蔗糖。而且，如果配制的根据第二个实施方案的固态多肽微粒包含金属离子，配制的微粒优选地包含理想的金属离子，且金属离子与多肽的摩尔比范围是约1/1～约10/1。当配制的根据第二个实施方案的固态多肽微粒包含稳定糖和金属离子二者时，达到理想的多肽稳定化程度所需的糖和金属离子的量可以相对于只含有稳定糖而无金属离子、或只含有金属离子而无稳定糖的制剂有所减小。这样的潜在优点可以通过糖、金属离子和在接近中性的pH的缓冲条件的相加稳定作用来实现。
当配制的根据第二个实施方案的固态肽微粒包含表面活性剂时，使用的表面活性剂优选地为阴离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)。包含在根据第二个实施方案的固态多肽微粒中的表面活性剂的量可以根据要稳定的多肽的量和类型以及包含在微粒中的其它赋形剂的性质和量而变化。然而，当从水性稳定溶液配制根据第二个实施方案的固态多肽微粒时，其包含的理想的表面活性剂的量为约0.02重量％～约0.2重量％。
可以从水性稳定溶液制备根据第二个实施方案的固态多肽微粒。为了制备适用于制备根据第二个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液，将要稳定的多肽溶解到表现出接近中性的表观pH的溶液中，且该溶液根据需要包含表面活性剂、金属盐、稳定糖或金属盐和稳定糖二者。接近中性的稳定溶液可以通过加入合适的缓冲剂来制备，例如已经讨论的那些缓冲剂，其量能产生具有理想表观pH的溶液。正如用于制备根据第一个实施方案的固态微粒的水性稳定溶液，用于制备根据第二个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液的表观pH控制着使用该水性稳定溶液生产的固态多肽微粒的重构pH。因此，为了得到理想的表观pH和理想的重构pH，在用于生产根据第二个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液中使用的缓冲剂的量和类型可以变化。而且，为了得到特征在于其缓冲剂含量在本文所述的范围内的固态多肽微粒，包含在水性稳定溶液中的缓冲剂的量可以根据使用的缓冲剂的类型、在固态微粒中理想的缓冲剂的精确量和要包含在固态微粒中的多肽和其它赋形剂的性质和量等因素而变化。例如，下面详述的实施例中，特征在于10mM浓度的组氨酸缓冲剂的稳定溶液提供了含有14重量％缓冲物质的固态多肽微粒。
溶解在适用于制备根据第二个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液中的金属盐或稳定糖的量也可以根据要稳定的多肽的量和性质以及金属盐或稳定糖的性质而变化。但是，当用于制备根据第二个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液包含稳定糖时，该水性稳定溶液优选地包含理想的稳定糖，其量在已经描述的范围内(即相对于要稳定的多肽约0.1/1重量/重量～约1/1重量/重量，其中约0.1/1重量/重量～约0.5/1重量/重量和约0.1/1重量/重量～0.25/1重量/重量的范围是优选的)。而且，当用于制备根据第二个实施方案的固态多肽微粒的水性稳定溶液包含金属离子时，制备的水性稳定溶液优选地包含理想的金属离子，金属离子与多肽的摩尔比在已经描述的范围内(即金属离子与多肽的摩尔比范围为约1/1～约10/1，其中约2/1～约6/1的摩尔比范围是优选的，约4/1的摩尔比是特别优选的)。
