专利名称：单纯疱疹病毒抗体唾液快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物诊断技术领域，尤其涉及一种单纯疱疹病毒抗体唾液快速检测试纸条。
背景技术：
单纯疱渗是由DNA病毒的单纯疱渗病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)所致。人类单纯疱渗病毒分为两型，即单纯疱渗病毒I型(HSV-I )和单纯疱渗病毒II型(HSV-II )。
I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口
腔粘膜)和器官(脑)的感染。n型主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。此两型可用荧光免疫检查及细胞培养法鉴别。
人是单纯疱瘆病毒的唯一自然宿主。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。原发性感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现，仅有少数可出现临床症状。原发感染发生后，病毒可长期潜伏于体内。正常人
群中约有50%以上为本病毒的携带者。HSV在人体内不产生永久免疫力，
每当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染
和情绪改变时，体内潜伏的HSV被激活而发病。目前，4企测以上传染病
最常用的方法是免疫4全测，此方法以抗原一抗体的特异性识别为基础，包
括传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)和近来兴起的胶体金法两种。胶体金法分为免疫层析和免疫渗滤两种方式，其中以免疫层析法最为方便、快捷。免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理如下利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸条的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被的抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测线(T线)，通过检测线的有无实现对结果的判定。但是传统免疫层析技术大多是以血液为样本，血液中成分复杂，在检测前需要对血液进行处理，操作复杂，检测成本较高。
发明内容
本发明提供了 一种单纯疱渗病毒抗体唾液快速检测试纸条，该试纸条 可以以唾液为样品，解决了现有试纸条检测成本较高，不适合现场检测的 缺点。
一种单纯疱渗病毒抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次 粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上
附着有胶体金标记的可与HSV-I和HSV-II的IgM抗体特异性结合的鼠抗 人IgM抗体；所述的硝酸纤维素膜上包被有由人重组HSV-I抗原和HSV
鼠二抗抗;构成的质控线。P —' ^ '"
本发明所述的HSV-I和HSV-II的IgM抗体是检测人是否感染单纯疱 瘆病毒的标记物，该标记物与通过血液检测人是否感染单纯疱渗病毒的标 记物为同 一标记物，为本领域技术人员所公知。所述的鼠抗人IgM抗体、 人重组HSV-I抗原和HSV - II抗原、羊抗鼠二抗抗体均可通过现有传统方 法制得。HSV-I的IgM抗体和HSV-II的IgM抗体是两种不同的抗体，鼠 抗人IgM抗体可同时与HSV-I和HSV-II的IgM抗体结合。
优选地，所述的胶体金垫上附着有0.16 0.25^ig/cri^的可与HSV-I和 HSV-II的IgM抗体特异性结合的鼠抗人IgM抗体。 优选地，所述的力交体金垫可通过如下方法制备
取胶体直径为15~35nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0~8.2，以每 100ml胶体金溶液计加入0.65~1.0mg所述的鼠抗人IgM抗体，搅拌后用 牛血清蛋白封闭，离心去上清液，用胶体金溶液复溶至相同体积，将每毫 升溶液均匀铺在20 40cri^玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。'
优选地，所述的检测线中人重组HSV-I抗原的含量为0.01 0.4ng/cm, 人重组HSV-II抗原的含量为0.03 0.8吗/cm;所述的质控线中羊抗鼠二抗 抗体含量为0.04-1.2pg/cm。
优选地，所述的4企测线包被方法如下
将所述的人重组HSV-I和人重组HSV-II抗原分别溶解在磷酸緩沖溶 液中制得浓度为0.04~0.8mg/ml的两种溶液，将该两种溶液以体积比1: 3的比例混合，将混合溶液以l~1.5nl/cm的用量在硝酸纤维素膜的一端划线，干燥后即得检测线；
所述的质控线包被方法如下
将所述的羊抗鼠二抗抗体溶解在磷酸緩冲溶液中制得浓度为0.04~0.8mg/ml的溶液，将该溶液以l~1.5|il/cm的用量在硝酸纤维素膜的另一端划线，干燥后即得质控线。
本发明还提供了上述单纯疱疹病毒抗体唾液快速#企测试纸条的检测方法，包括以下步骤
取人唾液，用磷g吏緩沖溶液稀释，取50-100^1稀释后的唾液滴在样品垫上，根据检测线(T线)和质控线(C线)的显色状态，判断检测结果。
如C、 T线均出现，判定样品为阳性；C线出现，T线不出现，判定样品为阴性；C、 T线都不出现或者C线不出现T线出现，均判定试纸无效。
本发明试纸条采用免疫层析技术检测唾液中HSV-I和HSV-II的IgM
抗体，从而确定人是否感染单纯疱渗病毒，具有反应快速、敏感性高、特异性强的特点，而且操作简单，适合自检以及检测成本较低。
具体实施方式
实施例1胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径15nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1MK2CO3调至pH8.0,以每100ml胶体金溶液计加入0.65mg可与HSV-I和HSV-II的IgM抗体特异性结合的鼠抗人IgM抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、 4°C离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml,按lml溶液铺20cm2的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37。C干燥30分钟，制成胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被将可与HSV-I和HSV-II的IgM抗体特异性结合的人重组HSV-I抗原 和人重组HSV-II抗原(上海领潮生物科技有限^^司)分别溶解在0.01M、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS )配制成0.04mg/ml的两种溶液，再将人重组HSV-I 抗原溶液和人重組HSV-II抗原溶液按照体积比1: 3的比例混合制成混合 溶液，将该混合溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜一端以lpl/cm的参数进行 划线。
将可与上述鼠抗人IgM抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体(上海领潮 生物科技有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩冲液(PBS)配制成 0.04mg/ml的溶液，将该溶液用喷膜仪分别在硝酸纤维素膜另 一端以 lnl/cm的参数进行划线。
