器官再生方法

专利名称：器官再生方法
技术领域：
本发明涉及器官的再生方法。
背景技术：
再生医疗是利用人工培养的细胞等来治疗因病或事故等失去的器官或组织的治疗方法。该治疗方法比现有的药品治疗副作用少，并且有望用于阿尔茨海默病等疑难病的治疗。最接近实际应用的是皮肤的再生，从真皮分离出成纤维细胞并大量培养，然后将细胞植于用胶原制作的片上，已成功地制作出真皮的结构。将该片移植到固烧伤等使皮肤受损伤的患者身体，则可以与患者的皮肤成为一体，再生皮肤。
还尝试过使用干细胞进行的再生医疗。干细胞是同时具有自我增殖能力和分化能力的来分化的细胞，是组织或器官发育的来源细胞，存在于几乎所有的器官或组织中。造血干细胞或神经干细胞等各种干细胞中，ES细胞(胚胎干细胞)是增殖能力高，可以分化为几乎所用种类的组织的细胞。ES细胞是由人受精后5-7天左右，小鼠受精后3-4天左右的早期胚胎(受精卵)制备的细胞。ES细胞具有分化为各种细胞的能力和高的增殖能力，因此有望应用于再生并补充失去的细胞这样的新的治疗方法(再生医疗)中应用。但是，ES细胞的应用存在两大问题得自受精卵，存在伦理学问题；在现有阶段要控制ES仅分化为所需细胞是极困难的。因此，本发明人针对来自骨髓的干细胞进行了再生医学研究。
肝脏是具有广泛的再生能力的唯一的器官。一直以来，人们认为肝脏的再生只由肝细胞或卵细胞进行。已知存在于间生在肝组织的微胆管之间的赫林氏(Herring)管中的卵圆细胞(毛细胆管细胞)具有向肝细胞和胆管细胞两极分化的能力。Petersen等人证明了施用四氯化碳和烯丙基醇后，来自骨髓的细胞生成肝细胞的可能性高。Lagasse等人指出通过对酪氨酸血症模型小鼠进行骨髓移植，可见肝细胞分化，并可见肝功能部分改善(参见Lagasse E.等。Nat Med.20006(11)1229-1234)。
但是，尚未证明具有卵圆细胞特征的干细胞可用于病肝组织或损伤肝组织的再生。并且，卵圆细胞是否真的就是肝脏组织的干细胞，是否可对肝脏组织的再生起主要作用，或者造血干细胞可以多大程度重新构成患病的肝组织，分化为肝细胞和肝脏的其它构成细胞时必须有什么样的情况等等，这些问题尚未明确。

发明内容
本发明的目的在于提供器官的再生方法、治疗方法和制备方法，以及提供再生器官。
本发明人为解决上述课题进行了深入研究，结果发现对有障碍的哺乳动物进行骨髓移植，则可以高比率地使有障碍的器官再生，从而完成了本发明。
即，本发明内容如下。
(1)器官或其一部分的再生方法，其特征在于对所述器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植。
(2)上述障碍的治疗方法，其特征在于对所述器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植，使该器官或其一部分再生。
(3)上述器官或其一部分的制造方法，其特征在于对器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植，使该器官或其一部分再生，采集所得再生器官或其一部分。
(4)再生的器官或其一部分，该再生的器官或其一部分是通过对器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植而得到的。