为了从接近中性的水性稳定溶液制备出根据第二个实施方案的固态多肽微粒，需要对接近中性的稳定溶液进行已知的微粒形成过程。如关于制备根据第一个实施方案的微粒所描述的，可以使用冻干或喷雾干燥过程从适当地配制的水性稳定溶液制备出根据第二个实施方案的固态微粒。例如，本文所述的冻干过程适用于从水性稳定溶液制备根据第二个实施方案的固态多肽微粒。但是同样，本发明不限于使用这里详述的具体冻干过程。通过冻干和喷雾干燥过程形成微粒是本领域熟知的，任何合适的冻干或喷雾干燥过程都可以应用到本发明的水性稳定溶液，以提供根据本发明的固态多肽微粒。
本发明的固态多肽微粒、水性稳定溶液和方法特别适用于稳定属于包括以下成员的肽超家族的肽垂体腺苷酸环化酶多肽(″PACAP″)和胰高血糖素。在人类中，PACAP/胰高血糖素肽超家族包括至少9种不同类型的生物活性肽PACAP-27；PACAP-38；胰高血糖素；胰高血糖素样肽，例如GLP-1和GLP-2；生长激素释放因子(″GRF″)；血管活性肠多肽(″VIP″)；肽组氨酸甲硫氨酸(″PHM″)；肠促胰液素；和糖依赖性胰岛素释放多肽(″GIP″)。在脑中发现了这9种不同类型的生物活性肽中的8种，并将它们分类为神经肽。另外，PACAP/胰高血糖素超家族的许多成员存在于胃肠、胰腺和生殖腺器官中(见，The originand function of the pituitary adenylate cyclase-activatingpolypeptide(PACAP)/glucagon superfamily，Endocrine Reviews，21(6)619-670)。包含在PACAP/胰高血糖素超家族中的肽通过它们的N末端氨基酸在结构上相关，在细胞生产各种不同的包含在PACAP/胰高血糖素超家族中的肽时使用的基因和前体分子在结构上相似。
特别令人感兴趣的是Bayer Corporation(″Bayer″)生产的合成的PACAP-R3激动剂类似物(″PACAP类似物″)。该合成肽通过下面的31个氨基酸序列定义HSDAVFTDNY TRLRKQVAAK KYLQS IKNKR Y。Bayer改造了PACAP类似物的效力和对胰腺中的R 3受体的选择性。为了提高PACAP类似物的稳定性，将位点17上的原始甲硫氨酸替换为缬氨酸，将原始位于位点24上的天冬酰胺替换为谷氨酰胺。该PACAP类似物可以用于治疗I I型糖尿病，理想的是从能输送PACAP类似物的可植入药物输送系统给对象(人)输送治疗剂量的PACAP类似物至少3个月，优选至少6个月。但是，无论是维持在固态还是溶解在水性的或有机溶剂溶液中，未保护的PACAP类似物在接近或超过生理条件的温度下是不稳定的。因此，为了将PACAP类似物装载在适用于从可植入的长期释放输送系统输送的悬浮液中，必须稳定固态PACAP类似物微粒以防止否则会因长期暴露于接近或超过生理条件的温度而造成的降解。
随着固态PACAP类似物暴露于接近或超过生理条件的温度，已经确定最重要的降解源是聚集体形成。更具体地，使用冻干的PACAP类似物，经测定，未保护的冻干的PACAP类似物的主要降解产物是共价二聚体、二聚体-OAc和PACAP-OAc加合物。目前认为，PACAP类似物降解为这样的聚集体产物是如下进行的形成反应性分子内环状酰亚胺，随后由醋酸盐离子、另一个PACAP类似物分子或二者进行亲核攻击。这些提出的降解途径的可能的修饰位点是在PACAP类似物分子的Asp3Ala4和Gln24Ser25氨基酸处。已经进一步确认，还发生N末端肽键的切割来降解固态的未保护的PACAP类似物。发现该蛋白水解主要在pH4，推测是通过辅助的Asp3羧基侧链的分子内环封闭而发生。但是，如在下面的实施例中所详述的，本发明的固态多肽微粒的各种实施方案在稳定PACAP类似物防止降解方面是有效的，甚至当该微粒维持在40℃和60℃的温度数月时亦如此。
