专利名称：用于预防和/或治疗粥样动脉硬化的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和/或治疗粥样动脉硬化的诱导免疫口服耐受性的组合物。
背景技术：
在西方社会，粥样动脉硬化和它的临床后遗症就其发病率和死亡率而论，是其中一个最危险的危害。因此，为了提供减缓或阻止粥样动脉硬化的早期无痛进程的方法，已经花费巨大的力量来研究它的发病机理也就不奇怪了。虽然没有明确的答案，但正逐步显示出动脉粥样硬化斑的逐渐形成并非仅与某一单独机制有关，就像以前在脂平衡的异常调节方面所推测的。
临床医师利用词语粥样动脉硬化来定义导致身体各部分的动脉闭塞的组织病理学过程。闭塞是由于循环中逐步被大量脂肪填充的各种来源的不同细胞积聚而引起的。脂肪是沉积于脉管壁的主要物质，它主要是由“有害”胆固醇低密度脂蛋白(LDL)组成的。在粥样动脉硬化的后期，脂质填充区开始积聚钙。钙的沉积致使动脉更硬、柔韧性更差，因此引起了它们的“石状”外观，这是导致了我们众所周知的“动脉硬化症”(粥样动脉硬化)的外观。当所涉及的动脉阻碍了血液流向心脏，一个人就会“心脏病发作”；当脑部动脉闭塞时，这个人就会表现出中风。当四肢的动脉狭窄时，就会导致剧烈疼痛、降低身体可动性并可能需要进行截肢。
很明显，许多年内都不能够察觉到以上提到的疾病的进展，而只在晚期才表现出来。当能够察觉到表现时，由于已经处于疾病晚期，因此进行治疗要难得多。
像在上面提到的，粥样动脉硬化是由于脂肪沉积于血管壁，因此形成了一个动脉粥样硬化斑层，该层阻碍了血液流向生命器官，从而导致中风综合症，心肌梗塞或外周血管疾病。已知的可加快病程的风险因素包括高血压、糖尿病、肥胖、吸烟和缺乏运动。
最近的研究表明，传染性因子如巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和肺炎衣原体也可能与粥样动脉硬化的发展有关。除了血管阻塞和再狭窄与抗-CMV抗原的自身抗体效价之间的联系，或是在动脉粥样硬化斑上发现传染性颗粒之外，以上的发现还通过粥样动脉硬化和龈炎之间的联系得到了证实。
最近十年，已经积累了许多证据来支持粥样动脉硬化具有一个重要的传染性自身免疫组分这一理论。
在自身免疫疾病中，免疫系统除攻击外来入侵物外，也攻击我们身体的组分(自身抗原)。自身免疫疾病可分为自身抗体介导的疾病或细胞介导的疾病。典型的自身抗体介导的自身免疫疾病包括重症肌无力和特发性血小板减少性紫癜(ITP)，而典型的细胞介导的自身免疫疾病是桥本氏甲状腺炎和I型糖尿病。
在粥样动脉硬化中涉及免疫网络公认在粥样动脉硬化损伤中免疫介导过程是普遍的，这种认识产生于在最初阶段，即脂肪纹中一贯观测到淋巴细胞和巨噬细胞。与更晚期的损伤相比，在早期损伤中，发现大部分为CD4+细胞(其余为CD8+细胞)的这些淋巴细胞要比巨噬细胞更多，在更晚期的损伤中，这个比例趋向于逆转。这些发现引出的问题是它们是反映了对于一个潜在抗原的初次免疫致敏作用，还是作为先前引起的局部组织损伤的一个纯粹副现象而保持。无论这些因子是否将炎症细胞募集到早期动脉粥样硬化斑，它们似乎表现出一种活化的状态，这通过伴随的II类MHC的HLA-DR和白介素(IL)受体以及白细胞共同抗原(CD45R0)和极晚期抗原1(VLA-1)整合蛋白的表达而得到证明。
在粥样动脉硬化损伤早期阶段，正在发生的炎症反应或者可能是主要的起始事件，从而导致局部细胞(即内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和炎性细胞)产生各种细胞因子，或者这个反应可能是机体防御免疫系统对抗危害过程的一种形式。已经表明被居留细胞上调的细胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ和单核细胞化学引诱肽-1(MCP-1)。也显示出在动脉粥样硬化斑中由细胞成分表达的血小板衍生生长因子(PDGF)是超量表达的，因此可能强化了由有丝分裂和趋化因子形式的共同刺激支持的先存炎症反应。就在最近，在UyemuraK，Demer LL，Castle SC等，粥样动脉硬化中IL-12和IL-10的交叉调节作用.J Clin Invest 1996 97；2130-2138中阐述了与正常动脉相比，在人粥样动脉硬化损伤中1型T细胞的细胞因子型，例如强表达IFN-γmRNA而不是IL-4 MRNA。此外，在损伤中发现了主要由活化单核细胞产生的并且是Th1细胞因子型的选择性诱导物的T细胞生长因子—IL-12超量表达，这通过存在大量的它的主要异源二聚体形式p70和p40(它的显性诱导型蛋白)mRNA而得到证明。
与证明在动脉粥样硬化斑中细胞免疫系统占优势的有力证据相似，同样也有充足的证据证明了也涉及局部体液免疫系统。因此，除了居留巨噬细胞中C3b和C3Bi受体的表达增加之外，在动脉粥样硬化斑中还显示出免疫球蛋白和补体组分的沉积。