划线后在室温下干燥8小时，分别^r测线和质控线。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20 25。C，湿度小于30%，将样品垫(玻璃纤维膜)、 胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝 酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的 1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的 1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料 卡中制成检测卡。
实施例2 胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径15nm的胶体金溶液，制备完成 后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1MK2CO3调至pH8.0，以每100ml 胶体金溶液计加入l.Omg可与HSV-I和HSV-II的IgM抗体特异性结合的 鼠抗人IgM抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入 重量百分比为5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、 4°C 离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml，按lml溶液铺40cm2 的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37-C干燥30分钟，制成胶体 金垫。
7硝酸纤维素膜的包被
将可与HSV-I和HSV-II的IgM抗体特异性结合的人重组HSV-I抗原和人重组HSV-II抗原(上海领潮生物科技有限公司)分别溶解在0.01M、pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成0.8mg/ml的两种溶液，再将人重组HSV-I抗原溶液和人重组HSV-II抗原溶液按照体积比1: 3的比例混合制成混合溶液，将该混合溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜一端以1.5nl/cm的参数进行划线。
将可与上述鼠抗人IgM抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体(上海领潮生物科技有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成0.08mg/ml的溶液，将该溶液用喷膜仪分别在硝酸纤维素膜另 一端以lnl/cm的参数进行划线。
划线后在室温下干燥8小时，分别检测线和质控线。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20 25。C，湿度小于30%，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10招:接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
临床样品试验
待检人在采集唾液样品前30分钟禁食，取每位待检人唾液0.5ml于纸杯中，用吸管取两滴滴加到浓度0.02M、 pH8.0的磷酸緩沖溶液中稀释，取稀释的唾液lOOpl加到样品垫中，肉目艮观测30分钟，记录T线和C线的显色状态。同时将唾液样品用单纯疱渗病毒IgM抗体EUSA试剂盒检测，若两者检测检测结果不一致，再以另外两种单纯疱渗病毒IgM抗体ELISA试剂盒进行;险测，若两种或以上的ELISA试剂为阳性，判定结果为阳性，两种或以上的ELISA试剂为阴性，判定结果为阴性。
收集唾液样品163份，其中ELISA试剂盒检测出阳性样品43份，本发明试纸条(实施例1 )检测出阳性样品44份，具 结果如下表1所示表1本发明试纸条对纯疱疹病毒抗体临床样品的检测结果
ELISA本试纟氏总数
+—+43043
—1119120
总数44119163
灵敏度=43/43=100%;特异性=119/120=99.2%
权利要求
1、一种单纯疱疹病毒抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，其特征在于所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与HSV-I和HSV-II的IgM抗体特异性结合的鼠抗人IgM抗体；所述的硝酸纤维素膜上包被有由人重组HSV-I抗原和HSV-II抗原构成的检测线以及可与所述的鼠抗人IgM抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体构成的质控线。
2、 根据权利要求1所述的单纯疱渗病毒抗体唾液快速检测试纸条， 其特征在于所述的月交体金垫上附着有0.16 0.25吗/cm2的可与HSV-I和 HSV-II的IgM抗体特异性结合的鼠抗人IgM抗体。
3、 根据权利要求1所述的单纯疱渗病毒抗体唾液快速检测试纸条， 其特征在于取胶体直径为15~35nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0~8.2， 以每100ml胶体金溶液计加入0.65~1.0mg所述的鼠抗人IgM抗体，搅拌 后用牛血清蛋白封闭，离心去上清液，用胶体金溶液复溶至相同体积，将 每毫升溶液均匀铺在20 400112玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。
4、 根据权利要求1所述的单纯疱渗病毒抗体唾液快速4企测试纸条， 其特征在于所述的检测线中人重组HSV-I抗原的含量为0.01~0.4ng/cm, 人重组HSV-II抗原的含量为0.03 0.8吗/cm;所述的质控线中羊抗鼠二抗 抗体含量为0.04~1.2|xg/cm。
5、 根据权利要求1单纯疱渗病毒抗体唾液快速检测试纸条，其特征 在于，所述的检测线包被方法如下将所述的人重组HSV-I和人重组HSV-II抗原分别溶解在磷酸緩沖溶 液中制得浓度为0.04 0.8mg/ml的两种溶液，将该两种溶液以体积比1: 3 的比例混合，将混合溶液以l~1.5jil/cm的用量在硝酸纤维素膜的一端划 线，干燥后即得检测线；所述的质控线包被方法如下将所述的羊抗鼠二抗抗体溶解在磷酸緩沖溶液中制得浓度为 0.04~0.8mg/ml的溶液，将该溶液以l~1.5nl/cm的用量在硝酸纤维素膜的 另一端划线，干燥后即得质控线。
6、 一种权利要求1单纯疱渗病毒抗体唾液快速4企测试纸条的检测方法，包括以下步骤取人唾液，用磷酸緩冲溶液稀释，取50~100^d稀释后的唾液滴在样 品垫上，根据检测线和质控线的显色状态，判断检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种单纯疱疹病毒抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与HSV-I和HSV-II的IgM抗体特异性结合的鼠抗人IgM抗体；所述的硝酸纤维素膜上包被有由人重组HSV-I抗原和HSV-II抗原构成的检测线以及可与所述的鼠抗人IgM抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体构成的质控线。本发明试纸条采用免疫层析技术检测唾液中HSV-I和HSV-II的IgM抗体，从而确定人是否感染单纯疱疹病毒，具有反应快速、敏感性高、特异性强的特点，而且操作简单，适合自检以及检测成本较低。
文档编号G01N33/569GK101639480SQ200910102100
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者李洪江, 郑隆泗 申请人:杭州艾力康医药科技有限公司