尽管本发明的固态多肽微粒方法的几种不同实施方案能有效地稳定PACAP类似物，3个实施方案提供了优越的稳定作用。在一个实施方案中，固态PACAP类似物微粒是从表现出表观pH 2的稳定溶液冻干的。用稀HCl将H2O的pH调至理想值，制备出用于稳定溶液的溶剂。在60℃储存2个月后，根据该实施方案的固态PACAP类似物微粒能回收92％的原始PACAP类似物，且仅形成1.1％的二聚体。图9显示了2个月稳定性的结果，证实了从具有表观pH2的稳定溶液制备出的固态PACAP微粒的显著提高的稳定性。
在第二个实施方案中，在酸性pH配制固态多肽微粒，且包含0.55/1重量/重量比(海藻糖/PACAP类似物)的海藻糖和PACAP类似物。这些微粒能回收96％的原始PACAP类似物，且仅形成0.7％的二聚体，甚至在60℃储存2个月后。为了配制特征在于酸性pH且包含0.55/1重量/重量比的海藻糖和PACAP类似物的固态PACAP类似物微粒，可以使用酸性的水性稳定溶液。可以使用合适的酸(例如稀HCl)制备这样的稳定溶液。该溶液的pH(表观pH)优选地调节至约pH2，且将海藻糖和PACAP类似物以理想的0.55/1重量/重量比溶解到该溶液中。然后可以对制备的溶液进行冻干或喷雾干燥过程，以生产理想的固态PACAP类似物微粒。
在第三个实施方案中，还是在酸性pH配制固态多肽微粒，且其包含4/1摩尔比(Ca2+/PACAP类似物)的PACAP类似物和Ca2+离子。在60℃储存2个月后，根据该制剂制备的微粒能回收95％的原始PACAP类似物，且仅形成0.8％的二聚体。为了配制特征在于酸性pH且包含4/1摩尔比的Ca2+和PACAP类似物的固态PACAP类似物微粒，可以制备酸性的水性稳定溶液。同样地，可以使用合适的酸(例如稀HCl)制备这样的溶液，且该溶液的pH优选地调节至约pH2。将CaCl2和PACAP溶解，其量能生成Ca2+和PACAP类似物的摩尔比为4/1的溶液，可以在溶液中提供合适量的Ca2+离子和PACAP类似物。然后可以对制备的稳定溶液进行冻干或喷雾干燥过程，以生产理想的固态PACAP类似物微粒。
尽管已经在最高60℃的温度、最长2个月的时间评价了包含在本文所述的微粒中的PACAP类似物的稳定性，该评价和在40℃的降解动力学的对比提供的发现表明，本发明的方法适用于提供稳定化的固态PACAP类似物微粒，其能在接近生理温度的温度(即40℃)抗降解远远超过2个月。更具体地，已经发现，包含在微粒中的PACAP类似物在60℃的总降解速度比在40℃高约5倍。而且，根据本发明生产的固态PACAP微粒中的聚集或二聚作用在60℃的速度比在40℃高10倍。因此，当将根据本发明的方法生产的固态PACAP类似物微粒维持在约37℃时，预期包含在微粒中的PACAP类似物将会表现出可接受的稳定性长达6个月和可能更久。
尽管下面的实施例指向PACAP类似物的稳定化，但是本发明不限于此。例如，本发明的方法可以用于提供PACAP/胰高血糖素超家族的其它成员的稳定化的固态微粒，特别是具有实质上同源的氨基酸序列的那些家族成员，例如人VIP和人生长激素释放因子。但是，本发明的方法也不限于稳定化PACAP/胰高血糖素超家族的成员。本发明的固态多肽微粒、水性稳定溶液和方法可以用于稳定表现出因蛋白水解或聚集体形成造成的降解或具有倾向于降解途径(例如对PACAP观察的那些)的一级结构的任何多肽。
实施例1鉴于在可植入的药物输送系统中使用的悬浮介质的性质，经常在升高温度下混合悬浮制剂材料并随后将悬浮制剂装载到可植入系统中。为了评价在升高温度下悬浮在各种悬浮介质中的PACAP类似物(或简称″PACAP″)的稳定性，将未保护的冻干PACAP悬浮在4种不同的悬浮介质(LL/GML/PVP，BA/PVP，EHL/PVP，和PEG/PVP)中。为了将PACAP悬浮在悬浮介质中，手工地将3.3mg醋酸PACAP混合到每种不同的悬浮液中，使PACAP含量为约3％。在65℃温育4小时后，评价PACAP悬浮制剂的稳定性。通过RP-HPLC和SEC评价了制备的PACAP悬浮液的稳定性，如从表1中所见，结果表明PACAP在整个4小时温育期间都是稳定的，因此应该能够经受与悬浮制剂生产过程典型相关联的温度条件。
