专利名称：一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物及其制备方法，属中药药品及制造技术领域。
背景技术：
单纯疱疹病毒(herpers simplex vinus，简称HSV)经口腔、呼吸道、生殖道粘膜和皮肤破损等多种途径侵入机体，可并潜伏在三叉神经节节细胞内、角膜细胞内或皮肤、粘膜表面。由HSV感染所引起的单纯疱疹性角膜炎(herpers simplex keratitis，简称HSK)是当今世界上危害严重的病毒感染性眼病之一，多类型、易复发，病程进展具有病毒，免疫等多途径、多环节因素相互作用，造成透明角膜被大量的新生血管、瘢痕组织所代替，继发葡萄膜炎、青光眼、细菌或真菌感染促成病情恶化，严重危害视功能，甚至引起失明。HSK的致盲率占角膜盲第一位，近年来随着抗生素、激素、免疫抑制剂广泛使用和艾滋病的增加，HSK更是居高不下，是除白内障外第二致盲眼病，严重危害人类健康，是世界性眼科棘手问题。
目前尚无有效控制该病的药物，西药无环鸟苷、碘苷、索利夫定、阿糖腺苷、曲氟尿苷、阿昔洛韦治疗时屡见耐药，不能有效控制复发，甚至在角膜移植后再发，而且有很多的不良的发应，类胆固醇皮质激素的应用造成免疫抑制、减少干扰素生成，促进病毒繁殖。详见陶佩珍在《抗疱疹病毒药物研究进展》(2003年中国新药杂志第12卷第四期P253-P257[中图分类号]R978.7[文章编号]1003-3734(2003)04-0253-05)。
从植物中提取具有抗菌抗病毒、调节免疫等活性成分具有毒副作用小、不易产生耐药性等优点。因此，从中药中医中发掘有效的治疗方法和药物已成为中国抗HSV-I活性成分研究的重要内容。
已有报道大黄、五倍子、丁香等中草药具有一定的抗HSV-I活性；2001年第19卷第7期P65-66《中药内服为主治疗单纯疱疹性角膜炎20例》一文中方选龙胆泻肝汤加减，方药龙胆、草泽泻，木通、柴胡、黄芩、生地、桅子、紫草、鱼腥草、甘草、水煎分早温服的中药汤剂治疗；用双黄连粉针剂进行超雾化眼浴法、静脉滴注、球结膜下注射治疗单纯疱疹性角膜炎已有临床或机理研究，双黄连粉针纯中药制剂，为金银花、连翘、黄芩等药加工制成的无菌针剂，但针对HSK这种多类型、易反复的眼病，未对眼粘膜和鼻粘膜直接给药，不能有效控制病灶的进一步恶化。
黄连解毒汤是清热解毒方中的经典方剂，该方由黄连(九克)、黄芩(六克)、黄柏(六克)、栀子(九克)四药组成，具有清热泻火解毒之功效，主治一切实热火毒、三焦热盛之证。对黄连解毒汤有效组分的药液进行体外抗病毒实验发现对疱疹病毒具有的抑制作用。
但上述中药汤剂都有见效慢、易贻误病情的缺点。而且至今还是没有认可的有效治疗手段和有效药物进入市场的抗HSV的中药制剂，如滴眼液制剂等。
依据传统中医学理论，用辨正和辨病结合的思路认识HSK“五轮学说”中黑睛(角膜)属风轮(肝)。本病主要是外受风热毒邪，内因肝经火热上壅，风火热毒搏击于黑睛；或湿热蕴结，夹风邪热毒结于黑睛；或阴亏水衰，风热犯肺，热邪传肝，循经上攻于黑睛而致“聚星障”。其病机演变规律是虚实相夹，征候特点是显露于外的实象(球结膜充血、角膜疱疹样病变、角膜上皮细胞发生凋亡)于隐伏于内的虚象(免疫功能紊乱或下降)共存，并互相影响，治疗不当可引起“花翳白陷”，治疗当“急则治其标，缓则治其本”。所以必须表本同治。
中药清热燥湿解毒泻火的要药黄连，《药性论》“黄连点赤眼昏痛，镇肝，去热毒”，现代药理研究黄连通过生物碱多种途径影响细菌、霉菌、病毒、沙眼衣原体达到抗生效果；具有显著抗炎活性使巨噬细胞激活，吞噬消化功能提高，并使激活的巨噬细胞呈定向趋化移动，到达补体活化部位呈趋化因子样作用；黄连中小檗碱具有杀灭、抑制对多种病原微生物、抗菌、抗病毒和抗炎作用，还具有增强网状内皮系统的吞噬能力、提高免疫力的作用。
龙胆草泻肝火、清湿热，入肝经，《医学启原》“龙胆，治两目赤肿睛胀，治眼中疾必用药也。”现代药理研究表明龙胆草煎剂对绿脓杆菌、金葡菌、石膏样毛菌等多种细菌、霉菌有抑制作用；其所含的龙胆碱抗炎作用强，能明显促进炎性细胞吞噬功能，巨噬细胞吞噬功能和淋巴细胞转化。
谷精草味辛，归肝经，疏风散热，明目退翳，近代利用其对绿脓杆菌等多种微生物的抗菌作用，对真菌的抑制作用；与龙胆配伍加强疏风泻热、清肝明目之功；《本草纲目》认为功用“主治目盲翳膜”，《本草正义》认为其“明目退翳之功，在菊花之上也”，谷精草药材除以谷精草为正品外，同属植物赛谷精草及白珠谷精草的带花茎的头状花序亦同等人药，冰片开窍散热，止痛明目，民间常以黄连煎水熬膏，入冰片少许点眼，《本草纲目》“能走能散，使壅塞通利，经络条达而惊热自平，疮毒能出”其味辛苦、性微寒、香窜善走，无处不到，能散郁火，通诸窍，它的特点是“病在深处用之，能引药深入病处”，中医认为冰片味辛、苦，性凉，归心、脾、肺经，有开窍醒神、清热止痛、生肌之功。《本草衍义》认为冰片“独行则势弱，佐使则有功”。近来研究证实，冰片能促进滴眼液穿过角膜进入前房，具有促渗作用。冰片具有抗菌、抗炎、止痛的功效，外用局部对感觉神经的刺激很轻，止痛温和的防护作用。冰片还有透过血脑屏障、促进药物透皮吸收、促进药物进入血脑屏障、促使药物体内浓度增高、提高生物利用度的作用。
发明内容