这里，在上述(1)-(3)的方法和(4)的器官或其一部分中，作为骨髓移植用的细胞，可例举骨髓细胞；作为造血干细胞，可例举例如来自外周血或脐带血的造血干细胞(例如外周血干细胞或脐带血干细胞)。障碍是指例如功能障碍或者物理或化学性损伤。对于哺乳动物并没有特别限定，例如可以使用新生哺乳动物。器官选自肝脏、心脏、脑、肺、肾脏、肠、胰脏、眼、骨和牙齿的至少一种。
附图简述

图1是表示肝脏的再生的照片。
图2是表示肝脏切除端的再生的照片。
图3是表示心内膜中来自骨髓干细胞的大量细胞的分化以及各个心肌细胞的出现图4是表示在一片冠状动脉断面上存在4-6个左右的心肌细胞的照片。
图5是通过冠状动脉断面对各个心肌细胞的存在进行分析，制成3D图像，在空间上表示来自骨髓干细胞的心肌细胞在整个心脏的有很多分布的照片。
图6是表示将心肌细胞用连接蛋白43和肌钙蛋白1c染色结果的照片，以及表示通过Nomarsky imaging观察GFP阳性心肌细胞的结果的照片。
图7是表示肺和支气管上皮细胞由骨髓再生的照片。
图8是表示肾脏的肾小球系膜细胞的再生的照片。
图9是表示小肠细胞的再生的照片。
图10是表示骨骼的骨细胞和成骨细胞的再生的照片。
图11是表示牙龈和牙齿的再生的照片。
图12是表示眼的表层的再生的照片。
图13是表示眼角膜上皮的再生的照片。
图14是表示脑神经细胞的再生的照片。
实施发明的最佳方式以下详细说明本发明。
本发明显示通过对器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植，或进行外周血干细胞等造血干细胞移植，使造血细胞高比率且广范围地分化成该器官的细胞，使其再生。
以往认为心脏、脑在出生后不再分裂或再生。本发明通过制作哺乳动物的伤害模型以及进行造血干细胞移植，首次成功地制备(再生)了器官。
并且新生小鼠的器官成熟后，在各组织(肝脏、心脏等)中的干细胞充分发挥其机能，因此比起造血干细胞对受伤组织的再生，已存在于组织中的干细胞对再生起着更重要的作用。因此，本发明人着眼于新生哺乳动物的初生环境。出生后体内的各器官快速生长，此时构成组织的各细胞的明显增殖。其中，移植造血干细胞在组织中得以利用的几率很高，另外由于是初生，具有高可塑性的环境的可能性高，因此对新生哺乳动物进行移植的同时可以一并制作用于观察再生情况的伤害模型。
本发明人为了实现利用造血干细胞的多功能性的再生医疗，首先考虑到了肝脏的再生。为了制作高比率且纯度的再生型肝脏，对作为受体的新生哺乳动物的肝脏进行部分切除，在此基础上进行骨髓移植(特别是骨髓中干细胞的移植)。对该受体的肝脏进行分析，得知大多数肝细胞由来自供体的造血干细胞分化而来。结果使利用造血干细胞进行的肝脏再生成为可能。这样可知即使是对受损伤的患者，造血干细胞的分化能力也可得以发挥。本发明基于上述认识而完成，涉及在各种器官中进行使用造血干细胞的再生医疗的开发。
1.哺乳动物本发明所使用的哺乳动物例如有猪、牛、马、猴、狗、绵羊、山羊、大鼠、小鼠等。从模型动物丰富，已培育有近交系的角度考虑，优选小鼠。从适合实际的再生医疗应用的角度考虑，优选猪。也可以对人进行临床应用，但这种情况下需获得知情同意后，在医生的严格监督管理下选择患者。对于本发明所使用的新生哺乳动物没有特别限定，优选在出生后4天内，更优选出生后2天以内。
2.器官或其一部分本发明中，“器官”是指生物体内生命活动所必须的所有的组织或器官，也包括其一部分(细胞、组织等)。
器官包括例如消化系统、呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、心血管系统、淋巴系统、感觉器官、中枢神经系统、骨骼系统、肌肉的各种组织或器官。
