专利名称：一种抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂的制作方法
技术领域：
本发明属中药制药领域，具体涉及一种抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂。该复方制剂由一定比例的大黄素、苦参总生物碱和姜黄总色素组成。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackie virus)属小RNA病毒科的肠道毒属，在人群中感染十分普遍，与多种人类疾病有着十分密切的关系，如病毒性心肌炎、慢性胰腺炎、慢性疲劳综合症、慢性肾炎、心律失常、I型糖尿病等。据统计，全世界每年心肌炎患病率为5～8个/10万，25％～50％急性心包炎患者，36％～65％急性心肌炎患者有近期或复发的CVB感染。由于缺乏有效的治疗药物，许多患者演变为慢性扩张性心肌病，最后死于心力衰竭。
人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和单纯疱疹病毒II型(HSV-II)。HSV-I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。HSV-II型主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。生殖器疱疹是主要由HSV-II引起的性传播病，疱疹病毒存在于皮肤和粘膜损害的渗出液、精液、前列腺分泌液、宫颈、阴道分泌液中，主要通过性交传染，引起原发性生殖器疱疹。原发性生殖器疱疹消退后，残存的病毒经周围神经沿神经轴长期潜存于骶神经节，当机体抵抗力降低或某些激发因素如发热、受凉、感染、月经、胃肠功能紊乱、创伤等作用下，可使体内潜伏的病毒激活而复发。本病发病率高，可通过胎盘及产道感染新生儿，导致流产及新生儿死亡，与宫颈癌的发生也有关，危害较大，又无特效疗法，已受到人们的重视。因此，生殖器疱疹已被卫生部列为重点防治的8种性病之一。
大黄素(emodin)化学名为1，3，8-三羟基-6甲基蒽醌，分子量为270.23。大黄素作用非常广泛与作用器官的肌肉蛋白结合而表现胆碱能的作用，抑制水分从肠腔转运至细胞，使水分滞留在肠腔，从而刺激大肠而利于排便；能使血清透明质酸及层粘连蛋白显著降低，肝组织纤维化程度明显改善，肝细胞损伤减轻；能抑制胰腺激肽释放酶、胰蛋白酶等，参与胰腺组织的再生和修复；能抑制组胺诱导的血管收缩反应；能抑制苯肾上腺素诱导的豚鼠胸主动脉环血管收缩反应；对血管平滑肌细胞增殖也有抑制作用；有较强的竞争性抑制肾髓质Na+-K+-ATP酶的活性，从而起到利尿作用；能促进人肺鳞状细胞癌细胞和人肺非小细胞癌细胞的凋亡，对人口腔鳞状细胞癌和唾液腺肿瘤细胞有较强的细胞毒性；可抑制脂多糖刺激的大鼠腹腔巨噬细胞分泌的TNF-a；可以抑制炎症反应中的NO的大量合成和释放；具有显著的抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、链球菌、肺炎球菌、幽门螺杆菌等均有效；还具有较好的抗病毒的效果。
姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等根茎中提取的一种天然有机成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等多种药理作用。