关于免疫介导的炎症反应促进粥样动脉硬化进程的有价值线索来自动物模型。因此，与免疫活性小鼠相比，无免疫应答小鼠(I类MHC缺陷型)似乎趋向于出现加速粥样动脉硬化。另外，利用IL-2转录的有效抑制剂环孢菌素A治疗C57BL/6小鼠(Emeson EE，Shen ML.环孢菌素A治疗高脂血C57BL/6小鼠的加速粥样动脉硬化.Am JPathol 1993；1421906-1915)和新西兰白兔(Roselaar SE，Schonfeld G，Daugherty A.抑制细胞介导的免疫在胆固醇喂养兔中增强出现粥样动脉硬化.J Clin Invest 1995；961389-1394页)在“正常”脂蛋白“负载”下可导致明显增强的粥样动脉硬化。这些随后的研究可能使人们深入地了解参与对抗粥样动脉硬化斑中的自我保持的炎性过程的免疫系统的可能作用。
虽然粥样动脉硬化的一些表现如产生阻塞血管的硬化斑可能与免疫系统作用有关，但它并不是一种典型的自身免疫疾病。在典型的自身免疫疾病中，可以很明确地确定受免疫系统攻击的自身抗原；可以确定攻击属于免疫系统的自身抗原(自身抗体或细胞)的免疫系统部分，即淋巴细胞。最重要的是可以表明通过被动转移这些免疫系统组分，在健康动物上可以诱导疾病，或是在人类中，患病孕妇可能将疾病传给她的下一代。在粥样动脉硬化中，以上几点并不是很普遍。另外，粥样动脉硬化的确具有共同的风险因素，如高血压、糖尿病、缺乏体育运动、吸烟等；它影响老年人；它比典型自身免疫疾病具有不同的遗传优势。
从本世纪初以来就已经知道了诱导口服耐受的方法以减小变态反应。为变应性患者喂食低剂量的已知变应原，则机体的免疫耐受就会恢复，而不发生变态反应。
自身免疫疾病的口服耐受在自身免疫疾病中，口服耐受是用于描述减弱自身免疫疾病的免疫应答的术语。通过给动物喂食“有罪”抗原而产生的耐受，由于对免疫应答的“麻痹”作用，可以消除疾病的发生。最近本发明人揭示出，在用β2GP-1免疫之前口服人β2GP-1导致改善相当于抗磷脂(APS)的综合症(anti-phospholipid(APS)-equivalent syndrome)。
口服耐受已经应用于自身免疫疾病领域，在自身免疫疾病中进行对抗自身抗原的免疫反应，而且也存在恢复免疫系统对自身抗原耐受的需要。这是通过给受治疗者喂食低剂量的自身抗原进行的。迄今为止，已经报道了几个动物模型，其中恢复了口服耐受，除通过给受治疗者喂食胶原蛋白和HSP-65分别预防佐剂性关节炎和胶原性关节炎之外，包括通过给受治疗者喂食来自神经膜的一种蛋白，即髓磷脂碱性蛋白(MBP)，防治了相当于多发性硬化症(MS)的实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的发生，。建于波士顿的一家名为“自身免疫”的公司已经进行了几个预防糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎和眼色素层炎的人体实验。人体实验的结果并不比非人体实验更令人印象深刻，然而在预防关节炎上却获得了成功。
抗原组分A.氧化的低密度脂蛋白LDL是一种大分子量蛋白的复合物，包括载脂蛋白B、中性脂、极性脂和亲脂性抗氧化剂(维生素E和β胡萝卜素)。氧化修饰LDL，导致在天然分子中形成新表位(neoepitopes)(在Apo B结构域中)，使得它能够被巨噬细胞上的清除受体所识别。粥样动脉硬化斑中的所有细胞组分(即内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和淋巴细胞)有可能增强脂类过氧化，产生不同程度的LDL氧化，然而并不能确定它们各自的相对影响。不考虑这些细胞的精确作用，看来血管壁水平的氧化和抗氧化力之间的平衡决定了暴露于Ox LDL的程度以及随后有害作用。Ox LDL具有活化衍生物，如溶血磷脂酰胆碱(LPC)，而且Ox LDL尽管是小分子量的，也仍然保留了一些生物活性。
溶血磷脂酰胆碱(LPC)在人粥样动脉硬化斑中表达。它是一种可以诱导粥样动脉硬化第一步的活性生物物质。实际上，它比Ox LDL甚至更有效。
Ox LDL和它的副产品对于硬化斑的发生的总体体内和体外影响大大超出了本发明的范围，但它对于阐明Ox LDL和免疫系统间的已知关系是重要的。
我们已经知道OxLDL是T细胞和单核细胞的趋化因子。而且OxLDL和它的副产品可以诱导如单核细胞趋化因子1的因子的表达；诱导集落刺激因子的分泌和发挥血小板活化特性，所有这些都是有效的生长刺激物。
Stemme S，FaberB，HolmJ等最近已经证实了在粥样动脉硬化中细胞免疫应答的主动介入。来自人粥样动脉硬化斑的T淋巴细胞识别氧化的低密度脂蛋白。Proc Natl Acad Sci USA 1995；923893-3897公开了从对作为刺激物的Ox LDL应答的硬化斑克隆中分离了CD4+。与Ox LDL相应的克隆(每27个中有4个)主要产生γ干扰素，而不是IL-4。尚须了解上述T细胞克隆是否说明仅以细胞免疫系统与强烈刺激免疫原(Ox LDL)接触，还是这个反应为对抗明显的无痛粥样动脉硬化过程而提供方法。
关于涉及体液机制的数据及其含义倍受争议。几篇报道已经将抗Ox LDL抗体水平的增加与粥样动脉硬化的进程(通过颈动脉狭窄程度、外周血管病的严重程度等表现)相联系。然而，其它科学家没有重现这些数据，也许是因为没有对用来测定对LDL抗体的测定进行标准化。在所有情况下，似乎关于在粥样动脉硬化斑中存在免疫复合物形式的Ox LDL抗体是一致的，尽管尚未确定这一发现的真正意义。
