具有抗微生物涂层的生物医学装置的制作方法

专利名称：具有抗微生物涂层的生物医学装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有涂层的装置。具体而言，本发明提供了在表面上形成合成阳离子肽抗微生物涂层的生物医学装置。
背景技术：
众所周知适用于人体中和人体上的装置。在决定所述装置整体功效中，上述装置表面的化学成分起关键作用。此外，已知提供具有抗微生物表面的上述装置是有利的。
业已开发了多种杀菌和抑菌涂层。例如，诸如多粘菌素、万古霉素和四环素的阳离子抗生素业已作为涂层用于接触透镜。此外，金属螯合剂、取代和未取代的多元酚、氨基苯酚、乙醇、酸和胺衍生物以及季铵业已作为抗微生物剂用于接触透镜。US5,472,703公开了某些作为抗微生物剂用于接触透镜的脂质化合物。
然而，这些已知抗微生物涂层的使用具有不利之处。使用抗生素涂层时，可产生抗抗生素的微生物。螯合剂无法对付许多粘附于所述装置的细菌。某些现有技术的涂层，例如苯酚衍生物和甲酚，可产生眼毒性或过敏反应。季铵化合物由于其刺激性而问题重重。因此，需要安全且有效的抗微生物涂层以克服至少一部分这些不利之处。
美国系列号09/516,636公开了鱼精蛋白、蜂毒肽、杀菌肽A(cecropin A)、乳链菌肽或它们的组合物可作为表面涂层以减少细菌粘附于装置表面和/或降低粘附于装置的细菌的生长。遗憾的是，业已发现那些肽在一定浓度下具有毒性或具有有限程度的抗微生物活性。
Subbalakshmi等。，FEBS Letters，448，62-66页(1999)公开了蜂毒肽C-末端15个氨基酸残基，保留了其抗细菌活性，但溶血活性大大降低。Juwadi等公开了将蜂毒肽C-末端置于合成肽的N-末端以减少对哺乳动物细胞的细胞毒性(Juwadi等.，J.Am.Chem.Soc.，vol.118，8989-8997页(1996))。但是，C-末端肽的抑菌程度却减少了，且抑制那些细菌所需肽的数量增加了(Subbalakshmi等.，FEBS Letters，448，62-66页(1999))。
也已公开了阳离子肽混合物。例如，已经合成了包含作为阳离子部分的赖氨酸的合成肽(Mor等.，J.Biol.Chem，vol.269，31635-31641页(1994))，以及鱼精蛋白与蜂毒肽混合物(Aliwarga等.，Clim.Exp.Ophthalmol.，vol.29，157-160页(2001))。
也已经合成了在单分子中掺入源自不同阳离子活性部分的合成肽。例如，公开了通过将杀菌肽A与蜂毒肽组合制备的系列肽，最大程度地保留了它们的抗菌功效(Boman等.，FEBS Letters，vol.259，103-106页(1989))。也合成了杀菌肽A和蜂毒肽的杂合体，并披露了在由细菌引起的角膜炎实验模型中能减少感染和炎症病症(Nos-Barbera等.，Cornea，vol.259，101-106页(1996))。但是，蜂毒肽仍保留着其毒性区，预计可能诱导哺乳动物细胞毒性。
附图简述

图1显示了相对于水，各种肽对绵羊红细胞的溶胞％。
发明详述和优选的实施方案本发明提供了具有抗微生物涂层的生物医学装置和用于生产该生物医学装置的方法。本发明预料不到的发现是某些合成肽可用于提供生物医学装置的抗微生物涂层。特别是，本发明的合成抗微生物肽，在肽中任何位置包含蜂毒肽的15-26片断，即片断ASEQ ID NO.1和鱼精蛋白的1-17片断，即片断BSEQ ID NO.2。所述肽还可包含第三个片断C，其可以是任何不抑制所述肽抗微生物活性或不诱导哺乳动物细胞毒性的连接基团，其包括0至约10个氨基酸的间隔区。本文定义的氨基酸指具有化学式-HN-(CR1R2)n-CO-的任何结构，其中n是1-21的整数，R1和R2独立地选自H、具有1-4个碳原子的直链或支链烷基、具有1-2个碳原子的直链或支链羟基、具有1-3个碳原子的直链或支链烷硫基、具有1-3个碳原子的氨基甲酰基、具有1-3个碳原子的羧基、具有1-4个碳原子和1-3个氮原子的伯氨基和仲氨基、苄基、苯酚、苯基吲哚和N，N-吡咯。优选地，n是1-10的整数，R1和R2中至少之一是H，另一选自如上。所述抗微生物合成肽的A、B和C片断可按任意顺序排列并可部分或全部重复。在一个优选的实施方案中，所述A和B片断位于末端位置，在另一个优选的实施方案中，所述合成抗微生物肽具有分子式ACB或BCA，且C包含至多5个氨基酸。
本发明也包括本文所例证的那些肽的保守变异的合成抗微生物肽。于此使用的术语“保守变异”表示其中至少一个氨基酸为其它生物学上相似残基所取代的多肽。保守变异的例子包括一种疏水残基的取代，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸为其它氨基酸所取代，或一种极性残基为其它残基所取代，例如精氨酸为赖氨酸、谷氨酸为天冬氨酸或谷氨酰胺为天冬酰胺所取代等等。中性亲水氨基酸可为一种其它氨基酸所取代，所述其它氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。
具体而言，本发明的一个发现是蜂毒肽、鱼精蛋白和它们的混合物当作为表面涂层时，减少了细菌在装置表面的粘附，降低了粘附于装置的细菌的生长，或两者皆大于约40％。
在一个实施方案中，本发明提供了一种生物医学装置，包含至少一个表面，基本上由至少一个表面组成，和由至少一个表面组成，所述表面包含覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽，基本上由覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽组成，和由覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽组成。还在另一个实施方案中，提供了一种用于制造生物医学装置的方法，包括将生物医学装置的至少一个表面与覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽接触，基本上由将生物医学装置的至少一个表面与覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽接触组成，和由将生物医学装置的至少一个表面与覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽接触组成。仍在本发明的另一个实施方案中。提供了另一种用于制造生物医学装置的方法，包括将生物医学装置的至少一个表面与覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽接触，基本上由将生物医学装置的至少一个表面与覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽接触组成，和由将生物医学装置的至少一个表面与覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽接触组成。亦在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于制造生物医学装置的方法，包括添加至少一种可聚合的合成抗微生物肽至反应混合物中并聚合所述反应混合物以形成生物医学装置，基本上由添加至少一种可聚合的合成抗微生物肽至反应混合物中并聚合所述反应混合物以形成生物医学装置组成，和由添加至少一种可聚合的合成抗微生物肽至反应混合物中并聚合所述反应混合物以形成生物医学装置组成。