姜黄素对多种肿瘤如结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、白血病等的癌细胞的产生、增殖、转移均具有抑制作用，诱导肿瘤细胞凋亡；可以阻止直肠瘤细胞DNA的错配修复，可以阻碍致瘤因素的侵袭，通过抑制细胞色素P450酶的活性和提高谷胱苷肽转化酶来达到其抗瘤作用；可以通过减少中性粒细胞的浸润、抑制脂质过氧化反应、降低丝氨酸活性抑制结肠细胞的炎症反应，对急性、亚急性、慢性炎症均有抑制作用；姜黄素分子中的酚羟基使其具有较强的抗氧化作用，可抑制脂质的过氧化反应、降低胆固醇，对小鼠脑、心、肝、肾、脾等重要脏器都具有非常明显的抗氧化作用；姜黄素还具有免疫抑制作用；姜黄素对实验性高脂血症大鼠有降血浆和主动脉中总胆回醇和甘油三酯的作用，可以促进脂蛋白(a)的代谢而达到降脂、减肥、抗动脉粥样硬化的作用；姜黄素具有体外抗革兰氏阳性菌活性以及沙门氏菌毒性，甚至具有一定的抗HIV的活性；姜黄素无明显的急性和长期的毒性作用，甚至可以调节肿瘤细胞的多药耐药性，减轻细胞毒性。
苦参碱(kushenin)是一类含有苦参次碱15酮基本结构的化合物，主要从苦参根及苦豆子中提取，其中氧化苦参碱含量在98％以上。具有抗炎、免疫抑制、抗心率失常、抗病毒和抗寄生虫等作用。近几年的临床研究结果显示苦参碱最主要的药理作用为抗乙型肝炎病毒和对肝脏的保护作用。苦参碱对乙型肝炎病毒的复制具有较强的抑制作用，对感染后免疫系统具有双向调节作用，阻断肝细胞的异常凋亡，抑制肝内胶原合成以及显著的抗肝纤维化作用。
发明内容
大黄素，经前期研究已经发现具有较强的抗科萨奇病毒的活性，但是也存在较大的细胞毒性，既有关于诱导癌细胞凋亡、抗肿瘤的报导，又有可疑的致癌作用。我们根据中药复方配伍减毒增效的理论，选择姜黄素、苦参碱和大黄素配伍。姜黄素、苦参碱均有一定的抗病毒的活性，同时苦参碱的细胞毒性很小，姜黄素具有保护细胞、减低细胞毒性的功效，二者都有抗肿瘤作用。实验证实这样的配伍用药有较好的抗病毒作用，同时也降低了大黄素的细胞毒性和用量。
本发明通过以下技术方案实现体外抗病毒实验1、实验材料大黄素、姜黄素、苦参碱分别由本实验室提供；Hep-2细胞，由武汉大学医学院病毒所保存；CVB3(Nancy株)、HSV-I、HSV-II由武汉大学医学院病毒所保存。
2、方法
2.1药物对细胞的毒性测定取已经生长成单层Hep-2细胞的96孔培养板，弃去培养液，加入不同组成、不同浓度的药物培养液，37℃ 5％ CO2培养72h，每12小时观察细胞形态，并与正常细胞作对照，MTT法检测细胞活性。结果显示大黄素对细胞的毒性最大，苦参碱对细胞毒性最小，大黄素与苦参碱、姜黄素进行配伍后，细胞毒性明显降低。其最佳配比为大黄素提取物5～50、苦参类生物碱5～50、姜黄总色素0～50。
2.2药物体外抗病毒实验根据病毒的复制周期，设计三个药物抗病毒作用途径，分三个处理组，同时根据药物细胞毒性实验的结果，以最佳配比在最低有效浓度和半数毒性浓度之间确定5个药物终浓度进行实验。
①药物抗病毒吸附组 将不同的组成和浓度的药物培养液加入生长完好的单层Hep-2细胞培养板中，37℃，5％CO2孵育1.5h后，弃去含药培养液，再加入病毒液，37℃，5％CO2孵育1.5h后，弃去病毒液，再加入普通细胞维持液继续培养。经72h的观察，各孔细胞均出现典型的病毒病变，即CPE症状细胞生长紊乱，细胞状态变形，颗粒增多，折光性增加，最后脱落死亡。说明病毒在Hep-2细胞中的繁殖不受抑制，各组药物均无抗病毒吸附作用。
②药物直接作用组 将不同组成和浓度的药物培养液和病毒液同体积混合37℃孵育1.5h后，再加入生长完好的单层Hep-2细胞培养板中，37℃，5％CO2孵育1.5h后，弃去含药含病毒培养液，再加入普通细胞维持液继续培养。结果显示各药物组分均具有一定的抑制感染细胞病变的作用，即各组分都具有直接杀死CVB3或HSV病毒的效力。
③药物抗病毒生物合成组 将病毒液加入生长完好的单层Hep-2细胞培养板中，37℃，5％CO2孵育1.5h后，弃去病毒液，再加入不同组成和浓度的药物维持液继续培养。结果显示各组分均具有一定的抑制感染细胞病变的作用，即都具有抑制病毒在细胞内生物合成的效力。
