专利名称：具有α-糖苷酶抑制活性的药物组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物及其用途，特别是涉及一种具有α-糖苷酶抑制活性的药物组合物及其在制备降糖药物上的应用。
背景技术：
糖尿病(Diabetes Mellitus)是由胰岛素分泌不足和/或胰岛素作用受损引起的一组以高血糖为特征的代谢性疾病。其表现为血液及尿液中葡萄糖浓度异常升高，血糖、尿糖过高时可出现典型的“三多一少”症状，即多饮、多尿、多食及体重减轻，且伴有疲乏无力。中医称糖尿病为“消渴证”，是指以烦渴引饮、消谷善饥、小便频数、形体消瘦为特征的疾病。糖尿病一般分为1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病等几种类型。2型糖尿病，以往称为非胰岛素依赖型糖尿病，约占糖尿病病人总数的90％。随着生活水平的提高，预期寿命的延长以及糖尿病检测手段的发展，世界各国糖尿病的患病率都在升高。治疗2型糖尿病的口服药物主要分四大类，即磺酰脲类、双胍类、α-糖苷酶抑制剂及胰岛素增敏剂。α-糖苷酶抑制剂(即α-葡萄糖苷酶抑制剂)是一类新型口服降糖药，适用于任何类型的糖尿病。目前已被批准用于临床糖尿病治疗的α-糖苷酶抑制剂主要有3种阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)和米格列醇(miglitol)，它们都是含氮的生物碱。
食物中的碳水化合物在胃肠道中的消化是几个连续的酶促反应的结果。淀粉首先被位于十二指肠和空肠上部的胰腺α-淀粉酶部分水解为分子量较小的寡糖，如麦芽糖、异麦芽糖和α-限制性葡聚糖等。这些寡糖很难被小肠粘膜吸收，必须经麦芽糖酶、葡糖淀粉酶和异麦芽糖酶水解为单糖如葡萄糖，才能被粘膜表面有效运输而进入代谢循环。食物中的蔗糖则被蔗糖酶水解为果糖和葡萄糖。这些酶统称为α-糖苷酶，位于小肠上皮细胞刷缘处。正常情况下，碳水化合物的消化吸收主要发生在小肠上部，小肠较低的部位(回肠)不参与这一过程。这是由于碳水化合物大部分已在小肠上部被消化和吸收，小肠下部没有酶作用的底物，其α-糖苷酶作用十分微弱。
由于α-糖苷酶抑制剂的活性中心含有氮，可与α-糖苷酶上碳水化合物的结合位点相结合，其亲和力远大于酶的正常底物，因此，当与膳食一起进食后，α-糖苷酶抑制剂可在小肠上皮细胞刷缘处和寡糖相竞争，占据α-糖苷酶上寡糖结合位点，使寡糖的消化吸收受阻，减少寡糖在小肠上部的消化。未被消化的碳水化合物被运送至小肠中下段及结肠，导致碳水化合物的消化吸收发生在整段小肠中，延缓和延长了餐后葡萄糖的吸收，从而降低餐后血糖的增高。
将α-糖苷酶抑制剂作为降糖药物是20世纪70年代后兴起的降糖新思路，其筛选和研制始于德国和日本等国。人们最初从放线菌属和链霉菌属中提取出一系列的α-糖苷酶抑制物，这些抑制物在化学结构上的共同点是含有由一分子环己六醇和一分子氨基糖(4，6-二脱氧-4-氨基-D-葡萄糖)组成的活性中心，称为acarviosine。80年代证实了1-脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin，DNJ)对糖苷酶有良好的抑制作用，1-脱氧野尻霉素化学名为2R，3R，4R，5S-2-羟甲基-3，4，5-三羟基哌啶，这种生物碱是一种天然糖的结构类似物。
另有研究发现多数黄酮类物质具有显著的α-糖苷酶抑制剂活性，如爱神木叶中有6种黄酮醇类物质具有显著的抑制α-糖苷酶的作用，酸枣叶中有3种黄酮甙是抑制α-糖苷酶的活性成分，杜仲茶的提取物中分离得到了5种α-糖苷酶的抑制成分，并据其物理化学特征和13CNMR结果确定化学成分为黄酮类物质的槲皮素衍生物。据报道茶多酚对链脲佐链菌素诱导的糖尿病大鼠有降糖作用，其降糖机理可能是茶多酚为糖苷酶抑制剂，使蔗糖和淀粉的分解延缓，从而降低口服蔗糖和淀粉后血糖的升高。
黄酮类化合物是自然界中广泛存在的一类化合物，以豆科、芸香科、唇形科、菊科等植物中较多，在植物体内常以游离态或与糖结合成甙的形式存在。如生药槐米、陈皮、葛根、黄芩、银杏、甘草、菊花、飞水蓟等均含有黄酮成分，槲皮甙、芸香甙(芦丁)、橙皮甙、葛根素、大豆素、银杏黄酮、黄芩甙、飞水蓟素等具有调节心血管和抗炎等功能，在一定程度上均可调节毛细血管的通透性，从而延缓餐后血糖的升高。