“生物医学装置”指设计用于人组织或流体中或其上的任何装置。这些装置的例子包括但不限于导管、植入物(包括但不限于心脏瓣膜)、支架、流体收集袋(fluid collection bags)、传感器、水凝胶绷带、输液管、抗生素载体、诊断和治疗剂和眼科装置。在某些实施方案中，导管是优选的医学装置。一类优选的生物医学装置包括眼科装置，特别是接触透镜。
如本文所用，术语“透镜”和“眼科装置”指放在眼内或眼上的装置。这些装置可提供光学校正、伤口护理、药物递送、功能性诊断或可以是化妆品。术语透镜包括但不限于软接触透镜、硬接触透镜、眼内透镜、覆盖透镜、眼内插入物和光学插入物。
在一个优选的实施方案中，所述生物医学装置是一种眼科透镜，包括，但不限于接触透镜或眼内透镜。更优选所述装置是接触透镜，最优选是软接触透镜。
如本文所用，术语“肽”或“多肽”指多肽的基本化学结构，其为本领域众所周知且已为本领域教科书和其它出版物所描述，本文中使用的该术语指包含两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质，所述氨基酸在直链中彼此通过肽键连接。如本文所用，该术语指短链，例如在本领域中其也通常称为肽、寡肽和寡聚体，以及较长的链，在本领域中其通常指蛋白质，所述蛋白质具有许多类型。应当理解多肽经常包含除了20种氨基酸外的氨基酸，所述20种氨基酸通常称为20种天然存在的氨基酸，而且在特定多肽中许多氨基酸，包括末端氨基酸可通过天然加工，如加工和其它翻译后修饰，或通过本领域众所周知的化学修饰技术得到修饰。即使在多肽中天然存在的常见修饰由于数量众多而无法在此穷举，但它们在基础教科书和更详细的专论中得到充分描述，也在大量的研究文献充分描述，为本领域技术人员众所周知。在可用于本发明多肽的已知修饰中，一些例证性命名为乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸，5-氧(代)脯氨酸形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、糖基磷脂酰肌醇锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸盐化、转移核糖核酸介导的添加氨基酸至蛋白质，例如精氨酰化和遍在蛋白化。上述修饰为本领域技术人员众所周知且已非常详细地描述于科学文献。几种特别常见的修饰，如糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化在基础教科书中描述最多，例如在PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，第2版.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)中。可获得许多关于该主题的详细综述，例如，POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson，编.，Academic Press，New York(1983)中，Wold，F.，Posttranslational Protein ModificationsPerspectives andProspects，1-12页；Seifter等.，(1990)，Meth.Eir.zymol.182，626-646和Rattan等.，“Protein SynthesisPosttranslational Modifications andAging”，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.663，48-62所提供的那些。应当理解，如众所周知和上文提及，多肽并不总是完全线性的。例如，多肽(线性和非线性)可产生自转译后事件的结果，包括天然加工事件和通过人为操作所带来的非天然产生的事件。可通过非转译天然加工和最好通过全合成方法合成环状、支化和支化环状肽。可在多肽的任何位置进行修饰，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羟基端。事实上，共价修饰能封闭多肽中的氨基或羟基基团，或两者皆封闭，这种情况在天然存在和合成多肽中经常见到，上述修饰也可发生在本发明的多肽中。例如，在蛋白酶解加工之前，大肠杆菌或其它细胞表达多肽的氨基端残基几乎总是N-甲酰甲硫氨酸。在肽翻译后修饰过程中，NH2-末端的甲硫氨酸残基可缺失。因此，本发明考虑到了本发明蛋白质包含甲硫氨酸和无甲硫氨酸氨基端变体的使用。所述发生在多肽中的修饰经常随着其获得方式而改变。例如，对于通过在宿主中表达克隆基因获得的多肽而言，大部分的修饰种类和程度应取决于宿主细胞翻译后修饰能力和所述多肽氨基酸序列中存在的修饰信号。例如，众所周知在细菌宿主中通常不发生糖基化，例如在大肠杆菌中。于是，当期望糖基化时，多肽应当在使蛋白质糖基化的宿主中表达，通常是真核细胞。昆虫细胞经常进行与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，因此，业已开发了用于有效表达具有天然糖基化型等特性的哺乳动物蛋白质的昆虫细胞表达系统。类似的考虑也应用于其它修饰。应当理解在给定多肽一些位点上相同类型修饰的程度可以是相同的或不同的。同样，给定多肽可包含许多种修饰。通常来说，如本文所用，术语多肽包括了所有上述修饰，特别是那些存在于通过在宿主细胞中表达多核苷酸重组合成多肽过程中的修饰。
如本文所用，“Melimine”指包含SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽。
其中T是苏氨酸、L是亮氨酸、I是异亮氨酸、S是丝氨酸、W是色氨酸、K是赖氨酸、N是天冬酰胺、R是精氨酸、Q是谷氨酰胺、P是脯氨酸、V是缬氨酸。如本文所用，L-melimine包含以天然形式存在的上述氨基酸序列。氨基酸光学异构体进行自发的非酶消旋化。对于每一种氨基酸而言，在给定温度或pH(贮藏条件)下该速率不同，但D异构体较L异构体更快。如本文所用，分别在pH为7和约25℃的温度下，L-或D-肽可包含约99％L或D异构体。