上述器官可例举以下内容。但并不限于这些。
消化系统口腔、咽、食管、胃、小肠、大肠、肝脏、胰脏呼吸系统气管、支气管、肺、胸膜泌尿系统肾脏、输尿管、膀胱生殖系统内生殖器、外生殖器心血管系统心脏、动脉、静脉淋巴系统淋巴管、淋巴结、脾脏、胸腺感觉器官视觉器官(眼眼球、眼附属器官等)、听觉器官(鼓膜等)中枢神经系统脑(大脑、间脑、中脑、小脑)、延髓、脊髓骨骼系统头骨、脊柱、肋骨、胸骨、上肢骨、肱骨、下肢骨、股骨等肌肉骨骼肌、平滑肌等其它皮肤、牙齿、牙龈3.器官的障碍本发明中，“障碍”是指上述器官或其一部分出现的功能障碍或者物理或化学性损伤。这里所述“一部分”是指即使施加了损伤仍可维持器官机能的程度的量，其根据器官而不同。例如肝脏全体的0.1-50％，优选10-30％是在本发明中可切除的“一部分”。机能障碍是指根据国际障碍分类，属于身心机能或身体结构上的问题，例如显著变异或丧失等，也包括固疾病使上述器官或其一部分产生异常的病态。“物理或化学性障碍”是指器官或其一部分的物理或化学性损伤，包括用手术刀切除、用针刺、用镊子夹取剥离、暴露于高浓度氧中、激光照射、放射线照射的情况。采集组织用于活检时的损伤也包括在“障碍”中。
例如在肝脏中用手术刀切除肝叶，心脏的心穿刺导致的壁贯通性伤害，在脑中对脑室周围直接针刺导致的伤害，肺暴露于高浓度氧下而导致的上皮伤害等。上述的对器官施加伤害可通过外科手术、使用内窥镜或腹腔镜的手术等公知的方法进行。
4.骨髓移植或造血干细胞移植本发明中施行的细胞移植根据移植细胞的种类而分为骨髓移植、外周血干细胞移植和脐带血干细胞移植。因此，本发明所使用的对象细胞是骨髓细胞、外周血干细胞和脐带血干细胞。
骨髓是存在于由骨骼组织内部的破骨细胞形成的骨髓腔内的组织，是主要的造血组织。骨髓内存在所有的血细胞系(红细胞、粒细胞、单核细胞-巨噬细胞、巨核细胞-血小板、肥大细胞、淋巴细胞)的前体细胞，成熟分化后释放到外周血液中。这些前体细胞来自造血干细胞。外周血干细胞在化学疗法(施用抗癌剂)后或施用引起白细胞增殖的粒细胞刺激因子后释放到血液中。脐带血干细胞是存在于脐带血液中的造血干细胞。
本发明中采用骨髓移植时，用于骨髓移植的来自哺乳动物的骨髓细胞例如，包括人在内的所有哺乳动物的骨髓细胞。这种情况下，供体(骨髓提供方)与受体(骨髓接受方)可以是同种也可以不同种。
骨髓细胞可通过骨髓穿刺等公知的方法采集。所得骨髓细胞可以直接使用，也可以使用悬浮细胞。使用悬浮细胞悬液时，骨髓细胞悬浮于细胞培养液(优选含有10％胎牛血清的动物细胞培养用培养基)中，然后接种于塑料培养皿上培养。通过该操作，粘着细胞都贴附于培养皿上，因此可只采集悬浮细胞。将含有上述悬浮细胞的培养液离心，这样可以只回收悬浮细胞。动物细胞培养用培养基的例子有DMEM、RPMI-1640、HamF12培养液或它们的混合物。另外，本发明中还可以只移植骨髓中的造血干细胞或间充质干细胞，这些造血干细胞和间充质干细胞也包含在本发明骨髓移植的“骨髓细胞”中。
本发明中，采用外周血干细胞或脐带血干细胞移植时，外周血干细胞和脐带血干细胞可用公知的方法采集。用于外周血干细胞或脐带血干细胞移植的来自哺乳动物的干细胞的例子有包括人在内的所有哺乳动物的干细胞。这种情况下，与骨髓移植同样，供体与受体可以是同种也可以不同种。
本发明中，可以根据目的或需要，从骨髓细胞(包括骨髓中的造血干细胞、间充质干细胞)、外周血干细胞、脐带血干细胞中选择CD34+细胞、CD34+CD38-细胞、侧群细胞(SP)、单核细胞等。