中国专利申请号01113191.8公开了“具有α-糖苷酶抑制剂活性的中药提取物、其制备方法及用途”，该专利涉及了从中药桑白皮、桑叶和桑椹制备的总生物碱，没有涉及黄酮类α-糖苷酶抑制剂的制备方法及用途，更没有涉及上述生物碱类物质与黄酮类化合物联合使用，使α-糖苷酶抑制剂效果明显增强的报道。
我国中药资源丰富，重新从糖的消化，吸收，代谢途径入手，以现代医学理论解释中医机理，开发安全可靠，有效成分明确，作用靶标清晰的天然降糖药物提供一条新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物；本发明的另一个目的是提供一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物在制备治疗糖尿病、治疗高血脂，抗氧化、抗衰老的药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，由从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱至少一种，重量百分比为5～90％、黄酮类提取物，重量百分比为10～95％组成。
从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱是由下述方法制备的将蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶，经粉碎后，以水或0.01～0.1N的酸或甲醇或乙醇或含水醇类为提取溶剂，进行冷浸提取或加热提取或回流提取，提取溶剂量的体积为被提取饮片重量的5～15倍，重复提取1-4次；过滤除去药渣；滤液浓缩；加乙醇沉淀，除去杂质沉淀；经离心或过滤，除去残渣；上清液上阳离子交换树脂，用无离子水洗尽不吸附的杂质，用浓度为0.2-1N氨水洗脱；洗脱液减压浓缩除去氨水；经活性碳吸附脱色，收集脱色液；浓缩，制成干粉状总生物碱。
从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱，重量百分比最好是30～80％、黄酮类提取物，重量百分比最好是20～70％组成。
所述黄酮类提取物可以选儿茶素、槲皮素、茶多酚中的一种。
黄酮类提取物也可以选儿茶素、槲皮素、茶多酚中的两种，其中，儿茶素∶槲皮素∶茶多酚的重量比为0∶1～9∶1～9或1～9∶0∶1～9或1～9∶1～9∶0。
黄酮类提取物还可以是儿茶素、槲皮素、茶多酚共三种，儿茶素∶槲皮素∶茶多酚的重量比为1～9∶1～9∶1～9。
黄酮类提取物还可以是槲皮甙、芸香甙、橙皮甙、葛根素、大豆素、银杏黄酮、黄芩甙、飞水蓟素中至少一种，两种以上，可按任意重量比例组合。
从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱，可以是上述几种中药饮片中一种如蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱，也可以是两种，如从蚕沙和桑枝中提取的总生物碱的混合物，也可以是三种或四种。
在从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱的制备过程中所使用的阳离子交换树脂为交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为001×1.1或001×4或001×7或001×14.5或Amberlite IR120或Dowex 50或Zerolit 225，洗脱液氨水浓度以0.5N为宜。
一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物在制备治疗糖尿病、治疗高血脂，抗氧化、抗衰老的药物中的应用。
本发明从α-葡萄糖苷酶抑制剂的机理入手，从中药中筛选出几种不同结构类型α-糖苷酶抑制剂成分；一种为桑科植物药材(桑枝、桑白皮、桑叶)或蚕沙中的总生物碱成分，它能有效抑制寡糖的水解。另一类是黄酮类提取物，可以是游离态的甙元，也可以是与糖结合的甙，如儿茶素，槲皮素，茶多酚，葛根素、大豆素、飞水蓟素、橙皮甙、槲皮甙、芸香甙(芦丁)、银杏黄酮、黄芩甙等，与第一类相比其α-糖苷酶的抑制效果较弱，但与小肠葡萄糖转运有作用，并能降低小肠毛细血管的通透量有效地抑制了葡萄糖的吸收；二者联合使用效果显著，具有良好的协同作用，可有效地抑制和延缓食物中碳水化合物的消化和吸收，降糖效果好于总生物碱和黄酮类提取物单独使用的效果。