已经假设Ox LDL的抗体在脂蛋白代谢中起积极作用。因此，知道与Ox LDL相比，Ox LDL的免疫复合物和它的对应抗体在悬浮液中可以更有效的被巨噬细胞所吸收。由于Ox LDL被巨噬细胞加速吸收是有益的还是有害的问题仍然没有解决，因此从对于粥样动脉硬化的发病机理的这一一致的发现中并不能够得出任何的结论。
从动物模型中获得了关于体液免疫系统在粥样动脉硬化中重要性的重要数据。已经发现，与用磷酸盐缓冲盐水(PBS)超免疫的对照组相比，用同源氧化LDL超免疫LDL-受体缺陷兔导致产生高水平的抗-Ox LDL抗体，并与粥样动脉硬化损伤程度的明显减小有关。利用富含胆固醇的脂质体免疫兔也减少了硬化斑的形成，并伴随抗-胆固醇抗体的产生，而这个效应也伴随有极低密度脂蛋白胆固醇水平下降35％。本发明人研究表明，在apoE剔除(knockout)小鼠中，利用同源Ox LDL重复免疫导致产生抗-Ox LDL抗体并减缓粥样动脉硬化。
B.热休克蛋白(HSP)60/65另外的一个起始炎症损伤并使损伤永存，从而最终导致增强粥样动脉硬化的主要抗原组分是60Kd的热休克蛋白。这种线粒体蛋白是HSP家族中的一员，该家族是由在不同物种间具有高度序列同源性的大约24种蛋白组成的。这些蛋白就像它们的名字所显示的，对于各种胁迫损害包括暴露于自由基、热、机械剪切应力、感染和细胞因子等做出反应而被上调。HSP的目的论重要性来自于它们对抗胁迫刺激物促进的细胞蛋白解折叠的保护作用。这个作用使它们被命名为分子“伴侣蛋白”。然而，HSP的这些明显有利作用也是一把双刃剑，因为它们的高度表达在一定条件下可能促进自身免疫反应，从而导致组织损伤。负责HSP免疫介导的损伤的机制目前仍不是完全清楚，并假设隐藏的新表位在上调后，暴露于免疫系统而不再被免疫系统识别为“自身抗原”。另一方面，有人认为在“外来”HSP和在感染后引入的自身HSP间存在交叉反应，这起作用而触发针对自身结构的免疫攻击。
HSP 60是一种特殊蛋白，它构成上面提到的HSP家族内的一个不同“类别”，并与HSP65一起为一个亚组蛋白的体内折叠提供一个隔离的环境。
在哺乳动物HSP60和细菌HSP65之间存在相似性，它容易被宿主的免疫效应子交叉识别。
证明在一些自身免疫疾病中自身抗体增强和对于HSP 60/65的细胞应答的研究支持了HSP涉及自身免疫的观点。
HSP65和粥样动脉硬化间的联系最初开始于Georg Wick小组在二十世纪九十年代初开展的开拓性工作(Xu Q，Dietrich H，Steiner HJ等，通过用免疫热休克蛋白65免疫在正常胆固醇血小鼠、兔中诱导粥样动脉硬化.Arteriosclerosis Thrombosis 1992；12789-799)。他们发现，只要用于免疫的制剂含有弗氏完全佐剂(CFA)，则利用不同的抗原免疫的兔发生粥样动脉硬化，。由于CFA的主要成分是热灭活的结核分枝杆菌，而它的首要组分是HSP-65，他们由此认为针对此组分的免疫应答导致粥样动脉硬化的发生。当所述动物随后仅仅用HSP-65免疫后，并且显现出明显的粥样动脉硬化时，这个假设得到证实。需要强调的是，注意到各组之间在脂蛋白分布型方面没有差别。随后Wick的小组开展的另外工作揭示出，与来自相应动物的外周血相比，发现从诱发粥样动脉硬化的兔的损伤处提取的T细胞超量表达HSP-65，从而证明在受胁迫的主动脉脉管的附近存在局部和受限的免疫反应。本发明人加强了Wick的发现，表明HSP-65(或结核分枝杆菌)免疫初次实验的小鼠导致加速形成脂肪纹。
当在患有粥样动脉硬化的患者中观察到了涉及对HSP-65应答的体液免疫机制时，进一步证明了这些发现。因此，在高水平抗-HSP65抗体和在筛选健康个体中根据声波图估计的颈动脉狭窄程度之间建立了相互关系。
最近，用于评价HSP-60/65对于培养内皮细胞的影响的体外分析加强了这些发现。因此，已经表明内皮细胞与HSP65一起温育可引起它们对单核细胞和粒细胞的粘连性，这种粘连性是浓度和时间依赖性的。此外，已经证实，这种作用是由内皮细胞E-选择蛋白(C62E)、血管细胞粘附分子-1(CD106)和细胞内粘附分子-1(CD54)的超量表达介导的。
磷脂和β2GP1作为粥样动脉硬化中的自身抗原组分本发明人发现，在用人抗心磷脂抗体(aCL)免疫的LDL-受体剔除小鼠中，抗心磷脂的产生会促进早期粥样动脉硬化。这个发现是由关于抗心磷脂抗体在粥样动脉硬化中的可能前致动脉粥样化(proatherogenic)作用方面积累的的间接资料一致。
β2GP1是一种证明为自身免疫病患者的aCL目标的分子。已经表明抗-β2GP1抗体会导致实验性APS并活化内皮细胞和血小板。本发明人已经证明，用β2GP1免疫的转基因型LDL-RD缺陷小鼠会产生相应的抗体以及促进早期脂肪纹的形成，并伴随有CD4+细胞的局部聚集。因此，在粥样动脉硬化中，β2GP1可能作为自身免疫应答的一个自身抗原目标。