从骨髓、外周血、脐带血分离移植用细胞(造血干细胞)时可如下进行可以使用已知的表面抗原来标记细胞，然后通过流式细胞仪的分类，只将所需的造血干细胞以95％或以上的纯度分离。由骨髓细胞中分离间充质干细胞时，可以在上述培养中分离粘着细胞。另外，也可以用使用抗体的分离方法。已知间充质干细胞具有与ES细胞近似的能力，已证实其可分化为骨骼、软骨、脂肪、心脏、神经、肝脏的细胞等，作为“第二万能细胞”而受到人们的关注。外周血干细胞可通过单采血液成分术获得。
从器官的一部分受到伤害到移植的期间为伤害后的0到1周，优选伤害后96小时(4天)以内，进一步优选伤害后48小时(2天)以内。
将如上所述制备的骨髓细胞或造血干细胞移植到具有障碍的哺乳动物或预先对器官的一部分施加伤害的受体(哺乳动物)中。移植方法如下。
首先进行移植前处置。即，移植开始前48小时至移植开始，施用大量的抗癌剂或进行全身放射照射，使受体中的骨髓细胞几乎完全被破坏。移植当天，将由供体提供的骨髓液、外周血干细胞、脐带血干细胞等通过点滴注入受体的静脉。
在可以再造正常的血液成分并稳定之前，受体在无菌室管理。移植后可能固排异反应、GVH病(移植物抗宿主病)、重度感染等而早期死亡，因此要随时观察变化，根据需要施用免疫抑制剂、抗生物质等。
5.器官再生在如上施行的骨髓移植或造血干细胞移植后使器官再生。“再生”是指从曾受伤害的部分新生出由来自供体的细胞构成的新的细胞、组织或器官。再生期间因器官不同而不同，因此可以适当观察有无再生，使其再生至所需大小。例如切除30％肝脏时，可以以48小时至数周的周期再生。此时，通过切除，移植的干细胞聚集在伤害部位。再生后持续分化、增殖。当为心脏时，不可能像肝脏那样切除，但可认为对新生哺乳动物的心穿刺已是足够的伤害。其再生所需期间大约为数小时至2周。心脏的再生过程中，优选确认干细胞是否具有明确的心肌形态，或者研究至具有心肌形态的时间。
对于器官是否来自供体，其检查、确认可以采用公知的任意方法。例如可将供体的骨髓细胞等用GFP(绿色荧光蛋白)等标记，观察该标记是否在受体的器官中表达。对于各器官的再生是否来自供体的判断，虽然形态上的大小是一个指标，但免疫染色是最直接、确切的鉴别方法。
器官生长(再生)至预计大小时，临床应用时可以使其直接生长。或者使用实验动物时，可以通过手术等由该动物体内采集器官。不过，无需等待再生至目标大小，可以根据需要，在再生中途回收部分组织或细胞。
本发明中，再生肝脏时，不仅可获得肝细胞，也可以从来自骨髓的干细胞获得肝星状细胞、枯否细胞、内皮细胞和胆管细胞。肝脏的再生部分具有来自供体的细胞，纯度高。如上所述采集的器官可用于供体(当为骨髓移植时，为骨髓移植中的骨髓提供者)的器官移植等。
以下通过实施例进一步具体说明。但本发明的技术范围并不受这些实施例1肝脏的再生(1)小鼠GFP(绿色荧光蛋白)转基因小鼠(称为GFP小鼠)是在肌动蛋白启动子上连接编码GFP的DNA而制备的(Okabe M等。FEBS Lett，1997；407(3)313-319)。该GFP小鼠作为骨髓移植的供体使用。GFP在生物体内任何细胞中均可表达，因此来自该小鼠的细胞移植到受体，则通过观察GFP阳性细胞，可以明确来自供体的细胞。
C57/BL6小鼠购自Charles River Japan。该小鼠作为骨髓移植的受体使用。
上述两种小鼠在九州大学动物设施中，在规定的管理条件下饲养。