本发明的目的是针对HSK的病机和征候特点，利用中药材性能、经现代制药工艺加工，获得药效明显、加工科学的抗单纯疱疹病毒的药物组合物。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物，其特征在于是由下列主要原为组分组成a.黄连40～80重量份、b.龙胆草40～80重量份、c.谷精草30～70重量份、d.冰片0.5～2重量份上述原料优选为a.黄连55～65重量份、龙胆草55～65重量份、c.谷精草45～55重量份、d.冰片0.9～1.1重量份；更优选a.黄连60重量份、b.龙胆草60重量份、c.谷精草50重量份、d.冰片1.0重量份为了达到较好的疗效，所述的主要原料中c谷精草还可以为下列之一或者两者以及两者以上的混合物替代蝉衣、木贼草、栀子、野菊花、鱼腥草、白菊花、密蒙花。
所述的主要原料中b龙胆草还可以用大黄替代。
所述主要原料其药理上可替代的原料包括以下(1)栀子(2)野菊花(3)蒲公英(4)鱼腥草(6)密蒙花(7)黄芩(8)木贼草(9)黄芪(10)大黄(11)紫草(12)蝉衣(13)白菊花(14)大青叶。上述抗单纯疱疹病毒的药物组合物的制备方法，它包括下列步骤(a)按配比量称取原料黄连、龙胆草、谷精草、冰片；(b)将配比量的黄连加入4～8倍的0.1％～2％盐酸溶液，浸泡后，煎煮1.5小时，滤出煎液再加4～8倍的0.1％～2％盐酸溶液第二次煎煮，煎煮时间为1小时；合并两次煎液，过滤所得滤液减压浓缩至比重为1.12，制得浸膏A；将配比量的龙胆草和谷精草加水煎煮两次，加水以没过药面为宜，煎煮时间分别为1.5小时、1小时，合并两次煎液，过滤得滤液，滤液减压浓缩至比重为1.12，制得浸膏B；(c)合并步骤(b)中得到的浸膏A和浸膏B加乙醇至含醇量为65～75％，静置冷藏24～72小时。吸取上清液，减压回收乙醇至无醇味，加纯化水，调整PH值至7.0，冷藏12～48个小时，吸取上清液；(d)将配比量的冰片加1/3量表面活性剂供研，再加入纯化水搅匀，加入到步骤(c)得到的上清液，搅拌均匀，制得本发明药物组合物的活性成分；
(e)把步骤(d)得到的活性成分加入常规附加剂，制成各种试剂。
步骤(b)中所述的盐酸浓度范围为0.1～2％；优选0.5％，黄连还可以用浓度为1％～8％醋酸提取；或0.2％～1％的硫酸提取。龙胆草、谷精草加水煎煮时加水量以浸没药面为宜，通过正交实验得出第一次最佳煎煮时间为1.5小时、第二次最佳的煎煮时间为1小时。
步骤(c)中醇沉用量为8～12倍，最佳为10倍至混合溶液中含醇量为65％～75％，较优选70％。
步骤(d))中表面活性剂为中药制剂中常规的表面活性剂，用以增加冰片的溶解度，优选吐温-80。
上述原料经加工制取的活性成分，可以根据不同需要加入制备不同制剂时所需的各种常规辅料，如表面活性剂等以常规的中药制剂方法制备成各种剂型，如滴眼剂、鼻喷剂、膏剂等。
滴眼剂是本发明组合物的主要剂型，它可以采用下列步骤制备将步骤(e)中得到活性成分加纯化水至配制量，以每ml配制量加0.0005g加入尼泊金乙酯，用盐酸调节PH值到6～7，并用氯化钠溶液调节渗透压为7.4，以过0.8μm的微孔滤膜精滤两次，灌封于250ml盐水瓶中，100℃流通蒸汽消毒0.5～1小时，冷却后无菌分装到滴眼液瓶中，本发明以黄连、龙胆、谷精草、冰片为主要原料，具有清热燥湿、泻火解毒的作用，还可应用于具有热毒炽盛、湿热内壅证候的皮肤粘膜病变、痈肿疮毒、疗毒内功、耳目肿痛、咽喉红肿等细菌性疾病。
本发明药物组合物具有广普抗病毒作用，而且经抗SARS病毒药物活性筛选实验证明，还具有一定的抗SARS病毒和保护被感染细胞的活性作用。
本发明药物组合物的滴眼液，具有较好抑制HSK-I对角膜造成的损害，促进角膜病灶的修复，有利于缩短了病程，减轻角膜云翳的形成。在临床上对春季卡他性结膜炎、睑缘炎、泡性结膜炎等变态免疫、过敏性疾病有明显疗效，而且毒性低与其它的抗病毒药物无交叉耐药，可作为单纯疱疹性角膜炎的综合治疗药具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1(a)称取下列中药材作为原料黄连6kg、龙胆草6kg、谷精草5kg、冰片0.1kg。
(b)将黄连6kg加36L、0.5％的盐酸溶液煎煮两次，第一次煎煮时间为1.5小时、药渣再加30L、0.5％的盐酸溶液第二次煎煮，煎煮时间为1小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)的浸膏A，将龙胆6kg、谷精草5kg两味药加水煎煮两次，第一次煎煮时间为1小时，滤出煎液，药渣再加水第二次煎煮时间为0.5小时，每次加水以没过药面为宜，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)的浸膏B。
(c)合并步骤(b)的浸膏A和浸膏B加10倍量乙醇，至溶液中的含醇量达70％，静置冷藏48小时。吸取上清液，减压回收乙醇至无醇味，加适量纯化水调整PH值为7.0，冷藏24小时，吸取上清液。
(d)取冰片0.1kg加0.04L吐温-80供研，加入10L新鲜纯化水搅匀，加入(c)的上清液，搅拌均匀，加新鲜纯化水至100L；加入50g的尼泊金乙酯，用盐酸调节PH为6～7，氯化钠溶液调节渗透压约为7.4个大气压，调节至氯化钠含量达0.9左右的溶液为等渗溶液；精滤两次，灌封于250mL盐水瓶中，100℃流通蒸汽消毒30分钟，冷却后，经精滤(通过0.8μm的微孔滤膜)一次后，无菌分装至滴眼液瓶中。