L-氨基酸是生物系统中天然存在形式，因此D-异构体更能抗酶解并可具有增强的持久性。该特性可通过使用立体异构体混合物而得到开发，对于特定应用可产生期望水平的活性和存活力。所以，对于期望长期持久性的应用而言，优选使用具有优势(大于约50％和优选大于约70％)D异构体的立体异构混合物。在期望更强抗菌活性的地方，优选使用具有优势(大于约50％和优选大约约70％)L异构体的立体异构混合物。
如本文所用，“Protattin”指包含SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽。
对于本发明目的而言，通常所使用的阳离子肽是基本上纯化的。
如本文所用，术语“基本上纯化的”指蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞物质或来自获得所述蛋白质的细胞或组织来源的其它污染蛋白质，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。所述术语“基本上不含细胞物质”包括在蛋白质制备中，从细胞的细胞成分中分离蛋白质，所述蛋白质分离自或重组产生自所述细胞。因而，基本上不含细胞物质的蛋白质包括在蛋白质制备中具有小于约30％、20％、10％或5％(干重)的异种蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)。当通过重组生产所述蛋白质或其生物活性部分时，也优选基本上不含有培养基，即培养基所占的蛋白制备物体积小于20％、10％或5％。当通过化学合成生产所述蛋白质时，优选基本上不含化学前体或其它化学药品，即分离自化学前体或涉及所述蛋白质合成的其它化学药品。因此，上述蛋白质制备物除了感兴趣的多肽外，具有小于约30％、20％、10％、5％(干重)的化学前体或化合物。
使用标准肽合成技术可合成在本发明中有用的合成抗微生物肽。或者，在体外翻译和/或转录系统中可合成在本发明中有用的合成抗微生物肽。
合成抗微生物肽亦可使用常规固相肽和溶液肽合成方法进行合成。上述方法为本领域技术人员众所周知。下面描述了使用固相合成技术制备一种合成抗微生物肽的合成路线，但不限于，本发明该方法的范围。可在任何合适的合成树脂上进行所述合成反应。合适的树脂包括不溶的交联聚苯乙烯树脂等等。一般使用芴基甲氧基羰基等基团保护氨基酸，并用N-羟基苯并三唑活化，以及但非必要，使用二异丙基碳二亚胺(DIC)以促进偶联。使用但不限于三氟乙酸或氨从树脂上裂解完成合成的肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化产物，和/或在候选物从水/乙腈混合物中冻干形成干粉后通过透析纯化产物。
在本发明中有用的合成抗微生物肽也可使用体外翻译和/或转录系统生产。该方法为本领域技术人员所公知。例如，在多种无细胞系统中编码Melimine或Protattin的合成mRNA可有效地翻译，所述无细胞系统包括但不限于麦芽提取物和网状细胞提取物。或者，在诸如TNTT7偶联的网状红细胞裂解物系统的体外转录和翻译系统中，包含Melimine或Protattin编码序列的合成DNA在T7启动子的控制下可有效地转录并翻译，所述TNT T7偶联的网状红细胞裂解物系统可购自Promega。可通过本文所述的方法纯化产物多肽。
L-melimine、protattin或它们的组合可吸附在生物医学装置的聚合物表面。所述合成抗微生物肽可在任何表面使用，但最方便用于具有负电荷的表面上。
或者，所述合成抗微生物肽可用丙烯酰基或异丁烯酰基官能化，所述基团可添加到单体混合物中，接着反应形成生物医学装置，在形成该装置的大多数聚合物中，以及在该装置表面上具有合成抗微生物肽。
或者，所述合成抗微生物肽可键合到聚合物表面。可通过直接反应或优选通过使用偶联剂的反应达到该目的。例如，直接反应可通过使用反应试剂活化表面聚合物或合成抗微生物肽中的基团，使之分别与肽或聚合物上官能团起反应，且不掺入偶联剂而得到完成。例如，一种或多种合成抗微生物肽上的胺或醇或硫醇基团可与该聚合物上的异硫氰酸酯、酰叠氮、N-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯氧酯、磺酰氯、醛、乙二醛环氧化物、碳酸酯、芳基卤、亚氨酸酯、甲苯磺酸酯或酐基直接反应。
在一个可选的实施方案中，可使用偶联剂。用于偶联装置表面阳离子肽或蛋白质的偶联剂包括，但不限于，N，N′-羰基二咪唑，碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(“EDC”)、双环己基碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或它们的混合物。所述碳二亚胺也可用于与N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺形成能与胺反应形成酰胺的酯。
氨基通过形成席夫碱也可偶联至所述聚合物，所述席夫碱可为诸如氰基硼氢化钠等的试剂还原形成水解稳定的胺键。具有该用途的偶联剂包括，但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、3，3′-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯等；亚氨酸酯，包括，但不限于，己二酰亚胺酸二甲酯；二氟苯衍生物、包括但不限于，1，5-二氟-2，4-二硝基苯；溴官能化醛，包括但不限于戊二醛(gluteraldehyde)以及双环氧化物，包括但不限于1，4-丁二醇二环氧甘油醚。取决于装置表面所存在的官能团，本领域技术人员可认识到许多其它偶联剂也可使用。
本领域技术人员也可认识到，如果装置表面并不包含合适的反应活性基团，上述合适的基团可通过任何常规的有机合成方法掺入到聚合物中。或者，可通过将包含反应活性基团的聚合单体添加至用于形成所述聚合物的单体混合物中以导入反应活性基团。
不受限制，其上可吸附或键合合成抗微生物肽的聚合物表面实例是由苯乙烯和取代的苯乙烯、乙烯、丙烯、丙烯酸酯和异丁烯酸酯、N-乙烯基内酰胺、丙烯酰胺和异丁烯酰胺、丙烯腈、丙烯酸和异丁烯酸的聚合物和共聚物、以及聚氨基甲酸酯类、聚酯、聚二甲基硅氧烷和它们的混合物所构成的表面。上述聚合物可包括水凝胶和硅酮水凝胶。优选使用甲基丙烯酸2-羟基乙酯的(″HEMA″)轻度交联聚合物和共聚物。“轻度交联”意指所述聚合物具有足够低的交联度使之在室温下柔软且具弹性。通常来说，轻度交联聚合物每约100个重复单体单位具有约0.1至约1个交联分子。合适的轻度交联HEMA聚合物和共聚物的实例包括但不限于，etafilcon A以及甘油异丁酸酯与HEMA的共聚物。也优选使用硅酮水凝胶，特别是那些亲水单体，例如N，N-二异丁烯酰胺。
在一个用于制造本发明装置方法的实施方案中，将所述要被覆盖的表面以任何方便的方式与L-melimine、protattin或它们的组合接触。优选涂层包含L-melimine。例如，所述装置可置于L-melimine溶液和该医学装置所放置的溶剂中。或者，首先用偶联剂处理所述装置表面，然后将该表面置于所选择的合成抗微生物肽溶液中。再或者，所述合成抗微生物肽可单独与聚合物表面起反应。