在动物和人类疾病模型中已经发现了自身抗原HSP60-65和OxLDL的自身抗体效价与粥样动脉硬化水平之间的相互联系。体内OxLDL是由于天然LDL的氧化产生的并且被认为是粥样动脉硬化的有害因子。对所述毒素应答产生抗-Ox LDL抗体。β2GP-1是人血液中对血液凝结过程起作用的一个天然蛋白；HSP65是各种胁迫刺激的结果。
在利用具有粥样动脉硬化发生的遗传素因的小鼠(LDL-R剔除小鼠)进行的实验中，通过喂食小鼠低剂量Ox LDL表明粥样动脉硬化病症缩减了30％。
此外，免疫系统参与粥样动脉硬化的诱发的事实以及免疫系统(淋巴细胞、自身抗体)的明确参与，指出了利用自身抗原例如Ox LDL、HSP60/65和β2GP1诱发口服耐受而控制疾病的能力。
美国专利第5,348,945号公开了一种在胁迫下的细胞或组织中对抗死亡率的方法。该方法包括将促进该细胞或组织存活有效量的热休克蛋白70(HSP70)接触该细胞或组织。该方法也许可以应用于在需要这样的治疗的人类或动物受治疗者中对抗粥样动脉硬化、血管成形术后的再狭窄和神经损伤。也公开了在药学上可接受的制剂中包含治疗有效量HSP70的药用组合物。
虽然HSP70和HSP60属于包括大约24种高度保守的热休克蛋白的家族，但它们表现出两种截然不同的特性。例如，它们的机制看来在控制抵抗胁迫刺激的保护作用方面的作用不一致。
HSP70最初获得专利是由于其在热暴露和其他胁迫损伤如缺血性预调节中具有明显的诱发作用。确实在转基因动物中HSP70的超量表达与防止胁迫危害的保护作用有关。
因此，美国专利第5,348,945号没有指出或提示本发明的主题。
本发明的公开因此，依照本发明现在提供了一种通过口服给予预防和/或治疗粥样动脉硬化的诱导免疫及口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种用于口服的药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种通过口服给予预防和/或治疗心脏病发作的诱导免疫及口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在本发明的另一个优选实施方案中，提供了一种通过口服给予用于预防和/或治疗血管成形术-再狭窄的诱导免疫及口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在本发明的一个更优选实施方案中，提供了一种通过口服给予预防和/或治疗中风的诱导免疫及口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在本发明的一个甚至更优选实施方案中，提供了一种诱导免疫及口服耐受的组合物，其中所述活性组分是修饰的低密度脂蛋白，或其中所述活性组分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)，或其中所述活性组分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)的活性衍生物，或其中所述活性组分是热休克蛋白60/65(HSP60/65)或β2-糖蛋白1(β2GP-1)。
本发明提供了一种诱导免疫口服耐受的组合物，其中所述活性衍生物是溶血磷脂酰胆碱(LPC)。
本发明也提供了一种诱导免疫口服耐受的组合物，其中所述LDL是丙二醛LDL(MDA-LDL)。
本发明的另一个方面提供了一种预防和/或治疗受治疗者的粥样动脉硬化的方法，包括口服给予一种诱导免疫口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在一个优选实施方案中，提供了一种预防和/或治疗受治疗者的心脏病发作的方法，包括口服给予一种诱导免疫口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在一个更优选实施方案中，提供了一种预防和/或治疗受治疗者的血管成形术-再狭窄的方法，包括口服给予一种诱导免疫口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在一个甚至更优选实施方案中，提供了一种预防和/或治疗受治疗者中风的方法，包括口服给予一种诱导免疫口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、热休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它们的功能性衍生物和混合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种预防和/或治疗受治疗者粥样动脉硬化的方法，其中所述活性组分是修饰的低密度脂蛋白，或其中所述活性组分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)，或其中所述活性组分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)的活性衍生物，或其中所述活性组分是热休克蛋白60/65(HSP60/65)或其中所述活性组分是β2-糖蛋白1(β2GP-1)。
本发明还提供了一种预防和/或治疗受治疗者粥样动脉硬化的方法，其中所述活性衍生物是溶血磷脂酰胆碱(LPC)。