本发明从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱，并同黄酮类提取物组成的药物组合物，以及由这种药物组合物利用各种公知的药物制剂技术，制成的各种制剂包括片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、滴丸剂等，具有作用机理清晰，疗效确切，可用于治疗糖尿病、肥胖症、高血脂症，并有抗氧化、抗衰老的药理活性。
图1为从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱、儿茶素、槲皮素及茶多酚的α-葡萄糖苷酶抑制曲线图；图2为桑枝总生物碱与儿茶素、槲皮素、茶多酚联合使用的α-葡萄糖苷酶抑制效果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1～16 列于表1表1
实施例27从桑枝中提取的总生物碱的方法桑枝1000g，加体积百分含量为50％的乙醇5L，70℃保温3小时，过滤，滤渣再加50％乙醇5L，煮沸后浸泡过夜，过滤，合并两次滤液，浓缩至原体积的1-2倍，离心，静置，加乙醇过夜沉淀，抽滤，滤液过001×7型阳离子交换树脂，0.5N氨水溶液洗脱，收集生物碱检测阳性部分，再经活性炭吸附脱色，减压浓缩，离心，冷冻干燥，得8.06g桑枝总生物碱。
生物碱的酸碱滴定法取上述干粉0.5克，溶于20ml冰乙酸中，以0.1N高氯酸为滴定液，测得其中N原子当量数。再取上述干粉0.5克，溶于20ml水中，以0.1N NaOH为滴定液，测得其中羧酸根当量数。N原子当量数减去羧酸根当量数应为生物碱的摩尔数，生物碱分子量以180计，所算得的生物碱重量应不低于总重量的30％。
公式生物碱含量＝[高氯酸体积(mL)-NaOH体积(mL)]×0.036×100％实施例28从桑枝中提取总生物碱的方法步骤同实施例27，以0.05N HCl为提取溶剂，提取方法可以是冷浸提取或50～80℃加热提取，提取溶剂量的体积为被提取饮片重量的5～15倍，重复提取1-4次；过滤除去药渣，用NaOH中和至中性，滤液浓缩；加乙醇沉淀，除去杂质沉淀；经离心或过滤，除去残渣；上清液上阳离子交换树脂，用无离子水洗尽不吸附的杂质，用浓度为0.2-1N氨水洗脱；洗脱液减压浓缩除去氨水；经活性碳吸附脱色，收集脱色液；浓缩，制成干粉状总生物碱。
以酸为提取溶剂，其浓度还可以选0.01N、0.1N、或0.02N，其酸还可以是硫酸。
实施例29从蚕沙中提取总生物碱的方法蚕沙1000g，加50％乙醇8L，70℃保温3小时，过滤。滤渣再加50％乙醇8L，70℃保温3小时，过滤，合并两次滤液，离心，絮凝，静置过夜，抽滤，滤液过001×7型阳离子交换树脂，以无离子水洗尽不吸附的杂质，0.5N氨水溶液洗脱，收集生物碱检测阳性部分，再经活性炭吸附脱色，减压浓缩，离心，冷冻干燥，得6.89g蚕沙总生物碱。
实施例30蚕沙生物碱及黄酮类提取物的α-糖苷酶抑制实验取体重120～140g的雄性Wister大鼠(1只)，处死后取小肠，剥离肠系膜，用预冷的生理缓冲液(PBS)冲洗肠内内容物，剪碎后至于匀浆器中，加30mlPBS研磨，4℃，10,000转/分、离心10分钟，取上清液得大鼠小肠α-糖苷酶粗酶液。
取DNJ标准品、上述实施例19制备的蚕沙总生物碱、以及市售的儿茶素、槲皮素、茶多酚等黄酮类化合物，配置不同浓度的水溶液。各取200μl，分别加入上述条件制备的α-糖苷酶粗酶液100μl，10mg/ml麦芽糖溶液100μl，混均，37℃温育20分钟，沸水加热终止反应。冷却后用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的释放量。以样品浓度为横坐标，490nm的吸光度为纵坐标，作图绘制糖苷酶的抑制曲线，以该方法制备的蚕沙总生物碱，以及儿茶素、槲皮素、茶多酚等黄酮类化合物均呈现出的α-糖苷酶抑制活性，其中总生物碱的糖苷酶抑制效果明显好于黄酮类化合物。(见图1)横坐标为浓度(μg/ml)纵坐标为吸光度490nm。