在某些实施方案中，本发明合成抗微生物肽的游离NH2基与包含反应活性COOH基的聚合物表面结合。
在本发明中适合使用的溶剂是那些能溶解所选择的合成抗微生物肽的，所述合成抗微生物肽例如L-melimine、protattin单体或组合物。优选的覆盖方法在水、醇或其混合物中进行。EDC在水溶液中有效，因此其是优选的偶联剂。
偶联剂可单独使用，也可与能稳定所形成的任何反应活性中间体的试剂组合使用。举例来说，EDC可与作为稳定剂的N-羟基琥珀酰亚胺一起使用。此外，应需要调节pH。优选pH调节到约6.5至于约8.0，更优选调节到约7.0至约7.5。
或者，可将潜反应活性组分添加至单体混合物中，其中所选择的单体不具有合适的羧酸官能团。合适的潜反应活性组分包括，但不限于，具有通式R-CO-L的酯化合物，其中R包含能进行阳离子、阴离子或自由基聚合的基团，以及L是离去基团。合适的R基团包括能进行自由基和/或阳离子聚合的单价基团，其包含至多20个碳原子。优选的R基团包含自由基反应活性基团、例如丙烯酸酯、苯乙烯基、乙烯基、乙烯醚、C1-6烷基丙烯酸酯、丙烯酰胺、C1-6烷基丙烯酰胺、N-乙烯基内酰胺、N-乙烯基酰胺、C2-12链烯基、C2-12链烯基苯基、C2-12链烯基萘基或C2-6链烯基苯基C1-6烷基，或阳离子反应活性基团，例如乙烯醚或环氧化物基团及其混合物。特别优选的R基团包括异丁烯酸酯、丙烯酰氧基、异丁烯酰胺、丙烯酰胺及其混合物。
合适的L基团在反应条件下是稳定的，保护羧酸酯基团，在涂层条件下容易离去。合适的L基团包括烷基酯、苯酯、羟基对-硝基芳基、对硝基苯酯、N-羟胺衍生物和甲苯磺酸酯，所有这些可以是取代的或非取代的。优选的L基团包括叔丁基酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基-氧代二氢苯并三嗪衍生物、1-羟基苯并三唑酯及它们的组合。优选的合适的L基团包括五氟苯酯、甲苯磺酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯及它们的混合物。优选的潜反应活性化合物包括五氟异丁烯酸酯和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺及它们的混合物等。
使用有效量的所选择偶联剂或反应活性组分进行偶联，其中所述有效量是足以将合成抗微生物肽偶联至装置表面的量。所使用的偶联剂的精确量取决于表面的化学性质和所选择的试剂。一般来说，基于涂层溶液重量，使用约0.01至约10重量百分比，优选约0.01至约5.0，更优选约0.01至约1重量百分比的偶联剂。涂层溶液指合成抗微生物肽和一种或多种溶剂、偶联剂、缓冲液等。典型地，每一透镜所使用的涂层溶液的量在约1ml至约10ml，优选约1ml至约5ml，更优选约1ml至约2ml。
在本发明方法中，所使用的诸如L-melimine、protattin或其组合的合成抗微生物肽的覆盖有效量指这样一种量，即当抗微生物肽与表面接触时足以覆盖该表面以致赋予该表面所需抗微生物特性的量。抗微生物特性指粘附在表面的细菌数量及其生长能力明显减少，大于约50％。一般来说，在接触透镜上与透镜接触的合成抗微生物肽量为每一透镜约1μg至约10mg，优选约10μg至约1mg。每一透镜产生的涂层量为约50至约1000μg。在使用L-melimine化合物情况下， 所使用的L-melimine的量优选为约250μg/透镜至约1000μg/透镜。
温度和压力并不是本发明方法的关键因素，本发明方法可方便地在室温和常压下进行。
所使用的接触时间应当是足以覆盖表面至所需程度的时间长度。优选的接触时间为约60秒至约24小时。
在接触后，用水或缓冲盐水溶液洗涤表面以除去未反应的合成抗微生物肽及溶剂。本领域技术人员应认识到用于生产通过本发明方法要被覆盖的表面的聚合物可包含其它单体和添加剂。例如，可使用紫外吸收单体、反应活性着色剂、加工助剂等等。
本发明将通过考虑如下非限制性实施例得到进一步阐明。
实施例1为评价溶液中阳离子蛋白质/肽抗菌效果，铜绿假单胞菌6294(Psudomonas aeruginosa6294)和金黄色葡萄球菌31(Staphylacoccusaureus 31)细胞在大豆胰蛋白胨肉汤(TSB)中于35℃培养18小时。接着通过离心收获细胞，并在磷酸盐缓冲液(PBS；NaCl8g/l；KCl0.2g/l；Na2HPO41.15g/l；KH2PO40.2g/l)中洗涤两次。然后将细胞重悬浮在PBS中，在660nm处调节OD值为0.1。将1mg/ml阳离子肽连续稀释，并将稀释液添加到96孔微量滴定板的孔中或5ml的一次性试管中。对照物是不含肽的细菌。在35℃下温育细菌18小时，并在660nm处测量浊度。无混浊试管所对应的肽稀释度被认为是最小抑制浓度(“MIC”)。
表1
抑制细菌生长所必需的最小浓度值表示为μg/mlR＝抗性，肽最高浓度＝1000μg/Ml；ND＝未测定S.a.31是金黄色葡萄球菌31(S.aureus 31)S.a.CK5是金黄色葡萄球菌CK5(S.aureus CK5)
P.a6294是铜绿假单胞菌6294(P.aeruginosa6294)P.a15442是铜绿假单胞菌15442(P.aeruginosa15442)表1中数据显示当使用常规方法测量试管溶液时，溶液中对金黄色葡萄球菌(S.Aureus)起作用的Melimine具有MIC为60-250μg/ml，而铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)对该肽的抗性高达1000μg/ml(所使用的最高浓度)。
实施例2为了进行活菌计数，从厂商的管形瓶中取出EtafilconA透镜，在1mlPBS中洗涤三次，干燥，接着将500μg L-Melimine移液至该接触透镜上(melimine在蒸馏水中溶解并在接触透镜上空气干燥)，在通风橱中在室温下覆盖过夜。用于每种菌株的透镜数量示于表2括号中。透镜在PBS中与0.5ml的1×108细菌细胞/ml在水合10分钟，所述将包括革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(S.Aureus)和革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)添加到透镜上。在室温下温育10分钟或5小时后，透镜在PBS中洗涤三次以除去不粘附或粘附松散的细菌。然后，使用组织匀浆器及1ml PBS均质化处理透镜直至其分解(约1-2分钟)。接着根据Miles和Misra技术制备连续稀释液，并将等分试样(20μL)置于营养琼脂上。在37℃下温育过夜后，测定仍存活的细菌，在计算透镜表面积(约310mm2)后结果以每平方毫米的菌落形成单位数来表示。基于与粘附在对照透镜上的每平方毫米菌落形成单位数比较来计算效果，所述对照透镜在细菌粘附测试前不覆盖阳离子蛋白质/肽。结果如表2所示。