然后进一步在37℃和65℃温育PACAP悬浮液另外的17天。另外的17天温育阶段结束后，在37℃温育的悬浮液中观察到微小的稳定性丧失(表2)，而在65℃温育的悬浮液中观察到相对更强的降解(表3)。该结果表明，共价连接的聚集是评价的PACAP悬浮液中的主要降解途径。在有和没有介质存在的情况下均发生聚集这一事实表明，悬浮介质不是造成自联结的原因。另外，其它的化学降解也促成冻干的PACAP的丧失。
实施例2从加工研究得到的基本发现导致对于糖(蔗糖)和非离子表面活性剂(吐温80)对PACAP冻干物和悬浮液的稳定化作用的评价。为了进行评价，以3个水平的吐温80(0，0.05，0.2重量％)和蔗糖(0，0.5/1，1/1，重量/重量)在10mM NH4OAc(pH6.4)中用PACAP制备了样品。还制备了在10mM组氨酸(pH 6.4)和琥珀酸钠(pH 5.6)中的PACAP溶液。冻干每种PACAP溶液，得到重构的固态PACAP微粒，向每个小瓶中装入3.3mg从每种溶液重构的物质样品，其中的样品含有(1)无添加剂，(2)0.2重量％的吐温80，(3)0.2％重量的吐温80+0.5∶1重量/重量的蔗糖，和(4)1∶1重量/重量的蔗糖。手工地将各种3.3mg样品与LL/GML/PVP和BA/PVP混合，得到具有约3％PACAP含量的悬浮制剂，在65℃温育悬浮制剂4小时。初始温育阶段后，如下所述储存各种悬浮制剂，并通过RP-HPLC和SEC评价。
图1表明，蔗糖抑制了PACAP聚集，而吐温80的存在没有附加作用。通过剩余PACAP的百分比评估的总体稳定性也相应增加。PACAP聚集的程度表现为受储存温度影响(图2)。不含有稳定剂的冻干的PACAP在4℃保持稳定至少3个月，且与40℃相比，在60℃实质上更迅速地聚集。该研究表明，蔗糖在生理温度(40℃)和升高温度(60℃)下均能稳定冻干的PACAP。
图3和4分别显示了用各种不同赋形剂制备的冻干制剂在40和60℃储存3个月PACAP聚集体形成的线性增加。证实了组氨酸和琥珀酸钠是比醋酸铵更好的稳定剂。除了含有1∶1重量/重量的蔗糖的样品以外，在60℃的聚集速度约比在40℃观察到的快10倍，在60℃的总降解速度约比在40℃观察到的快5倍(表4)。这些结果表明，高蔗糖含量能通过降低总体的分子流动性和蛋白-蛋白相互作用来提高热稳定性。
另一方面，总降解在3个月的时间段内表现出线性较低的关系(图5)。该实验表明，含有等量蔗糖(重量/重量)的冻干PACAP(在醋酸铵中在表观pH6.4制备的)能产生最佳的(但不是可接受的)稳定性，估计在40℃在6个月中的总降解为8.4％。
另外，该实验表明蔗糖对在BA/PVP和LL/GML/PVP中的PACAP悬浮液的聚集体形成的抑制(图6和7)类似于单独的冻干的PACAP制剂。就聚集体形成而言蔗糖的稳定化作用似乎在BA/PVP悬浮液中有所减小。在BA/PVP中PACAP的类似的长期稳定性需要更多量的蔗糖(图8)。
为了表征降解产物并阐明降解途径，通过电雾化飞行时间质谱分析了重构的稳定性样品(在60℃储存了24天的冻干PACAP)，并使用RP-HPLC方法鉴别了降解产物。
完整PACAP的分子量(MW)为3743原子质量单位。基于RP-HPLC分析，鉴别出主要的降解产物是共价二聚体和二聚体-OAc加合物。值得注意的是，在主峰之后但是在洗脱二聚体峰之前洗脱的一群峰都具有与PACAP-OAC加合物(即3785原子质量单位)相同的质量。从RP-HPLC和电雾化飞行时间质谱分析得到的组合结果表明，两种降解通过相同的反应中间体进行。基于该分析，可假设潜在的降解机制如下方案1假设的机制 可以假设降解通过2步机制进行，经由限速的环状酰亚胺中间体形成和随后的醋酸盐离子、另一个PACAP分子或二者的亲核加成。由于所有样品的水含量都较低(＜1％)，作为水亲核加成结果的脱酰胺作用不是主要的。
