专利名称：一种抑制冠状病毒的多肽及其衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制病毒的多肽及其衍生物。
背景技术：
SARS冠状病毒是传染性非典型肺炎的主要致病病毒，有很强的传染性，造成严重的社会危害。目前国家食品和药品监督管理局批准的抗SARS药物仅有干扰素“重组人干扰素α-2b喷雾剂”和“重组人干扰素ω喷鼻剂”，化学药品“注射用西维来司钠”和“注射用乌司他丁”等少数几个药物，“莲花清瘟胶囊”和“复方鳖甲软肝片”等中药品种正处在临床研究中。这些药有的是用于高危人群的预防，有的是广譜抗病毒和提高免疫力的辅助药物，目前尚没有直接抑制SARS冠状病毒的特效药，由SARS冠状病毒引起的非典型肺炎仍然处于无药可医的状态。由于传染性非典型性肺炎对人类健康和社会的巨大危害，应用基因组学、蛋白组学和药物设计的原理，发展直接针对SARS冠状病毒的特效药物，有重大的现实意义、经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制冠状病毒的多肽；本发明的另一个目的是提供一种抑制冠状病毒的多肽在制备抗冠状病毒药物中的应用；本发明的第三个目的是提供一种抑制冠状病毒的多肽衍生物；本发明的最后一个目的是提供一种抑制冠状病毒的多肽衍生物在制备抗冠状病毒药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z。该多肽的单字母表达式为X-VLQSGFR-Z，三字母表达式为X-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Z。
所述X为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
所述Z为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
将该多肽命名为Wogu(Wei-Chou-Gan-Du)多肽。
一种抑制冠状病毒的多肽，在制备抗冠状病毒药物中的应用。本发明的一种抑制冠状病毒的多肽可以按照药学领域的常规生产方法，与一种或多种载体混合，制成所需的制剂，根据患者的年龄、体重等因素进行一次或多次施用。
一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，它由下述化学表达式所示 所述X为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
所述Z为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，在制备抗冠状病毒药物中的应用。本发明的一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，可以按照药学领域的常规生产方法，与一种或多种载体混合，制成所需的制剂，根据患者的年龄、体重等因素进行一次或多次施用。
本发明的效果①本发明的一种抑制冠状病毒的多肽即Wogu多肽，对病毒有一定的抑制作用，其半数有效浓度为2.7×10-5mg/ml，可以制备抗病毒药物。
②本发明的一种抑制冠状病毒的多肽即Wogu多肽经化学修饰后成为衍生物，可成为SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制剂和抗非典型肺炎的药物。
③本发明的一种抑制冠状病毒的多肽即Wogu多肽经化学修饰后成为衍生物，可成为其它冠状病毒的抑制剂。
图1为SARS冠状病毒主蛋白酶与一种抑制冠状病毒多肽对接图示；图2A、B为SARS冠状病毒主蛋白酶与一种抑制冠状病毒多肽氢键相互作用的不同角度的透视图；图3 Wogu多肽的7个aa的氨基酸序列(SEQ ID No.1)
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地说明实施例1一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X为氨基，Z为羧基。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实施例2一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X为羧基，Z为氨基。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实施例3一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X为丙氨酸，Z为氨基。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实施例4一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X为甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-丙氨酸，Z为甘氨酸。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实施例5一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X为甘氨酸-丙氨酸，Z为甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-甘氨酸。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实施例6一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X为甘氨酸，Z为甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实施例7一种抑制冠状病毒的多肽，它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，其中X丙氨酸-丝氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-丙氨酸，Z为甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实施例8一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，其中X为氨基，Z为羧基。用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