实施例2(a)称取原料黄连4kg、龙胆草4kg、冰片0.05kg、鱼腥草4kg 白菊花4kg(b)鱼腥草4kg、白菊花4kg提取芳香水，取芳香水的量为20L。
黄连4kg用0.5％24L的盐酸溶液煎煮，第一次煎煮时间为1.5小时，滤出煎液，药渣再加20L的盐酸溶液第二次煎煮1小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成20℃时相对密度为1.12左右的浸膏A。
取龙胆4kg加水煎煮两次，加水量以浸没药面为宜，第一煎煮时间为1小时，滤出煎液，药渣第二次煎煮0.5小时，煎液过滤，滤液减压浓缩至20℃时，相对密度为1.12左右的浸膏B。
(c)取步骤(b)所得的浸膏A和浸膏B加乙醇至溶液的含醇量达70％，静置冷藏48小时。吸取上清液，减压回收乙醇至无醇味，加适量纯化水，调整PH值至7.0，冷藏24小时，吸取上清液。
(d)取0.05kg冰片加0.017L吐温-80供研，加入5L新鲜纯化水搅匀，加入(c)的上清液及(b)的芳香水，搅拌均匀，加新鲜纯化水至100L，加入50g的尼泊金乙酯，盐酸调节PH值为6～7、氯化钠溶液调节渗透压约为7.4个大气压，调节至氯化钠含量达0.9左右的溶液为等渗溶液；精滤两次，灌封于250ml盐水瓶中，100℃流通蒸汽消毒30分钟，冷却后，经精滤(通过0.8μm的微孔滤膜)一次后，无菌分装至滴眼液瓶中。
实施例3(a)称取以下中药材作原料黄连8kg 龙胆草8kg 冰片0.2kg 栀子8kg 野菊花8kg 蝉衣8kg(b)野菊花8kg提取芳香水，芳香水的量25L。
取黄连8kg用48L浓度为6％醋酸煎煮，第一次煎煮时间为1.5小时，滤出煎液，药渣第二次煎煮1小时，滤液减压浓缩成，相对密度为1.12左右(20℃)浓浸膏。
龙胆草8kg、栀子8kg、蝉衣8kg三味药加水煎煮，每次加水量为浸没药面为宜，煎煮时间为1小时、滤出煎液，药渣加水第二次煎煮0.5小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)的浸膏A。
(c)将步骤(b)所得浸膏A和浸膏B加乙醇，使溶液中的含醇量达75％，静置冷藏48小时。吸取上清液，减压回收乙醇至无醇味，加适量纯化水，调整PH值至7.0，冷藏24小时，吸取上清液。
(d)将冰片0.2kg加0.067L的吐温-80供研，加入10L新鲜纯化水搅匀，加入(c)的上清液及(b)的芳香水，搅拌均匀，加新鲜纯化水至100L，加入50g的尼泊金乙酯，盐酸调节PH值为6～7、氯化钠溶液调节渗透压约为7.4个大气压，调节至氯化钠含量达0.9左右的溶液为等渗溶液；精滤两次，灌封于250ml盐水瓶中，100℃流通蒸汽消毒30分钟，冷却后，经精滤(通过0.8μm的微孔滤膜)一次后，无菌分装至滴眼液瓶中。
实施例4
(a)称取下列中药材作为原料黄连5.5kg、龙胆草5.5kg、冰片0.09kg、密蒙花5.5kg、白菊花5.5kg(b)白菊花提取芳香水，取芳香水的量22L。
将黄连5.5kg用27L0.2％硫酸溶液煎煮，第一次煎煮时间为1.5小时，滤出煎液，药渣用25L硫酸溶液第二次煎煮1小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)的浓浸膏A。
取龙胆草5.5kg、密蒙花5.5kg加水煎煮，加水以没过药面为宜，第一次煎煮时间为1小时，滤出煎液，药渣加水第二次煎煮时间0.5小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)的浓浸膏B。
(c)将步骤b中所得浸膏A和浸膏B加乙醇，使溶液中含醇量达70％，静置冷藏48小时。吸取上清液，减压回收乙醇至无醇味，加适量纯化水，调整PH值至7.0，冷藏24小时，吸取上清液。
(d)取冰片0.09kg加0.03L吐温-80供研，加入10L新鲜纯化水搅匀，加入步骤c的上清液及步骤b的芳香水，搅拌均匀，加新鲜纯化水至100L，加入50g的尼泊金乙酯，盐酸调节PH值为6～7、氯化钠溶液调节渗透压约为7.4个大气压，调节至氯化钠含量达0.9左右的溶液为等渗溶液；精滤两次，灌封于250ml盐水瓶中，100℃流通蒸汽消毒30分钟，冷却后，经精滤(通过0.8μm的微孔滤膜)一次后，无菌分装至滴眼液瓶中。
实施例5(a)称取下列中药材作为原料黄连6.5kg、谷精草6.5kg、冰片0.11kg、大黄6.5kg。
(b)大黄6.5kg用52L浓度为60％的乙醇渗漉，渗漉液另存。
黄连6.5kg加39L0.1％的盐酸溶液煎煮，第一次煎煮时间为1.5小时，滤出煎液，药渣再加35L的盐酸溶液第二次煎煮1小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)的浸膏A。
谷精草6.5kg加水煎煮两次，加水以没过药面为宜，第一次煎煮时间为1小时，滤出煎液，加水第二次煎煮0.5小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)浸膏B。
(c)合并步骤b所得浸膏A和浸膏B，加乙醇使溶液的含醇量达65％，静置冷藏48小时。吸取上清液，加入步骤b的渗漉液混匀，减压回收乙醇至无醇味，加适量纯化水，调整PH值至7.0，冷藏24小时，吸取上清液。