(2)骨髓细胞的制备用于移植的细胞由GFP小鼠制备。即，将GFP小鼠解剖后，由大腿部和胫骨收集骨髓细胞。将收集的供体细胞反复过25号针头和40μm孔的滤器，制成单细胞悬浮液。为了分离造血前体细胞，将细胞与B220、CD3、Gr-1、Mac-1和TER119等抗体一起在4℃培养30分钟。然后用含2％胎牛血清(FCS)的PBS洗涤，将骨髓细胞与绵羊抗大鼠免疫磁珠(绵羊抗大鼠IgG结合磁珠抗体Dynabeads，M-450 DYNAL Great Neck，NY)一起培养。回收未与上述磁珠结合的细胞，进一步分离Sca-1(+)细胞。Sca-1是小鼠造血干细胞中最重要的标志之一，因此由GFP小鼠的全骨髓中分离Lin(-)Sca-1(+)细胞。通过结合有大鼠抗小鼠Sca-1抗体的微型磁珠进行Sca-1(+)细胞的阳性选择。所得的Lin(-)Sca-1(+)细胞悬浮于50μl的PBS。
(3)部分肝切除对出生后24小时以内的新生小鼠(C57/BL6)注射200μg盐酸氯胺酮腹膜内，实施麻醉。在皮肤上切1cm口，去除大约肝叶的一半(全体的10-25％)。皮肤和腹膜用尼龙线缝合。
(4)造血细胞的移植用500Gy的放射线全射照射处置新生小鼠(C57/BL6)。新生受体小鼠放射线照射6小时以内(肝切除24小时以内)，分别通过面静脉将上述制备的5000个来自GFP小鼠的Lin(-)Sca-1(+)细胞移植到各新生C57/BL6小鼠体内。
(5)造血细胞嵌合现象的实验移植后2个月至第8个月，由后眼窝静脉丛收集外周血，骨髓细胞由受体小鼠的下肢回收。
使用FACS Calibur(Becton Dickinson)检测GFP阳性的来自供体小鼠的细胞。为了使来自供体的细胞谱系表达，用B220、CD3、Gr-1、Mac-1和TER119对外周血或骨髓细胞进行染色。
(6)对于在肝脏中的分化的分析通过吸入异氟醚对骨髓移植后3天至第60天的小鼠实施麻醉，然后颈椎脱臼安乐死。解剖后立即将肝脏在4％多聚甲醛(PFA)中、在室温下固定30分钟。将固定的组织用梯度酒精脱水，用振动切片机切片为50μm的厚度。将全部组织在4％多聚甲醛(PFA)中、于4℃固定10分钟，在OCT(最佳切片温度)化合物(10.24％聚乙烯醇、4.26％聚乙二醇、85.5％非活性成分)中冷冻。该样品用于制备4-6μm的薄切片。
(7)免疫荧光根据厚度不同，如下制备组织切片。用抗体对50μm厚度的切片进行染色，将各切片在4℃、与一抗一起孵育过夜。2小时间用PBS洗涤两次，然后使切片与结合有Cy3(Jackson Immunoresearch)的二抗反应。
另外，将4-6μm厚度的切片用抗体染色，将各切片在室温下与一抗一起反应1小时。洗涤后将组织切片与Cy-3结合二抗一起孵育。
免疫染色要用共焦点显微镜(Olympus制造)小心分析。
(8)结果(i)嵌合现象的分析将Lin(-)Sca-1(+)细胞分别移植到各新生受体小鼠体内，分析受体的造血细胞嵌合现象。所有的受体小鼠中都可见70％或以上的供体细胞型嵌合现象。
从受体骨髓细胞中分离来自供体的细胞，移植到二次新生受体小鼠体内。二次受体小鼠中可见供体型嵌合现象。这意味着骨髓细胞中含有具有自我再生能力的造血干细胞。
为了鉴定GFP阳性细胞的分布和外观，解剖后立即用荧光显微镜，通过低倍率和高倍率观察肝脏(图1)。结果，来自骨髓干细胞的GFP阳性细胞扩散到全部肝脏。这表示由切断端再生的肝脏高比率来自骨髓干细胞。大多数GFP阳性细胞为纺锤型，但有几个百分点的供体细胞类似形态学上的肝细胞。另外，多数GFP阳性纺锤细胞分布在中央静脉的周围(图1)。