由Wogu多肽至多肽衍生物的修饰方案如下 一种抑制冠状病毒的多肽及其衍生物在制备抗冠状病毒药物中的应用，可以按常规方法制成针剂、片剂及胶囊剂等。
根据SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS CoV Mpro)分子的三维结构和多肽类药物设计的“变形的钥匙”理论，设计和合成了一种对SARS冠状病毒主蛋白酶有抑制作用，能阻断SARS冠状病毒复制的多肽X-VLQSGFR-Z(X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z)；该多肽经化学修饰后形成衍生物，经实验证明对SARS冠状病毒有抑制作用，并能成为SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制剂和抗非典型肺炎的药物，而且对其它冠状病毒的有一定抑制作用。
1.SARS冠状病毒主蛋白酶活性区域的确定本发明的第一步是确定SARS冠状病毒主蛋白酶的催化活性区域。Anand等首先建立了SARS冠状病毒主蛋白酶的同源模型(K.Anand，J.Ziebuhr，P.Wadhwani，J.R.Mesters，R.Hilgenfeld.Coronavirus main proteinase[3CLpro]structurebasis for design of anti-SARS drugs.Science 2003，300，1763-1767)。清华大学的饶子和研究小组从中国军事医学科学院发现的编号为BJ01的毒株中克隆了SARS冠状病毒的主蛋白酶基因，并通过遗传工程手段在大肠杆菌中获得了蛋白酶的高效、稳定表达，经过进一步的分离、纯化和结晶，收集了高分辨率的衍射数据，测定了该酶在四种不同条件下的三维空间结构，并详细阐述了该酶在底物结合区域的精确构象，进而通过解析该酶与抑制剂形成的复合物的三维空间结构，揭示了该酶与底物结合的精确模式(H.Yang，M.Yang，Y.Ding，Y.Liu，Z.Lou，Z.Zhou，L.Sun，L.Mo，S.Ye，H.Pang，G.F.Gao，K.Anand，M.Bartlam，R.Hilgenfeld，Z.Rao.The crystal structures ofsevere acute respiratory syndrome virus main protease and its complex with an inhibitor.Proc.Natl.Acad Sci.USA.2003，100，13190-13195)。由于SARS冠状病毒主蛋白酶的功能是切割病毒编码的多聚蛋白质，在病毒的复制周期中起着关键的作用，对病毒的生物特性有重要意义，因此SARS冠状病毒主蛋白酶的三维结构成为以分子结构为基础的直接药物设计的首选靶标。
SARS冠状病毒主蛋白酶包括304个氨基酸，折叠成三个结构域，结构域1为氨基酸残基8-99，结构域2为氨基酸残基100-193，结构域3为氨基酸残基184-199，蛋白酶与多肽结合的活性区域位于结构域1和结构域2之间的口袋状部位，我们的分子动力学模拟发现，催化活性区由23个氨基酸残基组成，它们是Cys-22、Gly-23、Thr-24、Thr-25、Leu-27、His-41、Val-42、Cys-44、Thr-45、Ala-46、Glu-47、Asp-48、Met-49、Leu-50、Asn-51、Pro-52、Tyr-54、Cys-145、His-164、Met-165、Asp-187、Arg-188、Gln-189。
2.分子动力学对接的计算机模拟SARS冠状病毒主蛋白酶与Wogu多肽VLQSGFR对接的计算机模拟是用药物设计软件包MOE(Molecular Operate Environment，Chemical Comuting Ltd.)完成的。水解酶切割多肽或蛋白质的催化敏感部位通常由可容纳8个氨基酸的8个位点组成，按惯例，8个氨基酸残基记作P4、P3、P2、P1、P1′、P2′、P3′、P4′，并且切割点在位点P1和P1′之间，标记为P1↓P1′(K.-C.Chou.Review prediction of human immunodeficiency virus protease cleavagesites in proteins，Analy.Biochem.1996，233，1-14；G.E.Schulz，R.H.Schirmer.Principles ofProtein Structure，Chap.2，pp.17-18，Springer-Verlag，New York，1985)。尽管偶尔有的水解酶的活性部位可容纳7-9个氨基酸，但8个氨基酸是最普遍的情况。我们的研究仅限于七肽的可分割性。