从以上结果看出大黄素虽然具有一定的直接杀死CVB3、HSV病毒和抑制CVB3、HSV病毒在细胞内的生物合成的效力，但是其细胞毒性较大。姜黄素虽然细胞毒性比大黄素要小一些，但是其抗病毒效力却不如大黄素。苦参碱的细胞毒性非常小，具有一定的抗病毒的能力。经过配伍以后，大黄素的细胞毒性明显减低，并且其直接杀死CVB3、HSV病毒和抑制CVB3、HSV病毒生物合成的作用也增强了。
3、体内抗CVB3病毒实验3.1实验材料根据体外抗病毒实验，选取抗病毒效力最好的配比进行体内抗病毒实验；4周龄雄性小鼠，体重(18±2)g，购于湖北省实验动物中心
3.2实验方法①药物对小鼠的急性毒性实验将50只雄性小鼠随机分成5组，每组10只，不同药物浓度灌胃，记录小鼠72小时的死亡情况，计算其LD50为850mg/kg。
②动物模型的建立4周龄雄性小鼠30只，注射部位消毒后，腹腔注射CVB3病毒液0.1ml，每天观察小鼠的发病及死亡情况，并作记录。2～4天小鼠出现活动减少、倦缩、体重减轻、紫绀等症状，6天后开始出现规律性死亡，说明造模成功。
③体内抗病毒实验随机将100只小鼠分成5组，每组20只，分别设立药物治疗高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药物对照组和生理盐水对照组，于病毒感染后24h开始治疗，同时另设立正常动物对照10只。各治疗组动物于CVB3感染10d后处死5只，摘除眼球后取血分离血清，并无菌操作取动物心、肝、脾、肾等脏器。各组小鼠脏器经10％甲醛固定、石蜡包埋、连续切片、HE染色、镜下观察，并记录病灶数。按常规方法，小鼠脏器无菌匀浆后接种于Hep-2细胞，测定病毒滴度。
表1 CVB3病毒感染小鼠存活率比较
表2药物治疗CVB3病毒感染小鼠组织中病毒滴度(logTCLD50/0.1ml)比较
以上结果说明该药物组合能显著减轻小鼠发病症状，延长其生存天数，降低死亡率；抑制小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器中病毒增殖，使这些脏器中感染性病毒滴度下降，特别是对心肌细胞病理损伤的减轻。本发明确定的该药物确为抗科萨奇病毒最佳药物配方。
4、体内抗HSV病毒实验4.1实验材料根据体外抗病毒实验，选取抗病毒效力最好的配比进行体内抗病毒实验；Dunkin-Harthey白毛豚鼠，体重300~350g，雌性，购于湖北省实验动物中心。
4.2实验方法①动物病毒接种方法戊巴比妥钠将豚鼠麻醉，背部脱毛，清洁，无菌操作。在裸露皮肤的中心区注射病毒液0.02ml。麻醉后，动物保存在30℃环境中2小时。观察皮肤感染情况。
②体内抗病毒实验随机将20只豚鼠分成2组，每组10只，为药物治疗组和对照组，于接种病毒24h开始治疗，用微量加样器加0.03ml药物于各自对应的皮区上，涂抹于感染部位，至药物干燥为止。每天涂抹2次。于第3、5、6、7天留皮肤样本做病毒滴度检测。
表3药物治疗HSV病毒感染豚鼠皮肤中病毒滴度(logTCLD50/0.1ml)比较
以上结果说明该药物组合能显著减轻豚鼠皮肤的发病症状，使皮肤感染性病毒滴度下降。本发明确定的该药物确为抗疱疹病毒的最佳药物配方。
实施例11、处方 选用下列用量的药物组合物和附加剂，制备片剂大黄素 110g姜黄素 25g苦参碱 95g淀粉320g乳糖25g
硬脂酸镁 5g2、制备取大黄素、姜黄素、苦参碱、淀粉、乳糖混合均匀，过80目筛，用95％乙醇湿法制粒，烘干，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，包衣，即得。