葡萄糖的含量测定法(葡萄糖氧化酶法)取待测样品10μl于200μl葡萄糖测定用工作液中(葡萄糖氧化酶试剂盒，用时制备)，37℃反应15分钟，于490nm处测定其吸光度。(在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖首先被氧化成葡萄糖酸和H2O2，H2O2催化过氧化物酶将4-氨基安替比林和酚合成红色的醌亚胺，并在490nm处有最大吸收。)实施例31桑枝生物碱及黄酮类提取物α-糖苷酶抑制效果的协同作用取体重120～140g的雄性Wister大鼠(1只)，处死后取小肠，剥离肠系膜，用预冷的生理缓冲液(PBS)冲洗肠内内容物。剪碎后至于匀浆器中，加30ml PBS研磨，4℃，10,000转/分、离心10分钟，取上清液得大鼠小肠α-糖苷酶粗酶液。
分别浓度均为0.1mg/ml的取阿卡波糖标准品、上述实施例18的桑枝总生物碱提取物、市售的儿茶素、槲皮素、茶多酚黄酮类化合物，以及其混合物的水溶液各200μl，分别加入上述α-糖苷酶粗酶液100μl，10mg/ml麦芽糖溶液100μl，混均，37℃温育20分钟，沸水加热终止反应。冷却后用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的释放量，考察单品的桑枝总生物碱提取物、黄酮类化合物，以及其混合物的糖苷酶抑制效果。如图2，结果显示桑枝总生物碱同黄酮类化合物(包括儿茶素、槲皮素、茶多酚)联合效果好于其单品的抑制效果，表明其具有良好的协同作用。
实施例32桑枝生物碱及黄酮类提取物的反转肠囊试验取体重120～140g的雄性Wister大鼠，处死，取出小肠，剥离肠系膜，用预冷的PBS冲洗肠内容物。把小肠切成3.5～4cm的小段，用吸管反转小肠。反转的肠囊一端用棉线结扎，从另一端加入Krebs-Henseleit缓冲液200μl，并结扎肠囊。迅速将肠囊放于添加有一定浓度糖苷酶抑制剂样品以及1％淀粉的4ml Krebs-Henseleit溶液中。37℃水浴中振荡60min后，加入10μl 1N HCl终止反应。从试管中取出肠囊，分别收集肠囊内液以及试管中反应液(即反转肠囊外液)，3000rpm离心10min，取上清，用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的释放量。以阿卡波糖为正对照，PBS为空白对照，考察其对淀粉水解以及对葡萄糖吸收的影响。
结果如表2显示，桑枝总生物碱提取物与黄酮类化合物联合使用的抑制效果与总生物碱，以及儿茶素、槲皮素、茶多酚单独使用相比较，其肠囊外对淀粉水解的抑制效果，以及肠囊内对葡萄糖吸收的阻碍作用均明显增强，呈现出良好的协同作用。
表2.中药提取物的反转肠囊试验
与空白对照组相比，*，p＜0.05；**，p＜0.01；(n＝5)与总生物碱组相比，Δ，p＜0.05；ΔΔ，p＜0.01；(n＝5)实施例33蚕沙生物碱及黄酮类提取物对正常小鼠餐后血糖的影响选取18-22g雄性昆明种小鼠，将其按体重随机分为正对照组(阿卡波糖组)、空白对照组(生理盐水组)和给药组，每组各7只，恒温条件下(24±1℃)喂养，饲以标准饲料，自由饮水。试验前16h禁食不禁水，分别取一定浓度的蚕沙总生物碱、黄酮类化合物提取物、相应浓度的混合物、以及阿卡波糖，同一定剂量的淀粉(5g/kg)一起给正常小鼠灌胃。分别在给药后0，30，60，120min尾静脉采血，并收集于含有一定量肝素钠和生理盐水的离心管中，3000rpm离心10min，取上清，以葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖水平，考察生物碱及黄酮类提取物及其混合物对正常小鼠糖耐量的影响。
结果如表3所示，蚕沙总生物碱以及黄酮类提取物(儿茶素、槲皮素)均可以降低正常小鼠的餐后血糖水平，并可延缓血糖高峰的时间，给药30min后，给药组与对照组相比，血糖值有显著差异(p＜0.01)；而中药提取物混合物组(总生物碱+儿茶素组、总生物碱+槲皮素组、总生物碱+儿茶素+槲皮素组)与总生物碱组单独使用相比较，给药30min后，血糖值也有显著差异(p＜0.01)，证明总生物碱与黄酮类物质配伍有良好的协同作用，可以明显增强糖苷酶的抑制效果。
表3中药提取物对正常小鼠血耐量的影响
与空白对照组相比*，p＜0.05；**，p＜0.01；(n＝7)与总生物碱组相比Δ，p＜0.05；ΔΔ，p＜0.01；(n＝7)
权利要求