表2
在10分钟和5小时暴露后，L-Melimine能明显减少水凝胶聚合物上的细菌数量。该数据显示对于所测试的菌株而言，覆盖有500μgL-Melimine的透镜粘附在水凝胶聚合物上的微生物数量减少了至少约80％。
实施例3如上所述，除了将L-melimine浓度改变为125μg、250μg或500μg/透镜外，将购自Johnson & Johnson的商标名为ACUVUE的Etafilcon透镜如实施例2所示进行浸泡。在在水凝胶聚合物吸收L-Melimine后，将透镜与PBS再水合，并暴露于金黄色葡萄球菌(S.Aureus)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中10分钟或5小时，如实施例2所述。在暴露完成后，根据标准的Miles和Misra平板计数测定法评估聚合物上微生物数量。
表3
测试用透镜数示于()中表3结果显示，随着L-Melimine浓度的减少，被抑制的微生物数量也相应减少。
实施例4在蒸馏水中制备包含L-Protattin的母液(50mg/ml)。在通风橱中，在室温下将500μg母液吸附在由EtafilconA所制成的接触透镜上，就像L-melamine在实施例2中那样，吸附18小时。随后的详细实验步骤如上实施例2所述，测量仍存活的细菌数量。结果示于下表4中。
表4
测试用透镜数示于()中表4数据显示使用Protattin肽能减少粘附在水凝胶聚合物上的微生物数量。但是，与实施例2中的L-Melimine数据比较，L-Melimine是优选的氨基酸序列，因为其较Protattin在减少细菌在接触透镜上的粘附和集群上更有效，特别是在数小时后。
实施例5进行热稳定性研究以评估L-Melimine暴露于高压灭菌后是否改变其防止细菌生长的能力。
将细菌(铜绿假单胞菌6294和金黄色葡萄球菌31)在TSB中35℃培养18小时，接着在PBS中洗涤两次。然后将细菌重悬浮在PBS中，在660nm处调节光密度至0.1。L-Melimine在PBS中溶解，浓度为1000μg/ml，并在121℃下高压灭菌15分钟。接着将相等体积的细菌悬浮液和L-Melimine混合并在35℃下温育至多72小时。对照物是不进行高压灭菌的L-Melimine。在24、48和72小时后，除去细菌/L-Melimine溶液的等分试样，使用标准的Miles和Misra平板计数测定法对仍存活的细菌计数。表5A和5B显示了结果。
表5A在溶液中Melimine抗铜绿假单胞菌6294的热稳定性
测试用透镜数示于()中表5B在溶液中Melimine抗金黄色葡萄球菌31的热稳定性
测试用透镜数示于()中所有的标准偏差皆为1或更小。L-Melimine的高压灭菌处理并不导致活性的任何减少。
实施例6如实施例1所述培养细菌(肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))。如实施例2所述制备接触透镜，并将其在细菌溶液中浸泡10分钟。在吸附完成后，如实施例2所述对透镜进行处理，并与没有用L-melimine处理的对照透镜比较以测量细菌减少％。结果示于下表6中。
表6
测试用透镜数示于()中表6数据显示L-Melimine能减少肺炎链球菌和粘质沙雷氏菌在接触透镜上的粘附。在产生有害结果时，已从接触透镜上分离到这些细菌。
实施例7将三只接触透镜(Etafilcon A)在0.1M pH5.0的醋酸钠缓冲液中洗涤两次，然后重悬于2ml 0.1M pH5.0的醋酸钠缓冲液中，在该缓冲液中1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(″EDC″)终浓度为2mg/ml，在室温下反应15分钟。然后将接触透镜在pH7.4PBS中洗涤三次。接着将接触透镜重悬于1mg/ml的L-Melimine PBS溶液中，并在37℃下搅拌温育两小时。然后将接触透镜在PBS中洗涤四次，并使用Cole和Ralston(1994)开发的方法定量结合的肽。在37℃下，使用过滤的溶有0.025％考马斯染色剂的10％醋酸和10％异丙醇染色接触透镜2-24小时。在37℃下，在10％醋酸和10％异丙醇中对透镜脱色。接着在25％吡啶中抽提透镜过夜。使用25％吡啶作为空白对照物，在分光光度计中A600处分析抽提液。通过将抽提物与标准曲线进行比较来确定L-Melimine的量，所述标准曲线是通过移取已知数量的L-Melimine至半干燥丙烯酰胺凝胶上并如上所述进行抽提而建立的，该方法从凝胶中抽提出所有的肽。使用本实施例的方法大约有18μg/透镜的Melimine结合到接触透镜上。
如实施例2所述，将透镜暴露于细菌(在35℃于铜绿假单胞菌10分钟)并对其分析。该透镜显示了66±3％的细菌吸附减少率。
实施例8对接触透镜进行涂覆并干燥(如实施例2所述)，所用的D-Melimine浓度为250μg/透镜或500μg/透镜。就像L-melimine那样，D-melimine是通过标准的肽合成技术(如Fmoc)使用D-氨基酸所制备的。如实施例2所述方法进行细菌吸附抑制的测定。
表7-L-melimine减少％
表8-D-melimine减少％
于10分钟及250μg/透镜时，L-和D-Melimines对金黄色葡萄球菌几乎不具有统计学上可测量的活性(表7和8)。此外，与L-Melimine比较，D-对映异构体在250μg/透镜下抗铜绿假单胞菌的活性没有差异。在500μg/透镜浓度下，L-对映异构体显示了抗铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的活性，而D-对映异构体显示了对铜绿假单胞菌统计学上一致的活性。
实施例9为了进行体外细胞毒性测试，在PBS中制备L-Melimine溶液(500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml和62.5μg/ml)。接着以1∶3比例将溶液稀释于组织培养液(EMEM)中，并将稀释后的组织培养液添加至鼠L929细胞，培养48小时。在盐水中漂洗细胞，然后在室温下使用0.25％胰岛素3-5分钟来收获细胞。接着，将1ml盐水添加至细胞和胰岛素混合物中，将500μl等分试样添加至19.5ml盐水中并在库尔特粒度仪中对细胞重复计数三次。将结果与未受扰培养物以及阳性(细胞毒性)对照物进行比较。以未存活细胞的百分率(100-样本中细胞数目/未受扰细胞中细胞数目×100)来表示结果。此外，检测肽溶解绵羊红细胞的能力。将绵羊红细胞在PBS中洗涤并重悬。将不同浓度的肽添加至红细胞中并在37℃下温育4小时。使用蒸馏水获得100％溶胞结果，而使用PBS获得0％溶胞结果。在离心除去完整的红细胞后，通过测量释放至PBS中的血红蛋白量来测定溶胞结果。
表9