本发明还提供了一种预防和/或治疗受治疗者粥样动脉硬化的方法，其中所述LDL是丙二醛LDL(MDA-LDL)。
其中用到的名词“功能性衍生物”预计包括标记蛋白、缀合蛋白、融合嵌合蛋白和可溶形式的纯化受体以及所述蛋白的片段、缺失和保守置换。
本发明人从粥样动脉硬化中存在针对Ox LDL的免疫应答和针对Ox LDL的反应与该疾病严重性之间的相互联系，并结合在小鼠和兔中Ox LDL的活性疫苗可以阻止粥样动脉硬化的发生的证据得出以下结论通过给人类受治疗者服用Ox LDL诱导免疫耐受，可以导致粥样动脉硬化进程速度减缓。需要提到的是，通过口服诱导免疫耐受的机制有可能是通过细胞因子TGFβ的刺激和产生以及非特异性抑制T细胞的发育而介导的。
本发明的口服耐受可以扩展以产生旁路(bystandard)抑制效应即阻断发生在粥样动脉硬化斑附近并对它的发生起一定作用的其他(非抗原特异性)自身免疫(抗自身)应答。
需要注意的是，本发明的目的是诱导耐受或者麻痹针对HSP65的免疫应答，而不是仅仅获得血清升高来帮助蛋白解折叠。
因此，一方面本发明结合了口服耐受、Ox LDL和粥样动脉硬化，粥样动脉硬化是一种部分由于免疫因素引起的疾病。已经报道Ox LDL在小鼠和兔中诱导Ox LDL抗原的免疫反应(与诱导免疫耐受相对比)并促进粥样动脉硬化病症。在这些动物模型中，没有报道Ox LDL进行口服实验，也完全没有提出用于口服耐受。
依照本发明用于口服给予的药用组合物是按照本身已经清楚的方法制备的，以及其给予也是按照已知的口服给予方法。
治疗前面描述的疾病的有效量取决于一些平常的因素，例如所述疾病的性质以及严重性和哺乳动物的体重对于口服给予，最好以单位剂量组合物的形式给予所述活性成分。
这些组合物是通过混合制备的，并适合于以片剂、胶囊、口服液体制剂、粉剂、颗粒剂等形式口服给予。
用于口服给予的片剂和胶囊通常呈现为单位剂量，并包括常规的赋形剂，如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、添味剂和甜味剂。片剂可以依照本领域的已知方法进行包衣。
可用的合适填充剂包括纤维素、甘露醇、乳糖和其他相似填充剂。合适的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉衍生物如淀粉羟基乙酸钠。合适的润滑剂包括例如硬脂酸镁。药学上可接受的合适润湿剂包括硫酸月桂酯钠。
这些固体口服组合物可以通过掺和、填充或压片的常规方法制备。重复的掺和操作可以使得活性剂均匀分散在使用了大量填充剂的那些组合物中。当然，这样的操作在本领域是常规的。
口服液体制剂可以是某些形式，例如水性或油性悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者是做为干粉，在使用前用水或其他合适介质重建。这些液体制剂可以包括一些常规添加剂，例如悬浮剂，如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂；乳化剂，例如卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸脂或阿拉伯胶；非水性介质(可以包括食用油)，例如杏仁油、分级椰子油、油性脂例如甘油脂、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯(proply)，以及如果需要，可以包括常规添味剂或着色剂。
口服形式也包括常规的缓释制剂，例如具有肠溶衣的片剂或颗粒剂。
优选实施方案的描述虽然在下列实施例中描述了本发明的某些优选实施方案，以便可以更全面理解和认识本发明的许多方面，但并不是要将本发明限制于这些特定的实施方案。相反地，它意图包括所有，可以包括在所附权利要求书中确定的本发明范围内的替代方案、修改方案和等同方案。因此，下面包括优选实施方案的实施例用来说明本发明的实施，应该理解，所显示的具体的实施例是作为实例，只是为了本发明的优选实施方案的解说性讨论，以及为了提供关于配制程序以及本发明原理和概念方面被认为是最有用而且容易理解的描述。
材料和方法动物12周龄的LDL-RD小鼠(C57BL/6J和129Sv品系的杂种)是通过同源重组产生的。小鼠购自Jackson实验室(Bar-Harbor ME)。当LDL-RD小鼠服用狗食具有高胆固醇水平(与人的值相似)，并且在食用高脂肪食物后发生明显的粥样动脉硬化，因此使用LDL-RD小鼠。给LDL-RD小鼠或者喂食包含4.5％(重量)脂肪(0.02％胆固醇)的正常狗食，或者喂食含有1.25％胆固醇、7.5％酪蛋白和0.5％(wt/)胆酸钠的致动脉粥样化饮食(Harlan，Teklad Premier Laboratory Diets，Madison，WI)。将小鼠保持在12小时光/12小时黑暗的周期中，而且允许它们随意接触到食物和水。
LDL的分离、氧化和特性鉴定空腹12小时后将用于脂蛋白分离的血液收集到EDTA(1mg/ml)中。用Kbr-调节密度后，用50型转子以50,000rpm/min制备性超速离心22小时，将LDL(密度＝1.019-1.063g/l)从血浆中分离出来。通过超速离心清洗LDL样品，在pH7.4、0.15mol/L的EDTA中透析，通过Acrodisc滤膜(孔径0.22μm)除去聚集体，然后保存于氮中，置于黑暗处。