(d)取冰片0.11kg加0.04kg吐温-80供研，加入20L新鲜纯化水搅匀，加入步骤c的上清液，搅拌均匀，加新鲜纯化水至100L，加入50g的尼泊金乙酯，分别用盐酸、氯化钠调节PH和渗透压，精滤两次，灌封于250ml盐水瓶中，100℃流通蒸汽消毒30分钟，冷却后，经精滤(通过0.8μm的微孔滤膜)一次后，无菌分装至滴眼液瓶中。
实施例6(a)称取下列中药材作原料黄连6.5kg、龙胆草5.5kg、谷精草5.5kg 冰片0.1kg(b)黄连6.5kg用36L 0.5％的盐酸溶液煎煮，第一次煎煮时间为1.5小时，滤出煎液，药渣加30L的盐酸溶液第二次煎煮1小时，煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)浸膏A，备用。
将5.5kg龙胆草、5.5kg谷精草两味药加水煎煮两次，每次加水以浸没药面为宜，第一次煎煮时间为1小时，滤出煎液，药渣加水第二次煎煮0.5小时；煎液过滤，滤液减压浓缩成相对密度为1.12左右(20℃)的浸膏B，备用。
(c)合并步骤b所得的浸膏A和浸膏B，加乙醇至溶液的含醇量达70％，静置冷藏48小时。吸取上清液，减压回收乙醇至无醇味，加适量纯化水，调整PH值至7.0，冷藏24小时，吸取上清液。
(d)冰片0.1kg加0.03L吐温-80供研，加入10L新鲜纯化水搅匀，加入步骤(c)的上清液，搅拌均匀，加新鲜纯化水至100L，加入50g的尼泊金乙酯，精滤两次，灌封于250ml盐水瓶中，100℃流通蒸汽消毒30分钟，冷却后，经精滤(通过0.8μm的微孔滤膜)一次后，无菌分装至鼻喷剂瓶中。
以下是本发明的药物制剂的试验例，以滴眼剂为例。
实验例1本发明滴眼液的急性毒性试验1.实验材料动物ICR小鼠，20只，雌雄各半，体重20～22g。由浙江省实验中心提供，雌雄分笼饲养，动物合格证浙实验动物准字(96)2001号。
药物本发明药物滴眼液，棕褐色液体，规格10ml相当于生药1.74g。
2.实验方法ICR小鼠20只禁食16小时后，灌胃给予本发明药物滴眼液40ml/kg体重，每隔5小时同样剂量灌胃给药1次，共3次，总剂量为每kg体重120ml，相当于每kg生药208.8g，观察给药后小鼠的毒性反应包括一般症状、外观、毛色、大小便、摄食状况、自主活动等以及7天内的死亡情况，并给药第七天称重。
3.实验结果小鼠给药后自主活动、毛色、外观、摄食均正常，首次给药5小时左右可见大便颜色加深，24小时后恢复正常，其它未见异常反应；在七天的观察期内未见有小鼠死亡，雌雄小鼠的体重均有增长，见表1。
表1本发明滴眼剂最大耐受量测定小鼠的体重变化(X±SD)
由实验得知，ICR小鼠口服本发明滴眼液40ml/kg3次，无明显的毒性反应，滴眼液小鼠口服的最大耐受剂量为120ml/kg，相当于生药208.8g/kg。
实验例2热毒清眼药水眼刺激性试验1.实验材料动物家兔，新西兰种，雄性，体重2.1-2.8kg，双眼正常，购自浙江省实验动物中心。
药物本发明滴眼液，杭州市中医院中药制剂室提供。
2.实验方法家兔4只，分别于一侧眼睛滴入滴眼液0.1ml，被动闭合10秒，在另一侧滴入生理盐水0.1ml作为对照，每天上下午各1次，连续7天。实验第2天起每日给药前观察角膜、结膜等部位的刺激反应，直至停药后1周。
按卫生部药政司主编的《中药新药研究指南》中的“眼刺激评分标准”进行评分，并换算成刺激反应等级
3.实验结果给予热毒清眼药水的4只兔眼未出现明显的刺激反应结膜无充血、无水肿、无分泌物；角膜无混浊；虹膜正常。根据《中药新药研究指南》反应分级均为0级。
热毒清眼药水每天两次，每次0.1ml给家兔滴眼，连续7天，未出现眼刺激症状，眼刺激综合平均分值为0分。可见热毒清眼药水多次给药无明显的刺激反应。
实验例3本发明滴眼液治疗单纯疱疹性角膜炎临床观察1、一般资料收治门诊108例，住院2例，共110例(170只眼)HSK患者，随机分组本发明药物滴眼液雾化治疗组，滴眼液滴眼组和阿普洛韦(无环鸟苷)滴眼对照组。
其中滴眼液雾化组50例(79只眼)男性15例，女性35例；年龄在12～84岁，平均(41.91±15.54)岁；本次实验前，病程最短2d，最长20年。
滴眼液滴眼组30例(46只眼)男性9例，女性21例；年龄13～76岁，平均(37.07±15.57)岁；本次实验前，病程最短3d，最长10年。
阿普洛韦(无环鸟苷)滴眼对照组30例(47只眼)男性10例，女性20例；年龄11～69岁，平均(36.73±15.62)岁；病程最短1d，最长12年。
2、诊断标准中药辩证和西医诊断标准，根据卫生部《新药(中药)临床研究指导原则》、《中医病证争端疗效标准》及《中医眼科学》(中医高等院校第5版教材)和《实用眼科学》(人民卫生出版社)，对单纯疱疹性角膜炎的诊断主要依靠病史和眼部检查确定。
中医诊断a.眼部症状①主证黑睛聚生星翳，色呈灰白；②兼证自觉眼内碜涩不适；羞明流泪；白睛红赤或抱轮红赤。
b.全身兼证①恶风发热、咽痛；②苔薄黄或黄；③脉弦数或浮数。
西医单纯疱疹性角膜炎诊断标准①有皮肤疱疹性损害或单纯性角膜炎病史；②近期有特定的上感、发热等复发因数；③病程多迁延，抗生素治疗无效，皮质激素使病情恶化；④角膜荧光素钠染色阳性，病灶出现树枝状、点状、星状、地图状等特殊形态；⑤角膜知觉减退。
3、实验方法①本发明滴眼液雾化组20ml加入402超声雾化仪雾化治疗，每次15min，2次/d本发明滴眼液滴眼组6次/d，每次2滴。
对照组0.1％阿昔洛韦眼药水滴眼，6次/d，每次2滴。