实施例3使用在pH6的NH4OAc缓冲液中制备的3种不同的多肽溶液，通过冻干方法(FTS Duro stop)制备了固态PACAP微粒。3种不同溶液中的每一种含有不同量的蔗糖，第一种无蔗糖，第二种含有的蔗糖与PACAP的重量比为0.5/1，第三种含有的蔗糖与PACAP的重量比为1/1。将从3种溶液中的每一种制备的固态PACAP微粒储存在2℃～8℃的对照温度、接近生理温度的温度(40℃)和超过生理温度的温度(60℃)。在24天和3个月，评估包含在每组固态PACAP微粒中的PACAP的稳定性。为了评估每组微粒中的PACAP稳定性，将微粒重构到水中，通过反相RP-HPLC(乙腈梯度洗脱，流动相含有0.1％三氟醋酸，在214nm紫外检测)和尺寸排阻HPLC(SEC，恒溶剂洗脱，30％乙腈与含有0.1％三氟醋酸和200mM氯化钠的70％水溶液混合，在220nm紫外检测)分析。
对于测试的所有制剂，在60℃的聚集速度(通过SEC评估)都比在40℃高10倍(表5)。除了以PACAP与蔗糖重量比为1/1制备的固态PACAP微粒外，在60℃在各种固态PACAP微粒中观察到的总降解速度(通过RP HPLC评估)都比在40℃快约5倍。
实施例4评价了pH对PACAP分子随时间的稳定性的影响。为了进行这样的评价，首先将PACAP原料溶解到3种不同溶液的水中，第一种溶液的pH为2，第二种溶液的pH为4，第三种溶液的pH为6。使用稀HCl将每种溶液的pH调至理想值。3种溶液中的每一种都装在冻干瓶中，通过本文已经描述的冻干过程，从每种溶液生产出固态PACAP微粒。然后将来自每种溶液的微粒在60℃储存2个月，然后使用RP-HPLC和SEC评价了包含在固态微粒中的PACAP的稳定性。图9显示了2个月稳定性的结果，证实了在酸性pH制备的固态PACAP微粒的显著提高的稳定性。
实施例5评价了在不同pH、用一定量的潜在稳定糖制备的固态PACAP微粒中含有的PACAP的稳定性。在每种情况下，固态PACAP微粒含有7.3摩尔当量的3种不同糖中的一种蔗糖；海藻糖；和甲基甘露吡喃糖苷(均来自Sigma)。从8种不同水性溶液制备了评价的固态PACAP微粒。通过将PACAP溶解到pH调至2的第一种溶液和pH调至6的第二种溶液(如前，使用稀HCl调整本实施例所述的各种溶液的pH)中，制备了前两种水性溶液。通过将PACAP和甲基-MP溶解到pH调至2的溶液和pH调至6的溶液中，制备了第三种和第四种水性溶液。通过将PACAP和海藻糖溶解到pH调至2的溶液和pH调至6的溶液中，制备了第五种和第六种水性溶液。通过将PACAP和蔗糖溶解到pH调至2的溶液和pH调至6的溶液中，制备了第七种和第八种水性溶液。
如已经描述的，通过冻干从8种溶液中的每一种制备了固态PACAP微粒，然后将从8种溶液中的每一种制备的固态PACAP微粒在60℃储存2个月。将各种固态PACAP微粒暴露于60℃2个月后，使用RP HPLC和SEC方法评价了包含在各种微粒中的PACAP的稳定性。
HPLC分析表明，当包含在于pH6制备的PACAP微粒中时，研究的所有3种糖都表现出提高的稳定性。更具体地，在pH6，蔗糖在防止聚集体形成方面提供约6倍的改善，海藻糖在相同的测量中提供约4倍的改善。而且，与在pH2制备的没有添加稳定糖的PACAP微粒相比，海藻糖和甲基MP均对在pH2制备的微粒中包含的PACAP提供附加的稳定性(表6)。但是，当包含在于pH2制备的PACAP微粒中时，蔗糖表现出显著的去稳定效应。我们认为，蔗糖对在pH2制备的PACAP的去稳定效应是从酸性pH的溶液生产PACAP微粒的过程中蔗糖分解的结果。
