专利名称：具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤血管新生和促进放疗后造血恢复及延长生存期的药物组合物，尤其是涉及减毒的细菌载体及克隆的cDNA载体及其在动物体内的表达，小鼠接种肿瘤后抗肿瘤血管新生治疗以及正常小鼠放射线照射后各种指标的检测及生存期的观察。
背景技术：
肿瘤病人放疗后血液系统均出现不同程度的损伤，一些长期接触放射性物质或者受到辐射损伤的病人也出现骨髓抑制。PF4是血小板特异性蛋白，CXC趋化因子家族成员。能促进放射损伤后造血的恢复，对造血细胞有可逆性的抑制作用，暂时性地抑制其增殖，使造血细胞停止于S期，能提高骨髓造血细胞对辐射的耐受性，还能刺激早期造血干细胞的增殖，从而有效地促进照射后骨髓造血细胞的恢复。PF417-70是PF41-70的一个基因片段，有报道腺病毒编码的PF41-70及PF417-70通过抑制血管新生抑制肿瘤的生长。并证明通过抗血管新生抑制肿瘤与目前的手术及放化疗相比毒性低。减毒细菌株其特点在于通过口服途径可以穿过小肠粘膜上皮细胞侵入肠壁的淋巴组织特别是回肠下端的集合淋巴结和孤立淋巴结，并延淋巴管至肠系膜淋巴结。在这些淋巴组织内，被巨噬细胞吞噬，并在其中繁殖；另一方面经胸导管进入血液，血液中的病菌很快被全身单核吞噬系统如肝、脾、骨髓、和淋巴结中的巨噬细胞。由于骨髓中的巨噬细胞摄取病菌较多，存在时间较长，故骨髓培养阳性率可高达90％。在肿瘤组织内的微环境的影响，减毒的沙门氏菌能选择性的集聚在肿瘤组织中，其特异性与正常组织相比1000∶1。成为一种有价值的抗肿瘤基因治疗的载体。减毒菌株由于不能合成对羟基苯甲酸(PAB)和2，3-二羟基苯(DHB)，所以不能在哺乳动物细胞内增殖而成为营养缺陷的减毒株。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物，通过减毒的菌株及克隆的cDNA载体在动物体内的表达。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物，携带有SEQ ID NO.1的核苷酸序列/或SEQ ID NO.3核苷酸序列片段的真核表达载体，通过口服后可以在体内整合，由受体细胞在体内表达相应多肽，达到抗辐射损伤和抗肿瘤作用，药物组合是通过将具有抗辐射和抗肿瘤血管新生的基因片段克隆到携带绿色荧光蛋白的真核表达载体中，并将克隆基因片断的载体通过电转化方式转入到减毒的沙门氏菌中。
所用的沙门氏菌为减毒菌株。
所述的真核表达载体为PIRES2-EGFP，经减毒沙门氏菌介导，转移整合到达全身各个组织。
口服后可以在体内表达具有放射保护作用的多肽因子，延长放射损伤动物的生存时间，促进造血的恢复。
口服后可以在体内表达具有抗肿瘤生长的多肽因子，显著抑制恶性肿瘤的生长。
本发明的有益效果是通过减毒的沙门氏菌株为细菌载体将转化的基因片断靶向性地在组织中发挥治疗作用。方法简单、有效，无毒副作用，损伤小适合长期应用。
图1是真核表达载体的构建。
图2是绿色荧光蛋白在小鼠肿瘤组织中的表达。
图3是绿色荧光蛋白在骨髓组织中的表达。
图4是绿色荧光蛋白在外周血中的表达。
图5是绿色荧光蛋白在肝脏中的表达。
图6是绿色荧光蛋白在脾脏中的表达。
图7是绿色荧光蛋白在肾脏中的表达。
图8是绿色荧光蛋白在小肠中的表达。
图9是肿瘤体积的观察。
图10是照射后小鼠的生存曲线。
图11是接种肿瘤后小鼠的生存率。
图12照射后是动物外周血象的比较。
图13照射后动物骨髓细胞总数的比较。
图14照射后动物骨髓高增值潜能集落形成单位数的比较。
图15照射后动物骨髓粒单集落形成单位数的比较。