②三组均全身应用聚肌胞针剂5d，2ml/d，肌注；③疗程与随访10d为一疗程，3d复诊一次，治疗1～2个疗程，本实验观察15d；每组50％的病例随访4～12个月。
4、疗效判定标准参考《实用眼科学》、《中医病证诊断疗效标准》①痊愈刺激症状消失，结膜充血(-)，角膜病灶水肿浸润吸收，点状、树枝状、地图状溃疡愈合，荧光素染色(-)。
②显效刺激症状基本消失、结膜充血(-)，角膜病灶浸润消失，溃疡愈合，荧光素染色减少达2/3，但有轻微水肿，增厚不超过角膜全厚的1/5～1/4。
③有效刺激症状减轻，病灶缩小，溃疡面缩小，水肿浸润好转。
④无效全部症状及角膜炎的各项体征无改善，甚至加重。
中医症候疗效评定①临床痊愈全部症状和体征的积分消失至0。
②显效全部症状和体征显著改善，积分下降≥2/3。
③有效全部症状和体征均有好转，积分下降1/3～2/3之间。
④无效全部症状和体征未好转，积分下降＜1/3或无下降，甚至加重。
⑤疗效性指标以治疗前后的变化进行比较。
5、实验结果①总疗效见表2表2组治疗对单纯疱疹性角膜炎的总有效率比较(例)
Ridit分析本发明滴眼液雾化组与对照组相比＝3.39，P＜0.01；本发明滴眼组与对照组相比＝2.07，P＜0.05。
②主要症状疗效比较见表3表3
③随访情况对15组有效病例按4、8、12个月进行随访，结果见下表表4各组停药后随访情况
随访4个月，本发明滴眼液雾化组与本发明滴眼组的复发率均为0，对照组复发率为12.90％；随访8个月，本发明滴眼液雾化组复发率为3.70％，本发明滴眼液的复发率为14.29％，对照组的复发率为28.57％；随访12个月，本发明滴眼液雾化组复发率为8.00％，本发明滴眼液组复发率为14.29％，对照组复发率为45.45％。
④不良反应所有观察病例未见有不良反应，随机选择9例患者进行肝肾功能、血糖等有关指标观察，未发现有不良影响。
实验例4本发明滴眼液治疗变态反应性结膜炎临床观察1、一般资料收治门诊86例，春季卡他结膜炎53例，泡性结膜炎33例随机分组本发明药物滴眼液雾化治疗组和对照组。
其中滴眼液雾化组52例春季卡他性结膜炎31例，泡性结膜炎21例；男性37例，女性15例；年龄在7～32岁，平均(12.62±5.54)岁；本次实验前，春季卡他性结膜炎病程最短21天，最长4年，泡性结膜炎最短1天，最长19天。
对照组34例春季卡他性结膜炎22例，泡性结膜炎12例；男性24例，女性10例；年龄6～31岁，平均(12.97±6.22)岁；春节卡他性结膜炎病程最短19天，最长4粘，泡性结膜炎最短1天，最长20天。
2、诊断标准春季卡他性结膜炎，按照国家中医管理局颁布的《中医病证诊断疗效》中相关诊断标准确诊双眼奇痒，畏光流泪；睑结膜出现大而扁平的乳头及角膜附近结膜胶样增生，严重者可见角膜点状混浊；分泌物粘，结膜刮片有大量嗜酸性粒细胞；季节性周期性发作；临床上分睑结膜型、角膜缘型及混合型。
泡性结膜炎按照《眼科全书》中相关诊断标准定为结膜、角膜缘上皮下出现结节状损害(细胞浸润)；位于角膜中央时，才造成不同程度市里损害；根据病位不同分为泡性结膜炎、泡性角膜炎、泡性角结膜炎；可季节性交替反复发作。
3、治疗方法①本发明滴眼液雾化组本发明滴眼液10ml加入402超声雾化仪配合自制一次性眼罩，每次15分钟，每日1次。
对照组地塞米松注射液8万，同样加入402超声雾化仪配合自制一次性眼罩，每次15分钟，每次1次。
②疗程10天为一疗程，治疗2各疗程，至少每5天复诊1次。每日一次。
③随访每组每个病种约40％病例随访，春季卡他性结膜炎随访3年，泡性结膜炎随访1年。
4、疗效评判标准①春节卡他性结膜炎参照《中医病证诊断疗效标准》为治愈角结膜病变消退，眼痒消除。好转角结膜病变缓解，眼痒减轻。未愈角结膜病变，眼痒无好转。
②泡性结膜炎治愈角结膜上皮下结节样病变消退，充血吸收。好转角结膜上皮下结节样病变缓解，充血减轻。未愈角结膜上皮下结节样病变、充血无好转5、实验结果见表5、表6、表7、表8，计量资料用t检验，计数资料用x2检验表5本发明滴眼液雾化治疗变态反应性结膜炎的总疗效组别例数治愈好转未愈治愈率％好转率％
治疗组523713271.1596.15对照组341615347.0691.18合计 8653285治愈率x2＝4.08 p＜0.05表6本发明滴眼液雾化治疗春季卡他性结膜炎和泡性结膜炎的疗效
春节卡他性结膜炎治愈率x2＝5.78 p＜0.05泡性结膜炎治愈率x2＝0.83 p＞0.05表7两组病人治愈时间比较
表8春节卡他性结膜炎治愈病人随访情况
x2＝4.11 p＜0.05实验例5本发明滴眼液外用治疗眼面部带状疱疹的疗效观察1、一般资料随机选择病房眼、颜面部带状疱疹(HZ)患者75例，分为2组治疗组和对照组其中治疗组37例；男性19例，女性18例；年龄在28～82岁，平均(56.32±15.84)岁；病程最短1～9d，平均4.41±1.64d；右眼23例，左眼14例；并发角膜炎22例，并发虹膜炎16例，并发巩膜炎3例。
对照组38例；男性19例，女性19例；年龄在26～80岁，平均(55.03±16.61)岁；病程最短1～9d，平均4.50±1.61d；右眼19例，左眼19例；并发角膜炎21例，并发虹膜炎15例，并发巩膜炎4例。
2、诊断标准依据《临床皮肤病学》成族水疱，沿神经分布，排列成带状，单侧性及有明显的神经痛等特点。并发角膜炎；球结膜充血、水肿，角膜上皮混浊、疱疹、溃疡。并发虹膜炎；角膜后kp+、前房tyn+、瞳孔缩小、对光反应迟钝或消失。