3.SARS冠状病毒主蛋白酶与Wogu多肽的结合机制Wogu多肽紧密地结合在蛋白酶的结构域1和2之间的口袋状部位，通过6个氢键紧密地结合在SARS冠状病毒主蛋白酶的催化活性区域，如果把多肽P1位的氨基酸残基Q(谷氨酰胺)用E(谷氨酸)取代，主蛋白酶与多肽之间的氢键减少到3个，使结合力大大降低。SARS冠状病毒主蛋白酶和其它冠状病毒的主蛋白酶的剪切点有明显的专一性，P1位点只能为Gln占据，P1′位点可以是Ser或其它氨基酸残基，表达为Gln↓(Ser，Ala和Gly)。计算机模拟证实了SARS冠状病毒主蛋白酶与多肽的结合机制和剪切点的专一性。这些发现进一步支持了Anand(K.Anand，J.Ziebuhr，P.Wadhwani，J.R.Mesters，R.Hilgenfeld.Coronavirus main proteinase[3CLpro]structurebasis for design of anti-SARS drugs.Science 2003，300，1763-1767)关于八肽中P1位置的Gln对SARS冠状病毒主蛋白酶的特异性起关键作用的说法，也为多肽的化学修饰指出了方向。
4.“扭曲的钥匙”模型与Wogu多肽的化学修饰的分析根据酶学中“钥匙和锁”的关系，从SARS冠状病毒主蛋白酶变异出来的多肽必须和活性位点有着很好的结合。然而，如果一个多肽用一些常规的方法把易断裂的键修饰后，会完全失去它的可劈开性，但它仍然能够和活性位点相结合。实际上，这种方法修饰的分子类似与“扭曲的钥匙”，它能够插入锁的孔中，但既不能打开锁也不能把钥匙拔出来，这自然就是一个理想的有竞争力的抗SARS蛋白酶的抑制剂。因此研究从酶本身分离出来的多肽和SARS蛋白酶的结合机理会给我们的药物设计提供有用的信息。图1所示的是Wogu多肽(实施例3)的化学修饰方案之一。
5.Wogu多肽AVLQSGFR的化学合成，用多肽合成仪按常规方法合成，合成从羧基端开始向氨基端延伸。
实验例1 Wogu多肽AVLQSGFR对非洲绿猴肾传代细胞(VERO)的毒性实验按一定比例稀释Wogu多肽，共9个稀释度，加到含有VERO细胞的96孔板中，每孔的培养液为100μl，多肽的终浓度为0.1mg/ml～7mg/ml，37℃下5％CO2培养48小时，每孔加20μl MTS/PMS，继续培养3小时，加50μl 10％SDS，检测OD490，以不加七肽的VERO细胞为对照，实验样品的OD490值大于对照细胞值的90％作为无毒性指标。实验结果是实验细胞的OD490值为1.87～2.06，对照细胞的OD490值为2.01，其比值均大于0.9，表明Wogu多肽对VERO细胞没有毒性。
实验例2 Wogu多肽AVLQSGFR对SARS病毒的抑制作用在96孔板中每孔接种10000个VERO细胞，培养液体积为100μl，37℃下5％CO2培养24小时，加入不同浓度的多肽(同实施例1)，每孔加入2μl SARS-BJ-01病毒，继续培养24～96小时，设置无细胞对照、细胞对照和病毒对照，当病毒对照组中细胞大量死亡时，测定OD490值。实验结果是实验细胞的OD490值为1.01～1.72，对照细胞的OD490值为2.11，其比值均小于0.9，表明该肽对SARS-BJ-01病毒的感染有一定的抑制作用。
实验例3 Wogu多肽AVLQSGFR和其它药物对SARS病毒抑制作用的比较按上述方法，对Wogu多肽AVLQSGFR和其它5种病毒抑制剂对SARS-BJ-01病毒的抑制效果进行了测定，结果见下表。表中结果表明Wogu多肽的半数有效浓度最低(2.7×10-5mg/ml)，选择性最好。
5种药物对SARS-BJ-01病毒的抑制作用药物 半数有效浓度(mg/ml)选择系数Wogu多肽 2.7×10-5＞37046-氮尿嘧啶核苷 16.86吡唑呋喃菌素 4.2 12霉酚酸 ＞50不可计算三氮唑核苷 ＞1000 不可计算甘草皂苷 300 ＞6权利要求
1.一种抑制冠状病毒的多肽，其特征在于它的氨基酸组成为X-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-Z，所述缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸用序列表SEQ ID No1表示。
2.根据权利要求1所述的一种抑制冠状病毒的多肽，所述X为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
3.根据权利要求1所述的一种抑制冠状病毒的多肽，所述Z为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
4.权利要求1至3之一的一种抑制冠状病毒的多肽，在制备抗冠状病毒药物中的应用。
5.一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，其特征在于它由下述化学表达式所示
6.根据权利要求5所述的一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，所述X为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
7.根据权利要求5所述的一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，所述Z为1至10之任意个氨基酸，或者是氨基，或者是羧基。
8.权利要求5至7之一的一种抑制冠状病毒的多肽衍生物，在制备抗冠状病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制冠状病毒的多肽及其衍生物，多肽的氨基酸组成为X－缬氨酸－亮氨酸－谷氨酰胺－丝氨酸－甘氨酸－苯丙氨酸－精氨酸－Z，实验证明，本发明的一种抑制冠状病毒的多肽及其衍生物，对非洲绿猴肾传代细胞没有毒性，对冠状病毒有一定的抑制作用，其半数有效浓度较低，为2.7×10
文档编号A61P11/00GK1560074SQ200410018679
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月23日 优先权日2004年2月23日
发明者魏冬青, 周国城, 甘一如, 杜奇石 申请人:天津师范大学, 天津大学