实施例6制备了含有组氨酸缓冲剂(Sigma)的PACAP微粒和含有组氨酸缓冲剂与氯化钙(CACl2，JT Baker)、蔗糖和十二烷基硫酸钠(SDS，Pierce)组合的PACAP微粒，评价了这些微粒提供的PACAP稳定作用。为了制备评价的PACAP微粒，制备了6种不同的水性溶液。每种溶液包含理想量的溶于其中的PACAP，通过加入稀HCl将制备的6种溶液中的每一种的pH调至6。制备的第一种水性溶液没有添加剂(组氨酸缓冲剂、CaCl2、蔗糖或SDS)。用10mM浓度的组氨酸缓冲剂制备了第二种水性溶液。用10mM浓度的组氨酸缓冲剂和10mM浓度的CaCl2配制了第三种水性溶液。用10mM浓度的组氨酸缓冲剂配制了第四种水性溶液，且含有相对于PACAP的重量比为0.5/1(蔗糖/PACAP)的蔗糖。用10mM浓度的组氨酸缓冲剂、10mM浓度的CaCl2和能提供相对于PACAP为0.5/1重量比(蔗糖/PACAP)的蔗糖量，制备了第五种水性溶液。用10mM浓度的组氨酸缓冲剂和0.02重量％的SDS制备了第六种水性溶液。然后使用本文已经描述的冻干过程，从6种水性溶液中每一种制备了固态PACAP微粒。然后将从每种溶液制备的PACAP微粒在60℃储存2个月，储存后，使用RP-HPLC和SEC方法评价了包含在各种不同微粒中的PACAP的稳定性。如表7所示，组氨酸缓冲剂的存在大大抑制了PACAP聚集体的形成(聚集体的形成大约降低了6倍)。另外，蔗糖、CaCl2和SDS能进一步稳定肽，将聚集体的形成降低约14～20倍。
实施例7为了评价CaCl2对在酸性和接近中性的pH制备的PACAP微粒的稳定作用，配制了4种不同类型的微粒，在60℃储存了2个月，然后分析了PACAP降解。从4种不同的水性溶液制备了4种不同的微粒制剂。4种溶液中的每一种都包含理想量的溶于其中的PACAP，并使用稀HCl将每种溶液的pH调至理想水平。配制的第一种水性溶液不含有添加剂(组氨酸或CaCl2)，且第一种溶液的pH调至2。配制的第二种水性溶液含有10mM浓度的CaCl2，且第二种溶液的pH调至2。配制的第三种水性溶液含有10mM浓度的组氨酸缓冲剂，配制的第四种水性溶液含有10mM浓度的组氨酸缓冲剂和10mM浓度的CaCl2。使用本文已经描述的冻干过程，从4种水性溶液中每一种制备了固态PACAP微粒(每种不同微粒的组成见表8)，将从4种中每种溶液制备的PACAP微粒在60℃储存2个月。将微粒在60℃储存2个月后，使用RP-HPLC和SEC方法评价了包含在微粒中的PACAP的稳定性。如表8所示，该评价的结果证实，在pH2和6，CaCl2均进一步提高PACAP微粒的稳定性(表8)。
权利要求
1.稳定化的多肽微粒，其包含多肽和选自金属离子和糖类的稳定剂，所述糖在高达或超过生理条件的温度在酸性条件下是稳定的，该多肽微粒配制成表现出酸性重构pH。
2.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有多肽、金属离子和糖，所述糖在高达和超过生理条件的温度在酸性pH下是稳定的。
3.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂选自二糖和单糖，所述糖在高达和超过生理条件的温度在酸性条件下是稳定的。
4.根据权利要求3的多肽微粒，其中所述的稳定剂选自海藻糖和甲基-甘露吡喃糖苷。
5.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含选自二糖和单糖的稳定剂，所述糖在高达和超过生理条件的温度在酸性条件下是稳定的，且该稳定剂以稳定剂与多肽的重量/重量比为约0.1/1～约1/1包含在多肽微粒中。