图1A中，视野右下方中可见的发出荧光的是肝脏的再生肝叶。与其他肝叶相比，可知GFP为强阳性。图1B表示再生肝脏的外观。再生肝脏具有与通常的肝脏相同的外观。图1C和D为对再生肝脏放大很大倍数进行观察所见。
(ii)肝脏的再生再生的叶片在肝切除的切口端显示强烈的GFP荧光强度(图2A、C)。
图2中，A和C是表示在肝脏的切除端GFP阳性细胞集成簇的样子的图，B和D是用清蛋白抗体对肝细胞染色的图。C是A的高倍数放大图，D是B的高倍数放大图。如图2所示，再生的叶片是来自供体的正常的肝叶，来自供体的细胞以高纯度存在。B和D的结果证明细胞显示阳性(黄色)，表示清蛋白阳性细胞以高比率存在，是生成清蛋白的正常功能性肝细胞。
实施例2心脏的再生(1)小鼠和骨髓细胞小鼠的饲养、管理和骨髓细胞的制备与实施例1同样进行。
(2)对心脏实施部分伤害出生后立即至出生后第3天的受体小鼠(C57/BL6)不开胸的情况下，用29号针头穿刺心肌，使其受损伤。手法是否成功可通过心腔内血液的逆流容易地判断。
(3)造血细胞的移植小鼠的前处置(放射线照射)和造血细胞的移植与实施例1同样进行。
(4)对于在心脏中的分化的分析(i)心脏组织的制备通过吸入异氟醚对受体小鼠实施麻醉，然后颈椎脱臼安乐死。解剖后立即将心脏组织在4％多聚甲醛中固定(室温下30分钟)。将固定的组织用梯度酒精脱水，用振动切片机(“microslicer DTK-1000”，DSK公司)切片为50μm的厚度。将全部组织在4％多聚甲醛(PFA)中固定(4℃10分钟)，在OCT化合物中冷冻，用于制备4-6μm的薄切片。待组织充分冷冻后，用冰冻组织切片机Cryostat(“CM3050D”Leica公司制造)切6μm的切片。
(ii)免疫染色用以下抗体对各心脏切片进行染色，为了鉴定心肌细胞，将心脏切片用肌钙蛋白1C(肌动蛋白43)、肌节肌动蛋白、肌动蛋白43或Nkx 2.5染色。用抗体染色厚切片时，各切片与一抗一起在4℃孵育过夜。2小时间用PBS洗涤两次，然后使切片与结合有Cy3(Jackson Immunoresearch)的二抗反应。
另外，将薄切片用抗体染色，将各切片在室温下与一抗一起孵育1小时。洗涤后将组织切片与Cy-3结合二抗一起孵育。
免疫染色要用共焦点显微镜(Olympus制造)小心分析。
(8)结果将5×105个Lin(-)骨髓细胞移植到各新生受体小鼠体内，移植后2个月或5个月时分析受体的造血细胞嵌合。结果，所有的受体小鼠中都可见70％或以上的供体细胞型嵌合。从受体骨髓细胞中分离来自供体的细胞，移植到二次新生受体小鼠体内。二次受体小鼠中可见来自供体的细胞。这可以说在1次受体中存活的骨髓细胞包含具有自我再生能力的造血干细胞。
施行心穿刺和造血干细胞移植2个月后，对心脏组织的嵌合和分化转换进行分析。
首先，将全部组织在488nm激发波长的荧光显微镜下进行观察。对于心包膜，沿着冠状动脉鉴定出GFP阳性细胞。将组织沿径向切断后，可见很多细胞沿着心肌纤维，发现了GFP阳性区(图3)。大多的GFP阳性细胞以纺锤线的外现存在(图3)。图3中，A是用荧光立体显微镜观察心脏内膜时的图像。可见很多GFP阳性细胞(来自骨髓细胞)。B、C和D是表示GFP阳性细胞中明确具有横纹的心肌细胞的图。即使再次进行荧光观察，也可得到与上述同样的结果，可知细胞的GFP阳性结果具有再现性，很多肌细胞可用做心脏损伤模型。另外，如图4所示，一个断面中可观察到多个来自供体的心肌细胞(箭头1-4)。分别将其放大，则显示明显的横纹肌的形态(图4)。
