专利名称：1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及l， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗单 纯疱疹病毒的药物的用途，特别涉及其作为制备抗单纯疱疹l型病毒的药物 的用途，属于药品领域。
背景技术：
1,2,3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖从余甘子〃朋Aw emMca L.)的枝叶中提取而得。余甘子(尸/^〃a"A^ L.)来源于大戟科
@1^1101^&06&6)叶下珠属植物(尸/^//朋^^)的成熟果实，又名滇橄榄、油柑，
广泛分布于西亚、北非、印度南部以及东南亚各地。我国西南至东南沿海地 区均有分布。在我国的中草药、藏药、蒙药、傣药、维吾尔药等民族药体系 以及印度寿命吠陀传统药物体系中，均具有十分悠久的用药史。 单纯疱疹病毒属a亚科，分单纯疱疹病毒1型和2型，是最早发现的疱疹类 病毒。单纯疱疹病毒1型引起唇疱疹、疱疹性角膜炎等。单纯疱疹原发感染 愈后病毒基因潜伏于神经节，当机体抵抗力低下时，病毒基因被激活并开始 繁殖，病情反复发作。
单纯疱疹病毒(HSV)为典型疱疹病毒形态，球形，有包膜，颗粒直径 120-150nm，内有核衣壳，直径100-110nm，包膜和核衣壳之间有无定形纤 维组织皮质层，内有核心，核心内有病毒DNA和蛋白质。
单纯疱疹病毒在全球广泛分布，人类是唯一的宿主。感染主要通过人群 与易感者之间的密切接触，无季节差异。机体感染病毒后可产生抗体，抗体 不能清除病毒，但可作为了解HSV感染流行病学的指标。
单纯疱疹病毒感染在人群中广泛存在，初次原发感染绝大多数形成隐性 感染，无临床症状，感染后产生中和抗体，60%-90%的人群中抗体检测为阳 性，但不能清除病毒。少数感染者出现黏膜、皮肤复发性疱疹病灶，新生儿 或免疫力低下者感染后可发展为疱疹性脑炎或全身性感染。唇疱疹为单纯疱 疹病毒l型(HSV-1)常见的皮肤感染，局部出现疱疹病灶， 一般自愈，可复发。也可引起皮肤疱疹、湿疹。眼角膜炎为单纯疱疹病毒常见的黏膜感染， 单纯疱疹病毒1型感染引起角膜炎，发病率较高。原发性感染多为急性树枝 状角膜炎，愈后经常反复发作，病变深入角膜基层组织，发展为角膜溃疡， 影响视力，甚至导致失明，发作病程长达数月。新生儿或免疫力低下者感染 疱疹病毒，可侵染神经系统，引发脑炎，病情严重、未治疗病人病死率高达
70%,治疗后也多发生后遗症。严重者可引起全身性单纯疱疹病毒感染，病 死率极高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供了l， 2， 3， 4， 6陽五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖(1， 2， 3， 4， 6-penta-0-galloyl-卩-D-glucose)
作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基 -b-D-葡萄糖作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途。
所述抗单纯疱疹病毒的药物是抗单纯疱疹病毒1型的药物。 所述抗单纯疱疹病毒的药物含有治疗有效量的1， 2， 3， 4， 6-五-0-没 食子酰基-b-D-葡萄糖和药学上可接受的载体。
所述抗单纯疱疹病毒的药物制成片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂。 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果(1)本发明以单 纯疱疹病毒l型(HSV-1)毒株和人胚肺成纤维细胞(MRC-5)细胞为实验 对象，观察1， 2， 3, 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖抗单纯疱疹病毒1 型的活性，确定了l， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-l感 染的细胞具有预防和治疗作用，还可以降低对MRC-5细胞的感染性，明确 了 1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-l具有直接杀伤作用， 使HSV-1感染MRC-5细胞的活性下降；(2)将l， 2， 3， 4， 6-五-0-没食 子酰基-b-D-葡萄糖用于制备抗单纯疱疹病毒1型的药物，在安全剂量范围 内，对单纯疱疹病毒1型的抑制率高；预防单纯疱疹病毒1型感染的作用强； 愈后快，可以减轻感染病人的综合症状；药物毒性小，稳定性好，具有重要 的开发与应用前景。
图1是正常细胞对照组的显微镜图(10xl0倍)。图2是病毒对照组的显微镜图(10xl0倍)。图3是本发明的药物组的显微镜图(10x10倍)。图4是阳性对照药物ACV组的显微镜图(10x10倍)。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实验材料的说明如下
1、 器材进口 24孔培养板(平底)；倒置显微镜；C02细胞培养箱；微量可调加样器；培养基为MEM (含青霉素、链霉素双抗各250U/ml)，除菌过滤前用碳酸氢钠调pH至7.0-7.2 ;小牛血清经56°C 30min灭活补体，除菌分装；消化液为5X胰蛋白酶5ml+0.01mol/L (pH7.2) PBS93ml，除
菌分装，低温保存。
2、 病毒和细胞株
单纯疱疹病毒1型毒株是来源于美国ATCC(VR733)，引自武汉病毒所。MRC-5细胞购于购自中国科学院细胞库，由申请人所在的实验室保存。MRC-5细胞系来自14周龄男性胎儿的正常肺组织，是正常二倍体细胞系，是疱疹病毒敏感细胞。MRC-5细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基连续传代3次保持在对数生长期，供实验用，维持液为含2%小牛血清的MEMi首养基。
3、 药物
将10mgl， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖先加入100plDMSO(二甲基亚砜)溶解后配成药物储存液，-20°0保存备用。阳性对照药无环鸟苷(ACV)为湖北科益药业股份有限公司产品，临用前用MEM维持液稀释。
实施例1
药物稀释将药物储存液用MEM维持液稀释，倍比稀释为20)Lig/ml，
510^g/ml， 5pg/ml， 2.5pg/ml， 1.25pg/ml。
阳性对照药物ACV稀释将10mg ACV样品溶于100nl去离子水配制药物母液，4"C长期保存，使用时用MEM维持液稀释，稀释为20pg/ml，10吗/ml， 5吗/ml， 2.5吗/ml， 1.25pg/ml。
分别将20貼/ml， 10pg/ml， 5|tig/ml， 2.5|ng/ml， 1.25吗/ml的1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和20pg/ml， 10pg/ml， 5pg/ml， 2.5pg/ml，1.25pg/ml的ACV维持液以100^1/孔的量加到单层MRC-5细胞的孔中，每个浓度设4个复孔，培养2小时后，接种100TCID50 (病毒感染力滴度)HSV-1病毒液100pl/ L，置于5%C02细胞培养箱继续培养2小时，病毒完全吸附到细胞后，加入由2倍的MEM维持液和1%羧甲基纤维素以1 : 1的比例配成的完全覆盖液800|iil，培养72小时，观察药物处理后的细胞对HSV-1感染的影响，同时设定病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。试验分析方法
