专利名称：：具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的酶解产物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及a-葡萄糖苷酶抑制剂，具体地说是一种通过胃蛋白酶处理牡蛎可溶性蛋白所得到的酶解产物及其应用。技术背景糖尿病是一种慢性的疾病，严重的威胁着人们的身体健康和生活质量。据世界卫生组织调查目前世界糖尿病人数高达约1.8亿，而中国的糖尿病人占全球的1/3。糖尿病及其并发症所引起的致残性、致死率己成为当前威胁人类健康的"第三大杀手"，若不及时治疗，糖尿病人可造成四肢麻木、全身疼痛、失明、肾功能衰竭、脑出血、猝死等严重后果。n型糖尿病约占糖尿病患者总数的90%。餐后血糖值过高是n型糖尿病并发症的直接致病因素，控制餐后血糖值可减缓n型糖尿病患者的糖尿病进程。a-葡萄糖苷酶可将多糖或寡糖降解为单糖葡萄糖，抑制a-葡萄糖苷酶活性可有效的抑制餐后血糖值的升高。因此a-葡萄糖苷酶抑制剂的研究是开发预防糖尿病并发症药物的热点。现有的作为治疗高血糖的合成药物如二甲双胍、阿卡波糖、伏格波糖、格列美脲等a-葡萄糖苷酶抑制剂均具有很多副作用，而源于食品蛋白的a_葡萄糖苷酶抑制剂无毒副作用，市场前景好。
发明内容本发明提供一种由食品来源的、高安全性的、廉价的、具有可产业化的具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解产物及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解产物，其可通过胃蛋白酶酶解牡蛎可溶性蛋白获得。所述胃蛋白酶酶解牡蛎可溶性蛋白的操作过程如下将牡蛎可溶蛋白溶于PI^2-4的磷酸缓冲液中，缓冲体系中蛋白的质量体积浓度为1.5-5%，加入胃蛋白酶，酶与底物牡蛎可溶蛋白的质量比为1:1-1000，在25-40。C条件下酶解1-48小时；所得酶解液加热至80-100°C，并保持5-30分钟，使蛋白酶失活；之后调节水解液pH=6-8，离心，经超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量MW为8000-12000道尔顿，收集透过超滤膜的小分子组分，其即为具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解产物。进行真空冷冻干燥，为牡蛎寡肽，-2(TC保存；将透过超滤膜的小分子组分经SephadexLH-20柱进行层析分离，用体积浓度20-40%的甲醇溶液洗脱，柱温为室温，检测波长为280纳米，按时间收集;收集^有较强a-葡萄糖苷酶抑制活性的组分，对酶解产物进一步纯化。所述磷酸缓冲液中盐的浓度可为0.01-0.2mol/L。所述牡蛎可溶性蛋白可按如下过程获取将新鲜牡蛎去壳、除内脏，将余下的白色肌肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎后，将其加到等体积的PH=6-8的PBS缓冲液中，充分搅拌;于0-8°C条件下，静置2-10小时后，离心；取上清液，加入硫酸铵，并使其最终浓度达到75-100%，并在0-8。C条件下，静置2-10小时，离心；将沉淀溶于PI^6隱8的PBS缓冲液中，装入透析袋，透析袋的截留分子量MW为8000-12000道尔顿，自来水流水透析12-36小时，再用去离子水流水透析12-36小时，然后将透析袋中的内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎可溶蛋白。所述的酶解产物及其盐类，它们具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，可在制备治疗和预防高血糖药物中应用。所述药物可为酶解产物及其盐类与充填剂所形成的各种形式的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、水溶液、悬浮液、乳化液、喷剂或粉剂，它们具有a-葡萄糖苷酶抑制活性；通过口腔摄取或者是注射液的形式使用；其使用可以采取经口腔和非经口腔的投入方法非经口腔的投入可以采取皮下和静脉注射，肛肠投入等方式；注射液的制作可以任意选用生理盐水、葡萄糖、安定剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂等。所述药物可以添加到各种食品当中，作为控制血糖保健食品；食品的形态可以是液体的，比如像清凉饮料、乳酸饮料、调味品、汤类、固体的奶酪、火腿、点心等。所述盐类可以为酶解产物与酸反应产生的盐类(比如说盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；蚁酸、乙酸、丙酸、甘氨胆酸、苹果酸、拧檬酸、酒石酸或琥珀酸等有机酸等形成的盐类；)、与金属离子形成的盐类(包括钠盐、钾盐、钙盐或铵盐)或与氨基乙醇、三乙氨或二环乙氨形成的胺类盐等，没有特别的限制。