6.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含选自二糖和单糖的稳定剂，所述糖在高达和超过生理条件的温度在酸性条件下是稳定的，且该稳定剂以稳定剂与多肽的重量/重量比为约0.1/1～约0.5/1包含在多肽微粒中。
7.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含选自二糖和单糖的稳定剂，所述糖在高达和超过生理条件的温度在酸性条件下是稳定的，且该稳定剂以稳定剂与多肽的重量/重量比为约0.1/1～约0.25/1包含在多肽微粒中。
8.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含源自二价金属离子盐的金属离子。
9.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含源自选自CaCl2，MgCl2和ZnCl2的二价金属离子盐的金属离子。
10.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含金属离子，且包含在多肽微粒中的稳定剂与多肽的摩尔比范围为约1/1～约10/1。
11.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含金属离子，且包含在多肽微粒中的稳定剂与多肽的摩尔比范围为约2/1～约6/1。
12.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的稳定剂包含金属离子，且包含在多肽微粒中的稳定剂与多肽的摩尔比为约4/1。
13.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的多肽选自垂体腺苷酸环化酶多肽/胰高血糖素超家族。
14.根据权利要求1的多肽微粒，其中所述的多肽选自垂体腺苷酸环化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、生长激素释放因子、血管活性肠多肽、肽组氨酸甲硫氨酸、肠促胰液素和糖依赖性胰岛素释放多肽。
15.稳定化的多肽微粒，其包含垂体腺苷酸环化酶多肽和选自海藻糖和甲基-甘露吡喃糖苷的稳定糖，其中包含在多肽微粒中的稳定糖与垂体腺苷酸环化酶多肽的重量/重量比是约0.55/1，且该多肽微粒配制成表现出酸性重构pH。
16.稳定化的多肽微粒，其包含垂体腺苷酸环化酶多肽和选自Ca2+、Mg2+和Zn2+的稳定金属离子，其中包含在多肽微粒中的金属离子与垂体腺苷酸环化酶多肽的摩尔比是约4/1，且该多肽微粒配制成表现出酸性重构pH。
17.多肽微粒，其包含多肽和2种或多种选自金属离子、表面活性剂、缓冲剂和糖类的稳定剂，所述糖类在高达和超过生理条件的温度下在接近中性的pH环境中是稳定的，该多肽微粒配制成表现出接近中性的重构pH。
18.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽选自垂体腺苷酸环化酶多肽/胰高血糖素超家族。
19.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽选自垂体腺苷酸环化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、生长激素释放因子、血管活性肠多肽、肽组氨酸甲硫氨酸、肠促胰液素和糖依赖性胰岛素释放多肽。
20.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有稳定糖和选自氨基酸缓冲剂、肽缓冲剂和无机缓冲剂的缓冲剂。