LDL的氧化是通过将预透析的LDL(在无EDTA的PBS中的浓度为1mg蛋白/ml)与硫酸铜(10μM)一起在37℃温育24小时来进行。通过对硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)的分析可以确定脂蛋白的氧化，TBARS可以通过脂肪过氧化试验来测量丙二醛(MDA)相当物，也可以通过对脂蛋白的共轭双烯含量的分析来确定。
抗-Ox LDL抗体效价的测定预先制备天然LDL和铜氧化的LDL的制剂。将96孔聚苯乙烯酶标板(Nunc Maxisorp，丹麦)在4℃用Ox LDL、天然LDL(在PBS中浓度为5μg/ml)或PBS包被过夜。利用含有0.05％吐温和0.001％抑酶肽(Sigma，美国)的PBS清洗4次后，再用2％牛血清清蛋白(BSA)在室温下封闭酶标板2小时。血清部分按1∶50稀释到含有0.05％吐温和0.2％BSA的PBS中。酶标板在再温育过夜后，洗板，然后加入碱性硝酸酶缀合的山羊抗-鼠IgG(Jackson ImmunoResearch laboratory Inc.，美国)，按1∶10,0000稀释到含有0.05％吐温、0.2％BSA的PBS中，室温下保留1小时。在彻底清洗后，加入在含有1mM MgCl2pH9.8的50mM碳酸缓冲液中浓度为1mg/ml的对硝基苯磷酸(Sigma)作为底物。30分钟后加入1M NaOH终止反应。利用Titertek酶标仪(S.L.TLaboratory Instruments，Vienna，Austria)在405nm波长读数，结果以405nm的OD值显示。抗-Ox LDL抗体的效价通过从结合Ox LDL中获得的数值减去从结合天然LDL中获得的数值而计算出来。
进行抑制测定是为了确定抗-Ox LDL抗体的特异性，并检查与HSP-粥样动脉硬化中重要的免疫源的可能交叉反应性。确定达到最大结合Ox LDL一半的HSP-65免疫的小鼠血清的浓度，并应用浓度增加的不同抑制物(即HSP-65、Ox LDL、牛血清白蛋白)。
抗-HSP-65抗体的检测通过在4℃温育过夜将磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.2)中的重组HSP-65(1μg/ml)包被到平底96孔酶标板(Nunc Maxisorp，丹麦)上。用含0.02％吐温的PBS(0.02％PBS Tween)洗板后，再用含1％BSA的PBS封闭，然后按不同稀释度(1∶50、1∶100、1∶200，PBS中)加入血清，在室温下温育1小时。加入过氧化酶缀合的兔抗-鼠IgG(DakoLtd，HighWycombe，UK)，在室温下温育1小时，然后用PBS/Tween清洗4次。最后，加入含有0.53mg/ml 2，2-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Sigma)的枸橼酸盐磷酸缓冲液(0.1M，pH4.2)100μl，30分钟后利用Titertek酶标仪在490nm测定吸光率。
抗-磷脂抗体的检测利用改良ELISA对抗PL的小鼠和人抗体的反应性进行测定。利用阴离子PL[心脂质(CL)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)]和磷脂酰胆碱(PC)中任一种包被微量酶标板(Nunc Maxisorp，丹麦)，以上的所有试剂来自Sigma化学公司，St.Louis，Mo，浓度50μg/ml，除了PC(氯仿-甲醇，1∶3)外其余溶解于乙醇中。酶标板在真空中干燥并用含有0.5％明胶的TBS封闭。然后用TBS清洗酶标板三次，再将不同浓度的小鼠制品加入到用人β2GP1(5μg/ml，30分钟)或仅仅是0.1％明胶/TBS处理的酶标板孔内。利用羊抗-鼠碱性磷酸酶缀合物和加入底物(对硝基苯磷酸)来检测抗体结合。结果通过405nm的吸光率(OD405)显示。
抗-b2GP1抗体的检测在96孔聚苯乙烯酶标板(Nunc)中4℃过夜温育50mM碳酸氢盐缓冲液pH9.6中的1μg/ml β2GP1或不同的DM。用TBS清洗3次后，再用0.5％明胶/TBS封闭2小时(如抗-PL ELISA一样)。然后清洗酶标板3次，再加入鼠血清(按1∶100稀释到明胶/TBS中)，在室温下温育2小时。3次清洗后，加入分别稀释到0.1％明胶/TBS(1∶10,000)中的碱性磷酸酶缀合的羊抗-人IgG。再清洗3次后，加入在碳酸钠缓冲液pH9.8中的底物对硝基苯磷酸，在405nm测吸光率。
脾脏淋巴细胞的增殖测定处死时从小鼠中取出脾脏，然后分离淋巴细胞。在不同浓度的HSP-65、OxLDL、β2GP1或卵清蛋白存在下在微量酶标板中，在0.2ml培养基中培养三份平行的1×106个细胞/ml 72小时。通过在培养的最后12个小时内在DNA中[3H]胸腺嘧啶的掺入来测定淋巴细胞的增殖。结果通过刺激指数(S.I.)计算出来抗原平均cpm与缺乏抗原时获得的平均背景cpm之比。