图16小鼠照射7Gy后生存曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不受限于下述实施例1用于克隆的cDNA的制备如图1所示，通过基因runner设计引物序列，由上海生物公司合成引物，引物两侧分别带有EcoRI和BamHI酶切位点，从载体PCMV-PF417-70及PCMV-PF41-70扩增带有人MCP-1信号肽(27个氨基酸)的PF417-70(SEQ ID NO.3)及PF41-70(SEQ ID NO.1)的基因片断。扩增的片断大约为240bp，291bp(包括信号肽)。EcoRI和BamHI酶切载体及胶回收后的PCR产物，分子克隆主要参考Sambrook等的方法(Sambrook，T.etal.Molecular CloningA Laboratory Manual，1989，Cold Spring HarborLaboratory，New York)，PIRES2-EGFP质粒购于invitrogen公司，减毒菌株购于加拿大细菌库，将两端分别带有EcoRI和BamHI接头cDNA的片段插入到经EcoRI和BamHI双酶切的PIRES2-EGFP的质粒中，用连接物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，进行酶切、电泳及测序鉴定，正确的克隆用于表达。
实施例2携带克隆基因片段载体的减毒菌株的制备减毒菌株在LB培养基中培养至OD600＝0.4，制备感受态减毒菌株，通过电穿孔的方法将携带克隆基因片段的载体转化入减毒菌株。筛选阳性克隆。
实施例3体内转染的检测如图2至图8，通过检测体内组织中绿色荧光蛋白的表达来间接说明转基因在体内的分布。分别取照射后及接种肿瘤小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、小肠、骨髓、外周血及肿瘤组织荧光显微镜检测荧光的表达，在共聚焦显微镜下均可见到绿色荧光蛋白的表达，肿瘤组织内表达更强。而对照组小鼠切片中未见到绿色荧光蛋白的表达。表明沙门氏菌可将外源性基因导入小鼠体内并进行器官特异表达。
实施例4肿瘤体积的观察如图9所示，将1(105)B16恶性黑色素细胞接种于小鼠右侧腋下，当肿瘤长至肉眼可见时，将转化有基因片段的减毒菌株在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基中培养至，OD600＝0.4，收集菌体，PBS清洗后，100g/LNaCHO3溶液悬浮调整细菌数为1×109个/ml。实验动物共分四组每组6只，分别为空白对照组、绿色荧光蛋白组、空菌组(SL3261)、SL3261/PF417-70组，各组鼠用胃管每隔三天饲服相应细菌0.1ml，空白对照组饲服等量100g/L NaCHO3，每隔两天测量肿瘤的大小。经过治疗的小鼠肿瘤体积明显缩小(P＜0.05)实施例5生存期观察如图10所示，小鼠照射后记录其状态及小鼠的存活情况。将携带转化克隆基因片段载体的减毒菌株培养至OD600＝0.4，10％NaHCO3将细菌数调整到1×109/ml取100ul通过食管探子口服喂饲。健康雄性Balb/c小鼠随机分为五组实验组PF41-70、实验组PF417-70、空载体组、减毒菌株组和PBS组，每组均于照射前隔三天喂饲，第二次喂饲后第二天给予7.0cGy放射线照射。照射后第二天给予喂饲，以后隔三天喂饲一次。共喂饲7次。经过PF41-70及PF417-70治疗的小鼠的生存期与对照组相比明显延长。PF417-70治疗的小鼠在试验期间一直存活，PF41-70治疗的小鼠有五分之二死亡，没有治疗的小鼠全部死亡。
如图11所示，肿瘤接种后经SL3261/PF417-70治疗的小鼠的生存期与对照组相比明显延长50％。
实施例6动物外周血象的比较如图12所示，照射后我们检测每组小鼠在第7天的外周血白细胞、血小板和红细胞的计数。各组小鼠的血小板和红细胞差异不明显。经过PF41-70及PF417-70治疗，的白细胞数虽然低于正常值，但是与对照组相比明显增高(P＜0.05)。