发现L-Melimine在500μg/ml处具有边际细胞毒性，而在所有其它浓度处没有细胞毒性(表9)。如图1所示，蜂毒肽引起红细胞广泛溶血，而所有其它肽/蛋白质引起更少溶血。L-Melimine所导致的溶血量在所有肽/蛋白质中最小。这些结果显示Melimine可用于接触透镜，而不引起眼的不良反应。
实施例10对L-Melimine进行评估以确定其对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的潜在诱导抗性。在暴露于L-Melimine前，如实施例1所述测定两种菌株的MICs。在实施例1中铜绿假单胞菌在1mg/ml时具抗性，因此当与铜绿假单胞菌温育时将用于测定L-Melimine MIC的起始浓度提高到15mg/ml，使用实施例1的方法结果测定的MIC为4mg/ml。对于实施例10而言，将约25％的MIC用作为亚抑菌浓度，其示于下表10栏2中。将细菌在TSB中培养过夜。并以1∶100比例接种于新鲜的TSB中并温育过夜，所述TSB包含亚抑菌浓度的L-Melimine。接着在新鲜TSB中将来自包含亚抑菌浓度肉汤培养基的细菌(表9，栏2)与相同浓度的L-Melimine再温育。连续重复30天。传代后，测定最后一次传代细菌的MIC。任何MIC的增加将表明细菌可能变成有抗性的。
表10
在传代全程中铜绿假单胞菌的MIC没有改变，显示了对Melimine不可能有抗性。在传代全程中金黄色葡萄球菌的MIC实际上减少了，表明该菌株的亚抑菌浓度更易受该肽的影响。没有迹象表明任一细菌对L-Melimine具潜在抗性。因此，本发明提供了具有抗菌活性阳离子肽，且没有迹象表明在传代全程中具抗菌抗性。因此，用这些肽涂覆或处理的医学装置应适合于重复或长期使用，并具有所需的抗菌活性。
实施例11评价L-Melimine以测定其在眼泪中所能保留的活性。如下所述将L-Melimine在眼泪存在下温育。在营养琼脂平板中打孔，接着接种细菌(铜绿假单胞菌6294或金黄色葡萄球菌31)。将从正常受试人处收集的眼泪(10μl)添加至孔中并使之在室温下为琼脂吸收15分钟。然后添加L-Melimine，浓度为125μg/孔。将营养琼脂平板在35℃下温育过夜，温育后，测量抑制区并用毫米(mm)来表示。结果示于下表11中。
表11
当在眼泪中时，L-Melimine活性没有明显增加或减少，表明眼泪并不干扰该肽的活性。
实施例12在室温及氮气氛下，向放置有干燥吸收器的干燥容器中添加30.0g(0.277 mol)的双(二甲氨基)甲基硅烷、13.75ml的1M TBACB(386.0gTBACB溶于1000ml无水THF)溶液、61.39g(0.578mol)的对二甲苯、154.28g(1.541mol)的甲基丙烯酸甲酯(相对于引发剂为1.4当量)、1892.13(9.352mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙酯(相对于引发剂为8.5当量)和4399.78g(61.01mol)的THF的溶液。向装备有热电偶和冷凝器的干燥三颈圆底烧瓶中充满上述于干燥吸收器中所配制的混合物，所有三颈都通氮气。
将反应混合物冷却至15℃，边搅动边用氮气清洗。在溶液达到15℃后，将191.75 g(1.100mol)的1-三甲基甲硅烷氧基-1-甲氧基-2-甲基丙烯(1当量)注射入反应器中。使反应放热至约62℃，接着将30ml0.40M TBACB溶液(154.4g TBACB溶于11ml无水THF中)按计量加入至反应的全部残留物中。在反应温度达到30℃时开始计量，添加467.56g(2.311mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙酯(相对于引发剂为2.1当量)、3636.6.g(3.463mol)正丁基单异丁烯酰氧基丙基-聚二甲基硅氧烷(相对于引发剂为3.2当量)、3673.84g(8.689mol)的TRIS(相对于引发剂为7.9当量)和20.0g双(二甲氨基)甲基硅烷的溶液。
使混合物放热至约38-42℃，随后冷却至30℃。在当时，添加10.0g(0.076mol)双(二甲氨基)甲基硅烷、154.26g(1.541mol)甲基丙烯酸甲酯(相对于引发剂为1.4当量)和1892.13g(9.352mol)甲基丙烯酸2-三甲基甲硅烷氧基)乙酯(相对于引发剂为8.5当量)的溶液，并使混合物再次放热至约40℃.在反应温度降至约30℃时，添加2加仑THF以减少粘度。向混合物中添加439.69g水、740.6g甲醇和8.8g(0.068mol)二氯乙酸的溶液并将混合物回流4.5小时以对HEMA上的保护基团去保护。接着除去挥发物并加入甲苯以帮助除去水，直至水蒸汽温度达到110℃为止。
将反应烧瓶维持在约110℃并加入443g(2.201mol)TMI和5.7g(0.010mol)二丁基锡二月桂酸酯。混合物起反应直至通过IR监测到异氰酸酯峰出现。减压蒸发甲苯直至产生灰白色的、无水蜡状反应活性单体。将该大分子单体置于丙酮中，以重量单位计为约2∶1的丙酮对大分子单体。24小时后，加入水以沉淀出大分子单体并将其过滤，使用真空干燥箱于45-60℃干燥20-30小时。
实施例13通过添加示于表12中的100份组分以形成反应混合物，根据表12中所示数量具有20份3，7-二甲基-3-辛醇。特别地，以如下顺序将大分子单体、Norbloc 7966、稀释剂、TEGDMA、HEMA、DMA、TRIS和mPDMS添加至琥珀烧瓶中。这些组分在170-300rpm和50-55℃下混合90-180分钟。在混合时，加入HEMA蓝并将这些组分进一步混合20-75分钟(在170-300rpm，50-55℃下)。还在混合中，添加PVP并再搅拌混合物20-140分钟(在170-300rpm，50-55℃下)。最后，在连续混合中添加CGI1850(Irgacure1850)。
表12
将异丁烯酸五氟苯基酯(OPfp)(0.5重量％)添加至反应混合物中。剧烈混合反应混合物约10分钟(或均匀混合直至溶液澄清为止)并接着脱气，或高真空直至反应混合物中没有气泡可见(约20分钟)。将该反应混合物置于热塑性接触透镜模具中，并使用Philips TL20W/03T荧光灯在N2气氛中于50℃照射约50分钟。在Dowanol DPMA(DPMA，购自Aldrich)中脱模。用DPMA洗涤透镜5次。每次洗涤持续约120分钟。将透镜单独置于含有2mL溶液的管形瓶中，该溶液含有2.5mg/mL melimine和溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的0.05重量％的N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)。使用灰色丁基阻聚剂对管形瓶(包含透镜和溶液)进行阻聚，然后于37℃在培养箱/振荡器中温育18小时，以100rpm持续摇动。