细胞因子水平的检测小鼠处死后取出脾脏细胞，利用Ox LDL、HSP-65或卵清蛋白培养脾细胞3天，然后收集上清。检测在脾细胞培养上清中细胞因子分布型(IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β)。
实施例实施例1在这个实验中用到的小鼠被称为LDL-受体缺陷(LDL-RD)小鼠。这些动物具有导致全身细胞中LDL受体缺陷的遗传突变。该受体负责从循环中排泄和清除“有害的”胆固醇(LDL)，当该受体缺乏时，若给小鼠喂食3-5周的高脂肪食物，小鼠会患有高血脂症，并发生粥样动脉硬化。
使用3组小鼠(每组15只LDL-RD小鼠)。通过一个特殊的装置(导管)进行喂食，所述装置设计成将食物导入小鼠的食道，以确保食物基本上全部到达胃部。
第1组隔天给小鼠喂食5剂溶于PBS的1mg人Ox LDL。在最后一剂量结束时，给小鼠喂食高脂肪食物并在喂食3周或5周后处死。
第2组给小鼠喂食5剂溶于PBS的1mg对照蛋白(卵清蛋白)，然后给小鼠喂食所述特殊食物3周或5周。
第3组在开始所述饮食之前，不给小鼠喂食任何东西。
处死小鼠时评估小鼠粥样动脉硬化损伤的存在、血清胆固醇数值以及Ox LDL抗体水平。
结果在本研究之前及结束时所有的小鼠都具有相似的重量。我们发现喂食Ox LDL的小鼠产生的粥样动脉硬化要少(减少30％)。
在本研究中，已经显示出在小鼠中用Ox LDL的口服耐受对诱发粥样动脉硬化的有益作用。有许多结果指出口服耐受在各种自身免疫疾病中的效果的研究，例如胶原蛋白在佐剂性关节炎(类似于类风湿性关节炎)中的作用、在糖尿病中的作用、在眼色素层炎中的作用、在EAE(类似于多发性硬化症)中的作用。在以上提到的研究中已经进行了人体实验。最近在给患有风湿性关节炎的病人通过口服给予胶原蛋白II(口服耐受)时，注意到了一个显著的功效。在对各种自身免疫疾病的小鼠研究和人体研究之间具有相类似的功效，表明外推至人类可获得成功。应该强调的是这种治疗没有任何副作用。
实施例2在LDL-受体缺陷小鼠中通过喂食人Ox LDL抑制高脂肪食物诱发的粥样动脉硬化给LDL-RD小鼠(n＝15)喂食5个剂量(隔天)的3种不同浓度(1mg/剂量、100μg/剂量和1mg/剂量)的人Ox LDL。给另外的LDL-RD小鼠(每组n＝15)喂食对照抗原(相似剂量的卵清蛋白)。
在最后一次喂食的第2天，所有小鼠用高脂肪食物(“paigen”)攻击5周。
在实验的最后，检测所有小鼠的血清中抗-OxLDL抗体、抗-HSP65抗体和抗磷脂抗体是否存在，并进行脂质分布型的检测(总胆固醇、LDL、VLDL、HDL和甘油三脂)。
在研究的最后取出所有小鼠的心脏，使用前冷冻于-70℃(见“材料与方法”)。利用抗CD3、CD4、CD8的单克隆抗体、巨噬细胞、平滑肌细胞和淋巴细胞活化标记进行在恒冷箱切片上进行免疫组织化学研究。
利用Ox LDL的活性衍生物-LPC进行相似的喂食方案。
实施例3通过喂食HSP-65抑制结核分枝杆菌引起的粥样动脉硬化本发明人已经发现，用MT免疫一次的LDL-RD小鼠产生增强的早期粥样动脉硬化。
给LDL-RD小鼠(n＝15)喂食5个剂量(隔天)的3种不同浓度(1mg/剂量、100μg/剂量和1μg/剂量)的重组HSP65。给另外的LDL-RD小鼠(每组n＝15)喂食对照抗原(相似剂量的卵清蛋白)。
在最后喂食的第2天，所有的小鼠经过用在完全弗氏佐剂中乳化的MT热灭活悬浮液(10mg/ml、100μg/只)免疫来进行攻击。小鼠在用MT免疫后12周处死。
在实验的最后，检测所有小鼠的血清中抗-HSP65抗体是否存在，并进行脂质分布型的检测(总胆固醇、LDL、VLDL、HDL和甘油三脂)。
评估来自HSP-65耐受小鼠和喂食对照物小鼠的引流(draining)淋巴结细胞对HSP的增殖应答。
评估在从培养基收集的上清液中细胞因子(IL-4、IFN-γ、IL-10和TGF-β)的水平，在所述培养基中用HSP65体外诱发淋巴细胞。
从所有小鼠中取出心脏，于-70℃冷冻。为了确定粥样动脉硬化的程度，进行恒冷箱切片(每个切片5μm厚)。有关切片(来自主动脉窦区域)利用油红O染色，通过计算用方格网统计的区域就可确定粥样动脉硬化的程度。
利用抗CD3、CD4、CD8的单克隆抗体、巨噬细胞、平滑肌细胞和淋巴细胞活化标记进行关于恒冷箱切片的免疫组织化学研究。
实施例4通过喂食人b2GP1抑制粥样动脉硬化实验程序与用于Ox LDL和HSP65的程序相类似，而且基于用β2GP1免疫诱发早期粥样动脉硬化的观察。
粥样动脉硬化程度的评估通过计算主动脉窦内粥样动脉硬化脂肪纹损伤的大小(作一定的修正)，可以定量测定定所述损伤。简而言之，从动物中取出心脏和主动脉的上段切片，细心剥离外周的脂肪。上段切片包埋在OCT培养基中并冷冻。取整个主动脉窦(400μm)的每隔一个切片(10μm厚)进行分析。通过作为动脉与心脏连接点的3个瓣前尖来识别主动脉窦的远侧部。在用油红O染色后评估切片的脂肪纹损伤。一个不熟悉检测标本的观察者利用网格来统计每个切片的损伤。