1.一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，由从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱中至少一种，重量百分比为5～90％、黄酮类提取物，重量百分比为10～95％组成。
2.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，其特征是所述从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱是由下述方法制备的将蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶，经粉碎后，以水或0.01～0.1N的酸或甲醇或乙醇或含水醇类为提取溶剂，进行冷浸提取或加热提取或回流提取，提取溶剂量的体积为被提取饮片重量的5～15倍，重复提取1-4次；过滤除去药渣；滤液浓缩；加乙醇沉淀，除去杂质沉淀；经离心或过滤，除去残渣；上清液上阳离子交换树脂，用无离子水洗尽不吸附的杂质，用浓度为0.2-1N氨水洗脱；洗脱液减压浓缩除去氨水；经活性碳吸附脱色，收集脱色液；浓缩，制成干粉状总生物碱。
3，根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，其特征是所述从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱，重量百分比为30～80％、黄酮类提取物，重量百分比为20～70％组成。
4.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，其特征是所述黄酮类提取物为儿茶素、槲皮素、茶多酚之一种。
5.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，其特征是所述黄酮类提取物为儿茶素、槲皮素、茶多酚之二种，所述儿茶素∶槲皮素∶茶多酚的重量比为0∶1～9∶1～9或1～9∶0∶1～9或1～9∶1～9∶0。
6.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，其特征是所述黄酮类提取物为儿茶素、槲皮素、茶多酚之三种，所述儿茶素∶槲皮素∶茶多酚的重量比为1～9∶1～9∶1～9。
7.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，其特征是所述黄酮类提取物为槲皮甙、芸香甙、橙皮甙、葛根素、大豆素、银杏黄酮、黄芩甙、飞水蓟素中至少一种。
8.根据权利要求2所述的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，其特征是所述阳离子交换树脂为交联聚苯乙烯系的强酸型树脂，其型号为001×1.1或001×4或001×7或001×14.5或Amberlite IR120或Dowex 50或Zerolit 225，所述洗脱液氨水浓度为0.5N。
9.权利要求1～7中任意一项的一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的药物组合物在制备治疗糖尿病、治疗高血脂，抗氧化、抗衰老的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有α－糖苷酶抑制剂活性的药物组合物，由从蚕沙或桑枝或桑白皮或桑叶中提取的总生物碱，重量百分比为5～90％、黄酮类提取物，重量百分比为10～95％组成，本发明的药物组合物中，从桑科植物药材桑枝、桑白皮及桑叶中或从蚕沙中提取的总生物碱，能有效地抑制寡糖的水解，而黄酮类提取物儿茶素、槲皮素及茶多酚，不但能抑制寡糖的水解，还能降低小肠毛细血管的通透量，有效地抑制葡萄糖的吸收；二者联合使用效果显著，具有良好的协同作用，可有效地抑制和延缓食物中碳水化合物的消化和吸收，降糖效果好于总生物碱和黄酮类提取物单独使用，本发明的药物组合物在制备治疗糖尿病、治疗高血脂，抗氧化、抗衰老的药物中应用。
文档编号A61P3/00GK1559539SQ20041001867
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月23日 优先权日2004年2月23日
发明者白钢, 杨文博, 耿鹏, 肖会姣, 杨洋, 田旺, 白 钢 申请人:南开大学