对心肌细胞进行免疫荧光分析，结果由损伤面一侧的心尖到整个心脏，均可观察到很多起源于供体的肌细胞(图5)。图5是将40个断面重叠得到的立体图像。在中心可见左心室，其它分散的由黄色至红色的斑点为来自骨髓的心肌细胞(图5的箭头)。
将心脏切片用肌动蛋白43和肌钙蛋白1c染色，进行免疫学分析。结果观察到各抗体染色图谱(图6)。图6中，上段C图片是表示由肌钙蛋白1c进行免疫染色的结果图，A是只进行GFP染色的结果，B是将A和C合成的图。这些结果证实了心肌细胞特异性标志的明确表达。同样，图6中段F图片是表示进行了肌动蛋白43染色的结果图。D是表示来自移植骨髓细胞的GFP阳性心肌细胞的结果，E是将D和F合成的图。这些结果证实心肌细胞是来自骨髓的细胞。这显示有几种类型的心肌细胞在损伤后可由来自骨髓的干细胞分化而来。
为了进行形态学分析，通过Nomarsky imaging观察GFP阳性肌细胞(图6下段图片)。图6下段图片是表示细胞的轮廓和与周围细胞的关系的图。由图可以明确轮廓，并判定来自供体的骨髓细胞作为心肌细胞被正常地整合。
以上从形态学、免疫学证明心肌细胞确实是来自骨髓的细胞。
实施例3其它器官的再生(1)小鼠和骨髓细胞小鼠的饲养、管理和骨髓细胞的制备与实施例1同样进行。小鼠的前处置(放射线照射)和造血细胞的移植(骨髓移植)与实施例1同样进行。
(2)伤害模型的制作(2-1)肺的伤害模型通过暴露于高浓度氧或施用LPS(内毒素)来伤害肺泡上皮细胞。
(2-2)肾脏的伤害模型通过抗Thy-1抗体伤害肾小球系膜细胞。
(2-3)小肠的伤害模型通过放射线照射诱发放射线肠炎。
(2-4)骨骼的伤害模型进行放射线照射。
(2-5)牙齿和牙龈的伤害模型直接用针伤害牙龈部位，或向该部位注入细胞。
(2-6)眼的伤害模型进行放射线照射。
(2-7)脑的伤害模型将出生后立即至出生后第3天的受体小鼠(C57/BL6)实施麻醉，将来自供体的细胞直接移植到脑室周围。
(3)分化的分析研究肺的支气管上皮细胞，肾脏的肾小球系膜细胞、小肠的类上皮细胞、骨骼的骨皮质、牙齿和牙龈的牙齿表层和牙龈的细胞、眼的表层和角膜实质层，脑的显示神经元和神经胶质的形态的细胞是否分别分化再生。
(4)结果(4-1)肺肺和支气管上皮细胞中，显示来自供体的骨髓并再生的GFP阳性细胞通过细胞角蛋白双重染色证实为上皮细胞(图7)。
(4-2)肾脏图8中，A为可观察到3个GFP阳性细胞的图。B为表示用胶原4染色的结果图。C是将A和B的图像合成的图，鉴定出肾脏的肾小球系膜细胞。D是在其它场合也可与A-C同样地鉴定来自供体的细胞。
(4-3)小肠肠管的管腔附近再生有来自供体的类上皮细胞(图9)。图9中，A为可观察到GFP阳性细胞的图。B为显示用广谱细胞角蛋白染色的结果的图。C是将A和B的图像合成的图。
(4-4)骨骼骨皮质中观察到来自供体的细胞(图10)。图10是骨皮质和骨髓腔的图，A为低倍放大、B为高倍放大的图。OC表示骨细胞，OB表示成骨细胞。
(4-5)牙齿和牙龈牙齿和牙龈中也可见再生(图11)。图11中，A是牙龈的细胞图，B是接近于牙齿表层处的细胞的图。G的部分是牙龈中的GFP阳性细胞。
(4-6)眼眼的表层和角膜上皮中可见再生(图12、13)。图12中，A是未施行骨髓移植的对照，未见GFP荧光。B是进行了骨髓移植的受体的眼，可见GFP荧光。图1 3是角膜内的细胞，可见来自供体的细胞(GFP荧光显色)。