温育后，从每个管形瓶中除去溶剂。然后，向每个管形瓶中添加大约9mL新鲜的DMF溶剂。1小时后，除去溶剂并再次添加相同体积的新鲜DMF溶剂。该过程总共重复4次，每次间隔1小时。在第四次溶剂交换后，在室温下将透镜直接置于DI水中，并洗涤4次，每次间隔1小时。在第四次洗涤后，在室温下将透镜置于包装溶液中1小时，然后在121℃高压灭菌30分钟。测量透镜特性，示于下表13中。
实施例14除了添加至包含melimine涂层溶液的偶联添加剂和melimine涂层溶液的浓度改变外，重复实施例13。因此，如实施例13所准确描述，将在DPMA溶剂中脱模及洗涤后的透镜分别置于含3mL 5mg/mL N-羟基苯并三唑(HOBt)DMF溶液的管形瓶中。使用标刻度的移液器，向每个管形瓶中添加50μL的二异丙基碳二亚胺(DIC)。在室温下20-60分钟后，使用标刻度的Eppendorf移液器将1mL的3mg/mLmelimine DMF溶液添加至每个管形瓶中，所述DMF溶液包含0.5重量％的N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)。使用灰色丁基阻聚剂对管形瓶阻聚。接着于37℃在培养箱/振荡器中温育透镜约19小时，以100rpm持续摇动。
温育后，从每个管形瓶中除去溶剂。然后，向每个管形瓶中添加大约9mL新鲜的DMF溶剂。1小时后，除去溶剂并再次添加相同体积的新鲜DMF溶剂。该过程总共重复4次，每次间隔1小时。在第四次溶剂交换后，在室温下将透镜直接置于DI水中，并洗涤4次，每次间隔1小时。在第四次洗涤后，在室温下将透镜置于包装溶液中1小时，然后在121℃高压灭菌30分钟。测量透镜特性，示于下表13中。标准偏差示于括号中。
表13
实施例15将实施例13和14所制备的透镜从管形瓶中取出，并在5mLPBS中洗涤3次，每次5分钟。无涂层及具有相同衬底(substrate)配方的透镜作为对照，在35℃下将四只透镜暴露于细菌(铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌)，暴露时间如下表14所示，如实施例2所述进行分析。
表14
实施例16-19除了melimine涂层溶液浓度和洗涤程序改变外，重复实施例14。因此，如实施例14所准确描述，在DPMA溶剂中脱模及洗涤后的透镜分别置于含3mL 5mg/mL N-羟基苯并三唑(HOBt)DMF溶液的管形瓶中。使用标刻度的移液器，向每个管形瓶中添加50μL的二异丙基碳二亚胺(DIC)。在室温下约60分钟后，使用标刻度的Eppendorf移液器将1mL列于表15不同浓度的melimine涂层DMF溶液添加至每个管形瓶中，所述DMF溶液包含0.05重量％的N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)。使用灰色丁基阻聚剂对管形瓶阻聚。接着于37℃在培养箱/振荡器中温育透镜约19小时，以100rpm持续摇动。
温育后，将透镜转移至含300mL新鲜DMF和磁力搅拌器的400mL烧杯中。透镜在DMF中搅拌1小时。该过程重复多于3次(总共4次)。在第四次溶剂交换后，将300mL DI水添加至烧杯中，并用DI水洗涤透镜共4次。在第四次洗涤后，将透镜置于含包装溶液的管形瓶中。然后在121℃下高压灭菌30分钟。测量透镜特性，示于下表15中。标准偏差示于括号中。
表15
N/M表示未测量。
实施例20将实施例16-19所制备的透镜从管形瓶中取出，并在5mLPBS中洗涤3次，每次5分钟。无涂层及具有相同衬底配方的透镜作为对照，在35℃下将四只透镜暴露于细菌(铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌)，暴露时间如下表16所示，如实施例2所述进行分析。标准偏差示于括号中。
表16
实施例21向装备有磁力搅拌器和容有0.60g melimine的100mL圆低烧瓶中添加50mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在25℃及氮气下，搅拌均相溶液30分钟。向溶液中添加N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，33μL)。接着仍在氮气下，将溶液置于冰浴中并搅拌。20分钟后，向溶液中添加异丁烯酰氯(19μL)。将溶液降至室温并通过质谱法监测。约20小时后，在室温下向溶液中添加多于19μL的异丁烯酰氯并搅拌溶液。再过约20小时，将DMF从烧瓶中蒸发，残留物溶于DI水中并使用透析管(苯甲酰化的纤维素透析管，截留分子量2,000，购自Sigma)对2×4L的DI水透析。对透析部分冷冻干燥得到约250mg的异丁烯酰化melimine，为蓬松的白色粉末。
实施例22将异丁烯酰化的melimine(实施例21，74.9mg)添加至3.12g的DMA中，在40℃下对混合物进行超声处理直至全部melimine都溶解(约1小时)。该melimine/DMA溶液被用于制备反应混合物。通过添加示于表17中的100份组分形成反应混合物，根据表17中所示数量具有20份3，7-二甲基-3-辛醇。特别地，以如下顺序将大分子单体、Norbloc 7966、稀释剂、TEGDMA、HEMA、melimine/DMA溶液、TRLS和mPDMS添加至琥珀烧瓶中。这些组分在170-300 rpm和50-55℃下混合90-180分钟。在混合时，加入HEMA蓝并将这些组分进一步混合20-75分钟(在170-300rpm，50-55℃下)。还在混合中，添加PVP并再搅拌混合物20-140分钟(在170-300rpm，50-55℃下)。最后，在连续混合中添加CGI1850(Irgacure 1850)。
表17
将反应混合物在高真空下脱气直至在反应混合物中没有气泡可见(约20分钟)。将该反应混合物置于热塑性接触透镜模具中，并使用Philips TL20W/03T荧光灯在N2气氛中于50℃照射约60分钟。照射后，打开模具将透镜在60％异丙醇/水中脱模，接着在IPA/DI中沥滤以除去所有残留的单体和稀释剂。将透镜转移至含包装溶液的管形瓶中，并在121℃下高压灭菌30分钟。测量透镜特性，示于表18中。
表18
实施例23将实施例22所制备的透镜从管形瓶中取出，并在5mL PBS中洗涤3次，每次5分钟。具有相同衬底配方但不含有异丁烯酰化的melimine的透镜作为对照。在35℃下将四只透镜暴露于细菌(铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌)，暴露时间如下表19所示，如实施例2所述进行分析。
表19