在主动脉窦的水平来评估粥样动脉硬化程度。将组织进行加工和染色。通过Rubin EM、Kraus RM、Spanler EA等的修正方法(在转基因小鼠中人载脂蛋白AI抑制早期粥样动脉硬化.Nature 1991；353265-267页)来定量测定损伤区域。
粥样动脉硬化损伤的免疫组织化学mAbs大鼠单克隆抗体H129.19(L3T4)-抗-小鼠CD4+和S3-6.7(Ly-2)-抗-小鼠CD8a得自PharMingen(San Diego，CA，USA)；MCA497(F4/80)-抗-小鼠巨噬细胞得自Serotec(Oxford，UK)。
在主动脉窦5μm厚的冷冻切片中对CD4、CD8和巨噬细胞进行免疫组化染色。切片在甲醇中-20℃固定4分钟，接着用乙醇在-20℃温育10分钟。然后用非免疫山羊血清在室温下封闭切片15分钟，接着用CAS封闭剂在室温下温育30分钟。随后，加入抗-小鼠CD4/CD8的大鼠-单克隆抗体1小时。清洗后，在室温下加入亲和纯化生物素基化的兔抗-大鼠IgG抗体30分钟。清洗后，用0.3％H2O2温育玻片，接着再进行清洗，然后在室温下用链霉抗生物素蛋白-过氧化酶缀合物温育30分钟。清洗后，用3-氨基-9-乙基carbonasole(AEC)底物(Dako)对玻片进行显色15分钟。切片用苏木精复染。脾脏切片作为阳性对照。在缺乏第1或第2抗体的情况下染色作为阴性对照。
过继转移实验在每一个研究中都从耐受小鼠和非耐受小鼠中分离T-细胞(CD4或CD8细胞)，并把它们转移到将用致动脉粥样化食物攻击6周的LDL-RD同窝小鼠中。在实验的结束时取出心脏用于评估粥样动脉硬化和进行免疫组化分析。
对于本领域技术人员来说，显然本发明并非限制于前面的说明性实施例的细节，而且在没有违背本发明必要的特征的情况下，本发明可以体现为其他特定形式，因此，本发明的实施方案和实施例在所有方面都应该被要求认为是例证性的而不是限制性的，并且参考所附的权利要求书，而不是前面的描述，因此包括在所述权利要求书等同物的含义和范围之内的所有变化，都将包括在本发明中。
权利要求
1.用于预防和/或治疗选自心脏病发作、血管成形术-再狭窄和中风的疾病的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其含有治疗有效量的选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白、热休克蛋白60/65、β2-糖蛋白-1、其功能性衍生物和混合物的活性组分，该活性组分与药学上可接受的载体结合以便于口服给药。
2.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述疾病是心脏病发作。
3.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述疾病是血管成形术-再狭窄。
4.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述疾病是中风。
5.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述活性组分是修饰的低密度脂蛋白。
6.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述活性组分是氧化低密度脂蛋白。
7.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述活性组分是氧化低密度脂蛋白的功能性衍生物。
8.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述活性组分是热休克蛋白60/65。
9.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述活性组分是热休克蛋白60/65的功能性衍生物。
10.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述活性组分是β2-糖蛋白-1。
11.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述活性组分是β2-糖蛋白-1的功能性衍生物。
12.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述修饰的低密度脂蛋白是溶血磷脂酰胆碱。
13.权利要求1的诱导免疫口服耐受的药用组合物，其中所述修饰的低密度脂蛋白是丙二醛LDL。
全文摘要
公开了用于预防和/或治疗粥样动脉硬化的诱导免疫口服耐受的组合物，该组合物包含结合一种口服用药学上可接受载体的一种活性组分，所述活性组分选自修饰的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、热休克蛋白60/65(HSP 60/65)、β
文档编号A61K38/17GK1616085SQ200410011940
公开日2005年5月18日 申请日期1999年9月30日 优先权日1998年10月4日
发明者耶胡达·索恩菲尔德, 德罗尔·哈拉特斯, J·乔治 申请人:脉管生物生长有限公司