72小时后，病毒对照组的细胞不再出现空斑时，弃去维持液，以10%甲醛溶液固定30分钟，然后用5%结晶紫溶液染色后作空斑计数，计算空斑抑制率。
空斑抑制率(％)=(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数xl00^
计算IC50 (半数抑制浓度)，计算方法为加权直线回归法，从而估测1，2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-l的感染有无预防作用。
结果显示1, 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-l感染的半数有效剂量(IC50)为2.104pg/ml。可见1， 2， 3, 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1感染的细胞具有预防作用。
实施例2
1， 2， 3， 4, 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物和阳性对照药物ACV
的稀释方法同实施例1。
先接种100TCID50的HSV-1于24孔板的单层MRC-5细胞上，在37°C、C02细胞培养箱吸附2小时，再将20ing/ml， 10吗/ml， 5(ag/ml， 2.5pg/ml，1.25pg/ml的1，2,3，4，6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和20pg/ml，10|tig/ml， 5吗/ml， 2.5昭/ml， 1.25吗/ml ACV维持液以100^1/孔的量加到单层MRC-5细胞的孔中，每个浓度设4个复孔，置于5XC02细胞培养箱继续培养72小时，观察空斑形成的情况。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。试验分析方法
统计不同的药物浓度作用下的空斑形成数目，计算IC50。结果显示1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-1感染的半数有效剂量(IC50)为1.600吗/ml。可见1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1感染的细胞具有治疗作用。
实施例3
1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物和阳性对照药物ACV
的稀释方法同实施例1。
分别将20吗/ml， 10吗/ml， 5pg/ml， 2.5pg/ml， 1.25ng/ml的1,2,3,4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和HSV-1存储液各lOOpl混合后，以200-孔的量加到24孔板单层MRC-5细胞上，每个浓度设定4个复孔，置于5%C02细胞培养箱培养72小时，观察药物对HSV-1感染细胞的综合作用。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。
试验分析方法
统计各药物浓度作用下的空斑形成数，计算IC50。
结果显示1， 2, 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-1感染的半数有效剂量(IC50)为:5.340—1。可见1, 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖可降低HSV-1对MRC-5细胞的感染性。
实施例4
1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物和阳性对照药物ACV
的稀释方法同实施例1。
分别将20吗/ml， 10pg/ml， 5|iig/ml， 2.5|iig/ml， 1.25|ug/ml的1， 2， 3， 4，6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和HSV-1存储液各lOOpl混合后，置37"C培养箱培养2小时后，将此混合液以200^0/孔的量加入单层MRC-5细胞孔中，37°C、 5XC02细胞培养箱培养72小时，观察药物对HSV-1的直接杀伤作用。同时设病毒对照组、正常细胞对照组和同样在37°C、 5%(302细胞培养箱中放置2小时的病毒对照组，实验重复3次。试验分析方法
统计各药物浓度的空斑数，计算IC50。
结果显示1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-l感染的半数有效剂量(IC50)为为1.302pg/ml。可见1, 2， 3， 4， 6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1具有直接杀伤作用，使HSV-1感染的MRC-5细胞的活性下降。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途。
2、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗单纯疱疹病毒的 药物是抗单纯疱疹病毒1型的药物。
3、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗单纯疱疹病毒的 药物含有治疗有效量的1， 2， 3， 4， 6-五-0-没食子酰基-b-D-葡萄糖和药学 上可接受的载体。
4、 根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗单纯疱疹病毒的 药物制成片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂。
全文摘要
本发明提供了1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途，特别涉及其作为制备抗单纯疱疹1型病毒的药物的用途。1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1感染的细胞具有预防和治疗作用，还可以降低对MRC-5细胞的感染性，对HSV-1具有直接杀伤作用，可以使HSV-1感染MRC-5细胞的活性下降；以其为有效成分制备的抗单纯疱疹病毒1型药物，在安全剂量范围内，对单纯疱疹病毒1型的抑制率高；预防单纯疱疹病毒1型感染的作用强；愈后快，可以减轻感染病人的综合症状；药物毒性小，稳定性好。
文档编号A61K31/7024GK101461817SQ20081022068
公开日2009年6月24日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者青 刘, 北里海雄, 张美英, 张颖君, 杨崇仁, 王一飞, 赢 裴, 钱垂文 申请人:暨南大学