实施例24向装备有磁力搅拌器和容有3.00g melimine的500mL圆低烧瓶中添加120mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在25℃及氮气下，搅拌均相溶液约5分钟。向溶液中添加N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，170μL)。接着仍在氮气下，将溶液置于冰浴中并搅拌。30分钟后，向溶液中添加异丁烯酰氯(95μL)。将溶液降至室温。约20小时后，反应结束通过质谱法监测。约20小时后，在室温下向溶液中添加多于19μL的异丁烯酰氯并搅拌溶液。将DMF从烧瓶中蒸发，残留物溶于约10mLDI水中并使用透析管(苯甲酰化的纤维素透析管，截留分子量2,000，购自Sigma)对3×4L的DI水透析。对透析部分冷冻干燥得到约940mg的异丁烯酰化melimine，为蓬松的白色粉末。
实施例25-27重复实施例22，使用了实施例24的异丁烯酰化melimine，数量如下表20所示。测量透镜特性，示于表20。标准偏差示于括号中。
表20
实施例28将实施例25-27所制备的透镜从管形瓶中取出，并在5mLPBS中洗涤3次，每次5分钟。具有相同衬底配方但不含有异丁烯酰化的melimine的透镜作为对照。在35℃下将四只透镜暴露于细菌(铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌)，暴露时间如下表21所示，如实施例2所述进行分析。标准偏差示于括号中。
表2权利要求
1.一种装置，包含生物医学装置，其至少一个表面包含覆盖有效量的至少一种合成抗微生物肽。
2.权利要求1的装置，其中所述装置选自导管、植入物、支架、流体收集袋、传感器、水凝胶绷带、输液管、抗生素载体、诊断和治疗剂和眼科装置。
3.权利要求1的装置，其中生物医学装置是一种眼科装置。
4.权利要求1的装置，其中至少一种合成抗微生物肽包含以任意顺序排列的三个片断A、B和C，其中片断A是具有序列SEQ ID NO.1的肽；片段B是具有序列SEQ ID NO.2的肽；和片断C是至多10个氨基酸的连接基团，其不抑制肽的抗微生物活性或不诱导哺乳动物细胞毒性，其包括0至约10个氨基酸的间隔区。
5.权利要求4的装置，其中片断C具有化学式-HN-(CR1R2)n-CO-，其中n是1-21的整数，R1和R2独立地选自H、具有1-4个碳原子的直链或支链烷基、具有1-2个碳原子的直链或支链羟基、具有1-3个碳原子的直链或支链烷硫基、具有1-3个碳原子的氨基甲酰基、具有1-3个碳原子的羧基、具有1-4个碳原子和1-3个氮原子的伯氨基和仲氨基、苄基、苯酚、苯基吲哚以及N，N-吡咯。
6.权利要求5的装置，其中n是1-10的整数，R1和R2中至少之一是H。
7.权利要求4的装置，其中A和B片断位于末端位置，片断C包含至多5个氨基酸。
8.权利要求1的装置，其中至少一个表面包含覆盖有效量的melimine、protattin及它们混合物。
9.权利要求8的装置，其中所述melimine是L-melimine。
10.权利要求8的装置，其中所述melimine是D-melimine。
11.权利要求1的装置，其中表面还包含选自下列的聚合物水凝胶、硅酮水凝胶、甲基丙烯酸2-羟基乙酯的聚合物和共聚物以及它们的混合物。
12.权利要求11的装置，其中聚合物是水凝胶。
13.权利要求11的装置，其中聚合物是硅酮水凝胶。
14.权利要求11的装置，其中聚合物是甲基丙烯酸2-羟基乙酯的聚合物和共聚物。
15.权利要求14的装置，其中甲基丙烯酸2-羟基乙酯的共聚物是甲基丙烯酸2-羟基乙酯的轻度交联的共聚物。
16.权利要求1-15的装置，其中所述装置是接触透镜。
17.一种制造装置的方法，包括将生物医学装置的至少一个表面与覆盖有效量的至少一种抗微生物肽接触的步骤。
18.权利要求17的方法，其中至少一种合成抗微生物肽包含以任意顺序排列的三个片断A、B和C，其中片断A是具有序列SEQ ID NO.1的肽；片段B是具有序列SEQ ID NO.2的肽；和片断C是至多10个氨基酸的连接基团，其不抑制肽的抗微生物活性或不诱导哺乳动物细胞毒性，其包括0至约10个氨基酸的间隔区。
19.权利要求17的方法，其中片断C具有化学式-HN-(CR1R2)n-CO-，其中n是1-21的整数，R1和R2独立地选自H、具有1-4个碳原子的直链或支链烷基、具有1-2个碳原子的直链或支链羟基、具有1-3个碳原子的直链或支链烷硫基、具有1-3个碳原子的氨基甲酰基、具有1-3个碳原子的羧基、具有1-4个碳原子和1-3个氮原子的伯氨基和仲氨基、苄基、苯酚、苯基吲哚以及N，N-吡咯。
20.权利要求17的方法，其中n是1-10的整数，R1和R2中至少之一是H。
21.权利要求17的方法，其中A和B片断位于末端位置，片断C包含至多5个氨基酸。
22.权利要求17的方法，其中至少一个表面包含覆盖有效量的melimine、protattin及它们混合物。
23.权利要求17的方法，其中生物医学装置是接触透镜。
24.权利要求23的方法，还包括将至少一个表面与偶联有效量的偶联剂接触的步骤。
25.权利要求22的方法，其中所述melimine包含L-melimine。
26.权利要求17的方法，还包括将所述合成抗微生物肽结合至所述装置的步骤。
27.权利要求26的方法，其中所述结合步骤是通过将所述装置中的反应活性基团与所述合成抗微生物肽中的反应活性基团直接反应，或将所述装置和合成抗微生物肽与偶联剂反应来进行的。
28.权利要求27的方法，其中所述结合步骤是通过与至少一种偶联剂反应来进行的，所述至少一种偶联剂选自N，N′-羰基二咪唑、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、双环己基碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和它们的混合物以及N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯、二氟苯衍生物、溴官能化醛、双环氧化物以及它们的混合物。
29.权利要求26的方法，还包括将至少一种潜在反应活性组分引入形成所述装置的反应混合物的步骤。
30.一种方法，包括形成一种反应混合物，所述反应混合物包含透镜形成组分以及至少一种包含丙烯酰基或异丁烯酰基的合成抗微生物肽，聚合所述反应混合物以形成一种生物医学装置。
31.权利要求30的方法，其中所述装置选自导管、植入物、支架、流体收集袋、传感器、水凝胶绷带、输液管、抗生素载体、诊断和治疗剂和眼科装置。
32.权利要求30的方法，其中生物医学装置是一种眼科装置。
33.权利要求30的方法，其中所述装置是接触透镜。
全文摘要
本发明提供了具有抗微生物涂层的生物医学装置。所述装置一个或多个表面上覆盖了阳离子肽、阳离子蛋白质或它们的混合物以赋予所述表面抗微生物特性。
文档编号A61L31/16GK1751251SQ200380109847
公开日2006年3月22日 申请日期2003年12月18日 优先权日2002年12月19日
发明者M·维尔科克斯, E·休姆, N·科尔, Y·阿利瓦加, D·扎尼尼 申请人:庄臣及庄臣视力保护公司