(4-7)脑可见具有类似神经突起的结构物的细胞的再生(图14)。
由脑的分析结果可知来自供体的骨髓，神经细胞分化。
产业实用性本发明可提供组织的再生方法。本发明的方法涉及以下的治疗方法通过对器官有障碍的哺乳动物进行造血细胞移植，可再生器官，另外通过对器官施加伤害，之后可以构建来自骨髓等的组织构成细胞；取出构建的细胞，作为人工组织进行移植。通过施加伤害，可制作动物模型，可以以该伤害部位为中心置换来自骨髓等的正常细胞。因此，本发明的方法可用于更广泛的再生医疗。
权利要求
1.器官或其一部分的再生方法，其特征在于对器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植。
2.权利要求1的方法，其特征在于造血干细胞是外周血造血干细胞或脐带血造血干细胞。
3.上述障碍的治疗方法，其特征在于对器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植，使该器官或其一部分再生。
4.权利要求3的方法，其特征在于造血干细胞是外周血造血干细胞或脐带血造血干细胞。
5.器官或其一部分的制备方法，其特征在于对器官或其一部分有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植，使上述器官或其一部分再生，采集所得再生器官或其一部分。
6.权利要求5的方法，其特征在于造血干细胞是外周血造血干细胞或脐带血造血干细胞。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述障碍是功能障碍或者物理或化学性损伤。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中再生的器官或其一部分来自供体。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中哺乳动物是新生哺乳动物。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中器官是选自肝脏、心脏、脑、肺、肾脏、肠、胰脏、眼、骨和牙齿中的至少一种。
11.再生器官或其一部分，其是通过对器官或其一部分具有障碍的哺乳动物进行骨髓移植或造血细胞移植而形成。
12.权利要求11的器官或其一部分，其中造血干细胞是外周血造血干细胞或脐带血造血干细胞。
13.权利要求11或12的器官或其一部分，其中所述障碍是功能性障碍或者物理或化学性损伤。
14.权利要求11-13中任一项的器官或其一部分，其中再生的器官或其一部分来自供体。
15.权利要求11-14中任一项的器官或其一部分，其中哺乳动物是新生哺乳动物。
16.权利要求11-15中任一项的器官或其一部分，其中器官是选自肝脏、心脏、脑、肺、肾脏、肠、胰脏、眼、骨和牙齿中的至少一种。
全文摘要
本发明提供对具有障碍的哺乳动物或者器官或其一部分具有伤害的哺乳动物进行骨髓移植或造血干细胞移植，再生器官或其一部分的方法，治疗障碍的方法，以及制备器官或其一部分的方法，以及由上述制备方法得到的器官或其一部分。
文档编号A61L27/36GK1738654SQ200380108830
公开日2006年2月22日 申请日期2003年11月17日 优先权日2002年11月15日
发明者石川文彦, 原田实根 申请人:株式会社产学连携机构九州, 石川文彦