3、治疗方法①治疗组用本发明滴眼液滴眼每2小时1次，每次1滴；眼睑、颜面部皮肤用消毒纱布5层浸本发明滴眼液湿敷，每次0.5小时，保持纱布湿润，每d6次；对照组用0.1％无环鸟苷眼药水滴眼，每2小时1次，每次1滴，皮肤用季德胜蛇药外涂，每日多次。继发性虹膜炎或巩膜炎加0.02％氟美瞳眼药水，每日滴眼4次，每次一滴；继发性青光眼加用0.25％噻吗心安眼药水，每d2次，每次1滴。两组均用中药双黄连注射液静脉滴注，每d3g，加入500ml生理盐水中。
②观察方法分别在治疗后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21d观察1次。观察指标皮疹停止出现新发疹时间；皮疹全部干涸时间；皮疹全部结痂时间；完全止痛时间；有无后遗神经痛(皮疹结痂后疼痛，属后遗神经痛)。
眼部症状畏光、流泪、刺痛等刺激症消失时间；上皮性角膜炎或基质性角膜炎、盘状角膜炎消失时间；虹膜炎消失时间。
4、疗效标准痊愈用药8d内，随后遗神经痛外，颜面部、眼睑疱疹，并发角膜炎、虹膜炎症状、体征全部消失；有效用药8d内，除后遗神经痛外，颜面部，眼睑疱疹，并发角膜炎好转，虹膜炎减轻；无效用药8d内，除后遗神经痛外，颜面部、眼睑疱疹、并发角膜炎、虹膜炎症状、体征无明显好转。
5、实验结果见表9、表10、表11、表12、表13表9两组总疗效n 痊愈例数有效例数无效例数治疗组37 30 70对照组38 21 17 0x2＝4.62 *p＜0.05表10本发明滴眼液与对照组治疗眼睑面部皮肤HZ疗效比较例数新疹停发时间皮疹干涸时间皮疹结痂时间完全止痛时间治疗组37 1.19±0.52 1.97±0.60 2.89±0.52 5.43±3.36对照组38 2.24±0.91 3.21±0.70 4.84±1.10 11.32±4.92t值 6.114 8.227 9.776.04P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01表11本发明滴眼液与对照组治疗HZ角膜炎疗效比较例数眼数(只)刺激症状消失时间角膜炎体征消失时间治疗组22 22 5.20±1.36 5.66±1.86对照组21 21 7.27±1.35 8.35±1.84t值 6.276.44P值 ＜0.01 ＜0.01表12本发明滴眼液与对照组治疗HZ继发虹膜炎疗效比较例数眼数(只)刺激症状消失时间虹膜炎体征消失时间治疗组16 16 5.06±1.06 6.13±0.96对照组15 15 6.46±1.88 7.20±1.66t值 2.572.21P值 ＜0.05 ＜0.05表13本发明滴眼液与对照组治疗眼面部分组 n 后遗神经痛无后遗神经痛治疗组371 36对照组383 35*P＞0.05实验例6本发明滴眼液体外抗I型单纯疱疹病毒药效实验
1、一般材料①单纯疱疹病毒 冻干HSV-I 168株，来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。
②药物本发明滴眼液每毫升含生药材174mg，使用时离心20min后弃沉淀，取上清液。
对照药物阿昔洛韦滴眼液武汉武警制药厂制备③细胞猪肾传代细胞株(IBRS-2)，浙江省医学科学院生物工程研究所病毒室保存。传代时经胰酶消化后加入生长液吹打分散使细胞数为5×10-5个/ml，加入于96孔微量板，每孔100 l置5％～7％CO2培养箱，37℃静置，24～48h长成单层。
④培养液，以含10％小牛血清的Eagla`s和LH作IBRS-2细胞培养液，病毒维持液含2％小牛血清。
2、实验方法①病毒病种传代和病毒毒力的测定病毒株经无血清Eagla`s液溶解，接种于IBRS-2细胞，复壮三代后的病毒液部分置于液氮灌，余存-30℃。使用时在细胞培养内传代增毒，待病毒毒力稳定后收取病毒培养供试验用。用维持液将病毒毒力稳定后收取病毒培养供试验用。用维持液将病毒10-1～10-6稀释成6种浓度，分别加入96孔培养板内，每个浓度接种3孔，100l/孔，吸附30min，洗3次，加入培养液，37℃5％～7％CO2孵育，逐日观察病毒致细胞病变作用(CPE)，供6天，并测定半数感量(TCID50)。设细胞对照。
②药物细胞毒性测定取本发明滴眼液用维持液2倍稀释成1∶10(17000mg/L)、1∶20(8500mg/L)、1∶40(4000mg/L)、1∶80(2000mg/L)、1∶160(1000mg/L)、1∶320(500mg/L)6种稀释度，分别加入于已长成单层细胞的微量板内，每孔100l，37℃5％～7％CO2培养7d，逐日镜检，观察细胞病变。测定药物半数毒性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。设细胞对照。
③对照药物阿昔洛韦滴眼液毒性测定取阿昔洛韦滴眼液用维持液稀释成1∶10(100000g/L)、1∶100(10000g/L)、1∶200(5000g/L)、1∶1000(1000g/L)4种稀释度，以下操作同②④本发明滴眼液抗HSV-I作用，参照《药物实验方法学》中关于抗病毒作用的检测方法进行。