本发明相关的a-葡萄糖苷酶抑制剂，使用量没有特别的限制，具体的要根据血糖偏高的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素，适当地确定。本发明应用现代酶催化技术对牡蛎可溶蛋白进行酶解，利用生物分子分离技术对具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的酶解产物进行了初步分离，对分离得到的活性组分在体内、体外对a-葡萄糖苷酶抑制活性进行了研究，结果表明此活性组分在体外有较强的a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性组分经4-10(TC不同温度条件处理后仍能保持原有对a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性组分经pH=2-12不同酸碱条件处理后仍能保持原有对a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性组分经模拟胃肠道条件处理后仍能保持原有对a-葡萄糖苷酶的抑制活性；此活性组分分子量小，属寡肽类小分子物质，进入体内容易吸收，同时不易产生免疫原性；离体回肠蠕动实验表明此活性组分的摄入不会影响回肠的正常蠕动；此活性组分属天然食品经胃蛋白酶降解所得，不产生合成类药物常见的毒副作用；动物实验结果表明此活性组分在体内有较强的降血糖效果。因此，可以将此活性组分及其衍生物或者其盐类作为糖尿病患者的长期治疗药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。图1为SephadexLH-20柱分离酶解产物液相图谱；图2为酶解产物初步分离所得活性组分的浓度与ci-葡萄糖苷酶抑制活性关系曲线。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的阐述实施例1牡蛎可溶蛋白的制备将新鲜牡蛎去壳、除内脏，将余下的白色肌肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎后，将其加到等体积的PI^6的PBS缓冲液中，充分搅拌；于0"C条件下，静置2小时后，离心；取上清液，加入硫酸铵，并使其最终浓度达到75%，并在0。C条件下，静置2小时，离心；将沉淀溶于PH=6的PBS缓冲液中，装入透析袋，透析袋的截留分子量为8000道尔顿，自来水流水透析12小时，再用去离子水流水透析12小时，然后将透析袋中的内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎可溶蛋白。实施例2牡蛎可溶蛋白的制备将新鲜牡蛎去壳、除内脏，将余下的白色肌肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎后，将其加到等体积的Pf^8的PBS缓冲液中，充分搅拌；于8"C条件下，静置10小时后，离心；取上清液，加入硫酸铵，并使其最终浓度达到100%，并在8"C条件下，静置10小时，离心；将沉淀溶于PH=8的PBS缓冲液中，装入透析袋，透析袋的截留分子量为12000道尔顿，自来水流水透析36小时，再用去离子水流水透析36小时，然后将透析袋中的内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎可溶蛋白。实施例3牡蛎可溶蛋白的酶解将牡蛎可溶蛋白溶于PI^2的磷酸缓冲液中，蛋白浓度1%，加入胃蛋白酶，酶与底物牡蛎可溶蛋白的质量比为1:1(质量比)，在25。C条件下酶解1小时。所得酶解液加热至8(TC，并保持5分钟，使蛋白酶失活。之后调节水解液pf^6，离心，经超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量为8000道尔顿，收集透过超滤膜的小分子组分，其即为具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解产物。实施例4牡蛎可溶蛋白的酶解将牡蛎可溶蛋白溶于PH=4的磷酸缓冲液中，缓冲体系中蛋白的质量体积浓度为5。％，加入胃蛋白酶，酶与底物牡蛎可溶蛋白的质量比为1:1000，在40。C条件下酶解48小时；所得酶解液加热至IO(TC，并保持30分钟，使蛋白酶失活；之后调节水解液p1^8，离心，经超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量为12000道尔顿，收集透过超滤膜的小分子组分，其即为具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解产物。实施例5酶解产物的初步分离由牡蛎可溶蛋白酶解液15ml经SephadexLH-20柱进行层析分离(如图1所示)，用30%的甲醇溶液洗脱，柱温为室温，检测波长为280纳米，按管数收集，20分钟/管，收集具有较强a-葡萄糖苷酶抑制活性的组分。