实施例7动物骨髓细胞总数的比较如图13所示，照射后第7天时每组取三只小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，取出股骨和胫骨，冲出骨髓细胞计数骨髓中单个核细胞(MNC)的数量。经过PF41-70及PF417-70治疗组的骨髓单个核细胞数比对照组增加(P＜0.05)。
实施例8照射后骨髓集落培养如图14、15所示，照射后第十四天，取小鼠的双侧胫骨及股骨单个核细胞5×104集落培养PF41-70及PF417-70治疗组，高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFC)的数量、粒单集落形成单位(GM-CFU)与对照组相比有明显区别(P＜0.05)。
实施例9化学合成人造血功能保护肽对小鼠的放射保护作用为验证上述的药物组合物的抗辐射保护造血的功能系细菌携带的重组载体在体内表达造血功能保护肽所致。本发明采用化学合成方法，合成了该多肽。并用高度纯化的多肽进行了动物体内试验。具体地说，雌性C57小鼠照射7Gy后，每天皮下注射多肽1次，共注射4次，每次每只小鼠注射5μg。然后观察小鼠的生存情况，结果如图16所示，接受多肽注射的小鼠其生存率提高了约27％。
SEQUENCE LISTING(序列表)<110>中国医学科学院血液学研究所<120>具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>439<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220>
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ctgatagcca cgctgaagaa tggaaggaaa atttgcttgg acctgcaagc cccgctgtac180aagaaaataa ttaagaaact tttggagagt 210
权利要求
1.一种具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物，其特征是携带有SEQ ID NO.1的核苷酸序列/或SEQ ID NO.3核苷酸序列片段的真核表达载体，通过口服后可以在体内整合，由受体细胞在体内表达相应多肽，达到抗辐射损伤和抗肿瘤作用，药物组合是通过将具有抗辐射和抗肿瘤血管新生的基因片段克隆到携带绿色荧光蛋白的真核表达载体中，并将克隆基因片断的载体通过电转化方式转入到减毒的沙门氏菌中。
2.根据权利要求1所述药用组合物，其特征是所用的沙门氏菌为减毒菌株。
3.根据权利要求1所述药用组合物，其特征是所述的真核表达载体为PIRES2-EGFP，经减毒沙门氏菌介导，转移整合到达全身各个组织。
4.根据权利要求1所述药用组合物，其特征是口服后可以在体内表达具有放射保护作用的多肽因子，延长放射损伤动物的生存时间，促进造血的恢复。
5.根据权利要求1所述药用组合物，其特征是口服后可以在体内表达具有抗肿瘤生长的多肽因子，显著抑制恶性肿瘤的生长。
全文摘要
本发明公开了一种具有放射保护和抗肿瘤作用的减毒沙门氏菌药物组合物，携带有SEQ ID NO.1的核苷酸序列/或SEQ ID NO.3核苷酸序列片段的真核表达载体，通过口服后可以在体内整合，由受体细胞在体内表达相应多肽，达到抗辐射损伤和抗肿瘤作用，药物组合是通过将具有抗辐射和抗肿瘤血管新生的基因片段克隆到携带绿色荧光蛋白的真核表达载体中，并将克隆基因片断的载体通过电转化方式转入到减毒的沙门氏菌中。通过减毒的沙门氏菌株为细菌载体将转化的基因片断靶向性地在组织中发挥治疗作用。方法简单、有效，无毒副作用，损伤小，适合长期应用。
文档编号A61K35/66GK1562375SQ200410018770
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月22日 优先权日2004年3月22日
发明者韩忠朝, 赵丽华, 刘斌 申请人:中国医学科学院血液学研究所