最大无毒浓度滴眼液抑制不同浓度的HSV-I病毒液的致CPE作用将100TCID50(10-3)和TCID50(10-4)HSV-I病毒液分别感染96孔微量板上已长成单层的IBRS-2传代细胞上，37℃5％～7％CO2吸附30min，吸出病毒，洗3次，弃去毒液；加入最大无毒浓度药液，每一病毒稀释孔各加4孔。分设病毒、细胞、药物、阿昔洛韦对照组。37℃5％～7％CO2孵育3天，逐日镜检，观察CPE。
不同浓度的本发明滴眼液对HSV-I致CPE的抑制作用经稀释的待测药物，加入10TCID50HSV-I毒液作为试验组，每一药物浓度各加4孔；设药物(药物浓度与试验组一致)、HSV-I、细胞对照组。最后测定本发明滴眼液的ID50。
检测方法及细胞病变判定标准细胞攻毒(或加入药物)后，逐日观察CPE。正常IBRS-2细胞形态呈梭形，攻毒后细胞出现退行性变化；肿胀、变圆，见到巨细胞和融合细胞。分五级①0级(-)4孔均无CPE，分值为8分；②1级(+)25％以下细胞出现CPE≥2孔，分值为6分③2级(++)5％-50％细胞出现CPE≥2孔，分值4分；④3级(+++)50％-75％细胞出现CPE≥2孔，分值2分；⑤4级(++++)75％以上细胞出现CPE≥2孔，分值0分。
3、实验结果①疱疹病毒I(HSV-I)的毒力HSV-I致IBRS-2细胞病变作用在细胞维持液不产生细胞病变条件下10-1～10-3三种病毒稀释度于接种第一天即使细胞出现大量特异性病变细胞肿胀、变圆、折光增加、空泡形成、靶标状；10-4HSV-I稀释药液于接种后第一天部分细胞出现病变；10-1～10-5五种稀释药液在接种第二天都出现典型细胞特异性病变；而10-6药液已经无毒力。
病毒效价的最高稀释度出现50％组织感染剂量HSV-I TCID50为5.5。
②本发明滴眼液药物对IBRS-2细胞的毒性观察4d，高于4000000g/L浓度的本发明滴眼液对细胞有不同程度的毒性。其半数毒性浓度(TC50)是4000000g/L。最大无毒浓度(TC0)2000000g/L。
③阳性对照药阿昔洛韦滴眼液毒性观察4d结果表明，阿昔洛韦浓度100000g/L(1∶10)、10000g/L(1∶100)对细胞有毒性，5000g/L为该药的最大无毒浓度。
④本发明滴眼液在细胞培养内抗HSV-I作用
a.本发明滴眼液抑制不同浓度的HSV-I病毒液的致CPE作用见表14，本发明滴眼液(2000000g/L生药)对感染100TCID50、10TCID50HSV-I病毒液的IBRS-2细胞致CPE具有很强抑制作用，加药后细胞未出现任何特异性细胞病变，统计学分析与阿昔洛韦相比差异无显著性(P＞0.05)。
表14 10TCID50与100TCID50HSV-I病毒攻击细胞后加药实验试验方法10TCID50HSV-I组 100TCID50HSV-I组观察天数 观察天数1 2 3 1 2 3药物+HSV-I - - - - - -HSV-I对照 + ++++ +++++++阿昔洛韦+HSV-I - - - - - -药物对照- - - - - -阿昔洛韦对照- - - - - -细胞对照- - - - -b.不同浓度本发明滴眼液对HSV-I致CPE抑制作用见表15，本发明滴眼液4000000～63000g/L对HSV-I致CPE具有非常有效的抑制作用，高于2000000g/L、1000000g/L药物浓度的药效，与不加病毒的药物组对细胞的作用相同，两者差异无显著性，在1∶40～1∶1280的对照组稀释范围内疗效与浓度呈负相关，这与药物的细胞毒性有关。
表15不同药物浓度的药物对HSV-I致CPF抑制作用药物浓观察天数积分t值 p值组别 度mg/l1234567试验组4000 --+++ +++ ++++ ++++ 4.00±3.46药物对(1∶40) --+++ +++ ++++ ++++ 4.00±3.46 0＞0.05照组HSV-I -+++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 1.42±2.99 1.49 ＞0.05对照试验组2000 ----++++ +++++ 5.71±3.35药物对(1∶80) ----+++ ++++ 6.00±3.05 0.17 ＞0.05照组HSV-I -+++ ++++ ++++ -+++ ++++ ++++ 1.42±2.99 2.53 ＜0.05对照试验组1000 -----++ ++++ 6.28±3.15药物对(1∶160 - ---++ ++6.86±1.95 0.41 ＞0.05照组 )
HSV-I- +++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++ 1.42±2.992.96 ＜0.05对照试验组 500 - ----+++6.86±2.27药物对 (1∶320 - -----++7.43±1.510.55 ＞0.05照组 )HSV-I- +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 1.42±2.993.83 ＜0.01对照试验组 125 - ----+++7.14±1.57药物对 (1∶640 - ------ 8.00±0.000.67 ＞0.05照组 )HSV-I- +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 1.42±2.994.48 ＜0.01对照试验组 63 - ------ 7.43±1.51药物对 (1∶128 - ------ 8.00±0.000.10 ＞0.05照组0)SV-I - +++ ++++ ++++ +++ ++++ ++++ 1.42±2.994.75 ＜0.01对照细胞对 - ------照本发明滴眼液的ID50≤63000g/L，本发明滴眼液有可能直接杀灭HSV-I或阻止HSV-I对细胞的粘附和侵入、复制作用。而且毒性较低；最大无毒浓度为2000000g/L，阿普洛韦为5000g/L。