实施例6a-葡萄糖苷酶抑制活性的测定a-葡萄糖苷酶抑制活性的测定根据Yong-MuKim的方法略有改动(见CarZw/y^/rateiasearc/z，Volume339，2004，Pages715-717)。材料与仪，pH6.S的缓冲液配制称取KH2P04，2.72克；KOH，0.64克；MgCl，2.6克；H20，0.13克的实验药品溶解，定容至100mL。实验试剂的配制用缓冲液配制0.1unit/ml的a-葡萄糖苷酶、底物(3mmol/L对硝基酚吡喃糖苷溶于缓冲液)。实验方法在20jliL实验样品中加入20的a-葡萄糖苷酶，在37"C恒温水浴器中，保温5分钟，再加入底物溶液20pL，反应30分钟，加入终止剂0.1mol/LNa2CO340pL，之后测定405纳米波长的吸光值。具体实验将酶解产物分离得到的活性组分分别配制不同浓度检测a-葡萄糖苷酶抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>如图2所示，经计算最终IC5o=8.8mg/ml权利要求1.一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的酶解产物，其特征在于其可通过胃蛋白酶酶解牡蛎可溶性蛋白获得。2.按照权利要求1所述酶解产物，其特征在于所述胃蛋白酶酶解牡蛎可溶性蛋白的操作过程如下将牡蛎可溶性蛋白溶于PP^2-4的磷酸缓冲液中，缓冲体系中蛋白的质量体积浓度为1-5%，加入胃蛋白酶，酶与底物牡蛎可溶蛋白的质量比为1:1-1000，在25-40。C条件下酶解l-48小时；所得酶解液加热至80-100°C，并保持5-30分钟，使蛋白酶失活；之后调节酶解液pJ^6-8，离心，经超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量MW为8000-12000道尔顿，收集透过超滤膜的小分子组分，其即为具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的酶解产物。3.按照权利要求2所述酶解产物，其特征在于将透过超滤膜的小分子组分经SephadexLH-20柱进行层析分离，用体积浓度20-40%的甲醇溶液洗脱，柱温为室温，检测波长为280纳米，按时间收集；收集具有较强a-葡萄糖苷酶抑制活性的组分，对酶解产物进一步纯化。4.按照权利要求2所述酶解产物，其特征在于所述磷酸缓冲液中盐的浓度为0.01-0.2mol/L。5.按照权利要求1或2所述酶解产物，其特征在于所述牡蛎可溶性蛋白可按如下过程获取将新鲜牡蛎去壳、除内脏，将余下的白色肌肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎后，将其加到等体积的PH=6-8的PBS缓冲液中，充分搅拌;于0-8°C条件下，静置2-10小时后，离心；取上清液，加入硫酸铵，并使其最终浓度达到75-100%，并在0-8。C条件下，静置2-10小时，离心；将沉淀溶于PH二6画8的PBS缓冲液中，装入透析袋，透析袋的截留分子量MW为8000-12000道尔顿，自来水流水透析12-36小时，再用去离子水流水透析12-36小时，然后将透析袋中的内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎可溶蛋白。6.—种权利要求1所述的酶解产物及其盐类在制备治疗和预防高血糖药物中的应用。7.按照权利要求6所述的酶解产物及其盐类的应用，其特征在于所述药物为酶解产物及其盐类与充填剂所形成的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、水溶液、悬浮液、乳化液、喷剂或粉剂，它们具有a-葡萄糖苷酶抑制活性。8.按照权利要求6所述的酶解产物及其盐类的应用，其特征在于所述药物可以添加到各种食品当中，作为控制血糖保健食品。9.按照权利要求6所述的酶解产物及其盐类的应用，其特征在于所述盐类可以为酶解产物与酸反应产生的盐类、与金属离子形成的盐类或与氨基乙醇、三乙氨或二环乙氨形成的胺类盐。全文摘要本发明涉及α-葡萄糖苷酶抑制剂，具体地说是一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的酶解产物，其可通过胃蛋白酶酶解牡蛎可溶性蛋白获得。本发明应用现代酶催化技术对牡蛎可溶性蛋白进行酶解，利用生物分子分离技术对酶解产物进行初步分离，对具有α-葡萄糖苷酶抑制活性组分的抑制机制进行了研究，并研究了此组分在体内、体外对α-葡萄糖苷酶抑制活性及稳定性，结果表明此酶解产物有较强的降血糖效果。因此，可以将此活性组分及其衍生物或者其盐类作为糖尿病患者的长期治疗药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。文档编号C12P21/06GK101323640SQ20071001168公开日2008年12月17日申请日期2007年6月13日优先权日2007年6月13日发明者徐俊光,杜昱光,王佳培,白雪芳申请人:中国科学院大连化学物理研究所