实施例21、处方 选用下列用量的药物组合物和附加剂，制备分散片大黄素 50g姜黄素 15g苦参碱 35g聚乙二醇6000 900g淀粉 50g硬脂酸镁 5g2、制备取大黄素、姜黄素、苦参碱、聚乙二醇6000，将PEG6000加热熔融，取药物加热溶解于适量无水乙醇中，再加入到熔融状态下的载体中不断搅拌，使混合均匀，并于80℃搅拌挥去溶媒，然后迅速倾倒入预冷的不锈钢板上，涂成薄层，在-20℃条件下冷却固化，成品贮于干燥器中数日，研细，过60目筛，再加入淀粉、乳糖，PVP湿法制粒，烘干，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，包衣，即得。
实施例31、处方 选用下列用量的药物组合物和附加剂，制备软膏剂大黄素 45g姜黄素 10g苦参碱 40g硬脂酸甘油脂80g硬脂酸 120g凡士林 150g甘油150g蒸馏水 500ml2、制备取硬脂酸甘油脂、硬脂酸、凡士林加热融化成液相，甘油、蒸馏水加热至90℃为水相。将水相缓缓倒入油相，边加边搅拌，得乳剂型基质。将大黄素、姜黄素、苦参碱加入上述基质中，搅拌均匀，即得。
实施例41、处方 选用下列用量的药物组合物和附加剂，制备胶囊剂大黄素 110g姜黄素 55g苦参碱 100g羧甲基纤维素钠 25g糊精35g硬脂酸镁5g2、制备取大黄素、姜黄素、苦参碱、羧甲基纤维素钠、糊精、硬脂酸镁混合均匀，过80目筛，干法制粒，整粒，灌装于胶囊中，即得。
实施例42、处方 选用下列用量的药物组合物和附加剂，制备混悬剂大黄素 6g姜黄素 2g苦参碱 5g羧甲基纤维素钠 0.2g维晶纤维素 1.0g苯甲酸钠 0.2g蒸馏水 加至100ml2、制备取苯甲酸钠溶于蒸馏水中，与维晶纤维素、羧甲基纤维素钠制成胶浆，将大黄素、姜黄素、苦参碱加入，混合均匀，即得。
以上实例仅为了对本发明作进一步的说明，而本发明的范围不受所举实例的局限。
权利要求
1.一种抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂，其特征在于复方制剂是由大黄素、苦参生物总碱、姜黄总色素按下述比例配制而成的药剂大黄素5～50、苦参总生物碱5～50、姜黄总色素0～50。
2.根据权利要求1所述的抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂，其特征在于它是由大黄素或含大黄素的提取物与一种或一种以上的苦参生物碱及一种或一种以上的姜黄色素配方组成。苦参生物碱包括苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱；姜黄总色素包括姜黄素、去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素。
3.根据权利要求1所述的抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂，以不同的给药途径配以不同的辅料、制成相应的内服或外用的剂型，用于治疗柯萨奇病毒、疱疹病毒引起的心肌炎、带状疱疹等多种病毒性疾病。
4.根据权利要求1所述的抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂，其特征在于所述的剂型是任何一种药剂学上所说的剂型。
5.根据权利要求1所述的抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂，其特征在于可以是与任何一种药剂学上所述的辅料混合制成的各种剂型。
全文摘要
本发明一种抗科萨奇病毒和疱疹病毒的复方制剂包括大黄素、苦参生物总碱和姜黄总色素按一定的比例配伍，进一步加入各种辅料制备成各种复方制剂。该复方制剂对科萨奇病毒和疱疹病毒具有较好的抑制和杀死作用。
文档编号A61P31/00GK101032482SQ20061012558
公开日2007年9月12日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者陈科力, 雷湘 申请人:陈科力