实验例7本发明滴眼液抗SARS病毒活性筛选实验1、检测原料本发明滴眼液国家新药刷选中心样品号S00842病毒株BJ-01(来源北京军事科学院微生物流行病研究所)2、检测方法检测样品处理样品溶于培养液或DMSO，配成适宜的初始浓度，5倍稀释，3个稀释度把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％CO2培养，SARS病毒感染细胞后，分别加入不同稀释浓度的样品，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录CPE，并用中性红染色测定OD值，参照对照进行样品抗SARS病毒活性作用的计算和评价。
3、检测结果检测结果见表16，在100g/ml浓度时见有一定的抗SARS病毒、保护被感染细胞的活性作用。
表16最终浓度(稀释率) CPE 细胞保护率(EC_)％ 细胞毒性率(CC_)％10％ +++27 272％ ++++ 0 00.4％ ++++ 0 0说明以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试本发明滴眼液抵抗病毒感染细胞的作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及感染细胞保护力细胞病变法(CPE)以“-”表示细胞附着形态完整，未见有明显的脱离，但不比较细胞数量的多少；以“+”表示细胞病变程度，＜25％+，25％～50％++，50％～75％+++，＞75％++++。
被感染细胞保护率通过比较病毒对照、细胞对照和样品对照的OD值，计算样品对病毒感染细胞的保护活性，保护率＞EC20初步认为本发明滴眼液对被病毒感染的细胞具有一定保护作用，有抗病毒活性。
权利要求
1.一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物，其特征在于主要由下列重量份的原料组成a.黄连40～80份、b.龙胆草40～80份、c.谷精草30～70份、d.冰片0.5～2份。
2.如权利要求1所述的抗单纯疱疹病毒的药物组合物，特征是所述的原料优选用量为a.黄连55～65重量份、b.龙胆草55～65重量份、c.谷精草45～55重量份、d.冰片0.9～1.1重量份。
3.一种如权利要求1或2所述的一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物的制备方法，它包括下列步骤(a)称取黄连、龙胆草、谷精草、冰片，备用；(b)黄连用4～8倍量的0.1～0.8％盐酸溶液煎煮两次，每次煎煮时间为1.0～1.5小时，合并煎液，过滤得滤液；滤液浓缩，制得浸膏A；龙胆草和谷精草加水煎煮两次，每次煎煮时间为1.0～1.5小时，合并两次煎液，过滤得滤液；滤液浓缩，制得浸膏B；(c)合并浸膏A和浸膏B，加乙醇至含醇量为65～75％；静置冷藏24～72小时，吸取上清液，回收乙醇；调整PH值至7.0，冷藏12～48个小时，吸取上清液；(d)冰片中加入表面活性剂，然后用纯化水搅匀；冰片溶液加入到步骤(c)得到的上清液，拌匀，制得活性成分；(e)在步骤(d)制得的活性成分中加入常规附加剂，制成制剂。
4.如权利要求3所述的一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物的制备方法，其特征是步骤(b)中盐酸溶液浓度为0.5％为佳。
5.如权利要求3所述的一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物的制备方法，其特征是步骤(c)中加乙醇至含醇量为70％为佳。
6.如权利要求3所述的一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物的制备方法，其特征是步骤(d)中的表面活性剂选用吐温-80。
7.一种如权利要求3所述的药物组合物的制备方法，特征是将步骤(d)中制取得到的活性成分，加尼泊金乙酯，经纯化水配制，盐酸调节PH，氯化钠溶液调节渗透压，经微孔滤膜精滤，常规制备滴眼液。
全文摘要
本发明公开一种抗单纯疱疹病毒的药物组合物及其制备方法，属中药药品及制造技术领域。组合物主要由黄连、龙胆草、谷精草、冰片按一定重量配比，制取活性成分，制得的活性成分具有清热燥湿、泻火解毒的作用，它可以制备成滴眼剂、鼻喷剂、膏剂。应用于有热毒炽盛、湿热内壅证候的皮肤粘膜病变、痈肿疮毒、疗毒内功、耳目肿痛、咽喉红肿等细菌性疾病。滴眼液作为药物组合物主要剂型具有较好抑制HSK－I对角膜造成的损害，可作为单纯疱疹性角膜炎的综合治疗药。
文档编号A61P31/22GK1663585SQ20041001680
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月5日 优先权日2004年3月5日
发明者钟良玉, 陈红梅 申请人:杭州市中医院