21.根据权利要求21的多肽微粒，其中稳定糖与多肽的重量/重量比范围为约0.25/1～约1/1。
22.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有选自氨基酸缓冲剂和肽缓冲剂的缓冲剂和稳定金属离子。
23.根据权利要求23的多肽微粒，其中金属离子与多肽的摩尔比范围为约2/1～约10/1。
24.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒包含选自氨基酸缓冲剂和肽缓冲剂的缓冲剂和表面活性剂。
25.根据权利要求25的多肽微粒，其中所述的表面活性剂占多肽微粒的约0.02重量％至约0.2重量％。
26.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有选自氨基酸缓冲剂和肽缓冲剂的缓冲剂、表面活性剂、金属离子和稳定糖。
27.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的表面活性剂包含十二烷基硫酸钠。
28.根据权利要求25的多肽微粒，其中所述的表面活性剂包含十二烷基硫酸钠，且占多肽微粒的约0.02重量％至约0.2重量％。
29.根据权利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽是垂体腺苷酸环化酶多肽，且该多肽微粒包含选自氨基酸缓冲剂和肽缓冲剂的缓冲剂和一种或多种另外的稳定剂，所述另外的稳定剂选自稳定糖，包含的稳定糖与多肽的重量/重量比范围为约0.25/1～约1/1；金属离子，包含的金属离子与多肽的摩尔比范围为约2/1～约10/1；和表面活性剂，其占多肽微粒的约0.02重量％至约0.2重量％。
30.稳定化的多肽微粒，其包含在酸性条件下是稳定的多肽，其中该多肽微粒配制成表现出酸性重构pH。
31.根据权利要求30的稳定化的多肽微粒，其中所述的稳定化的多肽微粒配制成表现出低于pH 5的重构pH。
32.根据权利要求30的稳定化的多肽微粒，其中所述的稳定化的多肽微粒配制成表现出约pH 2至pH 4的重构pH。
33.根据权利要求30的稳定化的多肽微粒，其中所述的多肽包含选自垂体腺苷酸环化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、生长激素释放因子、血管活性肠多肽、肽组氨酸甲硫氨酸、肠促胰液素和糖依赖性胰岛素释放多肽的多肽，且该微粒配制成表现出低于pH 5的重构pH。
34.根据权利要求30的稳定化的多肽微粒，其中所述的多肽包含选自垂体腺苷酸环化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、生长激素释放因子、血管活性肠多肽、肽组氨酸甲硫氨酸、肠促胰液素和糖依赖性胰岛素释放多肽的多肽，且该微粒配制成表现出约pH 2至pH 4的重构pH。
35.根据权利要求30的稳定化的多肽微粒，其中所述的多肽包含垂体腺苷酸环化酶多肽类似物，在60℃储存2个月后，配制的微粒能回收大于90％的初始垂体腺苷酸环化酶多肽类似物，且形成低于2％的二聚体。
全文摘要
本发明包括含有多肽物质的固态多肽微粒，所述多肽物质经稳定能在接近或超过生理条件的温度抗降解。在每个实施方案中，本发明的多肽微粒都含有多肽物质，其由一种或多种稳定条件稳定化以抗降解。因为本发明的多肽微粒可以配制成结合两种或多种稳定条件的相加作用，当本发明的多肽微粒包含稳定糖时，达到可接受的多肽稳定性所需的稳定糖的量显著降低。
文档编号A61K9/00GK1708314SQ200380102384
公开日2005年12月14日 申请日期2003年10月28日 优先权日2002年10月29日
发明者J·本茨, 康玲玲 申请人:阿尔萨公司